ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI
ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN
KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B
Tóm Tắt
Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa
vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác
nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Việc xác định kiểu gen của HBV ngày
càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng
lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B.
Bên cạnh đó, vấn đề phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng
Lamivudine trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta
mới có lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B. Chúng
tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với
bộ thuốc thử TruGene (Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng
thuốc Lamivudine đã được công bố của HBV. Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến
tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực
hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi
B mãn tính đang điều trị Lamivudine. Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25
trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4. Tất cả các
trường hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0 %) và
HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %). Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B
và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là 46 trường
hợp (37,7 %). Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng
Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I (11,5%);
L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V
& V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%). Trong
76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng
Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến
kháng Lamivudine. Tất cả bệnh nhân đang điều trị Lamivudine với thời gian điều
trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4
năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3,
4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3%. Qua kết quả bước đầu
đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan
trọng trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện
được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều
trị tối ưu.
Summary
APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS
GENOTYPES AND MUTATIONS
Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into 8 genotypes A through H based on
an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and
the different distribution of various genotypes in different continents, countries.
The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes
relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment
responses of Hepatitis B. Additionally, the discovery of resistance to medicines in
HBV treatment plays a very important role from which we can have an
appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment.We have applied the
Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to
identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation.
From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented
sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine
treatment in which: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females
(take 20.5%), medium age: 33.9±10.4. All cases are HBVDNA [+] in which: 100
cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%). There are only
two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are
genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%).
Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established
proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%);
L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I
(12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%).
There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in
46 cases of genotypes C (63.0%). All patients are on Lamivudine treatment with
average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment
period of 1, 2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18. The proportion of developing mutations
after 1, 2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%;
83.3%.
We have found that - with above preliminary results - the sequencing plays a very
important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations. From
those results we can approach an optimal treatment course.
I. Đặt vấn đề:
Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp phần đáng
kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh. Cho đến nay đã có 4 loại thuốc
điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý
thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là Interferone, Lamivudine, Adefovir và
Entecavir, trong đó Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu
tiên. Tuy nhiên trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề
đột biến kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng
cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine.
Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV Genotype).
Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh
giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm. Sự phân
bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ
có các kiểu gen vượt trội khác nhau.
Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng
thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật
giải trình tự chuỗi (Sequengcing) để đồng thời vừa xác định các đột biến kháng
thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định được kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen
nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá các loại và tỉ lệ đột biến kháng
Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine.
Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh nhân Việt
Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh
nhân điều trị Lamivudine liên tục.
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
1, Đối tượng nghiên cứu: