Luận văn Thạc sĩ Thú y: Nghiên cứu thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ QUỲNH ÁNH

NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐA GIÁ

NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA

MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA Ở LỢN

TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ QUỲNH ÁNH

NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM VẮC XIN ĐA GIÁ

NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA

MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA Ở LỢN

TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 8.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN ĐỨC HẠNH

THÁI NGUYÊN – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực và đã được sự đồng ý, cho phép sử dụng số liệu nghiên cứu

để hoàn thành luận văn cao học của PGS. TS. Cù Hữu Phú.

Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đã được cảm ơn. Các

thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày 06 tháng 8 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Ánh

LỜI CẢM ƠN

Sau hai năm học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành chương trình

khoá học với luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Thú y về đề tài “Nghiên cứu thử

nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra ở lợn tại

tỉnh Thái Nguyên”.Để hoàn thành khoá học và công trìnhnghiên cứu này, tôi đã

nhận được sự dạy bảo tận tình và định hướng của giảng viên hướng dẫn TS Trần

Đức Hạnh và sự giúp đỡ của PGS. TS. Cù Hữu Phú. Sự quan tâm giúp đỡ và tạo

mọi điều kiện thuận lợi của tập thể giảng viên khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng

Đào tạo - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên; Công ty Cổ phần thuốc thú y

Đức Hạnh Marphavet.

Nhân dịp này cho phép tôi được trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự

giúp đỡ tận tình, quý báu đó.

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn hội đồng chấm luận văn đã giúp đỡ và

cho phép tôi được bảo vệ bản luận văn này.

Tôi xin được cảm ơn Ban Lãnh đạo đơn vị, bạn bè, đồng nghiệp, người

thân và gia đình đã động viên, tạo điều kiện về thời gian, về vật chất và tinh

thần để tôi hoàn thành tốt khoá học.

Thái Nguyên, ngày 06 tháng 8 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Ánh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ...................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................. viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. x

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1

2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tế .......................................................................... 2

3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2

3.2. Ý nghĩa thực tế ........................................................................................... 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn ......... 3

1.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ........................................... 3

1.1.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae ................. 9

1.1.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và

bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra ..... 9

1.2. Vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra.12

1.2.1. Vi khuẩn P. multocida........................................................................... 12

1.2.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. multocida .................................. 16

1.2.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi lợn do

vi khuẩn P. multocida gây ra.....................................................................22

1.3. Vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra…. 22

1.3.1. Vi khuẩn S. suis ..................................................................................... 22

1.3.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis............................................. 22

1.1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi lợn do vi

khuẩn S. sui gây ra.....................................................................................29

Chương 2. NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 30

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 30

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 30

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 30

2.1.3. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 30

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 30

2.3.1. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo vắc xin đa giá nhũ

dầu phòng viêm phổi ở lợn.............................................................................. 31

2.3.2. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 31

2.3.3. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm .............................................................. 31

2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 31

2.4.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn ............................................. 31

2.4.4. Phương pháp chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn .............. 32

2.4.5. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của

đàn lợn sau tiêm phòng vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do

vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và S. suis ................................. 33

2.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 37

2.5.1. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ .............................................. 37

2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 37

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 38

3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vắc xin thử

nghiệm. ............................................................................................................ 38

3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

phân lập được .................................................................................................. 38

3.1.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập

được. ................................................................................................................ 40

3.1.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S.suis phân lập được

3.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn .......... 45

3.2.1. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vắc xin thử nghiệm .................................. 45

3.2.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn ............ 46

3.3. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vắc xin thử nghiệm ở

lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên ......................................................................... 57

3.3.1. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vắc xin thử nghiệm ..................... 57

3.3.2. Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh

Thái Nguyên .................................................................................................... 68

KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 71

1. Kết luận ....................................................................................................... 71

2. Đề nghị ........................................................................................................ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 73

PHỤ LỤC 1 ....................................................................................................... 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

ADN : Acid Deoxyribonucleic

AGID : Agargel Immuno Diffuse

A. pleuropneumoniae : Actinobaccillus pleuroneumoniae

Apx : Apx - Toxins

BHI : Brain Heart Infusion

Bp : Base pair

CAMP : Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson

CFU : Colony Forming Unit

CPS : Capsule polysaccharide

Cs : Cộng sự

DNT : Dermanecrotic toxin

ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay

H. pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae

HIP : Acid hippuric

HLTP : Hiệu lực tiêm phòng

IHA : Indirect Haemagglutination test

LPS : Lypopolysaccaride

LD : Lethal dose

MR : Methyl red

NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

OMPs : Outer membrane proteins

PBS : Phosphat buffer solution

PCR : Polymerase Chain Reaction

PPLO : Pleuropneumonia - like organism

P. multocida : Pasteurella multocida

RR : Relative Risk

vii

Sta. aureus : Staphylococcus aureus

S. suis : Streptococcus suis

TYE : Tryptone Yeast Extract Broth

TSA : Tryptic Soya Agar

TSB : Tryptone soya broth

VP : Voges Prokauer

YE : Yeast Extract

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A.

pleuropneumoniae phân lập được ................................................................... 39

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân

lập được ........................................................................................................... 41

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập

được ................................................................................................................. 42

Bảng 3.4: Các chủng vi khuẩn được chọn để chế tạo vắc xin thử nghiệm ........... 45

Bảng 3.5: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng ..................... 47

chế tạo vắc xin thử nghiệm ............................................................................. 47

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng .......................... 48

sử dụng chế tạo vắc xin thử nghiệm ................................................................ 48

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô vắc xin chế tạo thử nghiệm ............ 49

Bảng 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch 50

Bảng 3.9: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

khi công cường độc vi khuẩn A. pleuropneumoniae ..................................... 51

Bảng 3.10: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

khi công cường độc vi khuẩn P. multocida .................................................... 52

Bảng 3.11: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 2 ............................................. 53

Bảng 3.12: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên lợn ......... 56

bằng phương pháp công cường độc ................................................................ 56

Bảng 3.13: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn ................ 59

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau một tháng ................................................. 59

Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn ................ 60

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau hai tháng .................................................. 60

Bảng 3.15: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau ba tháng.................................................... 62

Bảng 3.16: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau bốn tháng ................................................. 64

Bảng 3.17: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm

được tiêm Vắc xin thử nghiệm sau năm tháng ............................................... 66

Bảng 3.18: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở vùng tiêm và vùng

không tiêm vắc xin thử nghiệm ....................................................................... 68

Bảng 3.19: Nguy cơ lợn mắc viêm phổi do không tiêm vắc xin thử nghiệm so

sánh giữa nhóm lợn được tiêm và nhóm lợn không tiêm ............................... 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn

thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau ba tháng ................................. 63

Hình 3.2. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn

thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau bốn tháng..........................65

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn

thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau năm tháng .............................. 67

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Để đưa chăn nuôi trở thành ngành sản xuất hàng hóa đáp ứng nhu cầu

thịt, sữa, trứng, nhất là thịt lợn xuất khẩu. Trong những năm gần đây Nhà

Nước, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã có những chính sách để

đưa ngành chăn nuôi của nước ta nói chung, ngành chăn nuôi lợn nói riêng

từng bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ

trọng đáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa đói

giảm nghèo. Tuy nhiên, dịch bệnh ở lợn cũng phát triển và có nhiều diễn biến

đa dạng, phức tạp đã gây nhiều thiệt hại cho các hộ chăn nuôi lợn, làm giảm

hiệu quả, thu nhập kinh tế. Việc tạo ra một môi trường chăn nuôi an toàn và

sạch bệnh là vấn đề vô cùng cần thiết để tang về cả năng suất và chất lượng

sản phẩm từ lợn thịt.

Ngoài những bệnh truyền nhiễm thì bệnh viêm phổi màng phổi là bệnh

gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh lây lan nhanh, tác

động kéo dài đối với cơ thể lợn. Bệnh tồn tại rất lâu trong cơ thể lợn cũng như

ngoài môi trường. Ngoài việc phòng trị rất khó khăn, khi lợn bị nhiễm bệnh

chi phí điều trị lớn, thời gian và liệu trình điều trị kéo dài.

Bệnh viêm phổi màng phổi đã và đang tồn tại trên khắp các tỉnh thành

trong cả nước, đặc biệt là những nơi chăn nuôi tập trung có điều kiện chăn

nuôi còn thấp kém.

Hiện nay tại Việt Nam chưa có loại vắc xin viêm phổi đa giá phòng

bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A.pleuropneumoniae, S.suis

và P.multocida gây ra sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu. Vắc xin đa giá nhũ dầu sẽ

tăng hiệu lực phòng bệnh của vắc xin, đặc biệt là thời gian miễn dịch của vắc

xin được kéo dài hơn nhiều. Chính vì vậy việc nghiên cứu chế tạo vắc xin đa

giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn từ 3 vi khuẩn

A.pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là vấn đề đòi hỏi cần thiết hiện

nay của sản xuất.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn, đáp ứng cơ sở khoa học cho việc

phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, đánh giá được hiệu lực phòng bệnh của

vắc xin sản xuất trên lợn, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida

và Streptococcus suis gây ra ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis sử dụng chế tạo thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh

viêm phổi cho lợn.

- Xác định hiệu lực của vắc xin đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi

khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại tỉnh Thái

Nguyên.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tế

3.1. Ý nghĩa khoa học

- Nghiên cứu thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu từ các chủng vi

khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được.

- Xác định hiệu lực của vắc xin đa giá nhũ dầu lần đầu tiên được nghiên

cứu chế tạo và thử nghiệm trong thực tế là cơ sở khoa học để xây dựng các

biện pháp phòng bệnh viêm phổi hiệu quả cho đàn lợn.

3.2. Ý nghĩa thực tế

Sử dụng vắc xin đa giá nhũ dầu tiêm phòng cho đàn lợn nuôi tại tỉnh

Thái Nguyên góp phần giảm tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm phổi và tăng hiệu quả,

thu nhập cho người chăn nuôi.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn do

vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra.

1.1.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae. A. pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn, là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng 0,3 - 0,5 x 0,6 - 1,4 µm. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô ( một số chủng không có giáp mô cũng đã được quan sát thấy). Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5 - 2 x 60 - 450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae (loại không có vỏ thì ít tìm thấy hơn). 1.1.1.1. Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có khả năng lên men đường glucose,

xylose, mannitol, mannose, sucrose và không lên men đường arabinose,

lactose, raffinose, sorbitol. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa cho thấy vi khuẩn A.

pleuropneumoniae có phản ứng urease và oxidase dương tính; phản ứng

cAMP dương tính hoặc âm tính (tùy thuộc vào serotype của vi khuẩn); phản

ứng âm tính với sinh Indol; phản ứng catalase âm tính, một số chủng cho phản

ứng dương tính nhẹ (tùy thuộc vào serotype của vi khuẩn); không mọc trên

thạch MacConkey (Moller và cs, 1996).

1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype chính dựa trên

nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi

là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Biotype 1 cần có NAD,

còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần

có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine

nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype

2. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule

polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào. Ở

biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên

như biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2

được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen

và cs, 1997).

1.1.1.3. Các yếu tố độc lực

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi

khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn được quyết định bởi các ngoại độc tố

mà chúng sản sinh ra (Devenish và cs, 1990; (Frey và Bosse , 1993)

Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt,

yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng đóng

vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Hiểu

biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính,

độc lực của vi khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ sở khoa học

cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng như chế

tạo vắc xin.

- Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn do ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX- toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993); Cho và Chae, 2001). Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae. + ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988). Trước đây ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990). Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1994; Rayamajhi và cs, 2005).

Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3.

+ ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhưng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lượng phân tử 120 kDa. Trước kia ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Rycroft và cs, 1991a; Macdonald và Rycroft, 1992; Jansen và cs, 1993). ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác. ApxIII giống 50% với ApxI và HlyI của vi khuẩn E. coli (Jansen và cs 1993). Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI (Chang và cs, 1993). Theo (Rayamajhi và cs, 2005) protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A. pleuropneumoniae.

+ ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã được phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA. Gen ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều đó chứng tỏ nó có tính chất đặc trưng cho loài. Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ trong quá trình gây bệnh hiện chưa được nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (Liu và cs, 2009).

Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx như serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey và Nicolet, 1990; Frey và cs, 1993, 1994). Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ mạnh đến yếu tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Theo (Frey và Nicolet, 1990) những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố. A. pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều

này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5. Đồng thời tác giả đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 để không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vắc xin cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5.

Thành phần heptose và glucose trong LPS của A. pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác như E. coli. Jensen và Bertram (1986) đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A. pleuropneumoniae có độc lực cao thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5. LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ sau khi A. pleuropneumoniae xâm nhiễm.

- Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS): Vi khuẩn A. pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và được cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997). Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy. Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 - 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác nhau. Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác nhau về độc lực. Các chủng A. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực có kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính dầy hơn so với những chủng ít độc; lớp vỏ của vi khuẩn A. pleuropneumoniae không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và dịch tễ.

- Các protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs): Protein màng ngoài của A. pleuropneumoniae có trọng lượng phân tử 43 kDa và có thể thay đổi tùy theo hàm lượng NAD cung cấp trong môi trường nuôi cấy. Các protein mang sắt nằm trên màng ngoài, sau đó các đặc tính cùng chuỗi gen của chúng cũng được Gonzalez và cs (1995); Chung và cs (2007) nghiên cứu xác định. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae sản sinh một vài loại protein màng ngoài (OMPs) và các protein này được cho là có vai trò trong đáp ứng miễn dịch. Hơn nữa, các kháng thể kháng OMPs của A. pleuropneumoniae được chứng minh tác động như một chất opsonin quan trọng chống đại thực bào và bạch cầu đơn nhân. A. pleuropneumoniae có khả năng tổng hợp hai protein mới khi được nuôi trong môi trường thiếu sắt và có các kháng thể chống lại chúng. Hiện tượng xuất hiện các polypeptid này chỉ có được ở trong cơ thể sống. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy có một số receptor transferrin đặc hiệu ở lợn và khả năng phát triển của A. pleuropneumoniae với transferrin vận chuyển sắt. Các phân tích về mặt di truyền các yếu tố mã hóa cho receptor các protein transferrin được nhận dạng bởi hai gen nằm trên một operon. Theo quy định gen tbpB (mã hóa cho protein Tbp2 có khối lượng phân tử dao động từ 59,8 đến 65,5 kDa) và gen tbpA (mã hóa cho protein Tbp1 với trọng lượng chính xác 102,2 kDa). Theo các chứng minh ngược dòng trên operon tbp gợi ý rằng các ion sắt ở môi trường điều khiển gen tbp qua protein Fur (Gerlach và cs, 1992).

- Các protein thu nhận sắt: Khả năng cạnh tranh và hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của A. pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae có thể sử dụng transferrin của vật chủ (Gerlach và cs, 1992) và hemoglobin (Archambault và cs 1999), cũng như sử dụng các loại siderophore khác nhau của nhiều vi sinh vật khác (Diarra và cs, 1996) làm nguồn cung cấp sắt cho sinh trưởng. Các nghiên cứu cũng đã xác định chắc chắn có sự tồn tại của các thụ thể trên bề mặt màng tế bào A. pleuropneumoniae đặc hiệu cho các nguồn thu nhận sắt. Nghiên cứu của Jacques (2004) cho biết vi khuẩn A. pleuropneumoniae có protein gắn kết hemoglobin và các receptor ferric hydroxamate. Chính protein gắn transferrin đã giúp cho A. pleuropneumoniae được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng.

- Các yếu tố độc lực khác: Ngoài các yếu tố độc lực chính như trên vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn có một số thành phần khác cũng có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học, bao gồm:

+ Fimbriae là yếu tố bám dính chính lên tế bào niêm mạc đường hô hấp của vật chủ của A. pleuropneumoniae trong quá trình xâm. Dưới kính hiển vi điện tử, fimbriae có đường kính từ 0,5 - 2 nm, dài từ 60 - 450nm.

+ Ngưng kết tố: Hiện tượng ngưng kết hồng cầu đã được xác định ở một số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được, tuy nhiên cũng có một số chủng A. pleuropneumoniae không có đặc tính ngưng kết cũng đã được xác định.

+ HlyX protein: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có chứa gen hlyX (cfp) quy định khả năng dung giải hồng cầu, biểu hiện phản ứng CAMP có mặt ở hầu hết các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được (Macdonald và Rycroft, 1993).

+ Protease: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae tiết ra protease có khả năng

phân giải gelatin, IgA, IgG và hemoglobin.

+ Enzym superoxide dismutase (SOD) là một trong những yếu tố độc lực vì nó giúp cho vi khuẩn tồn tại trong suốt quá trình gây nhiễm. Trình tự cấu trúc của enzym này đã được xác định bởi Langford và cs (1996).

+ Urease: Hoạt động của urease góp phần vào khả năng gây nhiễm trùng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên đường hô hấp của lợn và sau đó làm phát sinh bệnh. Hoạt động urease cũng góp phần gây bệnh do quá trình này cung cấp cho vi khuẩn nguồn nitrogen, từ đó trực tiếp hoặc gián tiếp gây tổn thương tế bào thực bào và tế bào nội mạc của vật chủ. 1.1.1.4. Khả năng đề kháng với kháng sinh

Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae được quyết định bởi thành phần plasmid có trong tế bào vi khuẩn và plasmid này có trọng lượng phân tử thấp (2,3-3,6) x106 dalton. Cơ sở của hiện tượng kháng này với ampicillin là do vi khuẩn tiết ra men β-lactamase. Những plasmid này không có vật liệu gen để thúc đẩy sự dẫn truyền tới vi khuẩn khác và sự xuất hiện của plasmid này gợi ý về kết quả của một quá trình chọn lọc của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Đặc tính kháng kháng sinh có khả năng truyền bằng plasmid.

Như vậy, khả năng kháng thuốc của vi khuẩn A. pleuropneumoniae khá phổ biến, có xu hướng tăng lên về tỷ lệ và chủng loại thuốc bị kháng. Do đó cần có biện pháp sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và thú y hợp lý nhằm hạn chế khả năng kháng thuốc của A. pleuropneumoniae. 1.1.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae 1.1.2.1. Triệu chứng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào: tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh. Dựa vào triệu chứng bệnh được chia làm ba thể: quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính.

- Thể quá cấp tính: Lợn mắc bệnh sốt 41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy. Thời gian ngắn trước khi chết, thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tư thế ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh. Ngay trước khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn bộ cơ thể trở nên tím tái (Nicolet, 1992), lợn mắc bệnh thường chết sau 24 - 36 giờ.

- Thể cấp tính: Ở thể này thường có nhiều lợn cùng mắc bệnh trong một

đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn. Các dấu hiệu

hô hấp nặng như khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ (Fenwick và

Henry, 1994). Bệnh diễn biến khác nhau ở từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ

tổn thương ở phổi và thời điểm bắt đầu điều trị. Lợn thường sống sót nếu qua

được 4 ngày đầu của bệnh.

- Thể mãn tính: Lợn mắc bệnh không có biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng.

Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân tố truyền bệnh cho những lợn

khác. Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ hơn nếu có nhiễm trùng kế

phát các vi sinh vật đường hô hấp khác (Mycoplasma, Pasteurella, PRRS) hay

các nhân tố Stress (MacInnes và Rosendal, 1988).

1.1.2.2. Bệnh tích

Lợn bị nhiễm A. pleuropneumoniae có những tổn thương chủ yếu ở

đường hô hấp (Nicolet, 1992). Đa số các trường hợp lợn bị viêm hai bên phổi

với tổn thương ở các thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm

hoành. Viêm màng phổi tơ huyết và fibrin thường rất rõ ở những lợn chết

trong giai đoạn cấp tính của bệnh. Hầu hết những nghiên cứu đều kết luận

rằng những tổn thương trên là do độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae

gây ra (Bertram, 1986). Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng như thể cấp

tính thấy khí quản và các phế quản bị lấp đầy bởi các chất tiết nhày, bọt lẫn

máu, phổi trở nên sẫm màu, có rất nhiều máu ở lồng ngực và nhiều tơ huyết

gắn giữa phổi, thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim.

1.1.2.3. Phòng bệnh

Việc phòng bệnh cần thực hiện theo một số nguyên tắc sau: Đối với trại chăn nuôi không có lợn mắc bệnh và nhiễm A. pleuropneumoniae phải duy trì việc cách ly, đi đôi với việc sử dụng tinh dịch an toàn. Khi nhập lợn mới vào đàn, phải đảm bảo lợn có nguồn gốc từ một đàn không bị bệnh, không bị nhiễm khuẩn, nên nuôi cách ly trước khi cho vào đàn. Có thể dùng thuốc kháng sinh để phòng bệnh nhưng không được dùng kéo dài và thường xuyên kiểm tra sự mẫn cảm của vi khuẩn A. pleuropneumoniae với kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không loại bỏ được mầm bệnh hoàn toàn và vi khuẩn A. pleuropneumoniae vẫn có thể thải ra môi trường (Fedorka-Cray và cs, 1993).

Trong trường hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết thanh dương tính cao thì tiêu hủy là phương pháp hiệu quả để thanh toán dịch bệnh, sau đó tiêu độc chuồng trại, tạo đàn mới từ những con giống sạch bệnh (Nicolet, 1992). Tuy nhiên, phương pháp này rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần quý. Trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà chưa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách.

* Phòng bệnh bằng vắc xin Hiện đã có nhiều loại vắc xin được sản xuất để phòng cho bệnh này và được chia thành 2 nhóm chính là vắc xin vô hoạt và vắc xin có chứa một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn. Vắc xin vô hoạt toàn khuẩn đặc hiệu theo chủng huyết thanh, có thể có miễn dịch chéo với các chủng huyết thanh khác. Vắc xin dùng tiêm cho lợn con khi kháng thể thụ động nhận được từ lợn mẹ đã giảm đi giúp đàn lợn giảm tỷ lệ tử vong, giảm thuốc điều trị và chất lượng thịt cũng được nâng cao, lợn ít bị viêm phổi.

Vi khuẩn nhạy cảm với nhiều chất sát trùng thông thường như: Han-Iodine

10%, Benkocid.

1.1.2.4. Điều trị bệnh

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có MIC cao với streptomycin,

kanamycin, spectinomycin, spiramycin và lincomycin (Nicolet và Schifferli,

1982. Prescott và Baggot (1993) đã đánh giá lại khả năng nhạy cảm của vi

khuẩn này với một số kháng sinh. Sự xuất hiện tình trạng vi khuẩn A.

pleuropneumoniae kháng lại ampicilin, cephalosporin, colistin, tetracyclin,

streptromycin, sulfonamide là vấn đề đáng lo ngại và thường gặp ở các

serotype 1; 3; 5 và 7; nhưng hiếm gặp ở các chủng khác, nhất là serotype 2

(Nicolet và Schifferli, 1982.

Kháng sinh được chọn lựa trong điều trị phải là kháng sinh có nồng độ

ức chế tối thiểu thấp và có khả năng diệt khuẩn tốt nhất. Một số kháng sinh

mới có gần đây như các dẫn xuất quinolone (enrofloxacin) hoặc

cephalosporin bán tổng hợp (ceftiofur sodium) đã được chứng minh trên thử

nghiệm rất có kết quả. Lê Văn Dương (2013) cho biết, các chủng vi khuẩn A.

pleuropneumoniae phân lập được mẫn cảm nhất với ceftiofur, chiếm tỷ lệ

77,08%; tiếp theo là amoxicillin, florfenicol, ampicillin lần lượt là 70,84%;

68,75%; 54,17%. Một số kháng sinh đang được sử dụng nhiều có tỷ lệ kháng

thuốc khá cao như lincomycin bị kháng tới 93,75%; tiếp đến là erythromycin,

neomycin và gentamicin với tỷ lệ tương ứng 79,17%; 77,08% và 45,83%. Có

nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn A.

pleuropneumoniae ngày càng gia tăng như do việc dùng kháng sinh điều trị

kéo dài, kháng sinh được bổ xung vào thức ăn chăn nuôi và do hiện tượng di

truyền tính kháng thuốc bởi các gen nằm trong plasmid của vi khuẩn A.

pleuropneumoniae. Cần làm kháng sinh đồ khi thí nghiệm điều trị bằng

kháng sinh. Sự thành công của điều trị phụ thuộc chủ yếu vào việc phát hiện

sớm các dấu hiệu lâm sàng và can thiệp điều trị kịp thời.

1.1.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và

bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra

1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây A. pleuropneumoniae đã được phân lập và đánh giá là một trong những nguyên nhân gây bệnh viêm đường hô hấp khá quan trọng ở tất cả các trại lợn trên toàn quốc. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Blackall và cs (2002) đã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype 1 ở 9

chủng vi khuẩn phân lập được tại Australia.

Bệnh viêm phổi - màng phổi (VPMP) ở lợn lây lan rộng và được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới, nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển. Bệnh có mặt và lây lan mạnh ở hầu hết các nước Châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và Australia. 1.2. Vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra

1.2.1. Vi khuẩn P. multocida

1.2.1.1. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn P. multocida thuộc bộ Eubacteriales, họ Parvobateriaceae, tộc

Pasteurelliae, giống Pasteurella, loài Pasteurella multocida. Kích thước của

vi khuẩn P. multocida có sự thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng, vi

m khuẩn phân lập từ bò có kích thước đồng nhất từ 0,5 - 1,2 , trong khi đó P.

m multocida phân lập từ lợn có dạng tròn hơn, kích thước từ 0,8 - 1,0 (Bergey,

1974).

Kích thước của vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy,

khi nuôi cấy lâu trên môi trường nhân tạo thường có hình trực khuẩn. P.

multocida là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, bắt màu Gram âm, không di động,

không sinh nha bào khi phát triển trong cơ thể; trong môi trường nuôi cấy có

bổ sung huyết thanh hoặc máu vỡ sẽ hình thành giáp mô. Khi cấy truyền trên

môi trường nhân tạo hoặc tiêm truyền qua động vật máu lạnh nhiều lần thì

độc lực của vi khuẩn giảm do không còn giáp mô, nhưng nếu tiêm truyền vi

khuẩn qua lợn thì độc lực lại tăng lên vì chúng lại khôi phục khả năng hình

m thành giáp mô. Vi khuẩn P. multocida có kích thuớc 0,2-0,41 x 0,04-1,5 m,

thường bắt màu sẫm ở hai đầu trong các tiêu bản máu ở phủ tạng lợn còn tươi.

Điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 37°C trong môi trường trung

tính hay hơi kiềm (pH: 7,2-7,4). Vi khuẩn P. multocida mọc tốt trên một số

môi trường như nước thịt, thạch thường, thạch máu… (Cù Hữu Phú, 2011).

Trên môi trường thạch có huyết cầu tố và huyết thanh là môi trường tốt

dùng để giám định, phân lập và xác định độc lực của vi khuẩn này. Ở môi

trường này vi khuẩn P. multocida phát triển thành khuẩn lạc đặc biệt có hiện

tượng phát dung quang. Peter và cs (1996) đã sử dụng môi trường dinh dưỡng

tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của vi khuẩn P.

multocida. Môi trường gồm 17 thành phần, trong đó có cysteine, acid

glutamic, leucine, muối vô cơ, nicotinamid, pantothenate, thiamine,

methionine. Kết quả cho thấy có 40/46 chủng đem thử (chiếm 87%) mọc tốt

sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không sinh

độc tố như lúc đầu.

Vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần cho

thêm một số chất như cysteine, acid glutamic, leucine, methionine, muối vô

cơ, nicotinamid, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucine có tác

dụng kích thích tăng trưởng và thiamine có thể thay thế bằng adenine. Vi

khuẩn có thể duy trì sự sống được trong môi trường Cary- Blair và L-15

(leubovitz medium No15) hơn 15 ngày ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên sử dụng

Cary - Blair làm môi trường vận chuyển (transport medium) thì sẽ tốt hơn,

còn môi trường L-15 thích hợp hơn khi bảo quản vi khuẩn này trong phòng

thí nghiệm.

Vi khuẩn P. multocida phát triển trong môi trường phổ thông có thêm

tụy đệm CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI -

Brain Heart Infusion (Michael và cs, 2002).

Môi trường tốt nhất cho P. multocida là môi trường YPC (yeast extract

peptone L-cytine) có thêm sacarose và sodium sulfite (Na2SO4) và môi trường

TSA (tryptone soya agar) (OIE, 2004). Trên môi trường TSA kích thước của

khuẩn lạc sẽ lớn hơn. Vi khuẩn P. multocida phát triển trên môi trường YPC

thạch máu sẽ tạo nhiều kháng nguyên quan trọng hơn khi cấy trong các môi

trường tổng hợp khác, đây cũng là môi trường giúp tái tạo giáp mô của vi

khuẩn. Theo Shivachandra (2006) vi khuẩn P. multocida còn có khả năng mọc

trên môi trường đậu phụ, tuy nhiên chúng không phát triển trên môi trường

MacConkey và thạch Citrate. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng thì các

gen liên quan đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh.

1.2.1.2. Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn P. multocida lên men đường glucose, mannitol, sorbitol,

galactose; không lên men đường lactose, arabinose, maltose. Phản ứng sinh

Indol, Catalaza và Oxydaza: Dương tính; phản ứng Urease: Âm tính; không mọc

trên môi trường MacConkey agar (Carter, 1984; Đỗ Quốc Tuấn và cs, 2007).

1.2.1.3. Cấu trúc kháng nguyên

Kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida rất phức tạp và cấu trúc từng

loại luôn thay đổi. Cho đến nay, người ta đã xác định được P. multocida có 2

loại kháng nguyên là kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O). Kháng

nguyên O của vi khuẩn P. multocida được cấu tạo từ gluxit, lipid và protein.

Về đặc điểm sinh học, kháng nguyên O của vi khuẩn P. multocida không

khác với kháng nguyên O của các vi khuẩn khác. Kháng nguyên này có vai

trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch. Kháng nguyên K bao

quanh thân vi khuẩn giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn

cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên thân O và kháng thể O. (Carter, 1984 đã

sử dụng phản ứng kết tủa và dùng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp

cũng xác định vi khuẩn P. multocida có 4 serotype nhóm kháng nguyên K

đánh theo chữ cái in hoa A, B, C, D.

Kháng nguyên thân O có hai thành phần đặc hiệu và không đặc hiệu, các

chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau theo kháng nguyên thân; kháng

nguyên thân có 16 serotype đánh số từ 1 - 16 và cho rằng khuẩn lạc của P.

multocida chuyển từ dạng S sang dạng R thì vi khuẩn giữ được kháng nguyên

thân O và cũng theo tác giả cho biết ở Nhật Bản bệnh do P. multocida gây ra

ở lợn thuộc serotype A1 và D2.

Theo Rimler và Rhoades (1987) bằng phản ứng IHA đã bổ sung thêm

một serotype giáp mô mới của vi khuẩn P. multocida ký hiệu là F. Các tác giả

còn cho biết phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp là thích hợp cho việc

định serotype theo kháng nguyên K mà hiện nay nhiều phòng thí nghiệm trên

thế giới đang dùng. Khi nghiên cứu tại Nhật Bản cho thấy trong 116 chủng vi

khuẩn P. multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh tích nhục hóa, áp xe phổi và

viêm màng phổi có 81,9% thuộc serotype A; 18,1% thuộc serotype D. Đỗ

Ngọc Thuý và cs (2009) đã tiến hành xác định serotype giáp mô của chủng vi

khuẩn P. multocida phân lập được từ vật nuôi. Kết quả cho thấy hầu hết các

chủng phân lập được từ dịch ngoáy mũi của lợn khoẻ, phổi hoặc dịch hầu

họng của lợn tại lò mổ đều thuộc serotype A trừ một chủng phân lập từ lợn bị

viêm phổi thuộc serotype D.

1.2.1.4. Độc lực của vi khuẩn

Nhiều nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida cho thấy ở những

gia súc, gia cầm chết do vi khuẩn P. multocida gây ra, người ta tìm thấy dấu

hiệu hoạt động của độc tố. Diallo và cs (1995) khi nghiên cứu độc lực của 9

chủng P. multocida phân lập được thuộc serotype A tại Australia cho biết trong

9 chín chủng này có 3 chủng không chứa plasmid nhưng rất độc với chuột,

tiêm liều 100 CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trong vòng từ 10 - 24

giờ, trong khi đó 3 chủng phân lập có chứa 1 plasmid và 3 chủng có chứa 2

plasmid lại không có khả năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn. Vi khuẩn

P. multocida thuộc serotype D còn tạo ra dermanecrotic toxin (DNT) là độc tố

gây hoại tử biểu bì, độc tố này không bền với nhiệt. Trọng lượng phân tử của

dermanecrotic toxin khoảng 112 - 160 kDa và có thể tách ra từ canh trùng nuôi

cấy, gen toxA quy định tổng hợp dermanecrotic toxin có chiều dài 4.381 bp.

Nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30oC thì hoạt tính của gen toxA này bị giảm nhiều và

số lượng độc tố DNT sinh ra cũng ít đi (Hunt và cs, 2000). Chung và cs (2001)

khi kiểm tra, đánh giá độc lực của vi khuẩn P. multocida chủng X - 73, PBA

930 và PBA 945 thuộc serotype A trên chuột và gà đã cho thấy độc lực của

chủng X - 73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia, đối với chuột thì độc lực

của chủng PBA 930 là thấp nhất.

1.2.1.5 Khả năng đề kháng với kháng sinh

Vi khuẩn P. multocida gây bệnh ở gia súc tại Thái Lan chứa 2 loại

plasmid có khả năng đề kháng với kháng sinh. Loại plasmid thứ nhất là pJR1

chứa 6.792 bp và loại thứ hai là pJR2 chứa 5.252 bp.

- Plasmid pJR1 có 6 gen chính: gen thứ nhất (Sul II) quy định tính kháng

sulfamide, gen thứ 2 (tet G) quy định đặc tính kháng tetracyclin, gen thứ 3

(cat B2) quy định đặc tính kháng chloramphenicol, gen thứ 4 (rep) quy định

khả năng tái tạo protein của plasmid, gen thứ 5 và 6 (mbe Cy và deltambe Ay)

quy định qúa trình tổng hợp các protein liên quan đến khả năng di chuyển của

plasmid.

- Plasmid pJR2 có 5 gen chính: gen thứ nhất (deltain I1) có liên quan đến

khả năng hợp nhất của plasmid, gen thứ 2 (aad A1) quy định đặc tính kháng

streptomycin, gen thứ 3 (bba P1) quy định đặc tính kháng ampicillin, gen thứ

4 và gen thứ 5 quy định khả năng tổng hợp của protein tham gia vào quá trình

tái tạo và phân ly plasmid (Wu và cs, 2003).

1.2.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. multocida

Vi khuẩn P. multocida có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ

phát gây ra bệnh viêm phổi ở lợn, bệnh có thể gây chết lợn hoặc làm giảm khả

năng tăng trọng của lợn do vậy gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi.

Theo Pijoan (1989), việc nhiễm P. multocida ở phổi lợn thường thấy ở

giai đoạn cuối của dịch viêm phổi địa phương hay hội chứng ho thở truyền

nhiễm do M. hyopneumoniae khởi phát hoặc ở những bệnh ghép.

1.2.2.1. Triệu chứng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra

rất khác nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn gây bệnh, thường xuất

hiện 3 thể:

- Thể cấp tính:

Thể này thông thường do hầu hết các chủng P. multocida thuộc

serotype B gây ra. Những con vật mắc bệnh thường có biểu hiện khó thở, hóp

bụng vào để thở, gõ vào bụng có âm đục “bịch, bịch”, sốt cao nhiệt độ lên tới

41 - 420C, tỷ lệ chết cao (5 - 40%). Ở những con vật chết và hấp hối có thể

thấy những vết đổi màu tím ở vùng bụng có thể là do sốc nội độc tố.

- Thể á cấp tính:

Ở thể này, hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở những lợn lớn.

Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường được coi là tiêu chuẩn xác định mức độ

nghiêm trọng của bệnh. Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này giống như

viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra, nhưng những đặc điểm phân

biệt chính là bệnh viêm phổi do P. multocida hiếm khi gây ra chết đột ngột,

hơn nữa lợn mắc bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra có thể tồn tại một

thời gian dài.

- Thể mãn tính:

Đây là thể đặc trưng thường thấy của bệnh, lợn bệnh thỉnh thoảng xuất

hiện ho, sốt nhẹ hoặc không. Những lợn bị bệnh thường ở giai đoạn lớn (10 -

16 tuần tuổi).

1.2.2.2. Bệnh tích

Bệnh tích do P. multocida gây ra chủ yếu ở phần xoang ngực và thường

đi kèm với bệnh tích của M. hyopneumoniae. Bệnh tích đặc trưng của bệnh

này xuất hiện ở thuỳ đỉnh và mặt trong của phổi, cùng với có bọt khí trong khí

quản. Có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và

vùng tổ chức phổi bình thường. Phần bị ảnh hưởng của phổi có sự biến đổi

màu sắc từ màu đỏ sang màu xám xanh phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh.

Bệnh nặng có thể xuất hiện viêm màng phổi và áp xe ở các mức độ

khác nhau. Lúc này màng phổi dính chặt vào thành xoang ngực và màng phổi

có vùng mờ đục, khô. Đây chính là bệnh tích chủ yếu để phân biệt bệnh viêm

phổi do Pasteurella với viêm phổi do Actinobacillus, trong đó thường thấy

mủ chảy ra có màu vàng và dính cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan, 1989).

Ở thuỳ phụ có dịch rỉ viêm của phế quản. Mức độ nghiêm trọng của

viêm phế quản là do sự tăng sản của tế bào nội mô và sự có mặt rất nhiều các

tế bào bạch cầu trung tính trong mủ nhầy (chất tiết nhầy có mủ) ở phế quản và

trong phế nang. Bệnh tích này là không đặc trưng cho sự nhiễm khuẩn P.

multocida mà nó phổ biến cho mọi trường hợp viêm phổi do nhiễm khuẩn.

Dấu hiệu bệnh này cũng thể hiện mối liên quan giữa bệnh viêm phế

quản do Pasteurella với bệnh viêm cầu thận, cũng do Pasteurella

(Buttenschon, 1991). Tác giả này cũng kết luận rằng hai bệnh này có liên

quan với nhau bởi quá trình vi khuẩn phát tán từ những bệnh tích ở phổi.

1.2.2.3. Chẩn đoán

Việc chẩn đoán đúng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra là hết sức

cần thiết, do đó cần tiến hành đồng thời nhiều phương pháp như: Dịch tễ học,

chẩn đoán lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và đặc biệt là dựa trên kết quả xét

nghiệm vi khuẩn học trong phòng thí nghiệm.

Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn tương đối dễ nuôi cấy, phân lập

trong phòng thí nghiệm. Những mẫu bệnh phẩm tốt nhất để phân lập vi khuẩn

bao gồm: Dịch khí quản và tổ chức phổi được lấy ở vùng ranh giới giữa tổ

chức bị tổn thương và tổ chức bình thường. Những mẫu dịch ngoáy mũi,

ngoáy họng bằng tăm bông cũng được xem là mẫu tốt cho việc phân lập P.

multocida, những mẫu này nên được giữ trong môi trường vận chuyển phù

hợp. Mẫu bệnh phẩm phải được đưa đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng

tốt, tránh bị tạp nhiễm và tất cả các mẫu phải được bảo quản lạnh (4 – 80C)

cho đến khi phân lập, nuôi cấy vi khuẩn.

Bên cạnh đó còn có thể sử dụng các phương pháp khác như: Phản ứng

kết tủa khuếch tán miễn dịch trên gel thạch AGID (Agargel Immuno Diffuse)

để xác định kháng nguyên thân (O) từ vi khuẩn phân lập được với kháng

huyết thanh chuẩn, phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính để định loại

kháng nguyên giáp mô (K), phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để xác

định kháng nguyên giáp mô, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction),...

Việc xác định chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được thuộc

serotype nào để xác định được thể bệnh mà chúng gây ra, từ đó có biện pháp

phòng trị bệnh phù hợp. Kỹ thuật PCR gần đây đã được ứng dụng rộng rãi

trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ở vật nuôi, trong đó

có P. multocida và đã được OIE chuẩn hóa thành quy trình chung, có thể áp

dụng ở các phòng thí nghiệm để định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida.

1.2.2.4. Phòng bệnh

Để phòng bệnh cần tiến hành đồng thời nhiều biện pháp để phòng các

bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra nói

riêng như: Giữ vệ sinh chuồng trại, chuồng nuôi thông thoáng, hợp lý, quản lý

chăm sóc tốt, nhất là thức ăn, nước uống cho lợn phải đầy đủ.

*Phòng bệnh bằng vắc xin

+ Vắc xin vô hoạt: ở Việt Nam đã và đang sử dụng các loại vắc xin vô

hoạt để phòng bệnh tụ huyết trùng cho lợn bao gồm:

Vắc xin tụ huyết trùng lợn keo phèn: chế từ chủng P. multocida Trung

Quốc do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương và Công ty thuốc thú y Trung

ương sản xuất; với ưu điểm của vắc xin là có miễn dịch cao, độ an toàn tốt, dễ

bảo quản và hiện nay đang được dùng rộng rãi.

Vắc xin tụ dấu do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất bằng

phương pháp lên men sục khí nên có đậm độ vi khuẩn cao, đang được sử

dụng rộng rãi tại tất cả các tỉnh phía Bắc.

Phan Thanh Phượng và cs (1994), Viện Thú y Quốc gia đã chế tạo

thành công một vắc xin kép dạng mới, đó là vắc xin tụ dấu nhũ hoá. Đây là

một vắc xin chết có bổ trợ dầu khoáng, tiêm một mũi có thể phòng được cả

hai bệnh: đóng dấu và tụ huyết trùng lợn. Liều tiêm lợn dưới 25kg là 2ml, cho

lợn trên 25kg là 3ml. Độ dài miễn dịch 4-8 tháng. Vắc xin này phù hợp với

những vùng xa xôi hẻo lánh vì điều kiện bảo quản đơn giản, mà hiệu lực miễn

dịch vẫn được đảm bảo. Tất cả các chủng vi khuẩn P. multocida dùng sản

xuất vắc xin đều thuộc serotype B hiệu lực đạt yêu cầu, nhưng mỗi loại phù

hợp và có hiệu lực phòng bệnh cao với từng vùng.

+ Vắc xin nhược độc: với chương trình nghiên cứu Công nghệ sinh

học cấp nhà nước mã số KHCN 02-03 do GS.TSKH Phan Thanh Phượng chủ

trì đã nghiệm thu thành công vắc xin phối hợp, một mũi có thể phòng được 4

bệnh đỏ của lợn: bệnh đóng dấu, tụ huyết trùng, phó thương hàn và dịch tả

lợn. Việc phối hợp đông khô 3 loại vi trùng được tiến hành theo phương pháp

thường qui, riêng dịch tả lợn được đông khô riêng, đặc biệt việc vô trùng

được tiến hành bằng kỹ thuật cao, nên khi phối hợp để tiêm cùng lúc với 3

loại vi khuẩn của 3 bệnh kia không gây tác dụng xấu lên kháng nguyên vi

khuẩn nhược độc. Một mũi tiêm phòng được 4 bệnh không những tạo được

miễn dịch cao như tiêm vắc xin đơn mà còn giảm được chi phí tiêm phòng.

Hiện nay, vắc xin nhược độc đa giá này được phép sản xuất tại phân Viện Thú

y miền trung để sử dụng trong cả nước (Phan Thanh Phượng và cs, 2006).

1.2.2.5. Điều trị

Việc nghiên cứu điều trị bệnh do P. multocida bằng kháng sinh đã được

quan tâm từ lâu. Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bình (1996), P.

multocida phân lập từ gia cầm ở Long An mẫn cảm với các loại kháng sinh:

spectinomycin 100%, flumequin 100%, nitrofuratonin 98%, colistin 90%... và

thấy rằng phần lớn những kháng sinh mới nhập vào thị trường Việt Nam đều

có tác dụng mạnh với P. multocida.

Salmon và cs (1995) đã làm phản ứng kiểm tra các chủng vi khuẩn

phân lập từ một số quốc gia và đã nhận thấy các loại cephalosporin và

enrofloxacin có tác động tốt nhất và các loại erythromycin, sulfamethazine và

lincomycin có tác động kém trong phòng thí nghiệm.

Một số thuốc kháng sinh đã được dùng có hiệu quả cho điều trị P.

multocida: lincomycin-spectinomycin, một số cephalosporin và nhiều

quinolon: enrofloxacin và danofloxacin. Trong đó ceftiofur đã được một số

tác giả chứng minh là kháng sinh tốt để chống lại vi khuẩn P. multocida.

Tuy nhiên, để điều trị có hiệu quả bệnh đường hô hấp do vi khuẩn P.

multocida gây ra phải dựa trên kết quả kháng sinh đồ vì vi khuẩn rất dễ kháng

thuốc và thường kết hợp gây bệnh với một số loại vi khuẩn đường hô hấp

khác như Mycoplasma, Actinobacillus,...

1.2.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn P. multocida và bệnh viêm phổi lợn

do vi khuẩn P. multocida gây ra

1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, Đỗ Quốc Tuấn và Nguyễn Quang Tuyên (2007) cho biết 25

chủng P. multocida phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh mẫn cảm

cao với các kháng sinh như chlotetracyclin, neomycin và ampicillin; sau đó tác giả

xác định mức độ mẫn cảm của các chủng P. multocida phân lập được ở lợn tại

một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam với một số kháng sinh thông dụng đã cho

thấy các chủng P. multocida mẫn cảm cao với norfloxacin, lincomycin và

neomycin. Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) cũng cho biết các chủng

P. multocida phân lập được ở lợn mắc PRRS mẫn cảm cao với các kháng sinh

như amoxicillin (100%), ampicillin (66,67%), gentamicin (66,67%) và kháng

mạnh các kháng sinh như streptomycin, enrofloxacin, colistin.

Vi khuẩn P. multocida phân lập được từ gia súc tại các tỉnh Cao Bằng và

Hà Giang có độc lực mạnh, đã gây chết từ 80% đến 100% chuột thí nghiệm

trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc (Đặng Xuân Bình và cs, 2010).

1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bệnh viêm phổi do P. multocida xuất hiện rộng khắp trên thế giới

nhưng bệnh hay xảy ra và gây thiệt hại ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới

như: Ấn Độ, Pakistan, Iran, Irắc, Thái Lan, Philippin, Indonesia, Lào,

Campuchia, Triều Tiên và Việt Nam, ở tất cả các điều kiện khí hậu và điều

kiện chăn nuôi.

1.3. Vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra.

1.3.1. Vi khuẩn S. suis 1.3.1.1. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn S. suis thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae, bộ

Lactobacillales, lớp Bacilli. S. suis là loại vi khuẩn hình cầu hoặc bầu dục, đường kính có khi đến 1m . Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không di động,

thường xếp thành chuỗi từ hai vi khuẩn trở lên, độ dài của chuỗi phụ thuộc vào

môi trường nuôi cấy:

- Trong bệnh phẩm, vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn như chuỗi hạt, thường có

từ 2-8 đơn vị.

- Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng, vi khuẩn hình thành chuỗi

dài. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae và Streptococcus equi có chuỗi từ

10-100 đơn vị.

- Ở môi trường đặc, liên cầu hình thành chuỗi ngắn.

Các vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là dạng hình cầu. Trong

canh trùng già, sau 30 – 48 giờ nuôi cấy có thể thấy thay đổi tính chất bắt màu

và chuỗi cũng dài hơn lên. Đặc biệt ở môi trường nuôi cấy có 5% huyết thanh

thì hình thái chuỗi vi khuẩn được nhìn thấy rõ nhất.

Hầu hết Streptococcus phát triển trong các môi trường hiếu khí hay

yếm khí tùy tiện, mọc tốt ở các loại môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt

độ là 37oC. Đôi khi có một số chủng vi khuẩn đòi hỏi hiếu khí nghiêm ngặt.

Trong môi trường nước thịt, vi khuẩn mọc tốt, lúc đầu môi trường đục

đều. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành những hạt hoặc những

cụm bông lắng xuống đáy ống nghiệm, lớp nước trong bên trên và dưới đáy

ống có cặn.

Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S,

màu hơi xám.

Trên môi trường thạch máu, Streptococcus mọc tốt, đa số vi khuẩn gây

dung huyết và một số không gây dung huyết. Dựa vào mức độ dung huyết

người ta phân ra làm 3 loại (Taylor và cs, 1990)

- Dạng a : Vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường màu xanh lơ

do tác động của Streptococcus làm cho Hemoglobin biến thành Met-

hemoglobin, xung quanh khuẩn lạc là vùng tan máu. Đây là hiện tượng dung

huyết từng phần hoặc không hoàn toàn.

Liên cầu khuẩn thuộc loại này gọi là liên cầu dung huyết nhóm a , độc

lực của nhóm này không cao.

- Dạng b : Vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc rõ và trong suốt do

Hemoglobin được phủ hoàn toàn. Đây thường là nhóm phụ Streptococcus gây

bệnh cho người.

Liên cầu thuộc dạng này gọi là liên cầu dung huyết nhóm b , nhóm vi

khuẩn có độc lực cao.

- Dạng g : Xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu, hồng cầu vẫn

giữ nguyên màu hồng.

Liên cầu khuẩn thuộc dạng này không có khả năng làm dung huyết

thạch máu, thường là vi khuẩn không gây bệnh.

Khương Bích Ngọc, 1996 trong quá trình nghiên cứu đã có nhận xét:

khả năng gây bệnh của vi khuẩn thuộc nhóm cầu khuẩn phụ thuộc rất nhiều

vào yếu tố gây dung huyết của mầm bệnh. Các yếu tố dung huyết lại phụ

thuộc vào mầm bệnh phân lập được ở giai đoạn đầu, giai đoạn giữa hay giai

đoạn cuối của quá trình sinh bệnh. Ở giai đoạn đầu của bệnh hoặc các ổ dịch

mới phát hiện lần đầu và có tính chất ồ ạt thì tỷ lệ vi khuẩn Streptococcus là 48,33% và dạng a thường gây dung huyết dạng b là 35,00%.

1.3.1.2. Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn Streptococcus gây bệnh ở lợn có khả năng lên men một số

đường: glucose, lactose, saccarose, trehalose, maltose, fructose…, không có

khả năng lên men một số đường như: dulciton, mannit, innulin…

Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 tính chất không lên men đường

innulin là đặc tính quan trọng vì nhờ nó chúng ta phân biệt được các chủng

gây bệnh.

Vi khuẩn không có men Oxydase và men Catalase nên phản ứng

Oxydase, Catalase âm tính.

- Phản ứng sinh Indol âm tính.

- Phản ứng sinh H2S âm tính.

Theo Nguyễn Như Thanh, 2001, Streptococcus có khả năng sinh các

loại men:

- Streptokinase: Có tác dụng làm tan tơ huyết, men này có tính kháng

nguyên cao, kích thích cơ thể hình thành kháng thể.

- Streptodonase: Có tác dụng làm lỏng mủ đặc, hoạt động của chúng

chỉ có tác dụng khi có mặt ion Mg++.

- Hyaluronidase: Men này có tác dụng phân hủy axit Hyaluronic gây

nhão mô, giúp vi khuẩn tăng khả năng lan tràn.

Ngoài ra Streptococcus còn có khả năng sinh men Diphotpho- Pyridin-

Nucleotidase (làm chết bạch cầu), Proteinase (có tác dụng phân hủy Protein,

nếu tiêm liều cao cho động vật sẽ gây nên các tổn thương ở tim).

1.3.1.3. Giáp mô và các yếu tố độc lực

Những nghiên cứu của nhiều tác giả đều khẳng định rằng nhóm vi

khuẩn Streptococcus không hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mô, sự

hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các mô

hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh.

Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1987, trong phòng thí nghiệm, bằng phương

pháp tiêm canh khuẩn vào tĩnh mạch hay xoang phúc mạc, nếu vi khuẩn có

độc lực sẽ gây chết chuột bạch và thỏ do bại huyết.

Roger, 1991 thấy rằng các xoang của cơ thể vật chủ khỏe mạnh là nơi

cư trú mầm bệnh Streptococcus độc hay không độc và rất dễ bài xuất mầm

bệnh ra ngoài. Bởi vậy, vật khỏe mạnh mang trùng là rất đáng quan tâm, điều

này phù hợp với kết luận của Burrow và Moulder, 1968. Ông cho rằng, viêm

phổi viêm màng não do vi khuẩn Streptococcus ít khi các tác nhân gây bệnh

được truyền từ vật mắc bệnh, từ con ốm, đa số được truyền từ con vật lành

mang vi khuẩn.

1.3.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra

Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn do vi khuẩn S. suis gây nên, hiện có 20

nhóm huyết thanh và 25 type khác nhau. Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh ở

lợn đều thuộc type 1 và type 2.

S. suis thường thấy ở vùng mũi họng của lợn nhà mà không gây bệnh.

Tuy nhiên, khi gặp một số điều kiện thuận lợi chúng có thể gây bệnh cho đàn

lợn. S. suis nhiễm phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi đến sau cai sữa vài

tuần, đặc biệt S. suis type 2 có thể gây bệnh cho người.

1.3.2.1. Triệu chứng

Triệu chứng của các thể bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra rất

phức tạp, khó nhận biết và khó phân biệt khi mà bệnh có hiện tượng bội

nhiễm, kế phát bởi một số vi khuẩn khác.

Viêm màng não và viêm khớp có thể xảy ra riêng rẽ hoặc kết hợp phổ

biến ở lợn 2 - 6 tuần tuổi, lợn con bị nhiễm trong cùng một ổ mắc nặng hơn.

Biểu hiện của thể viêm màng não là phản ứng toàn thân như sốt, biếng ăn và

cơ thể suy sụp. Lợn con đứng trên đầu ngón chân, bước đi cứng nhắc, phần

sau thân đu đưa, tai xuôi ép về phía thân. Lợn có thể bị mù, co giật cơ, mất

cân bằng, nằm nghiêng một bên, chân đạp bơi chèo rồi chết. Một số trường

hợp viêm rốn, viêm nội tâm mạc ở lợn thường thấy khi hôn mê hoặc chết

không có biểu hiện triệu chứng trước đó.

Vi khuẩn có thể phân lập từ dịch khớp, dịch não tuỷ, máu, mô não,

phổi, mẫu swab, từ hạch amidan của lợn khoẻ.

Liên cầu khuẩn (Streptococcus suis) gây ra nhiều thể bệnh khác nhau ở

các loài vật tuỳ theo chủng gây bệnh. Một số thể bệnh thường gặp như sau:

- Thể nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng huyết cấp tính do liên cầu xảy ra rải rác ở lợn nái và lợn

con theo mẹ. Bệnh xảy ra làm chết lợn đột ngột trong vòng 12 đến 48 giờ.

Triệu chứng gồm: cơ thể suy yếu, nằm phủ phục, sốt, thở khó, đi kiết, huyết

niệu. Mổ khám thấy xuất huyết điểm hoặc tràn lan ở hầu hết nội tạng. Những

con sống sót sau vài ngày mắc bệnh: phổi bị phù và chắc đặc. Bệnh lây khá

nhanh và tỷ lệ chết cao nếu như không dùng kháng sinh tác dụng tốt với vi

khuẩn để điều trị dự phòng.

- Thể viêm não và màng não

Viêm não và màng não khá phổ biến do nhiễm trùng huyết của

Streptoccocus ở con vật sơ sinh, nhưng cũng gặp ở lợn sau cai sữa 10 đến 14

tuần tuổi và lợn lớn hơn đến 6 tháng tuổi. Thể bệnh này ở lợn thường do S.

suis type 2 gây ra. Con vật biểu hiện chậm chạp, mất phối hợp, co giật từng

cơn, giật nhãn cầu. Bệnh tiến triển nhanh trong vòng 4 giờ và thường không

biểu hiện ốm trước khi chết.

- Thể viêm da

Viêm da truyền nhiễm ở lợn đặc trưng bởi mụn mủ ở mặt, cổ, gặp ít

hơn ở thân. Trong ổ mủ phát hiện cả liên cầu và tụ cầu. Bệnh lây lan qua vết

trầy xước ngoài da, đặc biệt ở lợn con khi cắn nhau, những lợn con này không

được cắt răng nanh. Bệnh có thể nhầm lẫn với viêm da do thẩm xuất.

1.3.2.2. Bệnh tích

Lợn chết do S. suis type 2, bệnh tích đại thể, vi thể bao gồm một hoặc

nhiều ổ viêm tương mạc hoá mủ, viêm phổi và màng phổi xuất huyết hoặc

viêm tơ huyết, viêm màng não mủ, viêm cơ tim, thoái hoá xuất huyết, viêm

van tim hai lá. Trong trường hợp viêm màng não, dịch não tuỷ bị đục, xung

huyết và viêm màng não tích tụ thể trắng, ổ mủ ở vùng dưới nhện. Hầu hết

các trường hợp hệ thống mạng lưới võng mạc nội mô bị ảnh hưởng nặng, các

mạch máu ở tâm thất, não và tuỷ sống bị tắc nghẽn do dịch thẩm xuất, nhiều

khi gây ra phù não. Mô thần kinh của tuỷ sống, tiểu não và cuống não có thể

biểu hiện thoái hoá dạng lỏng.

1.3.2.3. Chẩn đoán

Có thể thấy viêm khớp rải rác ở lợn do tụ cầu trùng nhưng phổ biến hơn

vẫn là do liên cầu trùng. Viêm khớp do Mycoplasma hyorhinis sinh mủ ít hơn,

do đó cần phải nuôi cấy xác định. Bệnh glasser (bệnh gây ra bởi Haemophilus

spp biểu hiện viêm đa khớp cấp tính, viêm màng phổi, viêm bao tim và viêm

phúc mạc) thường xảy ra ở lợn lớn hơn và kèm theo viêm màng phổi và phúc

mạc. Bệnh đóng dấu lợn ở lợn con thường biểu hiện nhiễm trùng huyết. Tuy

nhiên, thể viêm màng não do nhiễm Streptococcus có thể dễ nhầm lẫn với

viêm não do vi rút. S. suis type 2 cũng có thể gây viêm màng não ở lợn lớn từ

10-14 tuần tuổi.

1.3.2.4. Phòng và trị bệnh

Theo Clifton-Hadley và cs, 1986 để phòng bệnh, biện pháp vệ sinh

chuồng trại, chăm sóc nuôi dưỡng, quản lý và phân đàn, chia ô là yếu tố vô

cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn. Việc diệt trừ tận gốc mầm

bệnh bằng cách giảm mật độ và nuôi trong các ô chuồng sạch sẽ là điều kiện

cần thiết và có hiệu quả.

*Phòng bệnh bằng vắc xin

Hiện nay, các loại vắc xin được sử dụng để phòng bệnh do S. suis gây

ra cho lợn chủ yếu là các vắc xin chuồng (autogenous vắc xin) và hiệu quả

bảo hộ của các loại vắc xin này cũng chưa được xác định một cách rõ ràng.

Có thể liệt kê ra một số nguyên nhân của hiện tượng này như sự thoái hoá của

kháng nguyên bảo hộ hoặc vi khuẩn bị mất tính kháng nguyên do quá trình xử

lý bằng nhiệt hoặc formalin, do sự sản sinh kháng thể đối với các kháng

nguyên mà không có liên quan đến độc lực của vi khuẩn và sự thiếu hụt các

chủng S. suis hay serotype liên quan đến quá trình sinh bệnh học (Higgins và

cs, 2002). Các nhà khoa học cũng đã chế tạo thử nghiệm nhiều loại vắc xin

khác nhau như vắc xin toàn khuẩn, vắc xin sống nhược độc, vắc xin tiểu phần

(chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào). Tuy nhiên,

miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm được tiêm các loại vắc xin này

cũng rất thất thường và không ổn định. Trong một số trường hợp khẩn cấp,

việc lựa chọn dùng vắc xin vẫn là phương thức tối ưu nhất để bảo vệ đàn lợn.

1.3.2.4. Điều trị bệnh

Trong một vài thử nghiệm tính mẫn cảm kháng sinh cho thấy vi khuẩn

mẫn cảm với ampicillin, penicillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, kháng

với lincomycin, erythromycin, neomycin, streptomycin và tetracyclin. Trong

thí nghiệm khác lại cho thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập được mẫn cảm

với penicillin và ampicillin, 1/3 kháng với trimethoprim-sulfamethoxazole,

kháng rất mạnh với nitrofuran và tetracyclin. Tính mẫn cảm với penicillin có

thể không lâu dài với tất cả các chủng S. suis vì vậy nếu dùng lâu phải đánh

giá lại tính mẫn cảm.

1.3.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn S. suis và bệnh viêm phổi lợn do vi

khuẩn S. suis gây ra

1.3.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu về bệnh cầu khuẩn ở lợn,

Khương Thị Bích Ngọc (1996) đã chế tạo vắc xin cầu khuẩn chết có bổ trợ

keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt hiệu quả bảo hộ tương đối cao. Tuy

nhiên, hiện nay việc sử dụng vắc xin cầu khuẩn để tiêm phòng cho đàn lợn ở

nước ta chưa được phổ biến rộng dãi, bệnh liên cầu khuẩn vẫn thường xuyên

xẩy ra ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi.

1.3.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Tại Trung Quốc, năm 1994 đã dùng vắc xin đông khô chế từ chủng

nhược độc của vi khuẩn S. suis chủng ST.171, tiêm cho lợn từ cai sữa đến

trưởng thành và nái có chửa ở thời kỳ đầu. Khi sử dụng cho thêm nước

muối sinh lý có bổ trợ keo phèn 20% hoà thành huyễn dịch tiêm dưới da

hoặc tiêm bắp với liều 1ml/con. Sau khi tiêm 7 ngày đã sinh miễn dịch,

miễn dịch cao nhất sau 14 ngày và thời gian miễn dịch kéo dài được 6

tháng. Sau đó vào năm 2005, chính Trung Quốc cũng đã kiểm soát được

bệnh do S. suis gây ra ở lợn bằng vắc xin vô hoạt chế từ các chủng S. suis

serotype 2 (Lê Văn Tạo, 2005).

Chương 2

NỘI DUNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Lợn nghi mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra.

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn đã được lựa chọn để chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi

cho lợn. Gồm có: Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a

và 5b, vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D, vi khuẩn

Streptococcus suis serotype 2 và nghiên cứu thử nghiệm vắc xin đa giá nhũ

dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

- Ba địa điểm thuộc tỉnh Thái Nguyên (huyện Phú Lương, thành phố Thái

Nguyên, thị xã Phổ Yên).

- Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia.

- Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet

2.1.3. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 7/2018 đến tháng 7/2019.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và

5b ; P. multocida serotype A và D và Streptococcus suis serotype 2 có độc lực

cao, tính kháng nguyên ổn định để nghiên cứu thử nghiệm vắc xin phòng

bệnh viêm phổi ở lợn.

- Kiểm nghiệm vắc xin đa giá nhũ dầu chế tạo được.

- Xác định hiệu lực phòng bệnh viêm phổi của vắc xin đa giá nhũ dầu ở

phòng thí nghiệm và thực địa trên đàn lợn nuôi tại Thái Nguyên.

- Đánh giá hiệu quả của vắc xin phòng bệnh viêm phổi ở lợn.

2.3. Nguyên vật liệu

2.3.1. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo vắc xin đa giá

nhũ dầu phòng viêm phổi ở lợn

- Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid

(Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch

máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB...

- Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính

sinh hóa của vi khuẩn: Môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung

dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%...

- NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.

- Chất bổ trợ nhũ dầu so công ty Seppic- CHLB Đức.

2.3.2. Động vật thí nghiệm

- Chuột bạch dòng Swiss nuôi sạch bệnh tại Viện Thú y Quốc gia, khối

lượng 18-20 g/con;

- Lợn 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, chưa được tiêm vắc xin phòng viêm phổi.

2.3.3. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm

- Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất

dùng để sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ...

- Dây chuyền công nghệ chế tạo vắc xin quy mô công nghiệp như bộ máy lên

men sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của CHLB Đức; hệ thống ra chai vắc xin

tự động của Ý...

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn

Mẫu canh khuẩn cần xác định được lấy vô trùng, sau đó pha loãng canh

khuẩn với nước muối sinh lý vô trùng thành các độ pha loãng khác nhau từ 10-1

đến 10-8. Dùng 3 độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa

thạch máu mỗi đĩa nhỏ 0,1ml, dàn đều trên mặt thạch. Sau 18 giờ nuôi cấy ở tủ

ấm 370C, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc ở các đĩa thạch.

Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo công thức CFU:

X = a x N x 10 (X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn;

N là hệ số pha loãng; a: Số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh

khuẩn pha loãng).

2.4.4. Phương pháp chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn

Lựa chọn các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và

Streptococcus suis thuộc các serotype đặc trưng, mang đầy đủ các yếu tố gây

bệnh và có độc lực cao để sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vắc xin đa

giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn.

* Phương pháp chế tạo thử nghiệm vắc xin nhũ dầu:

Vắc xin được chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt

toàn khuẩn có bổ trợ nhũ dầu, bằng phương pháp lên men sục khí tại Nhà máy

vắc xin, Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet. Quy trình tóm tắt được trình

bày ở hình 2.1 (phụ lục 1).

- Kiểm tra thuần khiết của canh trùng chế tạo vắc xin

Kiểm tra thuần khiết được tiến hành song song với các bước nuôi cấy

canh trùng riêng rẽ của từng chủng vi khuẩn từ giống sản xuất nhỏ đến nhỡ

và lớn. Tiến hành lấy mẫu để kiểm tra thuần khiết bằng cách: phết tiêu bản,

nhuộm Gram, đồng thời nuôi cấy trên các loại môi trường (nước thịt thường,

nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey). Sau khi các canh trùng

vi khuẩn riêng của giống sản xuất lớn được đếm số vi khuẩn và đạt tiêu chuẩn

thuần khiết, các canh trùng được phối hợp với nhau theo tỷ lệ xác định.

* Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vắc xin

- Kiểm tra vô trùng của vắc xin thử nghiệm

Từ mỗi lô vắc xin, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường

nuôi cấy vi khuẩn thích hợp như môi trường thạch thường, thạch máu, thạch

TSA (có bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, nước

thịt gan yếm khí, thạch nấm. Các ống môi trường, sau khi cấy được bồi dưỡng

ở tủ ấm 370C có bổ sung 5% CO2, riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phòng.

Mỗi ngày đọc kết quả 1 lần. Nếu sau 7 ngày không có bất cứ một loại vi khuẩn

nào mọc trên các môi trường thì vắc xin được coi là đạt tiêu chuẩn vô trùng.

- Kiểm tra an toàn trên chuột bạch

Đối với mỗi lô vắc xin: dùng 15 chuột bạch khoẻ chia làm 2 lô. Lô thí

nghiệm gồm 10 con được tiêm vắc xin vào xoang phúc mạc 5 con, đường tĩnh

mạch đuôi 5 con. Lô đối chứng gồm 5 con tiêm 0,5 ml nước sinh lý vào phúc

xoang. Theo dõi chuột trong 10 ngày. Vắc xin đạt chỉ tiêu an toàn khi chuột ở

các lô thí nghiệm và đối chứng đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu

hiện phản ứng sau khi tiêm qua thời gian theo dõi.

- Kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phương pháp thay thế trên chuột bạch

Đối với mỗi lô vắc xin được tiêm cho 10 chuột bạch khỏe bằng đường

tiêm dưới da, liều 0,2 ml/con và tiêm lập lại mũi 2 sau 7 ngày, liều 0,2 ml/con; 5

con chuột đối chứng không tiêm vắc xin. Sau 21 ngày tiêm vắc xin mũi thứ nhất,

tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn của các chủng chế vắc xin với

liều 10LD50 cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. Theo dõi trong 10

ngày, lô vắc xin được đánh giá đạt hiệu lực trong phương pháp kiểm tra thay thế

nếu chuột đối chứng chết hết, trong khi lô thí nghiệm số chuột còn sống 3/4 là

đạt yêu cầu.

2.4.5. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của

đàn lợn sau tiêm phòng vắc xin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn

do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida và S. suis

Dựa theo hướng dẫn và quy chế giám sát vật nuôi sau tiêm phòng, chúng

tôi tiến hành giám sát đàn lợn sau khi tiêm vắc xin đa giá ngoài thực địa.

* Giám sát lâm sàng

Khảo sát độ an toàn của vắc xin đối với đàn lợn sau mỗi lần tiêm phòng,

chúng tôi tiến hành theo dõi thông qua điều tra trực tiếp một số đàn lợn theo

dõi trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên.

* Giám sát huyết thanh

Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên được

tiêm vắc xin đa giá tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày,

120 ngày và 150 ngày.

* Thu thập mẫu huyết thanh

Đối tượng lấy mẫu là huyết thanh lợn trước và sau khi tiêm vắc xin đa giá

phòng bệnh viêm phổi ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên.

Sát trùng bằng bông cồn ở tĩnh mạch rìa tai. Dùng bơm tiêm loại 5ml,

chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hướng đầu kim vào phía trong cơ thể lợn,

lấy 2- 3 ml máu/lợn, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy

nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh;

Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C (Bảo quản trong hộp xốp đựng

đá) trong vòng 48h, nếu bảo quản lâu hơn giữ ở nhiệt độ -200C;

Mẫu huyết thanh được vận chuyển tới Bộ môn Vi trùng thuộc Viện Thú

y Quốc gia trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi

bệnh phẩm kèm theo.

* Kiểm tra hiệu giá kháng thể ở lợn sau tiêm vắc xin

- Chọn 25 lợn 6 tuần tuổi khỏe mạnh, chưa được tiêm phòng bất kỳ loại

vắc xin nào có thành phần vi khuẩn giống với vi khuẩn A. pleuropneumoniae;

P. multocida và Streptococcus suis. Bằng phương pháp kiểm tra hiệu giá

kháng thể có trong máu lợn trước khi tiêm vắc xin, lợn có hiệu giá kháng thể

âm tính hoặc 1/2 mới sử dụng làm lợn thí nghiệm.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

+ Lô thí nghiệm: Gồm 20 lợn, được tiêm 2 mũi vắc xin đa giá phòng

bệnh viêm phổi với liều 2 ml/con/liều, mũi 2 cách mũi 1 một tuần.

+ Lô đối chứng: Gồm 5 lợn không được tiêm vắc xin đa giá.

- Các lợn thí nghiệm được nuôi chung trong cùng một ô chuồng và

được xác định trọng lượng trung bình trước và sau khi tiêm vắc xin thử

nghiệm. Tiến hành theo dõi trạng thái, biểu hiện lâm sàng của các lợn

trước và sau khi tiêm vắc xin.

- Tiến hành lấy mẫu máu vào các thời điểm: trước khi tiêm vắc xin và

sau khi tiêm vắc xin mũi thứ nhất được 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng và 5

tháng. Xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm bằng phản ứng ngưng

kết hồng cầu gián tiếp (Indirect Haemaglunation test - IHA). Theo quy trình

thường qui của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. Vắc xin có hiệu lực

phòng bệnh khi hiệu giá kháng thể ngưng kết phải đạt ≥ 1/16 sau 3 tháng lợn

được tiêm vắc xin.

2.4.6. Phương pháp tính LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis trên chuột

Cách tiến hành: canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

pha loãng hệ số 10, mỗi nồng độ tiêm cho 5 chuột với liều 0,2ml canh

trùng/con, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.

Công thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):

LgLD

LgA

a 50 ba

- · -

Trong đó, A là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột.

a là tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%).

b là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là

nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột.

d là lg của nồng độ pha loãng.

2.4.7. Phương pháp xác định độc lực trên động vật thí nghiệm

Xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis phân lập được trên động vật thí nghiệm theo phương pháp thường qui

của bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Cù Hữu Phú, 2011).

Canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được chuẩn bị

bằng cách nuôi các vi khuẩn này vào môi trường TYE, bồi dưỡng ở 370C trong 24

giờ (5% CO2).

Canh trùng nuôi cấy mỗi chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis được tiêm cho 2 chuột bạch, mỗi chuột thí nghiệm được tiêm 0,5 ml

canh trùng vào xoang phúc mạc.

Theo dõi số chuột sống và chết trong thời gian 7 ngày.

Khi chuột chết tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy máu tim, nuôi

cấy và phân lập lại vi khuẩn.

2.4.8. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể ở lợn đã được tiêm vắc

(Indirect xin bằng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu

Haemaglunation test- IHA)

* Các bước tiến hành phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu - IHA

- Chuẩn bị kháng nguyên

Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae hoặc P. multocida và S. suis

chuẩn được cấy vào thạch máu và bồi dưỡng ở 37oC trong 18 giờ. Rửa mặt

thạch bằng nước sinh lý, đem ly tâm huyễn dịch vi khuẩn 8000 vòng/phút,

trong 15 phút, chất cặn ở đáy ống được giữ lại hoặc pha loãng với nước sinh

lý sẽ thu được huyễn dịch kháng nguyên. Huyễn dịch kháng nguyên thu được

đun ở 80oC/120 phút và ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút. Chắt lấy nước

trong, đây chính là kháng nguyên dùng cho phản ứng ngưng kết IHA.

- Chuẩn bị hồng cầu

Cấy máu cừu vào bình có chứa dung dịch Alsever (dùng chống đông

máu) theo tỷ lệ 1:1. Sau đó rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS ba lần rồi pha

thành dung dịch hồng câu 10% trong PBS.

Formalin hóa hồng cầu bằng cách: cho dung dịch hồng cầu 10% vào

bình tam giác, rồi cho vào túi cellophane có chứa formalin và PBS vào bình.

Tùy lượng hồng cầu mà tính lượng formalin thích hợp (tỷ lệ hồng cầu 10%:

formalin: dung dịch PBS là 10: 1: 2), đưa lên máy lắc trong khoảng 20 - 22

giờ, sau đó ly tâm rửa sạch hồng cầu bẩy lần bằng dung dịch PBS rồi pha

thành dung dịch treo 50% và được bảo quản trong tủ lạnh.

- Hấp thụ hồng cầu - kháng nguyên

Lấy 0,4ml hồng cầu 50% đã chuẩn bị cho vào 5 - 7ml kháng nguyên để

37oC trong 2 giờ. Hồng cầu hấp thụ kháng nguyên được rửa 3 lần bằng cách

ly tâm với dung dịch PBS có thêm 0,3ml Formol, bảo quản 4 - 100C. Khi

dùng hồng cầu làm phản ứng thì pha bằng dung dịch PBS để có nồng độ 1%.

- Huyết thanh cần xác định hiệu giá kháng thể được lấy từ máu lợn đã

được tiêm Autovắc xin chế tạo từ các chủng A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis phân lập được và lợn thí nghiệm đối chứng. Mỗi mẫu

huyết thanh được chia thành các tỷ lệ: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64.

Tiến hành phảm ứng: phản ứng tiến hành trên tấm nhựa 96 lỗ đáy tròn.

- Đánh giá kết quả: đọc kết quả lần đầu sau 4 giờ và lần 2 sau 24 giờ.

+ Phản ứng dương tính: hồng cầu ngưng kết thành lớp mỏng đều dưới

đáy ống.

+ Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy ống thành cục tròn.

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

2.5.1. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ

- Công thức tính hiệu lực tiêm phòng (phụ lục 2). - Công thức tính c 2 để so sánh tần suất bệnh (phụ lục 2).

- Phương pháp xác định nguy cơ tương đối (RR) (phụ lục 2).

2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được, xử lý theo phương pháp toán học thông dụng

và thống kê sinh vật học, ứng dụng các phần mềm trong thống kê như Excel,

Minitab…

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vắc

xin thử nghiệm.

Qua 256 mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh viêm phổi phân lập được từ

những địa điểm khác nhau tại tỉnh Thái Nguyên trong ba năm 2017, 2018,

2019 đã xác định được 66 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, 89 chủng P.

multocida và 101 chủng S. suis. Các chủng vi khuẩn trên đã được kiểm tra,

giám định một số đặc tính, xác định serotype và được lưu giữ tại viện Thú y

Quốc gia, nhà máy vắc xin Marphavet. Ba loại vi khuẩn S.suis, P.multocida

và A. Pleuropneuminiae phân lập được từ đường hô hấp của lợn có đặc tính

hình thái, nuôi cấy, tính chất bắt mầu và các đặc tính sinh học giống như các

tài lieeujkinh điển đã mô tả.

Chúng tôi chỉ lựa chọn một số chủng điển hình để tiến hành kiểm tra làm

cơ sở lựa chọn các chủng chế tạo vắc xin thử. Vi khuÈn muèn g©y

bÖnh ®-îc th× ®iÒu kiÖn tiªn quyÕt lµ ph¶i cã ®éc

lùc. §Ó biÕt ®-îc c¸c chñng vi khuÈn ph©n lËp ®-îc

cã ®éc lùc hay kh«ng chúng tôi tiÕn hµnh kiÓm tra ®éc

lùc cña c¸c chñng vi khuÈn bằng phương pháp tiêm truyền động

vật thí nghiệm.

3.1.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

phân lập được

Tùy vào cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và các độc tố tạo nên độc lực

của các chủng A. pleuropneumoniae. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho

thấy những chủng A. pleuropneumoniae có kích thước lớn hơn và lớp vỏ dày

hơn, bám dính hơn có độc lực cao hơn những chủng độc lực thấp.

Sau khi đã xác định hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hóa học,

serotype thì việc kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là cần thiết nhằm

làm rõ vai trò gây bệnh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập

được và làm cơ sở lựa chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo vắc xin thử nghiệm.

Chúng tôi đã chọn 6 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae có đặc tính hình

thái, nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hoá học điển hình và đại diện cho ba serotype

2, 5a và 5b để xác định độc lực của chúng trên chuột bạch. Mỗi chủng A.

pleuropneumoniae được tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột thí nghiệm, sử dụng

canh trùng đã nuôi cấy 24 giờ ở 37oC trong điều kiện có 5 - 10% CO2, liều tiêm

0,5 ml/con; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả

kiểm tra độc lực được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn

A. pleuropneumoniae phân lập được

Liều Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết

tiêm sau khi tiêm Số Ký hiệu (con) STT phúc chuột chủng tiêm xoang 12h 18h 24h 30h 36h 48h 168h Cộng (con) (ml/con)

0,5 1 1 0 2 1 APP-TN 1 2

0,5 1 1 0 2 2 APP-TN 2 2

0,5 1 1 0 2 3 APP-TN 3 2

0,5 1 1 0 2 4 APP-TN 4 2

0,5 1 0 1 5 APP-TN 5 2

0,5 1 0 1 6 APP-TN 6 2

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong 6 chủng A. pleuropneumoniae kiểm

tra độc lực có 4 chủng có độc lực mạnh, giết chết 100% chuột thí nghiệm

trong khoảng thời gian từ 12- 30 giờ là APP-TN1; APP-TN2; APP-TN3 và

APP-TN4; 2 chủng giết chết 50% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ

36 - 48 giờ là APP-TN5 và APP-TN6. Tất cả số chuột sau khi chết được mổ

khám kiểm tra bệnh tích đều thấy phổi sưng xuất huyết phù nề, viêm dính giai

đoạn đầu và phân lập lại được vi khuẩn A. pleuropneumoniae thuần khiết từ

máu tim. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với với kết quả của một

số tác giả như Cù Hữu Phú và cs (2007) kiểm tra độc lực của các chủng vi

khuẩn A. pleuropneumoniae trên 15 chuột thí nghiệm, cho tỷ lệ chuột chết là

100%; Nguyễn Quang Tuyên và cs (2010) chọn 10 chủng A.

pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi kiểm

tra độc lực trên chuột thí nghiệm, cả 10 chủng đều gây chết 100% chuột thí

nghiệm trong khoảng thời gian từ 18 - 48 giờ. Trong đó có 2/10 chủng gây chết

chuột sau 18 giờ; 7/10 chủng gây chết chuột sau 24 giờ và 1/10 chủng gây chết

chuột sau 48 giờ.

Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân

lập được và đã xác định được liều LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2

là LD50 = 4,3 x 107CFU và serotype 5 là LD50 = 4,8 x 107CFU.

Kết luận vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được có độc lực cao đối

với chuột bạch, là một trong những nguyên nhân quan trọng gây viêm phổi cho

lợn nuôi ở tỉnh Thái Nguyên.

3.1.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida

phân lập được.

Để làm rõ vai trò gây viêm phổi ở lợn của vi khuẩn P. multocida, từ tủ

lưu trữ các chủng P. multocida phân lập được ở lợn tại Thái Nguyên chúng tôi

chọn 6 chủng có đặc tính sinh vật, hóa học điển hình được ký hiệu như sau:

PAS-TN 1, PAS-TN 2, PAS-TN 3, PAS-TN 4, PAS-TN 5, PAS-TN 6 và tiến

hành xác định độc lực trên chuột bạch. Mỗi chủng vi khuẩn P. multocida tiêm

cho 2 chuột vào phúc xoang, với liều 0,5 ml canh trùng nuôi cấy vi khuẩn này

ở 37oC/24 giờ; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả

được trình bày tại bảng 3.2. Qua bảng 3.2 cho thấy cả 6 chủng vi khuẩn P.

multocida giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 - 48 giờ, trong đó

có 2 chủng là PAS-TN 5 và PAS-TN 2 độc lực mạnh nhất, đều giết chết chuột

trong vòng 12 - 24 giờ sau khi tiêm. Kết quả thu được của chúng tôi cũng

tương đồng với nghiên cứu của Đỗ Quốc Tuấn và Nguyễn Quang Tuyên

(2007) khi kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập

được ở lợn thuộc ba tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang và Bắc Kạn đã cho thấy

các chủng vi khuẩn P. multocida đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí

nghiệm từ 50 - 100% trong thời gian từ 20 - 48 giờ; Đặng Xuân Bình và cs

(2010) kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được

từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Cao Bằng, Hà Giang đã cho biết các chủng vi

khuẩn đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 80 - 100% trong

vòng 48 giờ sau khi công cường độc.

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn

P. multocida phân lập được

Liều Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm Số chết sau khi tiêm (con) tiêm Ký hiệu Thuộc chuột phúc STT serotype tiêm chủng xoang 12h 18h 24h 36h 48h 168h Cộng (con) (ml/con)

1 PAS-TN 1 A 2 0,5 1 1 0 2

2 PAS-TN 2 D 2 0,5 1 1 0 2

3 PAS-TN 3 A 2 0,5 1 1 0 2

4 PAS-TN 4 D 2 0,5 1 1 0 2

5 PAS-TN 5 A 2 0,5 1 1 0 2

6 PAS-TN 6 D 2 0,5 1 1 0 2

Chúng tôi đã tiến hành mổ khám những con chuột chết và thấy có những

bệnh tích như bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất

huyết. Đây là bệnh tích đặc trưng, điển hình của chuột chết khi tiêm vi khuẩn P.

multocida cường độc. Tiến hành phân lập lại vi khuẩn P. multocida từ máu

tim của những chuột chết đều cho kết quả dương tính.

Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được

và đã xác định được liều LD50 của chủng P. multocida serotype A là LD50

= 4 x 107 CFU và serotype D là LD50 = 4,2 x 107CFU.

Như vậy, phần lớn các chủng vi khuẩn P. multocida mà chúng tôi phân

lập được đều có độc lực mạnh, chúng đều có khả năng gây viêm phổi cho lợn

khi gặp điều kiện thuận lợi, khi sức đề kháng của lợn giảm do thời tiết thay

đổi, chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc bị mắc PRRS.

3.1.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được

Căn cứ vào kết quả xác định serotype của các chủng S. suis phân lập

được chúng tôi chọn 6 chủng vi khuẩn đại diện cho 3 serotype chủ yếu phân

lập được từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Thái

Nguyên (2, 7 và 9) đã được kiểm tra độc lực trên chuột bạch. Mỗi chuột thí

nghiệm được tiêm 0,5 ml canh trùng nuôi cấy ở 37°C/24 giờ vào phúc xoang.

Chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày; khi chuột chết được mổ khám,

kiểm tra triệu chứng, bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn từ máu tim. Kết quả được

trình bày tại bảng 3.3.

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân

lập được

Liều

Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết

Số

tiêm

sau khi tiêm (con)

ST

chuột

Ký hiệu

Thuộc

phúc

T

serotype

tiêm

chủng

xoang

12h 18h 24h 36h 48h 168h Cộng

(con)

(ml/con)

SEP-TN 1 2

0,5

SEP-TN 2 2

0,5

SEP-TN 3 7

0,5

SEP-TN 4 7

0,5

SEP-TN 5 9

0,5

SEP-TN 6 9

0,5

Qua bảng 3.3 cho thấy: Các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 và

serotype 9 đều gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian

ngắn, từ 12 - 24 giờ. Trong khi đó, cả 2 chủng thuộc serotype 7 được kiểm tra

đều chỉ gây chết 50% số chuột thí nghiệm, chủng SEP-TN 3 gây chết chuột

trong vòng 36 giờ và chủng SEP-TN 4 gây chết chuột trong vòng 48 giờ sau

khi tiêm. Những chuột chết được mổ khám kiểm tra triệu chứng, bệnh tích.

Qua khám, kiểm tra số chuột thí nghiệm cho thấy: Tất cả các chuột chết đều

có bệnh tích phổi viêm sung huyết; tim sưng, mềm, nhão, tích nước trong

xoang bao tim; vùng xung quanh chỗ tiêm đôi khi có hiện tượng áp xe; cho

tiến hành phân lập lại vi khuẩn đều thu được vi khuẩn S. suis thuần khiết từ

máu tim. Bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột bạch đã cho thấy vi khuẩn

gây chết cấp tính đối với chuột thí nghiệm. Những chuột không chết có triệu

chứng thần kinh, mệt mỏi, ủ rũ.. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương

đồng với nghiên cứu của một số tác giả như: Lê Văn Dương (2013) kiểm tra

độc lực của vi khuẩn S. suis phân lập được ở lợn mắc bệnh tai xanh cho thấy

các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 và serotype 9 đều gây chết 100%

số chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn, từ 12 - 24 giờ.

Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn S. suis phân lập được và đã

xác định được liều LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 2 là LD50 = 4,4 x

107CFU; serotype 7 và serotype 9 là LD50 = 4,9 x 107CFU.

Như vậy, các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 và serotype 9 là

hai serotype chiếm ưu thế trong số các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được

từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Thái Nguyên và là

những chủng có độc lực mạnh, gây chết chuột thí nghiệm trong thời

gian ngắn.

3.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn

3.2.1. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vắc xin thử nghiệm

Dựa trên các kết quả nghiên cứu như xác định đặc tính sinh vật, hóa học,

xác định serotype, xác định độc lực của vi khuẩn phân lập được ở lợn mắc

bệnh tại tỉnh Thái Nguyên; dựa trên kết quả gây bệnh thực nghiệm trên lợn

với các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis, chúng

tôi đã lựa chọn được các chủng vi khuẩn có độc lực cao, tính kháng nguyên

ổn định để chế tạo và thử nghiệm vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn. Bộ

giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được lựa chọn

có nguồn gốc phân lập, ký hiệu chủng, serotype, các yếu tố độc lực được trình

bày tại bảng 3.4.

Bảng 3.4: Các chủng vi khuẩn được chọn để chế tạo vắc xin thử nghiệm

Thời gian Nguồn Ký hiệu TT Serotype Vi khuẩn chết chuột gốc chủng

1 Phổi lợn APP-TN 1 5a 12 - 18h

A. pleuropneumoniae Dịch họng 2 2 12 - 18h APP-TN 4 lợn

3 Phổi lợn A 12 - 24h PAS - TN5

P. multocida Dịch họng 4 D 12 - 18h PAS - TN2 lợn

Phổi lợn 2 12 - 24h 5 S. suis SEP - TN1

Như vậy, bộ giống vi khuẩn được lựa chọn để chế tạo vắc xin thử

nghiệm có 5 chủng vi khuẩn khác nhau. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có

hai chủng thuộc serotype 2 và serotype 5a; vi khuẩn P. multocida có hai

chủng thuộc serotype A và D; vi khuẩn S. suis được lựa chọn một chủng duy

nhất thuộc serotype 2, đây là serotype có khả năng cao gây bệnh cho lợn và

cho người. Các chủng vi khuẩn được lựa chọn để chế tạo vắc xin thử nghiệm

đều có có cấu trúc kháng nguyên ổn định, độc lực cao được phân lập ở lợn

mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Thái Nguyên.

3.2.2. Kết quả chế tạo vắc xin thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn

- Nuôi cấy canh trùng chế tạo vắc xin thử nghiệm:

+ Môi trường thích hợp để vi khuẩn A. pleuropneumoniae phát triển

tốt là môi trường giàu dinh dưỡng PPLO và để trong tủ ấm 5-10% CO2.

+ Vi khuẩn P. multocida và S. suis phát triển tốt trên môi trường BHI

broth và nước thịt TYE.

- Nuôi cấy lắc (300 - 500 lần/phút) trong vòng 24 giờ.

- Đậm độ tối thiểu cần đạt trong 1ml canh trùng dùng chế vắc xin thử

nghiệm thấp nhất là 1,5 x 108 vi khuẩn theo TCVN 8669 (2011).

- Vô hoạt bằng formalin để diệt vi khuẩn với tỷ lệ 0,5%.

- Bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/5 (20%).

- Vắc xin thử nghiệm chế tạo từ các chủng A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis được kiểm nghiệm theo TCVN 8669 (2011) đối với vắc

xin chết có bổ trợ nhũ dầu - Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương

I - Hà Nội.

* Kiểm tra đậm độ vi khuẩn của canh trùng sử dụng chế vắc xin thử nghiệm

Các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi

cấy riêng rẽ trong các bình khác nhau với thời gian nuôi cấy 24 giờ, trong

khi nuôi có lắc (300 - 500 lần/phút). Sau thời gian nuôi cấy đến giai đoạn

giống lớn, tiến hành lấy mẫu để kiểm tra đậm độ vi khuẩn trong 1 ml của

từng loại canh trùng bằng phương pháp đếm số lượng vi khuẩn trên môi

trường thạch TSA có bổ sung YE tươi đối với A. pleuropneumoniae và môi

trường thạch máu với P. multocida và S. suis.

Kết quả được trình bày tại bảng 3.5.

Bảng 3.5: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng

chế tạo vắc xin thử nghiệm

Số vi khuẩn/1 ml canh trùng

Lô A. P. multocida S. suis Đánh pleuropneumoniae vắc xin giá TN Serotype Serotype Serotype Serotype Serotype

2 5a A D 2

1,6 x 109 1,4 x 109 1,6 x 109 1,5 x 109 1,7 x 109 Đạt I

1,5 x 109 1,5 x 109 1,5 x 109 1,7 x 109 1,8x 109 Đạt II

1,7 x 109 1,6 x 109 1,6x 109 1,6 x 109 1,6 x 109 Đạt III

Qua bảng 3.5 cho thấy: Sau thời gian nuôi cấy các lô canh trùng của

ba lô vắc xin thử nghiệm chế thử đều có đậm độ vi khuẩn trung bình đạt từ

1,4 x 109 đến 1,8 x 109 vi khuẩn/ml. So sánh với yêu cầu trong 1 ml canh

trùng để chế vắc xin (TCVN) phải đạt thấp nhất là 1,5 x 108 vi khuẩn/ml thì

các lô canh trùng dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm đều đủ tiêu chuẩn.

Hiện nay ở Việt Nam chưa có tiêu chuẩn riêng cho vắc xin phòng

viêm phổi cho lợn chế tạo từ các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis nên trong nghiên cứu chúng tôi đã áp dụng công thức

tính số lượng vi khuẩn trong 1 liều vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn

loại vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu của Viện Nghiên cứu động vật Qeensland

- Australia với liều vắc xin tiêu chuẩn phải đạt đậm độ vi khuẩn 4 x 108

CFU. Bằng phương pháp cô đặc và tính liều vắc xin với đậm độ các canh

trùng của chúng tôi thu được sau khi bổ sung nhũ dầu, xác định được

liều tiêm cho lợn là 2 ml/con.

* Kiểm tra thuần khiết canh trùng chế tạo vắc xin thử nghiệm

Kiểm tra thuần khiết được tiến hành song song với các bước nuôi cấy

canh trùng riêng rẽ của từng chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.

multocida và S. suis dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm từ giống nhỏ đến nhỡ

và lớn như đã mô tả ở phần phương pháp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.

Qua bảng 3.6 cho thấy: Canh trùng dùng để chế tạo 3 lô vắc xin thử

nghiệm đều đạt các chỉ tiêu về thuần khiết. Trên các môi trường như nước

thịt thường, thạch máu cấy kèm Sta. aureus, thạch TSA (có bổ trợ YE), nước

thịt TYE nuôi cấy riêng biệt với từng loại canh trùng của 3 loại vi khuẩn khác

nhau ở cả ba lô vắc xin thử nghiệm I, II và II đều chỉ có duy nhất vi khuẩn A.

pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phát triển.

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng

sử dụng chế tạo vắc xin thử nghiệm

Môi trường Đánh giá Lô I Kết quả kiểm tra Lô II

Nước thịt thường Đạt

Đạt Nước thịt TYE

Đạt Thạch máu cấy kèm Sta. aureus

Đạt Thạch TSA Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Lô III Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3) Thuần khiết (3/3)

Ghi chú: (3/3) vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

* Kết quả kiểm tra vô trùng của 3 lô vắc xin thử nghiệm chế tạo được

Sau khi tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng formalin 0,5%, để ở tủ ấm

37oC/24 giờ, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng cách nuôi cấy trên

các loại môi trường khác nhau. Các bình canh khuẩn của từng chủng vi khuẩn

đạt các chỉ tiêu thuần khiết và đậm độ vi khuẩn được tập trung vào một bình

lớn tiến hành bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 20%. Trộn đều canh khuẩn và nhũ

dầu, sau đó lấy mẫu hỗn hợp canh trùng để kiểm tra vô trùng; cấy 0,2 ml canh

trùng hỗn hợp vào các ống môi trường thạch thường, thạch máu cấy kèm Sta.

aureus, thạch TSA (có bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước

thịt TYE, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm. Mỗi loại môi trường cấy kiểm

tra 4 ống; các ống môi trường sau khi cấy được bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC có bổ

sung 5% CO2, riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phòng và mỗi ngày đọc kết

quả 1 lần. Kết quả kiểm tra vô trùng của canh trùng sau khi diệt khuẩn bằng

formalin, vắc xin thử nghiệm bán thành phẩm và thành phẩm được trình bày ở

bảng 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô vắc xin chế tạo thử nghiệm

Lô I Lô II Lô III

Các giai đoạn Môi trường kiểm tra Kết quả

Số ống MTKT 4 Kết quả - Số ống MTKT 4 Kết quả - Số ống MTKT 4 -

4 - 4 - 4 -

Canh trùng sau khi vô hoạt bằng formalin

- - - - - - 4 4 4 4 4 4 - - - - - - 4 4 4 4 4 4 - - - - - -

4 - 4 - 4 -

Vắc xin TN bán thành phẩm

- - - - - - 4 4 4 4 4 4 - - - - - - 4 4 4 4 4 4 - - - - - -

4 - 4 - 4 -

Vắc xin TN thành phẩm

Thạch thường TM cấy kèm Sta. aureus Thạch MacConkey 4 Nước thịt thường 4 Nước thịt TYE 4 Nước thịt gan yếm khí 4 Thạch nấm 4 Thạch thường 4 TM cấy kèm Sta. aureus Thạch MacConkey 4 Nước thịt thường 4 Nước thịt TYE 4 Nước thịt gan yếm khí 4 Thạch nấm 4 Thạch thường 4 TM cấy kèm Sta. aureus Thạch MacConkey 4 Nước thịt thường 4 Nước thịt TYE 4 Nước thịt gan yếm khí 4 Thạch nấm 4 - - - - - 4 4 4 4 4 - - - - - 4 4 4 4 4 - - - - -

Ghi chú: MTKT: Môi trường kiểm tra; TM: Thạch máu; (-): Không có vi khuẩn nào mọc

Qua bảng 3.7 cho thấy: Trong các loại môi trường như thạch thường,

thạch máu cấy kèm Sta. aureus, thạch TSA (có bổ trợ YE), thạch

MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, nước thịt gan yếm khí và

thạch nấm dùng để kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vắc xin thử nghiệm đều

không quan sát thấy bất cứ một loại vi khuẩn nào mọc qua thời gian 7 ngày

theo dõi. Như vậy, cả 3 lô vắc xin thử nghiệm chế thử nghiệm đều đạt các

chỉ tiêu về vô trùng ở tất cả các giai đoạn là canh trùng sử dụng chế tạo vắc

xin thử nghiệm sau khi vô hoạt bằng formalin 0,5%, vắc xin thử nghiệm sau

khi bổ sung và vắc xin thử nghiệm sau khi ra chai.

* Kết quả kiểm tra an toàn của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

Dựa vào quy trình kiểm nghiệm vắc xin dùng trong Thú y theo TCVN

8669 (2011), chúng tôi đã kiểm tra chỉ tiêu an toàn của 3 lô vắc xin chế tạo

thử nghiệm trên chuột thí nghiệm. Mỗi lô vắc xin dùng 15 con chuột bạch,

chia thành 2 lô được bố trí như phần phương pháp mô tả ở trên. Kết quả được

trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

Đường tiêm Đánh giá Lô vắc xin TN Số chuột TN (con) Liều tiêm (ml/con) Số chuột sống (con)

Lô I Phúc xoang TM đuôi Đạt

Lô II Đạt

Lô III Đạt

5 5 Đối chứng 5 5 5 Đối chứng 5 5 5 Đối chứng 5 0,5 0,2 0,5 (sinh lý) Phúc xoang Phúc xoang 0,5 TM đuôi 0,2 0,5 (sinh lý) Phúc xoang Phúc xoang 0,5 TM đuôi 0,2 0,5 (sinh lý) Phúc xoang 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Ghi chú: - TN: Thí nghiệm; TM: Tĩnh mạch

- Các chuột thuộc lô thí nghiệm và lô đối chứng đều sống khỏe mạnh

qua thời gian 10 ngày theo dõi

Kết quả bảng 3.8 cho thấy với 2 đường tiêm phúc xoang và tĩnh mạch

đuôi cho chuột bạch của 3 lô vắc xin chế tạo thử nghiệm, các chuột thuộc lô

thí nghiệm và lô đối chứng đều sống khỏe mạnh qua thời gian 10 ngày theo dõi.

Như vậy, cả 3 lô vắc xin chế tạo thử nghiệm đều đạt chỉ tiêu về an toàn

100% khi thử trên chuột bạch.

* Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột bạch

- Công cường độc với vi khuẩn A. pleuropneumoniae: Mỗi lô vắc xin

thử nghiệm, chúng tôi tiêm phòng cho 10 con chuột bạch khỏe mạnh, mỗi con

tiêm 0,2 ml vắc xin thử nghiệm vào dưới da và tiêm lập lại mũi 2 sau 7 ngày

với liều 0,2 ml/con; 5 con chuột đối chứng tiêm 0,2 ml nước thịt TYE vào

dưới da. Sau 21 ngày tiêm phòng vắc xin thử nghiệm mũi thứ nhất, tiến hành

thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn A.

pleuropneumoniae (LD50 = 4,8 x 107CFU) cho tất cả chuột thí nghiệm và

chuột ở lô đối chứng.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột

bạch khi công cường độc vi khuẩn A. pleuropneumoniae

Tỷ lệ Số Liều công Số Số Lô Liều Thời bảo chuột chuột chuột (LD50 = tiêm gian theo vắc xin thử tiêm hộ sống chết dõi nghiệm (ml) (%) (con) (con) (con) 4,8 x 107CFU)

1 9 90 0,2 TN 10 10LD50 10 ngày I 0 5 0 0 ĐC 5 10LD50 18-24h

1 9 90 0,2 TN 10 10LD50 10 ngày II 0 5 0 0 ĐC 5 10LD50 18-24h

0,2 0 10 100 TN 10 10LD50 10 ngày III 5 0 0 5 0

ĐC 10LD50 18-24h Ghi chú: TN - Thí nghiệm; ĐC - Đối chứng

Qua bảng 3.9 cho thấy hiệu lực của 3 lô vắc xin thử nghiệm thử

nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn A. pleuropneumoniae

như sau:

+ Hai lô vắc xin thử nghiệm I và II đều có 9/10 chuột sống chiếm tỷ lệ

90% số chuột được bảo hộ.

+ Lô vắc xin thử nghiệm III có 10/10 chuột sống đạt tỷ lệ bảo hộ 100%.

+ Chuột ở các lô đối chứng đều chết 100% trong thời gian 18-24 giờ.

- Công cường độc với vi khuẩn P. multocida: Thí nghiệm được tiến

hành giống như với vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Tuy nhiên, sau 21 ngày

tiêm phòng vắc xin thử nghiệm mũi thứ nhất, tiến hành thử thách công cường

độc với liều 10LD50 của vi khuẩn P. multocida (LD50 = 4,2 x 107CFU) cho

tất cả chuột thí nghiệm và chuột ở lô đối chứng.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.

Qua bảng 3.10 cho thấy hiệu lực của 3 lô vắc xin thử nghiệm thử

nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn P. multocida như sau:

Bảng 3.10: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột

bạch khi công cường độc vi khuẩn P. multocida

Thời gian theo dõi Lô vắc xin thử nghiệm Liều tiêm (ml) Số chuột chết (con) Tỷ lệ bảo hộ (%) Số chuột tiêm (con) Số chuột sống (con)

III 0,2 0 0,2 0 0,2 0 10 5 10 5 10 5 0 5 0 5 1 5 10 0 10 0 9 0 100 0 100 0 90 0

Liều công (LD50 = 4,2 x 107CFU) TN 10LD50 10 ngày ĐC 10LD50 18-24h TN 10LD50 10 ngày ĐC 10LD50 18-24h TN 10LD50 10 ngày ĐC 10LD50 18-24h Ghi chú: TN - Thí nghiệm; ĐC - Đối chứng

+ Hai lô vắc xin thử nghiệm I và vắc xin thử nghiệm II đều có 10/10

chuột sống chiếm tỷ lệ 100% số chuột được bảo hộ.

+ Lô vắc xin thử nghiệm III có 9/10 chuột sống đạt tỷ lệ bảo hộ là 90%.

+ Các lô đối chứng, chuột đều chết 100% trong thời gian 18-24 giờ.

- Công cường độc với vi khuẩn S. suis:

Thí nghiệm được tiến hành giống như với vi khuẩn A.

pleuropneumoniae. Tuy nhiên, sau 21 ngày tiêm phòng vắc xin thử nghiệm

mũi thứ nhất, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi

khuẩn S. suis serotype 2 (LD50 = 4,4 x 107CFU) cho tất cả chuột ở lô thí

nghiệm và chuột ở lô đối chứng.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.

Qua bảng 3.11 cho thấy hiệu lực của 3 lô vắc xin thử nghiệm thử

nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis như sau:

+ Cả 3 lô vắc xin thử nghiệm I, vắc xin thử nghiệm II và vắc xin thử

nghiệm III đều có 10/10 chuột sống đạt tỷ lệ bảo hộ là 100%.

Bảng 3.11: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên chuột

bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 2

Số Liều công Số Số Tỷ lệ Lô Liều Thời chuột chuột chuột bảo (LD50 = tiêm gian vắc xin thử 4,4 x tiêm chết sống hộ (ml) theo dõi nghiệm (con) 107CFU) (con) (con) (%)

TN 10 0,2 10 ngày 0 10 100 10LD50 I ĐC 5 18-24h 5 0 0 0 10LD50

TN 10 0,2 10 ngày 0 10 100 10LD50 II ĐC 5 18-24h 5 0 0 0 10LD50

10 ngày 1 10 100 TN 10 0,2 10LD50 III ĐC 5 10LD50 18-24h 5 0 0 0

Ghi chú: TN - Thí nghiệm; ĐC - Đối chứng

+ Các lô đối chứng, chuột đều chết 100% trong thời gian 18-24 giờ.

- Từ kết quả được trình bày tại các bảng 3.8; 3.9; 3.10 và 3.11 đối chiếu

với quy trình kiểm nghiệm TCVN (2011) dành cho các vắc xin vi khuẩn vô

hoạt có bổ trợ formalin và của Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung

ương I. Cụ thể như sau:

+ Khi kiểm tra chỉ tiêu an toàn bằng phương pháp thay thế trên chuột

bạch: vắc xin được coi là an toàn khi tất cả chuột thí nghiệm phải sống khỏe

mạnh trong 10 ngày theo dõi sau khi tiêm vắc xin với liều sử dụng.

+ Trường hợp thử hiệu lực bằng phương pháp công cường độc trên động

vật thí nghiệm thay thế: với số động vật thí nghiệm (chuột bạch) được công là

5 con, nhóm đối chứng là 5 con, sau 3 tuần theo dõi, chuột đối chứng phải

chết hết và chuột thí nghiệm sống ít nhất 3 con thì vắc xin có hiệu lực.

Như vậy, so với quy định trên cả 3 lô vắc xin thử nghiệm vô hoạt phòng

bệnh viêm phổi cho lợn do A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

chế tạo được đảm bảo an toàn và có hiệu lực trên chuột thí nghiệm.

* Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên lợn thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm và trang trại lợn thí

nghiệm của nhà máy vắc xin Marphavet, lợn thí nghiệm gồm 40 con 6 tuần

tuổi, khỏe mạnh và được bố trí thí nghiệm thành 2 lô; lô thí nghiệm gồm 30

con, lô đối chứng gồm 10 con. Sau khi tiến hành lấy máu để xác định khả

năng nhiễm mầm bệnh tự nhiên của đàn lợn thí nghiệm, chúng tôi đã tiến

hành tiêm vắc xin thử nghiệm cho lợn thí nghiệm 30 con với đường tiêm dưới

da, mũi 1 liều tiêm 2 ml/con, mũi 2 sau tiêm mũi 1 là 7 ngày với liều tiêm 2

ml/con và 10 lợn đối chứng được tiêm nước muối sinh lý 2 ml/con.

Sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm mũi thứ nhất cho lợn được 21 ngày,

chúng tôi tiến hành công cường độc cho lợn cả đối chứng và thí nghiệm với

liều công cường độc tương đương với liều gây bệnh thực nghiệm như sau:

P. multocida serotype A: 4,5 x 109 vi khuẩn/ml

P. multocia serotype D: 4,5 x 109 vi khuẩn/ml

A. pleuropneumoniae serotype 2: 4,5 x 109 vi khuẩn/ml

A. pleuropneumoniae serotype 5a: 5 x 109 vi khuẩn/ml

S. suis serotype 2: 4,5 x 109 vi khuẩn/ml

Kết quả tổng hợp về xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm chế tạo

thử nghiệm trên lợn bằng phương pháp công cường độc được trình bày tại

bảng 3.12.

Qua bảng 3.12 cho thấy:

- Ở lô thí nghiệm 1 có 12 con lợn được tiêm vắc xin thử nghiệm sau 21

ngày tiêm mũi 1 chúng tôi phân ra làm 4 nhóm (3 con/nhóm) và tiến hành

công cường độc với các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Kết quả thu

được như sau: 3 con lợn tiêm công cường độc với vi khuẩn A.

pleuropneumoniae serotype 2 và serotype 5a với liều 6 ml/con đã gây chết 1

con, tỷ lệ bảo hộ 66,67%; 3 con lợn tiêm công cường độc với vi khuẩn A.

pleuropneumoniae serotype 2 với liều 5 ml/con cũng đã gây chết 1 con, đạt tỷ

lệ bảo hộ 66,67% ; 3 con lợn tiêm công cường độc với vi khuẩn A.

pleuropneumoniae serotype 5a với liều 5 ml/con đã không gây chết lợn thí

nghiệm, đạt tỷ lệ bảo hộ 100% ; 3 con lợn tiêm canh trùng của A.

pleuropneumoniae serotype 2 và serotype 5a với liều 5 ml/con cũng đã không

gây chết lợn thí nghiệm, đạt tỷ lệ bảo hộ 100%.

- Ở lô thí nghiệm 2 có 12 con lợn được tiêm vắc xin thử nghiệm sau 21

ngày tiêm mũi 1, chúng tôi phân ra làm 4 nhóm (3 con/nhóm) và tiến hành

công cường độc với các chủng vi khuẩn P. multocida. Khi công cường độc

với vi khuẩn P. multocida serotype A và serotype D với liều 6 ml/con đã gây

chết 1/3 số lợn thí nghiệm, đạt tỷ lệ bảo hộ là 66,67%; với 3 con lợn tiêm

canh trùng của P. multocida cả 2 serotype A và serotype D với liều 5 ml/con

không gây chết lợn thí nghiệm, đạt tỷ lệ bảo hộ 100%; 3 con lợn tiêm canh

trùng của P. multocida serotype A và 3 con tiêm P. multocida serotype D với

liều 5 ml/con cũng đều gây chết 1 con, đạt tỷ lệ bảo hộ 66,67%.

- Ở lô thí nghiệm 3 có 3 con lợn được tiêm vắc xin thử nghiệm, khi công

cường độc với cả 4 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, serotype

5a và P. multocida serotype A, serotype D với liều 5 ml/con đã gây chết 1/3

số lợn thí nghiệm, đạt tỷ lệ bảo hộ là 66,67%.

Bảng 3.12: Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm trên lợn

bằng phương pháp công cường độc

Tỷ lệ (%) Lô lợn Liều tiêm Chủng vi khuẩn gây bệnh

Lô 1

Lô 2

Số lợn thí nghiệm 3 3 3 3 3 3 3 3 Số lợn chết 1 0 0 1 1 1 0 1 Thời gian chết 16h - - 16h 16h 16h - 16h 66,67 100 100 66,67 66,67 66,67 100 66,67 Lô thí nghiệm (Tiêm vắc xin thử nghiệm)

5 ml 3 1 24h 66,67 5 ml A.pp2 A.pp5a 5 ml A.pp2 + A.pp5a 5 ml A.pp2 + A.pp5a 6 ml 5 ml P.mA 5 ml P.mD 5 ml P.mA + P.mD P.mA + P.mD 6 ml A.pp2 + A.pp5a + P.mA + P.mD

3 5 ml 0 S. suis 2 - 100 Lô 3 Lô 4

0 2 5 ml 2

0 2 6 ml 2 36- 48h 12- 16h Lô 5

0 5 ml 2 2 16- 36h

Lô đối chứng (Không tiêm vắc xin thử nghiệm)

Lô 6 A.pp2 + A.pp5a + P.mA + P.mD A.pp2 + A.pp5a + P.mA + P.mD A.pp2 + A.pp5a + P.mA + P.mD + S. suis 2 Nước sinh lý - 2 2 0 0 - - - -

5 ml 0 Ghi chú: A.pp2 - A. pleuropneumoniae serotype 2; A.pp5a - A.

pleuropneumoniae serotype 5a; P.m A - P. multocida serotype AP.m D - P.

multocida serotype D; S. suis 2 - S. suis serotype 2.

- Ở lô thí nghiệm 4 với 3 con lợn được tiêm vắc xin thử nghiệm, khi

công cường độc với vi khuẩn S. suis serotype 2 với liều 5 ml/con đã không

gây chết lợn, đạt tỷ lệ bảo hộ với vi khuẩn S. suis serotype 2 là 100%.

- Ở lô đối chứng 5 có 6 con lợn được chia ra 3 nhóm không tiêm vắc xin

thử nghiệm, nhóm 1 và nhóm 2 công cường độc với cả 4 chủng vi khuẩn A.

pleuropneumoniae serotype 2, serotype 5a và P. multocida serotype A,

serotype D với liều 5 ml/con và 6 ml/con đều gây chết 100% lợn ở lô đối

chứng; nhóm 3 công cường độc với cả 5 chủng vi khuẩn sử dụng chế tạo vắc xin

thử nghiệm với liều 5 ml/con cũng đã gây chết 100% lợn ở lô đối chứng.

- Ở lô đối chứng 6 có 4 con lợn được chia ra 2 nhóm không tiêm vắc xin

thử nghiệm, không công cường độc cả 4 con lợn đều sống khoẻ mạnh.

Từ kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm bằng phương pháp

công cường độc cho lợn thí nghiệm được trình bày tại bảng 3.12 có thể đánh

giá vắc xin thử nghiệm đạt hiệu lực bảo hộ là 66,67%.

3.3. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vắc xin thử

nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên

3.3.1. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vắc xin thử nghiệm

Vắc xin thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi lợn chế tạo từ các chủng vi

khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, A. pleuropneumoniae serotype 5a, S.

suis serotype 2, P. multocida serotype A và P. multocida serotype D phân lập

được ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên, đạt các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực bảo hộ

cao trên chuột bạch, lợn thí nghiệm theo tiêu chuẩn đánh giá của Trung tâm

kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương (2011). Chúng tôi tiến hành bước đánh

giá tiếp theo về độ dài miễn dịch của vắc xin thử nghiệm trên lợn nuôi tại tỉnh

– Phổ Yên - Thái Nguyên. Chọn lợn thí nghiệm 25 con (6 tuần tuổi) khỏe

Thái Nguyên. Thí nghiệm được tiến hành tại trang trại lợn Xóm Bến – Đắc Sơn

mạnh, chưa được tiêm phòng loại vắc xin nào có thành phần kháng nguyên

của 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis. Bằng phương

pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể có trong máu lợn trước khi tiêm vắc xin

thử nghiệm, lợn có hiệu giá kháng thể âm tính với các kháng nguyên vi

khuẩn sử dụng chế tạo vắc xin thử nghiệm mới sử dụng làm lợn thí nghiệm.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Lô thí nghiệm: Gồm 20 con lợn, được tiêm 2 mũi vắc xin.

- Lô đối chứng: Gồm 5 con lợn không tiêm vắc xin.

Thời gian tiến hành từ ngày 2/8/2018

Ngày 2/8/2018: Tiêm vắc xin lần 1, liều 2 ml/con, dưới da.

Ngày 9/8/2018: Tiêm vắc xin lần 2, liều 2 ml/con, dưới da.

Tất cả lợn được nuôi dưỡng, chăm sóc trong điều kiện giống nhau, sau

đó tiến hành lấy mẫu máu lợn kiểm tra hàm lượng kháng thể vào các thời

điểm: 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng và 4 tháng và 5 tháng sau khi tiêm vắc xin mũi

thứ nhất.

Tất cả lợn ở lô thí nghiệm và lô đối chứng đều được tiêm phòng đầy đủ

các loại vắc xin như phó thương hàn, E. coli, dịch tả lợn, Tai xanh, lở mồm

long móng theo đúng qui định của cơ quan chuyên môn.

* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể lợn thí nghiệm sau khi tiêm vắc

xin thử nghiệm một tháng

Sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm mũi thứ nhất được một tháng, chúng tôi

lấy mẫu máu của 20 con lợn ở lô thí nghiệm và 5 con lợn ở lô đối chứng chắt

lấy huyết thanh pha thành các tỷ lệ 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64 và kiểm tra

hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết với kháng nguyên của 5 chủng vi

khuẩn dùng sản xuất vắc xin thử nghiệm là S. suis serotype 2; A.

pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 5a; P.

multocida serotype A và P. multocida serotype D. Kết quả được trình bày ở

bảng 3.13. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ở lợn sau khi tiêm vắc xin thử

nghiệm 1 tháng trình bày tại bảng 3.13 cho thấy 100% mẫu huyết thanh của

20 con lợn ở lô thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm đều ngưng kết với

kháng nguyên của 5 chủng vi khuẩn tương ứng dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm

là S. suis serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae

serotype 5a; P. multocida serotype A và P. multocida serotype D. Hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/16 là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100%; hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/32 là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100% và hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/64 cũng là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100%; còn các

mẫu huyết thanh của 5 con lợn ở lô đối chứng không tiêm vắc xin thử nghiệm

đều không ngưng kết với kháng nguyên của 5 chủng vi khuẩn trên. Điều này đã

chứng tỏ vắc xin thử nghiệm chế tạo được có tác dụng kích thích hình thành

kháng thể tốt ở những lợn được tiêm phòng.

Bảng 3.13: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau một tháng

Hiệu giá kháng thể

1/16

1/32

1/64

Kháng

Số kiểm

nguyên

SLMH

tra

dùng kiểm

(con)

(+)

(%)

(+)

(%)

(+)

(%)

tra

kiểm

tra

TN 20

100

20 100

S. suis

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100

20 100

A.pp

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100

20 100

A.pp

serotype 5a

ĐC 5

TN 20

100

20 100

P. multocida

serotype A

ĐC 5

TN 20

100

20 100

P. multocida

serotype D

ĐC 5

Ghi chú: - SLMHT: Số lượng mẫu huyết thanh; A.pp: A. pleuropneumoniae

- TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng

Như vậy, sau một tháng 100% lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử

nghiệm khi kiểm tra đều có hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng

nguyên vi khuẩn sử dụng chế tạo vắc xin thử nghiệm đạt ở mức cao 1/64.

* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm

vắc xin thử nghiệm hai tháng

Vào thời điểm 2 tháng sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm phòng viêm phổi

lợn, chúng tôi tiếp tục lấy mẫu máu kiểm tra hiệu giá kháng thể lần 2 với 5

kháng nguyên vi khuẩn là S. suis serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 2;

A. pleuropneumoniae serotype 5a; P. multocida serotype A và P. multocida

serotype D của 20 con lợn đã tiêm vắc xin thử nghiệm và 5 con lợn đối chứng

không tiêm vắc xin thử nghiệm. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.14.

Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn

được tiêm vắc xin thử nghiệm sau hai tháng

1/16

Hiệu giá kháng thể 1/32

1/64

Số kiểm tra (con)

(+)

(%)

(+)

(%)

(+)

(%)

Kháng nguyên dùng kiểm tra

S. suis serotype 2 A.pp serotype 2 A.pp serotype 5a P. multocida serotype A P. multocida serotype D

TN 20 ĐC 5 TN 20 ĐC 5 TN 20 ĐC 5 TN 20 ĐC 5 TN 20 ĐC 5

SLMH T kiểm tra 20 5 20 5 20 5 20 5 20 5

20 0 20 0 20 0 20 0 20 0

SLMH T kiểm tra 20 5 20 5 20 5 20 5 20 5

20 0 20 0 20 0 20 0 20 0

SLMH T kiểm tra 20 5 20 5 20 5 20 5 20 5

20 100 0 20 100 0 20 100 0 20 100 0 20 100 0

0 thanh; A.pp: A.

100 100 0 0 100 100 0 0 100 100 0 0 100 100 0 0 100 100 0 0 lượng mẫu huyết

- SLMHT: Số Ghi chú:

pleuropneumoniae

- TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ở lợn sau khi tiêm vắc xin thử

nghiệm 2 tháng trình bày tại bảng 3.14 cho thấy 100% mẫu huyết thanh của

lợn ở lô thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm đều ngưng kết với kháng

nguyên của 5 chủng vi khuẩn tương ứng dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm là

S. suis serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae

serotype 5a; P. multocida serotype A và P. multocida serotype D. Hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/16 là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100%; hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/32 là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100% và hiệu giá

kháng thể ngưng kết 1/64 cũng là 20/20 lợn kiểm tra, đạt tỷ lệ 100%; còn các

mẫu huyết thanh của 5 con lợn ở lô đối chứng không tiêm vắc xin thử nghiệm

đều không ngưng kết với kháng nguyên của 5 chủng vi khuẩn sử dụng chế tạo

vắc xin thử nghiệm trên.

Như vậy, vắc xin thử nghiệm chế tạo có tác dụng bảo hộ tốt ở những lợn

được tiêm phòng. Sau hai tháng vẫn có 100% lợn thí nghiệm được tiêm vắc

xin thử nghiệm khi kiểm tra đều có hiệu giá kháng thể ngưng kết với các

kháng nguyên vi khuẩn sử dụng chế tạo vắc xin thử nghiệm đạt ở mức 1/64.

* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể lợn thí nghiệm sau khi tiêm vắc

xin thử nghiệm ba tháng

Tiếp theo vào thời điểm 3 tháng sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm, chúng

tôi lấy mẫu máu của 20 con lợn được tiêm vắc xin thử nghiệm ở lô thí nghiệm

và 5 con lợn không tiêm vắc xin thử nghiệm ở lô đối chứng để kiểm tra kháng

thể lần 3. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.15.

Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả 20 con lợn được tiêm vắc xin thử

nghiệm ở lô thí nghiệm khi kiểm tra kháng thể thì cả 20 con đều có kháng thể

tương ứng với 5 thành phần kháng nguyên vi khuẩn là S. suis serotype 2; A.

pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 5a; P.

multocida serotype A và P. multocida serotype D dùng sản xuất vắc xin thử

nghiệm. Trong khi cả 5 con lợn ở lô đối chứng không được tiêm vắc xin thử

nghiệm thì đều không có kháng thể tương tự như lợn ở lô thí nghiệm.

Bảng 3.15: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí

nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau ba tháng

Hiệu giá kháng thể

Số kiểm

1/16

1/32

1/64

Kháng nguyên

tra

dùng kiểm tra

SLMHT

(con)

(+)

(%)

(+)

(%)

(+) (%)

kiểm tra

TN 20

100

20 100

S. suis

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100

20 100

A.pp

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100

100 20

A.pp

serotype 5a

ĐC 5

TN 20

100

100 20

P. multocida

serotype A

ĐC 5

100

100 20

TN 20

P. multocida

serotype D

ĐC 5

0 5 thanh; A.pp: A.

5 lượng mẫu huyết

- SLMHT: Số Ghi chú:

pleuropneumoniae

- TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng

Kết quả bảng 3.15 kiểm tra hiệu giá kháng thể của 20 con lợn được tiêm

vắc xin thử nghiệm sau ba tháng cho thấy:

- Sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm thử nghiệm cho lợn được 3 tháng hiệu

giá kháng thể ngưng kết 1/64 của lợn thí nghiệm đã có chiều hướng giảm so

với các lần kiểm tra trước. Cụ thể là kháng nguyên P. multocida serotype A

và S. suis serotype 2 đều có 95% (19/20) lợn kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể

ngưng kết 1/64; kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, kháng

nguyên A. pleuropneumoniae serotype 5a và P. multocida serotype D có 90%

(18/20) lợn đạt hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/64.

- Số lợn thí nghiệm kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/16 và

1/32 vẫn đạt 100%.

Như vậy, sau ba tháng lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm khi

kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn chế

vắc xin thử nghiệm đạt mức 1/16 và 1/32 là 100%; hiệu giá kháng thể ngưng

kết 1/64 đã giảm, tỷ lệ đạt từ 90% đến 95%.

Hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn chế vắc

xin thử nghiệm sau ba tháng được thể hiện ở hình 3.1.

Tỷ lệ (%)

100

S. suis serotype 2

A.pp serotype 2

A.pp serotype 5a

P. multocida serotype A

P. multocida serotype D

Kháng nguyên dùng KT

Hiệu giá kháng thể1.16

Hiệu giá kháng thể1.32

Hiệu giá kháng thể1.64

Hình 3.1. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu

lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau ba tháng

* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm

vắc xin thử nghiệm bốn tháng

Tiếp theo vào thời điểm 4 tháng sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm, chúng tôi

lấy mẫu máu của 20 con lợn lô thí nghiệm và 5 con lợn không tiêm vắc xin thử

nghiệm ở lô đối chứng để kiểm tra kháng thể lần 4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.16.

Bảng 3.16: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí

nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau bốn tháng

Hiệu giá kháng thể

Kháng

Số kiểm

1/16

1/32

1/64

nguyên

tra

dùng kiểm

SLMHT

(con)

(%)

(+)

(%)

(+)

(%)

(+)

tra

kiểm tra

100 20

100

TN 20

S. suis

serotype 2

ĐC 5

100 20

100

TN 20

A.pp

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100 20

100

A.pp

serotype 5a

ĐC 5

TN 20

100 20

100

P. multocida

serotype A

ĐC 5

TN 20

100 20

100

P. multocida

serotype D

ĐC 5

Ghi chú: - SLMHT: Số lượng mẫu huyết thanh; A.pp: A. pleuropneumoniae

- TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng

Kết quả kiểm tra kháng thể lợn ở lần này cũng cho thấy cả 20 con lợn ở lô

thí nghiệm tiêm vắc xin thử nghiệm được kiểm tra đều vẫn có kháng thể tương

ứng với kháng nguyên của 5 chủng vi khuẩn dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm

là A. pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 5a; P.

multocida serotype A; P. multocida serotype D và S. suis serotype 2.

Còn cả 5 con lợn ở lô đối chứng không tiêm Vắc xin thử nghiệm đều

không phát hiện thấy kháng thể tương tự khi kiểm tra.

Qua bảng 3.16 cho thấy sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm được 4 tháng đã

có sự sụt giảm rõ rệt về hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm so với những

lần kiểm tra trước. Hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/64 cụ thể như sau: kháng

nguyên P. multocida serotype A có 90% (18/20) số lợn kiểm tra đạt; kháng

nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2 và S. suis serotype 2 đều có 85%

(17/20) số lợn kiểm tra đạt; kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 5a

và P. multocida serotype D đều có 80% (16/20) số lợn kiểm tra đạt.

Số lợn thí nghiệm kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/16 và 1/32

vẫn đạt 100%.

Như vậy, sau bốn tháng lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm

khi kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn

chế vắc xin thử nghiệm đạt mức 1/16 và 1/32 vẫn đạt 100%; riêng mức hiệu

giá kháng thể ngưng kết 1/64 chỉ đạt từ 80% đến 90%. Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của Lê Văn Dương (2013) khi

nghiên cứu về autovắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn đã cho kết quả sau

bốn tháng lợn thí nghiệm được tiêm autovắc xin khi kiểm tra có hiệu giá

kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn chế Autovắc xin đạt mức

1/16 và 1/32 vẫn đạt 100%; riêng mức hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/64 chỉ

đạt từ 80% đến 90%.

Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi

khuẩn chế vắc xin thử nghiệm sau bốn tháng được thể hiện ở hình 3.2.

Tỷ lệ (%)

100

Kháng nguyên dùng KT

S. suis serotype 2

A.pp serotype 2

A.pp serotype 5a

P. multocida serotype A

P. multocida serotype D

Hiệu giá kháng thể1.16

Hiệu giá kháng thể1.32

Hiệu giá kháng thể1.64

Hình 3.2. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể

trong máu lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau bốn tháng

* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm

vắc xin thử nghiệm năm tháng

Tiếp theo vào thời điểm 5 tháng sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm, chúng

tôi lấy mẫu máu của 20 con lợn lô thí nghiệm và 5 con lợn không tiêm vắc xin

thử nghiệm ở lô đối chứng để kiểm tra kháng thể lần 5. Kết quả được trình

bày ở bảng 3.17.

Bảng 3.17: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí

nghiệm được tiêm Vắc xin thử nghiệm sau năm tháng

Hiệu giá kháng thể

Kháng

Số kiểm

1/16

1/32

1/64

nguyên

tra

dùng kiểm

SLMHT

(con)

(%)

(+)

(%)

(+)

(+) (%)

tra

kiểm tra

TN 20

100 20

S. suis

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100 20

A.pp

serotype 2

ĐC 5

TN 20

100 20

A.pp

serotype 5a

ĐC 5

TN 20

100 20

P. multocida

serotype A

ĐC 5

TN 20

100 20

P. multocida

serotype D

ĐC 5

Ghi chú: - SLMHT: Số lượng mẫu huyết thanh; A.pp: A. pleuropneumoniae

- TN: Thí nghiệm; ĐC: Đối chứng

Kết quả kiểm tra kháng thể lợn ở lần này cũng cho thấy cả 20 con lợn ở lô

thí nghiệm tiêm vắc xin thử nghiệm được kiểm tra đều vẫn có kháng thể tương

ứng với kháng nguyên của 5 chủng vi khuẩn dùng chế tạo vắc xin thử nghiệm

là A. pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 5a; P.

multocida serotype A; P. multocida serotype D và S. suis serotype 2.

Còn cả 5 con lợn ở lô đối chứng không tiêm vắc xin thử nghiệm đều

không phát hiện thấy kháng thể tương tự khi kiểm tra.

Qua bảng 3.17 cho thấy sau khi tiêm vắc xin thử nghiệm được 5 tháng đã

có sự giảm sút rõ rệt về hiệu giá kháng thể so với tháng thứ 4. Hiệu giá kháng

thể ngưng kết 1/64 đối với kháng nguyên P. multocida serotype A, D còn

45% (9/20), kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và S. suis

serotype 2 đều chỉ còn 40% (8/20).

Số lợn thí nghiệm kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết 1/16 và 1/32

vẫn đạt 100%.

Hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn chế vắc

xin thử nghiệm sau năm tháng được thể hiện ở hình 3.3.

Tỷ lệ (%)

100

Kháng nguyên dùng KT

S. suis serotype 2

A.pp serotype 2

A.pp serotype 5a

P. multocida serotype A

P. multocida serotype D

Hiệu giá kháng thể1.16

Hiệu giá kháng thể1.32

Hiệu giá kháng thể1.64

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu

lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm sau năm tháng

Như vậy, sau năm tháng lợn thí nghiệm được tiêm vắc xin thử nghiệm

khi kiểm tra có hiệu giá kháng thể ngưng kết với các kháng nguyên vi khuẩn

chế vắc xin thử nghiệm đạt mức 1/16 và 1/32 vẫn đạt 100%; riêng mức hiệu

giá kháng thể ngưng kết 1/64 chỉ đạt từ 40% đến 45%.

3.3.2. Kết quả xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh

Thái Nguyên

Để xác định hiệu lực của vắc xin thử nghiệm, chúng tôi tiến hành xác

định tỷ lệ lợn có triệu chứng nghi mắc viêm phổi giữa vùng tiêm phòng vắc

xin thử nghiệm và vùng không tiêm phòng vắc xin. Vùng không tiêm phòng

vắc xin trên các địa bàn là huyện Phú Lương, thành phố Thái Nguyên, thị xã

Phổ Yên chúng tôi theo dõi 1.860 con lợn lứa tuổi 2 đến 3 tháng cùng thời

gian đó, ở vùng tiêm vắc xin thử nghiệm với số lợn tiêm phòng vắc xin được

chúng tôi theo dõi là 1.520 con cũng cùng lứa tuổi.

Tất cả lợn được tiêm và lợn không tiêm vắc xin đều được điều tra theo

dõi trong cùng một thời gian, nên lợn giữa vùng được tiêm phòng và lợn vùng

không tiêm phòng vắc xin đều có cùng các yếu tố như ngoại cảnh, lứa tuổi,

chế độ chăm sóc nuôi dưỡng … Kết quả được trình bày tại bảng 3.18.

Bảng 3.18: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở vùng tiêm và vùng

không tiêm vắc xin thử nghiệm

Nội dung Địa điểm Tỷ lệ (%) Hiệu lực vắc xin (%) Số lợn theo dõi (con) Số lợn mắc bệnh (con)

7,34 Tx. Phổ Yên 572 42

Tiêm vắc xin TN 8,06 6,95 Tp. Thái Nguyên H. Phú Lương 459 489 37 34

7,43 1.520 113 Cộng

81,96

Không tiêm vắc xin TN 40,26 43,45 40,10 Tx. Phổ Yên Tp. Thái Nguyên H. Phú Lương 673 626 561 271 272 225

41,29 1.860 768 Cộng

Kết quả bảng 3.18 cho thấy: Lợn có triệu chứng mắc viêm phổi ở vùng

không tiêm cao hơn vùng tiêm vắc xin. Ở vùng không tiêm vắc xin số lợn

mắc bệnh là 768/1.860 con theo dõi (41,29%). Trong khi đó vùng tiêm vắc

xin số lợn mắc bệnh là 113/1.520con theo dõi (7,43%).

Áp dụng công thức tính hiệu lực tiêm phòng thay số liệu qua tính toán chúng

tôi xác định đuợc hiệu lực của vắc xin thử nghiệm là 81,96% (P < 0,001).

Như vậy, vắc xin thử nghiệm chế tạo từ các chủng vi khuẩn A.

pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được dùng phòng bệnh

viêm phổi cho lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên có hiệu lực đạt 81,96%. Với việc

thử nghiệm vắc xin đạt kết quả như trên đã giúp chúng tôi nhận định là vi

khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis có vai trò quan trọng gây

viêm phổi ở lợn tại Thái Nguyên.

* Nguy cơ lợn mắc viêm phổi do không tiêm vắc xin thử nghiệm so

sánh giữa nhóm lợn được tiêm và nhóm lợn không tiêm

Để đánh giá sự sai khác về tỷ lệ lợn mắc bệnh giữa lợn được tiêm và lợn

không được tiêm vắc xin thử nghiệm tại vùng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến

hành xác định nguy cơ tương đối lợn mắc viêm phổi do không tiêm phòng vắc

xin. Kết quả được trình bày tại bảng 3.19.

Bảng 3.19: Nguy cơ lợn mắc viêm phổi do không tiêm vắc xin thử nghiệm

so sánh giữa nhóm lợn được tiêm và nhóm lợn không tiêm

RR Nội dung Cộng c 2

303,06 3,45 Không tiêm vắc xin TN Tiêm vắc xin TN

Số mắc Số không bệnh mắc bệnh (con) a 768 c 113 a +c (con) b 1.092 d 1.407 b + d a +b 1.860 c +d 1.520 N Cộng 881 2.499 3.380

Từ kết quả ở bảng 3.19, áp dụng công thức tính RR và công thức tính χ2

TN = 303,06 > χ2

α, RR = 3,45. Như

thay số liệu vào qua tính toán cho kết quả χ2

vậy, lợn không được tiêm vắc xin phòng bệnh viêm phổi có nguy cơ mắc viêm phổi cao gấp 3,45 lần so với lợn đã được tiêm (p < 0,001).

* Từ kết quả thử nghiệm như trên chúng tôi có nhận xét:

- Vắc xin thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn chế tạo từ các chủng vi

khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2; A. pleuropneumoniae serotype 5a; P.

multocida serotype A; P. multocida serotype D và S. suis serotype 2 phân lập

được ở lợn mắc bệnh tại tỉnh Thái Nguyên đã có tác dụng kích thích hình

thành kháng thể tốt ở động vật thí nghiệm và ở lợn được tiêm.

- Khi tiêm phòng cho lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên có hiệu lực bảo hộ đạt

78,16%.

- Lợn không được tiêm vắc xin thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi có nguy cơ mắc viêm phổi cao gấp 3,45 lần so với lợn đã được tiêm (p < 0,001).

KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã lựa chọn các chủng A.

pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được từ các mẫu bệnh

phẩm lợn mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Thái Nguyên, đang được lưu giữ tại

công ty Marphavet. Qua nghiên cứu, tổ chức thực nghiệm, chúng tôi rút ra 4

kết luận như sau:

1. Tiến hành thử nghiệm 18 chủng vi khuẩn, đã chọn được 5 chủng vi

khuẩn có độc lực cao, tính kháng nguyên ổn định để chế tạo vắc xin thử

nghiệm phòng bệnh viêm phổi ở lợn gồm các chủng vi khuẩn: A.

pleuropneumoniae thuộc serotype 2 và serotype 5a; P. multocida thuộc

serotype A và D và S. suis thuộc serotype 2, đây là những serotype có khả

năng gây bệnh cao cho lợn;

2. Cả 3 lô vắc xin chế tạo thử nghiệm đều đạt các chỉ tiêu về đậm độ,

thuần khiết, vô trùng và an toàn 100% khi thử trên chuột bạch;

3. Khi công cường độc xác định hiệu lực của vắc xin trong phòng thí

nghiệm cho thấy:

Đối với A. pleuropneumoniae đạt 90% tại lô I và II và 100% đối với lô

III, chuột đối chứng đều chết sau 18-24h;

Đối với P. multocida đạt 100% tại lô I và II và 90% đối với lô III,

chuột đối chứng đều chết sau 18-24h;

Đối với S.suis đạt 100% tại các lô I, II và III, chuột đối chứng đều chết

sau 18-24h.

4. Khi công cường độc xác định hiệu lực của vắc xin trên lợn cho thấy:

- Tiến hành công cường độc với các chủng vi khuẩn A.

Pleuropneumoniae tỷ lệ bảo hộ 66,67%;

- Tiến hành công cường độc với các chủng vi khuẩn P. multocida. Khi

công cường độc với vi khuẩn P. multocida đạt tỷ lệ bảo hộ 66,67%;

- Khi công cường độc với vi khuẩn S. suis serotype 2 với liều 5 ml/con

đã không gây chết lợn, đạt tỷ lệ bảo hộ với vi khuẩn S. suis serotype 2 là

100%.