Ức chế sự sinh trưởng và sự chết tế bào theo chương trình bởi kaempferol được điều hòa bởi sự hoạt hóa của mek - mapk ở tế bào ung thư phổi

Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> 10 ÖÙC CHEÁ SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SÖÏ CHEÁT TEÁ BAØO<br /> THEO CHÖÔNG TRÌNH BÔÛI KAEMPFEROL ÑÖÔÏC ÑIEÀU HOØA<br /> BÔÛI SÖÏ HOAÏT HOÙA CUÛA MEK-MAPK ÔÛ TEÁ BAØO UNG THÖ PHOÅI A549<br /> Nguyeãn Thò Thanh Tuyeàn* ; Huyønh Huøng*<br /> <br /> TOÙM TAÉT<br /> Moät soá löôïng lôùn caùc chaát khaùc nhau coù trong thieân nhieân cho thaáy coù tính ñeà khaùng ôû ung thö thöïc nghieäm<br /> vaø nhieàu baèng chöùng gôïi yù Kaempferol coù nhöõng ñaëc tính ngaên ngöøa hoùa trò cuûa ung thö. Tuy nhieân, caùc cô<br /> cheá baûo veä chính xaùc thì vaãn coøn ñöôïc hieåu moät caùch ngheøo naøn. Ñeå laøm saùng toû caùc cô cheá naøy,chuùng toâi ñaõ<br /> thöû nghieäm teá baøo ung thö phoåi ôû ngöôøi -A549 vôùi Kaempferol vaø nghieân cöùu nhöõng aûnh höôûng cuûa noù treân<br /> nhöõng bieåu ñoà veà söï taêng tröôûng vaø söï daãn truyeàn tín hieäu. Ñieàu trò caùc teá baøo A549 vôùi Kaempferol cho keát<br /> quaû öùc cheá khaû naêng soáng cuûa teá baøo va söï toång hôïp DNA phuï thuoäc vaøo thôøi gian vaø lieàu löôïng thuoác. Cuøng<br /> luùc ñoù, ñieàu trò Kaempferol cuõng laøm taêng haøm löôïng cuûa nhöõng protein pro-apoptosis (Bax va Bad) vaø laøm<br /> giaûm haøm löôïng cuûa nhöõng protein anti- apoptosis (Bcl-xL va Bcl-2). Trong khi Akt vaø phospho hoùa Akt bò öùc<br /> cheá thì MAPK laïi ñöôïc hoaït hoùa.Söï cheát teá baøo do Kaempferol ñöôïc keát hôïp vôùi söï taùch ra (cleavage) cuûa<br /> Caspase-7 vaø PARP.Söï öùc cheá MEK1/2 nhöng khoâng phaûi PI-3K ñaõ ngaên chaën Kaempferol gaây hoaït hoùa<br /> cleave Capsae-7, PARP vaø söï cheát cuûa teá baøo.Nhöõng keát quaû treân cho thaáy raèng söï baát hoaït cuûa Akt vaø söï thay<br /> ñoåi caùc protein cuûa gia ñình Bcl-2 khoâng ñuû ñeå Kaempferol gaây ra söï cheát teá baøo maø söï hoaït hoùa cuûa MEKMAPK laø ñieàu kieän taát yeáu ñeå Kaempferol gaây ra cô cheá cheát ôû teá baøo A549.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> KAEMPFEROL-INDUCED GROWTH INHIBITION AND APOPTOSIS IN A549 LUNG<br /> CANCER CELLS IS MEDIATED BY ACTIVATION OF MEK-MAPK.<br /> Nguyen Thi Thanh Tuyen, Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 *<br /> 2004: 72 – 80.<br /> <br /> A vast variety of naturally occurring substances have been shown to protect against experimental<br /> carcinogenesis and an increasing amount of evidence suggests that kaempferol may have cancer<br /> chemopreventative properties. However, the precise underlying protective mechanisms are poorly understood.<br /> To elucidate these mechanisms, we challenged human lung cancer cell line A549 with kaempferol and<br /> investigated its effects upon cellular growth and signal transduction pathways. Treatment of A549 cells with<br /> kaempferol resulted in a dose- and time-dependent reduction in cell viability and DNA synthesis with the rate<br /> of apoptosis equivalent to 0.9 ± 0.5, 5.2± 1.5, 16.8± 2.0, 25.4± 2.6, and 37.8 ± 4.5 % on treatment with 0, 17.5,<br /> 35.0, 52.5 and 70.0 μM kaempferol, respectively. Concomitantly, kaempferol treatments led to a 1.2-, 2.7-, 3.3and 3.4-fold increase in Bax. Similar elevations were also observed in Bad which increased 1.2-, 3.3-, 3.7- and<br /> 4.7-fold respectively as compared to control. Bcl-2 and Bcl-xL expression were inhibited in a dose-dependent<br /> fashion. While the Akt-1 and phosphorylated Akt-1 were inhibited, the mitogen-activated protein kinase<br /> (MAPK) was activated upon kaempferol treatment. Activation of MAPK and c-Jun was peaked at 6 h and<br /> MAPK activity was sustained over 96 h. In addition, MEK1/2 phosphorylation was observed in concordance<br /> with MAPK activation. Kaempferol induced apoptosis was associated with the cleavage of caspase-7 and PARP<br /> * Laboratory of Molecular Endocrinology-National Cancer center of Singapore<br /> <br /> 72<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> (poly ADP-ribose polymerase). Inhibition of MEK1/2 but not PI-3 kinase blocked kaempferol-induced cleavage<br /> of caspase-7, PARP cleavage, and apoptosis. The results suggest that inactivation of Akt-1 and alteration of Bcl2 family of proteins are not sufficient for kaempferol to induce apoptosis and activation of MEK-MAPK is a<br /> requirement for kaempferol-induced cell death machinery in A549 cells.<br /> Montesano et al., 1999). Caùc nghieân cöùu vôùi caùc öùc<br /> MÔÛ ÑAÀU<br /> cheá phaân töû nhoû hoaït ñoäng cuûa MEK (Dudley et al.,<br /> Ung thö phoåi laø moät trong caùc ung thö thoâng<br /> 1995; Favata et al., 1998) ñaõ chöùng minh vai troø cuûa<br /> thöôøng nhaát treân theá giôùi vaø öôùc tính khoaûng 28% so<br /> MEK trong vieäc ñieàu hoøa bieåu hieän cuûa caùc proteinase<br /> vôùi toång soá töû vong do ung thö gaây ra.Khoaûng 75%<br /> trong söï xaâm laán vaø di caên cuûa teá baøo ung thö (Reddy<br /> ung thö phoåi laø ung thö teà baøo phoåi khoâng nhoû<br /> et al., 1999; Liu et al., 2000) vaø söï giaùn ñoaïn hình<br /> (NSCLC-non-small cell lung cancer) vaø phaàn coøn laïi<br /> thaùi hoïc cuûa lôùp bieåu moâ (Lu et al., 1998; Chen et al.,<br /> laø teá baøo ung thö phoåi nhoû (SCLC-small cell lung<br /> 2000). Khoâng coù caùc chaát döôùi doøng cuûa MEK naøo<br /> cancer) (Midthun va Jett, 1997). Hieäu quaû ñieàu trò cuûa<br /> ñöôïc xaùc ñònh khaùc hôn ngoaøi p44/42 MAPK<br /> ung thö phoåi vaãn coøn ngheøo naøn. Trung bình tæ leä<br /> (reviewed in Anderson et al.,1990). Ñieàu trò caùc teá<br /> soáng 5 naêm ñoái vôùi ung thö phoåi khu truù laø 48% vaø di<br /> baøo vôùi caùc yeáu toá taêng tröôûng hoaëc taùc nhaân hoùa trò<br /> caên laø 2.5% (Feng et al., 2001). Tæ leä soáng 5 naêm cuûa<br /> lieäu khaùc nhau gaây ra söï hoaït hoùa cuûa MEK1/2 vaø caùc<br /> beänh nhaân ung thö phoåi ôû giai ñoaïn I vôùi phaãu thuaät<br /> muïc tieâu döôùi doøng cuûa noù. MAPK ñieàu hoøa söï taêng<br /> caét boû töøng phaàn coù theå ñaït tôùi 60% (Feng et al.,<br /> sinh,bieät hoùa vaø söï soáng cuûa teá baøo (reviewed in<br /> 2001). Ña soá beänh nhaân bò ung thö phoåi laø beänh<br /> Bllaif vaø Blenis, 2001). Söï hoaït hoùa cuûa MAPK ñieàu<br /> khoâng theå moå ñöôïc vaø coù tieân löôïng raát xaáu. Chæ coù<br /> hoøa hoaït ñoäng cuûa moät soá chaát döôùi doøng (substrates)<br /> 15% beänh nhaân ñöôïc chaån ñoaùn ôû giai ñoaïn sôùm vaø<br /> bao goàm nhaân toá phieân maõ (Transcription factor)<br /> khu truù bôûi vì phaàn lôùn ung thö phoåi baét ñaàu taêng<br /> p62TCF (ELK1), c-myc, ATF2, vaø caùc thaønh phaàn APtröôûng moät caùch yeân laëng maø khoâng keøm theo baát kì<br /> 1: c-Jun vaø c-Fos (Favataet al., 1998). MAPK cuõng<br /> nhöõng trieäu chöùng naøo cho ñeán khi ung thö ñaõ ôû giai<br /> lieân quan trong vieäc vaän chuyeån thuoäc nhaân (nuclear<br /> ñoaïn tieán trieån (Gargiullo et al., 2002). Hieän taïi chuùng<br /> transport), taäp hôïp caùc tieåu ñôn vò caáu truùc nhieãm saéc<br /> ta coù nhöõng phöông thöùc ñieàu trò phuï vaø taïm thôøi coù<br /> chaát (nucleosome assembly) vaø söï ñieàu hoøa boä xöông<br /> theå chaáp nhaän ñeå maø keùo daøi cuoäc soáng cuûa beänh<br /> teá baøo (Lewis et al., 2000). Söï hoaït hoùa MAPK coù theå<br /> nhaân ung thö phoåi. Do ñoù vieäc khaùm phaù ra phöông<br /> aûnh höôûng maïnh hoaëc laø ñeà khaùng laïi söï cheát teá baøo<br /> thöùc môùi ñeå chaån ñoaùn, phoøng ngöøa vaø ñieàu trò ung<br /> (reviewed in Walter, 2002) hay pro-apoptotic (Moos<br /> thö phoåi thì raát caàn thieát vaø caáp baùch.<br /> vaø Fitzpatrick, 1998; Bhat vaø Zhang, 1999). Nhöõng<br /> Moät trong nhöõng muïc tieâu döôùi doøng<br /> aûnh höôûng naøy phuï thuoäc vaøo baûn chaát cuûa töøng loaïi<br /> (downstream targets) thoâng thöôøng cuûa caùc tyrosine<br /> teá baøo.<br /> kinase coù hoaëc khoâng coù thuï theå vaø caùc protein Ras<br /> Ñieàu hoøa söï cheát teá baøo laø moät tieán trình phöùc taïp<br /> keát noái vôùi GTP laø bieåu ñoà daãn truyeàn tín hieäu cuûa<br /> vaø lieân quan ñeán moät soá löôïng lôùn caùc gen cuûa teá baøo<br /> MEK-MAPK (Lewis et al., 1998; Ballif vaø Blenis,<br /> bao goàm Bcl-2 (Fisher et al., 1993) vaø caùc thaønh vieân<br /> 2001). Caùc möùc ñoä taêng cao hoaït hoùa cuûa MEK1 chuû<br /> lieân quan ñeán Bcl-2 chaúng haïn nhö Bcl-xL, Bcl-xS,<br /> yeáu ñöôïc thaáy thöôøng xuyeân ôû caùc doøng teá baøo sinh<br /> Bad vaø Bax (Boise et el., 1993). ÖÙc cheá Bcl-2 laøm cho<br /> ung (Amundadottir vaø Leder, 1998; Hoshino et al.,<br /> thuùc ñaåy söï cheát cuûa teá baøo ñaùp öùng vôùi moät soá chaát<br /> 1999). Söï hoaït hoùa MEK1 chuû yeáu goùp phaàn cho söï<br /> kích thích bao goàm nhöõng thuoác choáng ung thö<br /> sinh tröôûng cuûa teá baøo (Gupta et al, 1999; Blaif vaø<br /> (Hickman., 1992; Fisher et al., 1993). Bcl-2 vaø BclBlenis, 2001), söï di chuyeån (Krueger et al., 2001), söï<br /> xL, goùp phaàn choáng laïi söï cheát teá baøo. Chuùng cuõng<br /> bieán naïp cuûa nguyeân baøo sôïi vaø teá baøo bieåu moâ<br /> ngaên ngöøa Bax vaø caùc protein pro-apoptotic gaây ra<br /> (Mansour et al., 1994; Greulich vaø Erikson, 1998;<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> 73<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> phoùng thích cuûa cytochrome c vaø söï hoaït hoùa cuûa<br /> caspase 9. Nghieân cöùu gaàn ñaây veà söï cheát teá baøo ñaõ<br /> chöùng minh taàm quan troïng cuûa PI-3kinase vaø<br /> protein döôùi doøng cuûa noù Akt (Franke et al., 1995;<br /> Kulik et al., 1997). Akt ñoùng vai troø laø chaát ñeà khaùng<br /> söï cheát teá baøo baèng caùch choáng laïi vôùi caùc chaát kích<br /> thích khaùc nhau (Franke et al., 1995). Moät söï keát noái<br /> tröïc tieáp giöõa PI-3 kinase vaø caùc protein ñieàu hoøa söï<br /> cheát teá baøo ñaõ ñöôïc thieát laäp thoâng qua Akt phospho<br /> hoùa Bad (Zha et al., 1996; Datta et al., 1997).<br /> Moät soá caùc nghieân cöùu veà dòch teã hoïc ñaõ daãn<br /> chöùng moái quan heä giöõa cheá ñoä aên vaø ung thö vaø caùc<br /> baèng chöùng cho raèng cheá ñoä aên nhieàu traùi caây vaø rau<br /> quaû ñöa ñeán nguy cô maéc beänh thaáp ôû moät soá loaïi<br /> ung thö (Steinmetz va Potter, 1991; Block et al.,<br /> 1992). Flavonoides laø thaønh phaàn polyphenolic maø noù<br /> ñöôïc phaân boá moät caùch roäng raõi ôû nhieàu loaïi rau quaû<br /> vaø traùi caây (Leighton et al., 1992; Messinaet al.,<br /> 1994; Stavric., 1994). Glycone flavonoids thoâng<br /> thöôøng nhaát ñöôïc tìm thaáy trong cheá ñoä aên laø<br /> Quercetin, Kaempferol, Rutin vaø Robinin (Anton et<br /> al., 1988). Trong soá ñoù Quercetin ñaõ ñöôïc nghieân cöùu<br /> moät caùch roäng raõi (Constantinou et al., 1995; Leeet<br /> al., 1998; Aligiannis et al., 2001. Hoaït ñoäng cuûa<br /> Flavonoids chaúng haïn nhö Kaempferol vaø quercetin<br /> ñöôïc ñieàu hoaø bôûi söï taùc ñoäng qua laïi vôùi caùc vò trí keát<br /> noái vôùi estrogen loaïi II ñaõ ñöôïc ñeà caäp tôùi (Ranelletti<br /> et al., 1992). Trong in vitro, Kaempferol öùc cheá söï<br /> taêng tröôûng cuûa teá baøo ung thö maùu ôû ngöôøi (Dimas<br /> et al., 2000) vaø teá baøo NIH3T3 bieân naïp vôùi v-H-ras<br /> (Kuo et al., 1994), nhöng laïi baûo veä teá baøo PC12 vaø<br /> T47D khoûi ñoäc toá gaây ra bôûi β-amyloid (Roth et al.,<br /> 1999.)<br /> Ñeå hieåu saâu hôn veà cô cheá phaân töû cô baûn cuûa<br /> Kaempferol, trong taøi lieäu naøy chuùng toâi chöùng minh<br /> raèng Kaempferol ñaõ öùc cheá söï sinh tröôûng vaø gaây cheát<br /> teá baøo ôû teá baøo ung thö phoåi A549 thoâng qua haøng<br /> loaït söï thay ñoåi ôû möùc ñoä phaân töû nhö öùc cheá hoaït<br /> hoùa Akt, gia taêng caùc protein pro-apoptosis (Bax va<br /> Bad), giaûm suùt protein anti-apoptosis (Bcl-2 va Bcl-xL)<br /> vaø söï hoaït hoùa vaø keùo daøi cuûa MAPK laø chuû yeáu.Maët<br /> khaùc duøng chaát öùc cheá cuûa MAPK –U0126 ñaõ ngaên<br /> <br /> 74<br /> <br /> chaën hoaït hoùa cuûa MEK-MAPK vaø laøm maát ñi ñoäc toá<br /> teá baøo cuûa Kaempferol. Ñieàu naøy khaúng ñònh theâm<br /> MEK-MAPK ñoùng vai troø then choát trong söï cheát teá<br /> baøo do Kaempferol ôû teá baøo A549.<br /> <br /> VAÄT LIEÄU VAØ<br /> NGHIEÂN CÖÙU<br /> <br /> CAÙC<br /> <br /> PHÖÔNG<br /> <br /> PHAÙP<br /> <br /> Nuoâi caáy teá baøo vaø ñieàu trò<br /> Caùc teá baøo bieåu moâ phoåi A549 ñöôïc nuoâi caáy<br /> trong moâi tröôøng RPMI 1640 boå sung vôùi 10% FCS,<br /> 1% khaùng sinh PN ôû nhieät ñoä 37°C vaø 5% CO2. Ñeå<br /> nghieân cöùu nhöõng aûnh höôûng cuûa Kaempferol, teá baøo<br /> A549 ñöôïc nuoâi caáy vôùi nhöõng maät ñoä khaùc nhau vaø<br /> ñeå chuùng qua 24 giôø. Sau ñoù caùc teá baøo ñöôïc ñieàu trò<br /> vôùi nhöõng noàng ñoä gia taêng khaùc nhau cuûa<br /> Kaempferol töø 17.5 cho tôùi 70 μM trong moâi tröôøng<br /> nuoâi caáy khoâng coù huyeát thanh (Serum free media).<br /> Khi ñaït ñöôïc thôøi gian thích hôïp, caùc teá baøo seõ ñöôïc<br /> thu thaäp vaø xöû lí vôùi nhöõng phöông phaùp khaùc nhau.<br /> Kó thuaät hình thaùi hoïc<br /> Ñeå quan saùt hình aûnh cuûa caùc teá baøo cheát. Sau 24<br /> giôø ñieàu trò vôùi nhöõng noàng ñoä khaùc nhau caùc teá baøo<br /> ñöôïc coá ñònh vôùi dung moâi formadehyde 4% khoaûng 1<br /> giôø, sau ñoù ñöôïc röûa vôùi dung dòch phosphate buffer<br /> saline. Söï cheát teá baøo ñöôïc phaùt hieän baèng xeùt<br /> nghieäm vôùi boä kit TUNEL (terminal deoxynucleotidyl<br /> transferase mediated dUTP nick-end labeling).<br /> Kæ thuaät ño löôøng tæ leä teá baøo sinh<br /> tröôûng vaø teá baøo coù khaû naêng soáng<br /> Baèng caùch suû duïng boä kit ELISA (Enzyme Linked<br /> ImmunoSorbent Assay) cho vieäc phaùt hieän teá baøo<br /> sinh tröôûng vaø xeùt nghieäm MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium<br /> bromide) cho caùc teá baøo coù khaû naêng soáng.<br /> Kæ thuaät thaám western<br /> Duøng ñeå quan saùt ôû möùc ñoä phaân töû. Caùc teá baøo<br /> ñieàu trò sau 24 giôø, ñöôïc thu naïp vaø chieát xuaát phaân töû<br /> protein vôùi dung dòch tan(lysis buffer) vaø söû duïng kæ<br /> thuaät thaám western (Western Blot). Sau ñoù caùc maøng<br /> lai ñöôïc uû vôùi nhöõng khaùng theå thích hôïp.<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Phaân tích thoáng keâ<br /> <br /> KEÁT QUAÛ<br /> Baèng nhöõng kæ thuaät treân chuùng toâi ñaõ xaùc ñònh<br /> ñöôïc aûnh höôûng cuûa Kaempferol treân söï sinh tröôûng<br /> cuûa teá baøo trong in vitro.Kaempferol kieàm haõm söï<br /> taêng sinh cuûa teá baøo phuï thuoäc vaøo thôøi gian vaø lieàu<br /> löôïng.<br /> a<br /> <br /> a<br /> <br /> 24H<br /> 48H<br /> b<br /> <br /> A<br /> <br /> b<br /> <br /> Hình 2 Söï gaây ra teá baøo cheát do Kaempferol baèng xeùt<br /> nghieäm hình aûnh hoïc<br /> <br /> 1<br /> (450 nm)<br /> <br /> The rate of BrdU Incorporation<br /> <br /> 1 .5<br /> <br /> c<br /> <br /> c<br /> <br /> 0 .5<br /> <br /> d<br /> <br /> c<br /> d<br /> e<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 1 7 .5<br /> <br /> 35<br /> <br /> 70<br /> <br /> 5 2 .5<br /> <br /> K a e m p f e r o l ( µ M / m l)<br /> <br /> a<br /> 24H<br /> 48H<br /> <br /> 1 .4<br /> <br /> B<br /> <br /> a<br /> Absorbance ( 570 nm)<br /> <br /> a<br /> <br /> α-tubulin<br /> <br /> Bax<br /> Fold changed<br /> (Bax)<br /> <br /> b<br /> <br /> 1 .1<br /> b<br /> <br /> A<br /> B<br /> 1<br /> <br /> 1.15<br /> <br /> 2.7<br /> <br /> 3.29<br /> <br /> 3.41<br /> <br /> 3.78<br /> <br /> 4.73<br /> <br /> c<br /> 0 .8<br /> <br /> c<br /> <br /> Bad<br /> <br /> c<br /> d<br /> d<br /> <br /> 0 .5<br /> 0<br /> <br /> 1 7 .5<br /> <br /> 35<br /> <br /> 5 2 .5<br /> <br /> 70<br /> <br /> Fold changed<br /> (Bad)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1.25<br /> <br /> 3.36<br /> <br /> C<br /> <br /> K a e m p f e r o l ( µ M /m l)<br /> <br /> Bcl-2<br /> <br /> Hình 1 AÛnh höôûng cuûa Kaempferol treân söï sinh<br /> tröôûng vaø khaû naêng soáng cuûa teá baøo.<br /> <br /> Sau 48 giôø ñieàu trò cho thaáy maät ñoä teá baøo giaûm<br /> xuoáng tuøy thuoäc vaøo lieàu löôïng thuoác ñöôïc quan saùt<br /> hình 1B. Hình 2 A cho thaáy söï thay ñoåi hình thaùi hoïc<br /> cuûa teá baøo vaø maøng teá baøo bò boùng nöôùc (blebbing) laø<br /> nhöõng ñaëc tính cuûa teá baøo cheát. Teá baøo cheát ñöôïc xaùc<br /> ñònh baèng xeùt nghieäm TUNEL cho thaáy söï vôõ ra töøng<br /> maõnh DNA vaø keát tuï cuûa nhaân teá baøo ôû hình 2B<br /> Do söï cheát cuûa teá baøo ôû nhöõng teá baøo ñoäng vaät coù<br /> vuù cho thaáy ñöôïc ñieàu hoøa bôûI caùc protein Bax, Bad,<br /> Bcl-2 va Bcl-xL. Ñeå thöû nghieäm khaû naêng naøy chuùng<br /> toâi duøng kæ thuaät thaám western vaø keát quaû ñaït ñöôïc<br /> cho thaáy Kaempferol gaây gia taêng ñoái vôùi bieåu hieän<br /> cuûa nhöõng protein pro-apoptosis Bax vaø Bad (hình 3B<br /> vaø 3C). Söï gia taêng ñöôïc quan saùt roû nhaát ôû noàng ñoà<br /> 52.5 vaø 70μM.<br /> <br /> D<br /> 1<br /> <br /> 0.52<br /> <br /> Fold changed<br /> (Bcl-xL)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.46<br /> <br /> 0.24<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> 0.12<br /> <br /> Kaempferol (µM/ml)<br /> <br /> 0<br /> <br /> 17.5<br /> <br /> 35<br /> <br /> 52.5<br /> <br /> 70<br /> <br /> Fold changed<br /> (Bcl-2)<br /> <br /> 0.31<br /> <br /> 0.27<br /> <br /> 0.19<br /> <br /> Bcl-xL<br /> <br /> E<br /> <br /> Hình 3 AÛnh höôûng cuûa kaempferol treân bieåu hieän<br /> protein Bcl-2, Bax, Bad vaø Bcl-xL ôû teá baøo A549 baèng<br /> kæ thuaät western blot.<br /> <br /> Vôùi soá laàn laø 3.29- vaø 3.41- ñoái vôùi Bax, 3.78- vaø<br /> 4.73 -laàn ñoái vôùi Bad khi ñöôïc so saùnh vôùi chaát kieåm<br /> soaùt (control). Ngöôïc laïi caùc protein choáng laïi söï cheát<br /> teá baøo nhö Bcl-2 vaø Bcl-xL ñöôïc cho thaáy giaûm ñi theo<br /> noàng ñoä cuûa thuoác (hình 3D vaø 3E).<br /> Bieåu ñoà PI-3 kinase ñöôïc hoaït hoùa bôûi moät soá caùc<br /> chaát taêng tröôûng khaùc nhau ñaõ ñöôïc laøm saùng toû. Caùc<br /> xeùt nghieäm gaàn ñaây treân tín hieäu cheát cuûa teá baøo ñaõ<br /> chöùng minh söï quan troïng cuûa PI-3 kinase vaø chaát<br /> döôùi doøng cuûa noù Akt.<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br /> 75<br /> <br /> Nghieân cöùu Y hoïc<br /> <br /> Y Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 8 * Phuï baûn cuûa Soá 1 * 2004<br /> <br /> α-tubulin<br /> <br /> A<br /> <br /> PI-3K<br /> <br /> B<br /> <br /> Phospho-Akt<br /> Fold changed<br /> (pAkt)<br /> <br /> hoùa cuûa caspase 7 ñöôïc quan saùt ôû noàng ñoä thaáp vaø<br /> taêng daàn theo vôùi noàng ñoä ôû hình 5B vaø 5C.<br /> <br /> C<br /> 1<br /> <br /> 0.75<br /> <br /> 0.14<br /> <br /> 0.18<br /> <br /> 0.076<br /> <br /> D<br /> <br /> Akt<br /> Fold changed<br /> (Akt)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.92<br /> <br /> 0.65<br /> <br /> Kaempferol (µM/ml)<br /> <br /> 0<br /> <br /> 17.5<br /> <br /> 35<br /> <br /> 0.42<br /> <br /> 0.33<br /> <br /> 52.5<br /> <br /> 70<br /> <br /> Hình 4 Nhöõng aûnh höôûng cuûa Kaempferol leân caùc<br /> phaân töû protein p85 PI-3K vaø phospho Akt ôû teá baøo<br /> A549 baèng kæ thuaät western blot.<br /> <br /> Töø hình 4B vaø 4C keát quaû cho thaáy bieåu hieän cuûa<br /> p85 PI-3 kinase vaø chaát döôùi doøng cuûa noù Akt<br /> giaûm.Ñieàu naøy chöùng toû Kaempferol coù aûnh höôûng<br /> ñeán söï öùc cheá cuûa nhöõng protein naøy.<br /> <br /> α-tubulin<br /> <br /> A<br /> <br /> Cleavedcaspase 7<br /> <br /> B<br /> <br /> Foldchanged<br /> (Cleavedcaspase 7)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1.25<br /> <br /> 2.51<br /> <br /> 3.71<br /> <br /> 5.61<br /> <br /> CleavedPARP<br /> <br /> 89kD<br /> <br /> Foldchanged<br /> (CleavedPARP)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2.1<br /> <br /> 5.98<br /> <br /> 9.57<br /> <br /> 11.5<br /> <br /> Kaempferol (µM/ml)<br /> <br /> 0<br /> <br /> 17.5<br /> <br /> 35<br /> <br /> 52.5<br /> <br /> 70<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 5 Nhöõng aûnh höôûng cuûa Kaempferol leân caùc<br /> phaân töû protein cleavage caspase 7 vaø PARP ôû teá baøo<br /> A549 baèng kæ thuaät western blot.<br /> <br /> Moät ñieàu cuõng ñöôïc chöùng minh laø söï taùch ra cuûa<br /> protein PARP (poly ADP-ribo polymerase) laø söï kieän<br /> sinh hoùa xaûy ra sôùm trong quaù trình teá baøo cheát. Do<br /> bôûi cleaved PARP laø daáu xaùc nhaän tieâu chuaån<br /> (hallmark) cuûa söï hoaït hoùa heä caspase, chuùng toâi xaùc<br /> ñònh xem cô cheá cuûa teá baøo cheát coù ñöôïc hoaït hoùa khi<br /> ñieàu trò vôùi Kaempferol hay khoâng,caùc khaùng theå ñöôïc<br /> xeùt nghieäm sau ñoù vaø keát quaû cho thaáy söï taùch rôøi cuûa<br /> phaân töû protein 89 kDa (cleaved PARP) vaø söï hoaït<br /> <br /> 76<br /> <br /> Hình 6. AÛnh höôûng cuûa kaempferol treân caùc phaân töû<br /> protein phosphorylated MEK1/2, MAPK, vaø<br /> phosphorylated p44/42 MAP kinase (Thr202/Tyr204)<br /> vaø phospho C-Jun (Ser63) ôû teá baøo A549 baèng kæ thuaät<br /> western blot.<br /> <br /> MAPK coù theå gaây söï cheát teá baøo vaø döï ñoaùn ñoä<br /> nhaïy hoùa trò cuûa khoái u (Akata et al., 1995; Sabsbury<br /> et al., 1997; Lieu et al., 1998; Chen et al., 1999; Koo<br /> et al., 1999; Petrache et al., 1999; Alechman et al.,<br /> 2000). Ñeå nghieân cöùu öùc cheá söï taêng tröôûng vaø teá baøo<br /> cheát coù phaûi do Kaempferol hay khoâng,kæ thuaät thaám<br /> western cuøng vôùi khaùng theå khaùng phospho-MAPK vaø<br /> MAPK ñöôïc thöïc hieän.Keát quaû cho thaáy ñieàu trò teá baøo<br /> A549 vôùi nhöõng noàng ñoä khaùc nhau cuûa Kaempferol<br /> sau 48 giôø daån ñeán söï phospho hoùa cuûa MAPK tuøy<br /> thuoäc vaøo noàng ñoä (hình 6B). MEK1/2 cuõng ñöôïc<br /> phospho hoùa gioáng nhö MAPK (hình 6D). Bôûi vì cJun laø ñích hoaït ñoäng cuûa MAPK,neân möùc ñoä<br /> phospho cuûa c-Jun cuõng ñöôïc xaùc ñònh. Keát quaû cho<br /> thaáy c-Jun cuõng phospho gioáng nhö söï hoaït hoùa cuûa<br /> MAPK (hình 6F), ñieàu naøy cho thaáy söï phospho cuûa<br /> MAPK do MEK1/2 laøm gia taêng hoaït ñoäng cuûa MAPK.<br /> Do söï hoaït hoùa cuûa JNK vaø p38 cuõng ñöôïc cho laø<br /> <br /> Chuyeân ñeà Hoäi nghò Khoa hoïc Kyõ thuaät BV. Bình Daân 2004<br /> <br />