Ứng dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng định tính đương quy trong thực phẩm chức năng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỚP MỎNG<br /> ĐỊNH TÍNH ĐƯƠNG QUY TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG<br /> Quách Thanh Tâm*, Phan Bích Hà *, Tân Hoàng**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Đương quy có tên khoa học Angelica sinensis (Oliv.) Diels., là một trong những dược liệu quý<br /> đã được con người sử dụng từ rất lâu. Hiện nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm được nhà sản xuất công bố<br /> là thực phẩm chức năng có chứa đương quy. Để bảo vệ lợi ích người tiêu dùng, công tác xét nghiệm đương quy<br /> nhằm xác nhận chất lượng và hiệu quả sử dụng của thực phẩm chức năng là rất cần thiết.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Định tính đương quy trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lớp<br /> mỏng.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát tìm điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu, sắc ký lớp mỏng cũng<br /> như tính chọn lọc và giới hạn phát hiện của phương pháp.<br /> Kết quả nghiên cứu: Quy trình định tính đương quy trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp<br /> sắc ký lớp mỏng có giới hạn phát hiện cho mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 21,6 mg/ml và 27 mg/g. Ứng<br /> dụng quy trình phân tích để định tính đương quy trong 9 mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, tất cả<br /> các mẫu đều cho kết quả dương tính.<br /> Kết luận: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, thích hợp cho định tính<br /> đương quy trong thực phẩm chức năng.<br /> Từ khóa: Đương quy, thực phẩm chức năng, sắc ký lớp mỏng.<br /> ABSTRACT<br /> QUALITATIVE ANALYSIS ANGELICA SINENSIS (DONG QUAI) IN FUNCTIONAL FOODS<br /> BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY<br /> Quach Thanh Tam, Phan Bich Ha, Tan Hoang<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 358 - 361<br /> <br /> Background: Angelica sinensis (Dong quai) is one of the precious medicinal herbs has been used as a<br /> traditional medicine in Asia from thousands of years ago. Functional food that manufacturers announced that<br /> contains Angelica sinensis becoming increasingly popular. Therefore, testing of Angelica sinensis to confirm<br /> the quality and efficiency of functional foods are also essential for protection of consumers’ interest.<br /> Objectives: Thin layer chromatography is used for qualitation of Angelica sinensis in functional foods.<br /> Methods: Survey of sample preparation and thin layer chromatography are conducted to acquire the optimal<br /> parameters as well as the selectivity and detection limits of the method.<br /> Results: The qualitative analysis Angelica sinensis in functional foods by thin layer chromatography<br /> method with detection limits for liquid samples and solid samples are 21.6 mg/ml and 27 mg/g respectively. Using<br /> this method for qualitative analysis Angelica sinensis in 9 samples of functional food on the market, all the<br /> samples were positive.<br /> Conclusion: Thin Layer Chromatography shows a simple, inexpensive and adaptive method for qualitative<br /> analysis of Angelica sinensis in functional foods.<br /> <br /> * Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh ** Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Quách Thanh Tâm ĐT: 0908371989 Email: qttamihph@gmail.com<br /> 358 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Keywords: Angelica sinensis, Dong quai, TLC, Functional food.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Đương quy có tên khoa học Angelica sinensis Đối tượng nghiên cứu<br /> (Oliv.) Diels., thuộc họ Hoa tán (Apiaceae). Các sản phẩm dạng lỏng mà nhà sản xuất<br /> Đương quy là vị thuốc thảo dược được dùng công bố là thực phẩm chức năng có chứa<br /> trong đơn thuốc bổ huyết, điều trị kinh nguyệt đương quy.<br /> không đều và các bệnh phụ nữ khác. Sản phẩm<br /> Các sản phẩm dạng rắn mà nhà sản xuất<br /> này được bán rộng rãi như thuốc bổ để chăm sóc<br /> công bố là thực phẩm chức năng có chứa<br /> sức khỏe phụ nữ ở Châu Á và làm thực phẩm<br /> đương quy.<br /> chức năng ở Châu Âu và Châu Mỹ. Đương quy<br /> nổi tiếng với tác dụng điều hòa máu, chống oxy Phương pháp nghiên cứu<br /> hóa và điều hòa miễn dịch. Đương quy cũng có Phương pháp<br /> tác dụng chống ung thư, cải thiện trí nhớ, chống Định tính đương quy trong các sản phẩm<br /> phóng xạ và bảo vệ thần kinh. Các nghiên cứu dạng lỏng, dạng rắn được nhà sản xuất công bố<br /> hóa thực vật trên cây này đã phát hiện được các là thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc<br /> acid hữu cơ, các phthalide, các polysaccharide và ký lớp mỏng. Phương pháp này có ưu điểm là<br /> các chất chuyển hóa khác. Dựa trên các nghiên đơn giản, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, thích<br /> cứu trên động vật và thử nghiệm lâm sàng gần hợp để định tính hợp chất(1).<br /> đây, đương quy đã được dùng trong điều trị các<br /> Trong trường hợp nghi ngờ, phương pháp<br /> bệnh phụ khoa, bệnh mạch máu não, bệnh tim,<br /> sắc ký khí ghép khối phổ được sử dụng để<br /> các bệnh về hệ thống thần kinh và triệu chứng<br /> khẳng định(3).<br /> liên quan đến thận(1,2).<br /> Dụng cụ<br /> Hiện nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm<br /> được nhà sản xuất công bố là thực phẩm chức Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck<br /> năng có chứa đương quy. Bên cạnh việc kiểm tra 1055540001).<br /> an toàn vệ sinh thực phẩm, công tác xét nghiệm Ống vi quản, bình khai triển, bình lóng 50 mL,<br /> các hoạt chất sinh học để xác nhận chất lượng và erlen cổ nhám 100 mL, chén sứ 50 mL.<br /> hiệu quả sử dụng của thực phẩm chức năng Thiết bị<br /> cũng rất cần thiết. Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ: Agilent<br /> Trên cơ sở các tài liệu tham khảo, chúng tôi GC 7890A và MS 5975C (trong trường hợp cần<br /> tiến hành thực hiện triển khai quy trình định khẳng định).<br /> tính đương quy trong thực phẩm chức năng Điều kiện chạy máy<br /> bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.<br /> Điều kiện sắc ký<br /> Mục tiêu nghiên cứu Khí mang: Helium: 99,999%, tốc độ dòng: 1<br /> Ly trích đương quy trong mẫu thực phẩm mL/phút.<br /> chức năng.<br /> Cột sắc ký: DB-5: 30m; ID: 0,25 mm; bề dày<br /> Định tính đương quy bằng phương pháp sắc film: 0,25 m.<br /> ký lớp mỏng.<br /> Nhiệt độ cột: Nhiệt độ đầu 50oC. Tăng lên<br /> Định tính đương quy bằng phương pháp sắc 180oC với tốc độ gia nhiệt 4oC/phút. Tăng lên<br /> ký khí ghép khối phổ trong trường hợp cần 300oC với tốc độ gia nhiệt 20oC/ phút.<br /> khẳng định.<br /> Tiêm mẫu: Chia dòng 1:10, giữ 1 phút; thể<br /> tích mẫu tiêm: 2L.<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 359<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016<br /> <br /> Nhiệt độ bộ phận tiêm mẫu: 320oC. chiết, cho bay hơi đến khô, sau đó hòa tan cặn<br /> Điều kiện khối phổ với 1 mL ethanol 95%, được dung dịch đối<br /> chiếu cho mẫu lỏng.<br /> Nguồn ion hóa: EI.<br /> Năng lượng ion hóa: 70 eV. Xác định các thông số của phương pháp(4)<br /> Nhiệt độ nguồn ion: 300oC. Khảo sát tính chọn lọc<br /> Chế độ quét phổ: Full Scan. Tiến hành phân tích mẫu trắng, lặp lại 06 lần,<br /> so sánh tín hiệu phân tích của mẫu trắng với<br /> Khoảng khối quét: 50 - 550 amu.<br /> mẫu đối chiếu. Phân tích mẫu thử có đương quy,<br /> Buồng đèn UV CV 415.LS, 365nm Tube. lặp lại 06 lần, so sánh tín hiệu phân tích của mẫu<br /> Hóa chất, chất chuẩn thử với mẫu đối chiếu.<br /> Dược liệu đối chiếu (Herbal reference Khảo sát giới hạn phát hiện<br /> standard) đương quy (Angelica sinensis (Oliv.) Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng<br /> Diels) được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm độ nhỏ khác nhau. Mỗi nồng độ phân tích lặp lại<br /> Thuốc Tp. Hồ Chí Minh. 10 lần, xác định tỷ lệ % dương tính. Giới hạn<br /> Chloroform (Merck 1024422500), Ethyl phát hiện là nồng độ nhỏ nhất cho kết quả<br /> acetate (Merck 1008642500), Ethanol (Merck dương tính 100%.<br /> 1009862500), n-Hexan (Merck 1043672500). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Xử lý mẫu (1)<br /> Kết quả sắc ký lớp mỏng<br /> Dùng dung môi để ly trích đương quy trong<br /> Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 L mỗi<br /> mẫu rắn và mẫu lỏng.<br /> dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Sau khi khai<br /> Mẫu rắn triển, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, để bay<br /> Lấy 4 g mẫu bột, thêm 20 mL ethanol 95 % hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng. Quan sát<br /> ngâm trong 1 giờ, lắc đều. Lọc và cho bay hơi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, trên<br /> dịch lọc đến còn khoảng 1 mL, được dung sắc ký đồ của dung dịch thử phải có 2 vết phát<br /> dịch thử. quang xanh sáng to rõ và các vết màu xanh lơ<br /> Mẫu lỏng (phụ) có cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết<br /> trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.<br /> Lấy 50 mL mẫu cho vào bình lóng, chiết 2 lần<br /> với dung môi cloroform, lấy dịch chiết, cho bay<br /> hơi đến khô, sau đó hòa tan cặn với 1 mL ethanol<br /> 95%, được dung dịch thử.<br /> Dung dịch khai triển<br /> Pha hỗn hợp dung môi n-hexan: ethyl acetat<br /> theo tỷ lệ thể tích 9: 1.<br /> Dung dịch chuẩn<br /> Dung dịch đối chiếu cho mẫu rắn: Lấy 4 g<br /> mẫu bột đương quy (Dược liệu đối chiếu), thêm<br /> 20 mL ethanol 95 % ngâm trong 1 giờ, lắc đều.<br /> Lọc và cho bay hơi dịch lọc đến còn khoảng 1<br /> mL, được dung dịch đối chiếu cho mẫu rắn.<br /> Dung dịch đối chiếu cho mẫu lỏng: Lấy 4 g<br /> mẫu bột đương quy (Dược liệu đối chiếu), Hình 1: Sắc ký lớp mỏng chuẩn đương quy trong<br /> chiết 2 lần với dung môi cloroform, lấy dịch ethanol 95% và cloroform (từ trái sang phải)<br /> 360 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Kết luận dương tính Bảng 2: Kết quả định tính đương quy trong thực<br /> Trên sắc ký đồ, dung dịch thử có 2 vết phát phẩm chức năng<br /> quang xanh sáng to rõ giống như dung dịch đối Mẫu Kết quả<br /> HTTĐB Dương tính<br /> chiếu và có từ 3 đến 5 vết màu xanh lơ (phụ)<br /> PHK Dương tính<br /> giống như dung dịch đối chiếu.<br /> SQĐB Dương tính<br /> Trong trường hợp nghi ngờ, tiến hành chạy MNS Dương tính<br /> sắc ký khí ghép khối phổ với dữ liệu khối phổ PM Dương tính<br /> nhận danh như sau: AD Dương tính<br /> EEWE Dương tính<br /> Bảng 1: Dữ liệu khối phổ nhận danh (identify) các AH T KG Dương tính<br /> cấu tử có trong chuẩn đương quy UBB HH Dương tính<br /> Thời gian lưu Dữ liệu khối phổ Nhận xét: 100% sản phẩm có chỉ tiêu định<br /> (phút) m/z (relative intensity)<br /> tính phù hợp với công bố của nhà sản xuất.<br /> 150(100), 135(74), 118(3), 107(29), 89(4),<br /> 19,460<br /> 77(25), 63(4), 51(6) KẾT LUẬN<br /> +<br /> 190(M ,4), 144(3), 133(100), 134(11),<br /> 29,920<br /> 105(24), 77(9), 51(3) Chúng tôi đã triển khai quy trình định tính<br /> +<br /> 188(M , 21), 160(13), 159(100), 146(32), đương quy trong thực phẩm chức năng với giới<br /> 30,449<br /> 131(21), 103(17), 77(13)<br /> +<br /> 204(M ,34), 175(100), 162(39), 147(21), hạn phát hiện cho mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt<br /> 31,544<br /> 91(16), 73(23), 57(31) là 21,6 mg/mL và 27 mg/g.<br /> +<br /> 188(M , 20), 159(100), 146(32), 131(22),<br /> 31,845<br /> 104(12), 103(20), 77(13) Với kết quả trên, phương pháp này cho phép<br /> 32,274<br /> +<br /> 192(M , 23), 163(3), 135(5), 107(100), 79(22) định tính đương quy trong thực phẩm chức<br /> +<br /> 33,497<br /> 190(M , 66), 161(100), 148(78), 134(15), năng trên thị trường.<br /> 106(32), 105(44), 77(21), 55(33)<br /> +<br /> 190(M , 64), 161(100), 148(72), 134(15),<br /> Ứng dụng quy trình phân tích trên, định tính<br /> 36,007<br /> 106(33), 105(45), 77(23), 55(36) đương quy trong 9 mẫu thực phẩm chức năng<br /> Tính chọn lọc trên thị trường, tất cả các mẫu đều cho kết quả<br /> dương tính.<br /> 100% mẫu trắng khảo sát cho kết quả âm<br /> tính. 100% mẫu thử khảo sát cho kết quả TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> dương tính. 1. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ tư. Nhà<br /> xuất bản Y học Hà Nội, tr.767-768, 949-962.<br /> Giới hạn phát hiện 2. Chen et al (2013). Phytochemical and pharmacological studies<br /> on Radix Angelica sinensis. Chin J Nat Med, 11(6): pp. 577-87.<br /> Giới hạn phát hiện của phương pháp cho<br /> 3. Lao et al (2004). Identification and quantification of 13<br /> mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 21,6 mg/mL components in Angelica sinensis (danggui) by gas<br /> và 27 mg/g. Với giới hạn phát hiện này, chromatography-mass spectrometry coupled with pressurized<br /> liquid extraction. Analytica Chimica Acta, 526: pp. 131-137.<br /> phương pháp trên đủ độ nhạy để định tính 4. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích<br /> đương quy trong nhiều loại thực phẩm chức hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà<br /> năng khác nhau. Nội, tr. 16-21.<br /> <br /> Khảo sát mẫu trên thị trường<br /> Ngày nhận bài báo: 2/6/2016<br /> Mẫu được thu thập từ các hiệu thuốc. Sản<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/7/2016<br /> phẩm được nhà sản xuất công bố là thực phẩm<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016<br /> chức năng có chứa đương quy. Chúng tôi thu<br /> thập 4 mẫu lỏng, 5 mẫu rắn. Tiến hành phân tích<br /> theo quy trình, kết quả thể hiện ở bảng 1.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 361<br />