zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Ứng dụng kỹ thuật phân tử phát hiện đột biến gen α Globin gây bệnh Hemoglobin H

Chia sẻ: ViBandar2711 ViBandar2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Báo xấu

68
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh huyết sắc tố H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh α thal với ba trên bốn gen α globin của cơ thể bị đột biến. Mục tiêu: Phát hiện các đột biến gen α globin gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật phân tử phát hiện đột biến gen α Globin gây bệnh Hemoglobin H

tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Ngô Thị Tuyết Nhung*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Diễm Ngọc*, ,Nguyễn Thị Phương Mai*, Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Nguyễn Thị Mai Hương** * Khoa Di truyền và Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung ương ** Khoa Huyết học lâm sàng- Bệnh viện Nhi Trung ương TÓM TẮT Alpha thalassemia (α thal) là một trong những bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất trên thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có khu vực Đông Nam Á[1,2]. Bệnh huyết sắc tố H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh α thal với ba trên bốn gen α globin của cơ thể bị đột biến. Mục tiêu: Phát hiện các đột biến gen α globin gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhi được chẩn đoán mắc HbH dựa trên lâm sàng tại Bệnh viện Nhi TƯ. Các kỹ thuật phân tử bao gồm: Multiplex Gap PCR, CARMS PCR , giải trình tự gen, MLPA để phát hiện đột biến trên gen α globin. Kết quả: Tỷ lệ phát hiện đột biến là 40/40(100%). Kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đã phát hiện 33/40(82,5%) bệnh nhân có các kiểu gen như sau: (--SEA/-HbCs); (--SEA/-α3,7); (-- SEA/-α4.2); (-- SEA/-HbQs), với tỷ lệ lần lượt là: 17/40 (42,5%);10/40(25%); 4/40(10%); 2/40 (5%). Kỹ thuật MLPA phát hiện 1/40 (2,5%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-HbA1) và 4/40 (10%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-c.2delT), 1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến (--SEA/- c.92G>A),1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến(--SEA/- c.426A>T) được phát hiện bằng phương pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2. Kết luận: 100% bệnh nhân HbH được phát hiện đột biến trên gen α globin bằng bằng kỹ thuật phân tử, trong đó có ba đột biến hiếm gặp. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong điều trị, tiên lượng bệnh, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh HbH. Từ khóa: HbH, α Thalassemia, Multiplex Gap PCR, CARMS PCR, giải trình tự gen, MLPA. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ đột biến mất đoạn và đột biến không mất đoạn. Thông thường, 90% bệnh này là do các đột biến Alpha thalassemia là bệnh di truyền đơn gen mất đoạn gen gây nên do sự kết hợp giữa đột phổ biến, là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu biến mất hai gen α globin trên cùng một NST 16 máu, tan máu ở trẻ em, do đột biến gen α-globin và đột biến mất 1 gen α globin trên NST 16 còn nằm trên cánh ngắn NST 16 (16p13.3) quy định, lại. Trong đó, các kiểu mất đoạn gen dạng SEA gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin [1]. (--SEA), Thailand(--THAI), Philipin (--FIL), α 4.2 (-α4.2), Người bình thường có tổng số 4 gen α globin, α3.7(α3.7) là những kiểu mất đoạn thường gặp nằm trên hai nhiễm sắc thể (NST) số 16 tương nhất trong quần thể người Trung Quốc và Đông đồng, trong đó mỗi NST 16 có 2 gen α globin (αα/ Nam Á [ 7,8]. Bệnh HbH không do mất đoạn gen αα). Trong bệnh HbH, một NST 16 mất hoàn toàn chiếm khoảng 10%. Thể bệnh này là do sự kết cả hai gen α globin, và ở NST 16 tương đồng còn hợp giữa mất hai gen α globin trên cùng một lại mất hoặc đột biến 1 gen α globin. Hậu quả của NST 16 và một đột biến điểm trên một gen α sự thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin này dẫn đến globin của NST 16 còn lại, trong đó các đột biến sự tăng tổng hợp chuỗi β globin, tạo thành các điểm Hb Constant Spring (HbCs), Hb Qzuong Sze chuỗi β4, là Hemoglobin H (HbH)[1,2]. (HbQs) tại gen α2 là các đột biến điểm rất thường Bệnh HbH có thể được chia thành hai thể, dựa gặp ở quần thể người Trung Quốc và Đông Nam vào hai loại đột biến có thể gặp trên gen α globin: Á[4,5,8]. 80
phần nghiên cứu Bệnh HbH gây thiếu máu trên lâm sàng ở Refractory Mutation System-PCR) nhiều mức độ khác nhau, có thể có hoặc không Kỹ thuật CARMS PCR sàng lọc hai đột biến phụ thuộc truyền máu, hoặc tử vong do biến điểm HbCs (Hb Constant Spring-283bp) và HbQs chứng truyền máu. Do đó, việc xác định loại đột (Hb Quong Sze-238 bp). biến gây bệnh HbH đóng vai trò rất quan trọng 2.2.4. Kỹ thuật giải trình tự gen trong vấn đề tiên lượng mức độ của bệnh để đưa Giải trình tự gen được thực hiện trên máy ABI ra các quyết định điều trị phù hợp, đặc biệt trong 3130. Kết quả được phân tích bằng phần mềm việc tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. Do Chromas và Chromas Pro, sau đó được đưa lên đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục Ngân hàng gene (Gene Bank) để so sánh với trình tiêu: Xác định các đột biến trên gen α globin gây tự chuẩn. Kỹ thuật này được sử dụng để sàng lọc bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử. các đột biến điểm khác trên gen HbA1, HbA2. 2.2.5. Kỹ thuật Multiplex Ligation-Dependent 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU probe Amplification (MLPA) 2.1. Đối tượng Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực hiện Nghiên cứu được thực hiện trên 40 bệnh nhi bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại P140-B4 để phát hiện các đột biến mất đoạn lớn. Kết quả tại Bệnh viện Nhi Trung ương, từ tháng 1/2016 được phân tích trên phần mềm COFALYSER. đến tháng 8/2016. 2.2. Phương pháp 3. KẾT QUẢ 2.2.1. Kỹ thADN được tách trực tiếp từ mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA) bằng Kit QiaAmp Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện DNA mini kit (Qiagen, Đức). 40/40 mẫu mang đồng thời hai đột biến gây bệnh HbH, trong đó: 33/40mẫu phát hiện bằng 2.2.2. Kỹ thuật Multiplex Gap Polymerase Chain kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR, chiếm Reaction( Multiplex Gap PCR) 82.5%, 07/40 mẫu phát hiện bằng phương pháp Kỹ thuật Multiplex Gap PCR được thực hiện tại giải trình tự gen HbA, HbA2 và 01/40 mẫu được Khoa Di truyền và Sinh học phân tử Bệnh viện xác định bằng kỹ thuật MLPA, chiếm 2%. Có 17 Nhi Trung ương để sàng lọc 7 loại đột biến mất mẫu mang kiểu gen (--SEA/-HbCs), chiếm 42,5%, đoạn 1 gen và 2 gen thường gặp của quân thể 10 mẫu mang kiểu gen (--SEA/- α3,7), chiếm 25%, người châu Á: SEA (--SEA) (1349 bp), α 4.2 (-α4.2) 04 mẫu (--SEA/-c.2delT), 01 mẫu mang kiểu gen (1628 bp), α 3.7(-α3.7) (1800 bp), Philipin (--FIL) (560 (--SEA/-c.92G>A), chiếm 2.5%, 01 mẫu mang kiểu bp), Thailand(--THAI) (411 bp). gen (--SEA/- c.426A>T) chiếm 2,5% và 01 mẫu 2.2.3. Kỹ thuật CAMRS PCR (Combine Amplification mang đột biến (--SEA/HbA1) chiếm 2,5%. Bảng 1. Kiểu gen và tỷ lệ đột biến của bệnh nhân HbH Kiểu gen bệnh nhân HbH Số lượng bệnh nhân Tỷ lệ % (n=40) Đột biến mất đoạn 15 37,5 (--SEA/-α3.7) 10 25 (--SEA/-4.2) 4 10 (--SEA/-HbA1) 1 2,5 Đột biến không mất đoạn 25 62,5 (--SEA/-HbCs) 17 42,5 (--SEA/-c2delT) 4 10 (--SEA/-HbQs) 2 5 (--SEA/-c.92G>A) 1 2,5 (--SEA/- c.426A>T) 1 2,5 Tổng số 40 81
tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 Hình 1. Xác định đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex Gap PCR M: Maker 1kp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng dị hợp tử SEA; 3: Chứng dị hợp tử α3.7; 4: Chứng bệnh SEA/ α4.2; 5: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 6: ADN bệnh nhân SEA/ α4.2; 7: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 8: ADN bệnh nhân SEA/ α3.7; 9: Mẫu không chứa ADN. Hình 2. Phát hiện đột biến không mất đoạn bằng kỹ thuật CARMS PCR M: Maker 100bp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng bệnh SEA/HbCs; 3: Chứng bệnh SEA/HbQs; 4: ADN bệnh nhân SEA/HbCs; 5: ADN bệnh nhân SEA/HbQs; 6: ADN bệnh nhân không bị đột biến; 7: Mẫu không chứa AND. Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.2delT Hình 3. Đột biến c.2delT được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen 82
phần nghiên cứu Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.92G>A Hình 4. Đột biến c.92G>A được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.426A>T Hình 5. Đột biến c.426A>T được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến mất đoạn HbA1 Hình 6. Đột biến mất đoạn HbA1 được phát hiện bằng phương pháp MLPA 83
tạp chí nhi khoa 2016, 9, 5 4. BÀN LUẬN không do mất đoạn gen thường có biểu hiện lâm sàng nặng hơn loại do mất đoạn gen [7]. Do đó,việc Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu, có xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trò rất 25/40 (62,5%) người mắc HbH thuộc nhóm đột quan trọng trong vấn đề tiên lượng mức độ của bệnh biến không mất đoạn,15/40 (37,5%) thuộc nhóm để đưa ra các quyết định điều trị phù hợp, đặc biệt đột biến mất đoạn. Người mang kiểu gen (- - SEA/- trong việc tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. HbCs) chiếm tỷ l ệ cao nhất: 42,5%, người mang kiểu gen (- - SEA/- α 3.7): 25%; người mang kiểu gen (- - SEA/ 5. KẾT LUẬN HbQs): 5%, (--SEA/-α4.2): 10%. Kết quả này phù Tỷ lệ phát hiện đột biến là 40/40 (100%). Kỹ hợp với một số nghiên cứu khác của tỉnh Quảng thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đã phát Đông, Trung Quốc. Trong 435 bệnh nhân HbH hiện 33/40(82,5%) bệnh nhân, trong đó kiểu gen được nghiên cứu tại tỉnh Quảng Đông, có 328/435 (--SEA/-HbCs) chiếm tỷ lệ cao nhất:17/40 (42,5%). (75,6%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến Kỹ thuật MLPA phát hiện 1/40 (2,5%) bệnh nhân không mất đoạn, 107/435 (25,4%) thuộc nhóm mang đột biến (-- SEA/- HbA1) và 4/40 (10%) bệnh đột biến mất đoạn[ 4,6]. Một nghiên cứu khác nhân mang đột biến (-- SEA/- c.2delT), 1/40(2,5%) tại Thái Lan, người mang kiểu gen (- - SEA/HbCs): bệnh nhân mang đột biến (--SEA/-c.92G>A) và 181/355 (51%), người mang kiểu gen (- - SEA/-α 3,7): (--SEA/-c.426A>T) được phát hiện bằng phương 135/355 (38%), tỷ lệ người mang kiểu gen (--SEA/HbQs), pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2. (--SEA/-α4,2) lần lượt là: 5/355 (1,4%) và 2/355 Việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng (0,6%). Tuy nhiên, kết quả này có đặc điểm khác vai trò rất quan trọng trong vấn đề tiên lượng biệt so với nhiều nghiên cứu khác [1,4,8]. Do đó, mức độ của bệnh để đưa ra các quyết định điều để có thể kết luận về tỷ lệ phân bố kiểu gen của trị phù hợp, đặc biệt trong việc tư vấn di truyền bệnh nhân HbH, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành và chẩn đoán trước sinh, giảm nguy cơ sinh con nghiên cứu khảo sát trên một cỡ mẫu lớn hơn. bị bệnh, làm tăng chất lượng cuộc sống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO kỹ thuật Multiplex Gap PCR và CARMS PCR đầu tiên để sàng lọc 7 đột biến có tần suất gặp cao 1. Amy Yuk-Yin Chan, Chi-Chiu So, Edmond nhất ở người Đông Nam Á: SEA, α 3.7, α4,2, Shiu-Kwan Ma et al. A laboratory strategy for Thailand, Philipin, HbCs, HbQs, phát hiện được genotyping haemoglobin H disease in the Chinese. 33/40(82,5%) mẫu đều mang 2 đột biến, 7 mẫu J Clin Pathol 2007; 60: 931–934. chỉ phát hiện được 1 đột biến mất đoạn 2 gen 2. Higgs DR, Vickers AOM, Wilkie I-M, et al. A SEA. Trong trường hợp này chúng tôi tiến hành review of the molecular genetics of the human giải trình tự gen và MLPA để tìm đột biến còn lại. a-globin gene cluster. Blood1989;73:1081–104. Đối với 7 mẫu mới phát hiện 1 đột biến (SEA), 3. Liebhaber SA. A-Thalassemia. Hemoglobin chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự gen phát 1989; 13: 685–731. hiện 4 đột biến điểm c.2delT(ATG>A-G), 1 đột biến 4. Guangxi province, Southern China: clinical review of 357 patients.Acta Haematol. điểm c.92G>A,1 đột biến điểm c.426A>T và sử 2010; 124(2): 86–91. dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mât đoạn 5. Chen FE, Ooi C, Ha SY, et al. Genetic and 1 gen HbA1. Đặc biệt đột biến điểm c.426A>T clinical features of hemoglobin H. (p.Term143Tyr) là đột biến điểm đầu tiên gây bệnh 6. Yin XL, Zhang XH, Zhou TH, et al. Hemoglobin Hemoglobin Pakse được phát hiện ở mức độ phân H disease in disease in Chinese patients.N Engl J tử tại Việt Nam. Phát hiện này bước đầu mang Med2000;343:544–50. nhiều ý nghĩa, đóng vai trò quan trọng trong việc 7. Chan Pui Wah Vicky. (2003). “Molecular xác định các đột biến hiếm gặp và đột biến mới. Genetics of HbH Disease in Hong Kong Chinese”. Bệnh HbH là bệnh tan máu mạn tính ở nhiều Thesis submitted for the Degree of Master Science, mức độ khác nhau. Dựa vào hai loại đột biến có thể Dept of Pathology, Hong Kong University. gặp trên gen α globin, bệnh HbH được chia thành 8. Fang J, Chen L, Zeng R, Tian Q,et al. The Hb H hai thể: đột biến mất đoạn (deletional type) và đột disease genotypes in Southern China. Hemoglobin. biến không mất đoạn (non-deletional type). Bệnh 2014; 38(1): 76-8. 84

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.