Ứng dụng một số mô hình khảo sát tác dụng của chất kháng nấm ex vivo trên candida albicans

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> ỨNG DỤNG MỘT SỐ MÔ HÌNH KHẢO SÁT TÁC DỤNG<br /> CỦA CHẤT KHÁNG NẤM EX VIVO TRÊN CANDIDA ALBICANS<br /> Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát điều kiện thích hợp để Candida albicans phát triên dưới dạng biofilm và gây<br /> nhiễm móng thực nghiệm. Áp dụng các mô hình thực nghiệm này để khảo sát tác động của các chất kháng nấm.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các điều kiện môi trường, lượng nấm, thời gian ủ thích hợp để C.<br /> albicans phát triển ở dạng biofilm trên bảng nhựa 96 giếng và nhiễm móng cô lập. Sử dụng mô hình để khảo sát<br /> tác động của một chất kháng nấm có nguồn thực vật, so sánh với ketoconazol, nystatin, terbinafin. Qua đó xác<br /> định cách đọc và điểm dừng đọc kết quả.<br /> Kết quả: Đã đề nghị được các điều kiện để C. albicans phát triển ở dạng biofilm trên bảng nhựa 96 giếng và<br /> nhiễm móng cô lập. Xác định được cách đọc và điểm dừng đọc kết quả thích hợp. Nồng độ tối thiểu ức chế C.<br /> albicans dạng biofilm của các chất thử thường cao hơn nồng độ ức chế dạng men. Nồng độ diệt C. albicans trên<br /> móng nhiễm của các chất thử thấp hơn ketoconazole và terbinafin và phù hợp với liều của các chất này ở các<br /> thuốc dùng ngoài.<br /> Kết luận: Có thể sử dụng các mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng C.albicans ex vivo để phỏng đoán liều<br /> thử nghiệm in vivo của một số chất kháng nấm mới.<br /> Từ khóa: Candida albicans, ex vivo, biofilm, móng nhiễm<br /> <br /> ABSTRACT<br /> EX VIVO MODELS FOR TESTING ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS<br /> Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Dinh Nga<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 86 - 89<br /> Objective: study experimental condition for biofilm’s formulation and nail infection of Candida albicans.<br /> Using these model to test antifungal activity of several compounds.<br /> Method: survey medium, volume of colonies, incubation time for formulating biofilm on 96-well plate and<br /> infecting nail of Candida albicans. Applied these model for antifungal agents from medical plants, compared with<br /> ketoconazole, terbinafine and nystatine. Whereby, determine method and breakpoint to observe results.<br /> Result: we determined conditions for Candida albicans to form biofilm on 96-well plate and infect nail,<br /> method to obtain results and breakpoints. The MICs of these compounds against Candida albicans biofilm were<br /> higher than MICs against yeast cells. The MFCs on nail infected were lower than ketoconazole and terbinafine, it<br /> is suitable to dermal dosage of these compounds.<br /> Conclusion: We could use these ex vivo models to guess in vivo dosage of new antifungal agents, therefore,<br /> it could decrease time and expenditure for research.<br /> Keyword: Candida albicans, ex vivo, biofilm, nail infected<br /> <br /> <br /> <br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Vũ Giang Bắc ĐT: 093 404 1225<br /> <br /> 86<br /> <br /> Email:giangbacnguyenvu@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Candida albicans là một vi nấm gây bệnh cơ<br /> hội ở người, hiện nay, vi nấm này đang được<br /> quan tâm không những ở lĩnh vực y học lâm<br /> sàng mà còn trong các nghiên cứu sinh học cơ<br /> bản. Trong điều kiện bình thường, Candida<br /> albicans là thành phần thuộc hệ vi sinh vật cộng<br /> sinh ở niêm mạc dạ dày ruột và niêm mạc âm<br /> đạo. Ở người khỏe mạnh, Candida albicans có thể<br /> gây ra một số bệnh lý nhiễm trùng ngoài da.<br /> Tuy nhiên, ở những bệnh nhân suy giảm miễn<br /> dịch thì sẽ phát triển dạng Candida lan tỏa. Có<br /> hai yếu tố quyết định độc lực của bệnh<br /> candidiasis là hình thành biofilm hoặc xuyên<br /> qua màng tế bào. Biofilm được định nghĩa là cấu<br /> trúc vi sinh bám lên bề mặt hoặc bao lấy khối<br /> vật liệu polymer1. Biofilm phát triển trên bề mặt<br /> của khoang miệng, thực quản, van tim. Ngoài<br /> ra, biofilm còn phát triển ở các vật liệu cấy ghép<br /> như máy điều hòa nhịp tim, stent, ống thông<br /> đường tiểu. Biofilm là nguyên nhân gây ra tái<br /> nhiễm và tăng khả năng đề kháng của Candida<br /> albicans với các thuốc kháng nấm.<br /> Ngoài ra khi nghiên cứu tác động của chất<br /> kháng nấm mới thường gặp vấn đề không<br /> tương đồng giữa tác động kháng nấm in vitro và<br /> in vivo. Do đó, việc sử dụng các mô hình thử<br /> nghiệm ex vivo trong nghiên cứu Candida albicans<br /> đang được quan tâm. Trong phạm vi nghiên<br /> cứu này, chúng tôi dò tìm điều kiện để C.<br /> albicans tạo biofilm trong bản nhựa polystyrene<br /> và nhiễm bệnh mô móng tay của người khỏe<br /> mạnh cắt rời, áp dung mô hình để khảo sát hoạt<br /> tính của một số chất kháng nấm.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Candida albicans ATCC 10231<br /> Chất kháng nấm:<br /> Dầu Riềng (DR) chiết từ thân rễ Riềng nếp<br /> Alpinia galangal Zingiberaceae, chứa ít nhất<br /> 45% acetoxychavicol aceate, định lượng bằng<br /> GC-MS.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cây Bông móng tay Impatiens balsamina L.<br /> Balsaminaceae, chứa khoảng 70% 2-methoxy1,4-naphthoquinon định lượng bằng phương<br /> pháp đo quang UV-Vis2<br /> Tinh dầu Hương nhu trắng (HNT) chiết từ<br /> cây Hương nhu trắng Ocimum gratissimum<br /> Lamiaceae chứa khoảng 60% eugenol, định<br /> lượng bằng GC-MS.<br /> Chất đối chiếu: ketoconazol, terbinafin HCl,<br /> nystatin<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu:1, 3<br /> Điều kiện để C. albicans phát triển ở dạng<br /> biofilm trên bảng nhựa 96 giếng: C. albicans<br /> được hoạt hóa trong môi trường YPG lỏng ở<br /> nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Ly tâm và loại bỏ<br /> phần môi trường, cắn được rửa 2 lần với dung<br /> dịch PBS. Hòa tan phần cắn trong môi trường<br /> Glucose-Glycin sao cho số tế bào nấm men là 106<br /> CFU/ml (xác định bằng mật độ quang học<br /> OD=0,1). Dùng pipette nhiều kênh cho dịch nấm<br /> vào bảng nhựa 96 giếng. Đậy nắp và ủ ở nhiệt<br /> độ 37oC. Sau thời gian 48 giờ, hút bỏ phần môi<br /> trường, rửa giếng 2 lần với dung dịch PBS. Chú<br /> ý rửa nhẹ nhàng để tránh làm ảnh hưởng đến<br /> biofilm hình thành ở đáy giếng.<br /> <br /> Thử hoạt tính của chất kháng nấm trên dạng<br /> biofilm:<br /> Chất kháng nấm được hòa tan trong DMSO,<br /> sau đó được pha loãng trong môi trường YPG<br /> để có dãy nồng độ mong muốn trước khi cho<br /> vào bảng nhựa.<br /> Cao bông móng tay:<br /> µg/ml - 0,125 µg/ml<br /> <br /> 256<br /> <br /> Tinh dầu hương nhu:<br /> 0,00047 µg/ml<br /> <br /> 5 µl/ml -<br /> <br /> Nystatin:<br /> <br /> 32 µg/ml – 0,015 µg/ml<br /> <br /> Ketoconazol:<br /> <br /> 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml<br /> <br /> Quan sát sự phát triển trở lại của vi nấm từ<br /> dạng biofilm bằng mắt thường để xác định nồng<br /> độ chất kháng nấm có khả năng ức chế dạng<br /> biofilm.<br /> <br /> Cao Bông móng tay (BMT) chiết từ vỏ qua<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> 87<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Gây nhiễm C.albicans trên móng tay người<br /> khỏe mạnh:4<br /> Móng tay người tình nguyện, khỏa mạnh,<br /> không có bệnh gì về móng và không được sơn<br /> móng tay trong vòng 6 tháng được cắt thành<br /> mảnh 3x3 mm, rửa sạch 3 lần với EtOH 70% và<br /> nước muối sinh lý. Móng được làm khô ở nhiệt<br /> độ phòng trước khi gây nhiễm.<br /> C. albicans được hoạt hóa trong môi trường<br /> YPG lỏng ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Sau khi<br /> ly tâm, bỏ phần môi trường, phân tán đều phần<br /> cắn trong nước muối sinh lý để đạt số lượng vi<br /> nấm là 107 CFU/ml (xác định bằng buồng đếm<br /> hồng cầu Neubauer). Pha dịch treo vi nấm trong<br /> môi trường thạch nước sao cho nồng độ đạt 106<br /> CFU/ml trong hộp petri vô trùng. Đặt móng tay<br /> đã xử lý vào môi trường sao cho nền móng tiếp<br /> xúc với thạch chứa nấm, như vậy nấm chỉ sử<br /> dụng móng là nguồn dinh dưỡng duy nhất. Sau<br /> 7 ngày ử ở 37oC thì quan sát sự phát triển của vi<br /> nấm trên móng dưới kính hiển vi.<br /> <br /> Thử hoạt tính của chất kháng nấm:<br /> Chất kháng nấm được hòa tan trong dung<br /> dung dịch PEG:cồn tuyệt đối (75:25), rồi pha<br /> loãng trong môi trường thạch YPG để đạt dãy<br /> nồng độ thử nghiệm<br /> Terbinafin từ 2 – 0,06 %<br /> Ketoconazole: 2 – 0,06 %<br /> Cao bông móng tay: 0,5 – 0,015 %<br /> Dầu Riềng 0,03 - 0,5%<br /> Tinh dầu Hương nhu trắng 0,3-2,5%<br /> Móng sau khi gây nhiễm được chuyển sang<br /> môi trường có chứa chất thử sao cho lưng móng<br /> tiếp xúc với môi trường, nền móng hướng lên<br /> trên. Sau 2-3 ngày thì quan sát sự phát triển trở<br /> lại của vi nấm bằng mắt thường và kính hiển vi<br /> quang học để xác định khả năng kháng nấm của<br /> chất thử.<br /> Sau đó, chuyển móng sang môi trường<br /> thạch YPG sao cho nền móng tiếp xúc với môi<br /> <br /> định nồng độ tối thiểu diệt nấm trên mô móng.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Tác động của chất kháng nấm trên dạng<br /> biofilm<br /> Sau 48 giờ, quan sát dưới kính hiển vi soi<br /> ngược đã thấy biofilm hình thành ở đáy tất cả<br /> các giếng dưới dạng sợi nấm bám dính vào bảng<br /> nhựa.<br /> Bảng 1: Nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans dạng<br /> biofilm của các chất kháng nấm<br /> Chất kháng nấm<br /> Cao BMT<br /> Tinh dầu HNT<br /> Dầu Riềng<br /> Nystatin<br /> Ketoconazol<br /> <br /> MIC biofilm<br /> (µg/ml)<br /> 32<br /> 2,5<br /> 8<br /> 3<br /> 1,25<br /> <br /> MIC in vitro (µg/ml)<br /> 16<br /> 0,6<br /> 1<br /> 2<br /> 0,03<br /> <br /> Ghi chú: Số liệu nhận được là trung bình của<br /> 9 lần lập lại thử nghiệm.<br /> Nồng độ tối thiểu ức chế C. albicans dạng<br /> biofilm của ketoconazol là 1,25 µg/ ml, cao<br /> hơn nồng độ MIC in vitro khoảng 40 lần.<br /> Trong khi đó, với các chất kháng nấm có<br /> nguồn gốc từ thực vật, nồng độ ức chế dạng<br /> biofilm chỉ cao hơn MIC in vitro từ 2-8 lần (cao<br /> BMT là 2 lần, tinh dầu HNT là 4 lần và DR là 8<br /> lần).<br /> <br /> Tác động kháng nấm trên mô hình móng<br /> nhiễm<br /> Bảng 2: Tác động kháng C.albicans ở mô hình móng<br /> của các chất kháng nấm<br /> Chất kháng nấm<br /> <br /> Cao BMT<br /> Tinh dầu HNT<br /> Dầu Riềng<br /> Terbibafin<br /> Ketoconazol<br /> <br /> Nồng độ chất thử (mg/ml)<br /> MIC<br /> MIC<br /> MFC<br /> in vitro<br /> ex vivo<br /> ex vivo<br /> 0,016<br /> 1,25<br /> 2,5<br /> 0,6<br /> 1,25<br /> 1,25<br /> 0,001<br /> 0,5<br /> 0,5<br /> 5<br /> 20<br /> -3<br /> 0,03x10<br /> 10<br /> 20<br /> <br /> Ghi chú: (-): không thử<br /> <br /> trường, ủ ở 37 oC trong 48 giờ, quan sát sự phát<br /> <br /> Các nồng độ thử nghiệm đạt được sau 6 lần<br /> <br /> triển trở lại của vi nấm. Giai đoạn này giúp xác<br /> <br /> thử với chứng dương là lô móng tay không<br /> <br /> 88<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> được tiếp xúc với chất thử.<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Tác động kháng C.albicans ở mô hình tạo<br /> biofilm trên bản nhựa polystyrene<br /> Nystatin là chất diệt nấm nên MIC trên<br /> biofilm gần bằng MIC in vitro. Các chất còn lại<br /> đều có nồng độ tối thiểu ức chế dạng biofilm<br /> cao hơn nồng độ ức chế dạng men.<br /> Ketoconazole là chất kìm nấm thuộc nhóm 5imidazol, cho MIC trên biofilm gấp 40 lần nồng<br /> độ ức chế dạng men. Trong khi đó, các chất<br /> được chiết xuất từ dược liệu như cao BMT, dầu<br /> Riềng và tinh dầu Hương nhu trắng lại có MIC<br /> biofilm chỉ gấp 2-8 lần MIC in vitro. Đây có thể<br /> là những tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn về các<br /> chất này.<br /> <br /> Tác động kháng C. albicans trên mô móng<br /> tay cô lập<br /> So sánh tác động kháng C.albicans của<br /> ketoconazol trên mô hình móng nhiễm có thể<br /> thấy sự tương đồng giữ nồng độ diệt nấm<br /> (MFC) và nồng độ của chế phẩm đang sử dụng<br /> trên thị trường là 2%. Điều này cho thấy mô<br /> hình móng nhiễm cô lập có thể là minh chứng<br /> <br /> Chuyên Đề Ký Sinh Trùng<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> khoa học cho việc dự đoán liều sử dụng in vivo<br /> cho các chất kháng nấm mới.<br /> Đối với các chiết xuất từ dược liệu, dầu<br /> Riềng có MIC in vitro thấp nhất nhưng MIC ex<br /> vivo cao gấp 500 lần. Cao BMT cho tác động<br /> kháng C.albicans trên móng nhiễm ở nồng độ<br /> 0,25%, chỉ gấp 156 lần MIC in vitro. Tinh dầu<br /> HNT cho tác động kháng C.albicans trên móng<br /> nhiễm chỉ gấp 40 lần MIC in vitro. Kết quả này<br /> cho thấy khả năng thấm vào móng tốt của các<br /> chiết xuất từ dược liệu hơn các chất hóa học.<br /> <br /> Tài liệu tham khảo<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Erst JE and Roger PD (2007). Antifungal agent-methods and<br /> protocols. In: Erst J.E. Method in Molecular medicine,Vol.188,<br /> pp 71-75. Humana Press Inc, Totowa, NJ<br /> Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009). Tổng hợp và tác<br /> dụng kháng nấm của methyl lawson, thành phần chính của<br /> cây Bông móng tay. Tạp chí Dược học, 49(395): 29-32<br /> Vardecer-Unlu Gulhan (1998). A comparison of germ tube<br /> production by Candida albicans in three media. Tr.J. of Biology,<br /> 22: 2005-2010<br /> Yazdanparast SA and Richard CB(2006). Arthroconidia<br /> production in Trichophyton rubrum and a new ex vivo model of<br /> onychomycosis. Journal of Medical Microbiology, 55: 15771581<br /> <br /> 89<br /> <br />