Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật Microsatellite dna

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A<br /> BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE-DNA<br /> Đỗ Thị Hiến, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Hemophillia A là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt yếu tố đông máu<br /> FVIII. Xác định đột biến gen, phát hiện người lành mang gen bệnh và tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả<br /> nhất giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ mắc bệnh. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường được thực<br /> hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân. Tuy<br /> nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khó khăn do<br /> cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể được áp dụng dựa vào xác định allele đột biến (Linkage<br /> analysis)…Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA và áp dụng kỹ<br /> thuật này để xác định người lành mang gen bệnh thông qua việc khuếch đại các vùng trình tự lặp lại STR<br /> (short tandem repeat) và so sánh với kết quả phát hiện đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Kỹ thuật giải<br /> trình tự gen và kỹ thuật Microsatellite - DNA cho kết quả trùng khớp nhau cho thấy đã hoàn thiện được kỹ<br /> thuật Microsatellite - DNA phát hiện người lành mang gen bệnh; 10/10 người mẹ đã được phát hiện là người<br /> lành mang gen bệnh, 24/38 thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân là người lành mang gen bệnh. Kỹ thuật<br /> Microsatellite - DNA hứa hẹn là một phương pháp hữu hiệu để phát hiện người lành mang gen bệnh<br /> Hemophillia A ở Việt Nam.<br /> Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh, Microsatellite-DNA<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hemophillia A là bệnh di truyền lặn trên<br /> <br /> trai bị bệnh Hemophilia A, hoặc là con gái của<br /> <br /> nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt<br /> <br /> người mẹ mang gen bệnh; hoặc chị em con dì<br /> <br /> yếu tố đông máu FVIII. Gen bệnh nằm trên<br /> <br /> với người bị bệnh hemophilia A [4]. Cùng với<br /> <br /> nhiễm sắc thể X không có allele tương ứng<br /> <br /> sự tiến bộ của kỹ thuật phân tử, nhiều loại đột<br /> <br /> trên nhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang<br /> <br /> biến gen F8 đã được phát hiện bao gồm: đột<br /> <br /> gen bệnh có thể truyền bệnh cho 50% con trai<br /> <br /> biến điểm, đột biến xoá đoạn, đột biến đảo<br /> <br /> và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ<br /> <br /> đoạn [5]. Việc phát hiện đột biến gen, xác định<br /> <br /> [1; 2]. Bệnh có thể di truyền qua nhiều thế hệ<br /> <br /> người lành mang gen bệnh và tư vấn di truyền<br /> <br /> và có nhiều người mắc bệnh trong cùng một<br /> <br /> là giải pháp hiệu quả giúp ngăn ngừa và làm<br /> <br /> gia đình. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng<br /> <br /> giảm tỉ lệ mắc bệnh.<br /> <br /> 6000 người bị bệnh Hemophilia A và khoảng<br /> <br /> Ngày nay, phát hiện người lành mang gen<br /> <br /> 30.000 người mang gen bệnh Hemophilia A [3].<br /> <br /> bệnh thường được thực hiện bằng kỹ thuật<br /> <br /> Phụ nữ chắc chắn mang gen bệnh nếu có con<br /> <br /> phát hiện đột biến trực tiếp trên gen F8 dựa<br /> vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân [6; 7].<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 23/12/2016<br /> Ngày được chấp thuận: 26/2/2017<br /> <br /> 24<br /> <br /> Tuy nhiên, vẫn còn một tỷ lệ đáng kể bệnh<br /> nhân chưa phát hiện được đột biến và đôi khi<br /> việc phát hiện đột biến gặp khó khăn do cấu<br /> trúc gen lớn, giá thành phân tích cao [8]. Kỹ<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> thuật phân tích gián tiếp Microsatellite-DNA<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh sạch của DNA: bằng<br /> <br /> dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại<br /> <br /> phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/<br /> <br /> STR có thể được áp dụng để xác định allele<br /> <br /> A280nm = 1,8 ÷ 2,0.<br /> <br /> đột biến với giá thành rẻ hơn và độ chính xác<br /> khá cao [9; 10]. Vì vậy, nghiên cứu này được<br /> tiến hành với mục tiêu:<br /> Hoàn chỉnh quy trình xác định người lành<br /> mang gen bệnh Hemophillia A bằng kỹ thuật<br /> Microsatellite-DNA.<br /> <br /> - Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột<br /> biến điểm<br /> Sử dụng các cặp mồi tương ứng với các vị<br /> trí đột biến chỉ điểm của bệnh nhân để xác<br /> định người mang gen cho các thành viên gia<br /> đình bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Exon<br /> <br /> Xác định người lành mang gen bệnh He-<br /> <br /> tương ứng với vị trí đột biến trên gen F8 được<br /> <br /> mophillia A bằng kỹ thuật Microsatellite-DNA<br /> <br /> khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và tiến hành<br /> <br /> trên các thành viên gia đình bệnh nhân.<br /> <br /> giải trình tự theo 2 chiều [5].<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> - Kỹ thuật Microsatellite-DNA<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> Để xác định allele bệnh người mẹ truyền<br /> cho con trai bị bệnh, trước tiên cần tiến hành<br /> <br /> + 3 gia đình của các bệnh nhân Hemophilia<br /> <br /> kỹ thuật single PCR sử dụng 14 cặp mồi được<br /> <br /> A đã được xác định đột biến gen F8 dùng để<br /> <br /> đánh dấu huỳnh quang FXS8061, DXS9897,<br /> DXS9901, FXS52, FXS8087, FXS9796,<br /> <br /> xây dựng quy trình microsatellite-DNA phát<br /> hiện người mang gen.<br /> + 7 gia đình của các bệnh nhân Hemophilia<br /> A chưa xác định được đột biến gen F8.<br /> <br /> FXS7501, FXS7153, FXS1073, FXS7532,<br /> FXS1108, DXS1073, F8int13, F8int22 để<br /> khuyếch đại các vùng trình tự lặp lại STR đặc<br /> hiệu trên mẫu mẹ, chọn ra được ít nhất 2 mar-<br /> <br /> Tổng số 38 người gồm 10 mẹ bệnh nhân<br /> <br /> ker dị hợp tử [11; 12]. Tiếp tục, tiến hành với<br /> <br /> và 28 thành viên gia đình (em gái, chị gái, dì,<br /> <br /> DNA của bệnh nhân trên marker dị hợp tử đã<br /> lựa chọn và so sánh kết quả thu được từ mẫu<br /> <br /> bác gái, bà ngoại, chị họ, em gái họ).<br /> Các mẫu máu được thu thập tại Trung tâm<br /> nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y<br /> Hà Nội.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt<br /> ngang.<br /> <br /> mẹ và mẫu con để xác định allele đột biến,<br /> các đỉnh có kích thước tương đương nhau<br /> giữa mẫu mẹ và mẫu con thể hiện allele đột<br /> biến (allele bệnh).<br /> Thành phần của phản ứng PCR: 1X đệm<br /> PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;<br /> 0,5unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O,<br /> tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR:<br /> <br /> 2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên<br /> cứu<br /> <br /> 94oC/30 giây; [94oC/12 giây, 62oC/30 giây,<br /> 72oC/30 giây] x 35 chu kỳ; 72oC/5 phút. Sản<br /> <br /> - Tách chiết DNA<br /> <br /> phẩm khuếch đại PCR được điện di trên hệ<br /> <br /> DNA được tách chiết theo phương pháp<br /> <br /> thống sequencing của hãng Beckman Coulter.<br /> <br /> phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi<br /> <br /> Kết quả được phân tích bằng phần mềm Ge-<br /> <br /> của người nhà bệnh nhân.<br /> <br /> neMapper v3.2.<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 25<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự<br /> nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân<br /> hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi<br /> <br /> 1. Hoàn chỉnh quy trình xác định người<br /> lành mang gen bệnh Hemophillia A bằng<br /> kỹ thuật Microsatellite DNA<br /> <br /> không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên<br /> cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ<br /> <br /> * Gia đình bệnh nhân mã số HA11:<br /> <br /> được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để<br /> <br /> - Kết quả phát hiện người lành mang gen<br /> <br /> giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa<br /> <br /> F8 bị đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen<br /> <br /> chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin<br /> <br /> của gia đình HA11:<br /> <br /> cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> Người bình thường<br /> <br /> Bệnh nhân HA<br /> <br /> Bác gái bệnh nhân HA<br /> <br /> Mẹ bệnh nhân HA<br /> <br /> Chị gái bệnh nhân HA<br /> <br /> Hình 1. Ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA11<br /> Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 của người mẹ và chị gái bệnh nhân HA11 xuất hiện 2<br /> đỉnh chồng lên tại vị trí đột biến đã phát hiện được ở bệnh nhân HA11 (c.2776_2777insC), chứng<br /> tỏ mẹ và chị gái bệnh nhân mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử. Bác gái bệnh nhân<br /> không mang gen bệnh.<br /> - Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 bị đột biến bằng kỹ thuật Microsatellite-DNA:<br /> Marker dị hợp tử được tìm thấy khi khuếch đại các vùng STR trên mẹ bệnh nhân HA11 là<br /> DXS9901, DXS 9897.<br /> <br /> 26<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Allele đột biến<br /> <br /> Allele đột biến<br /> <br /> Bệnh nhân HA<br /> <br /> Mẹ bệnh nhân HA<br /> <br /> Chị bệnh nhân HA<br /> <br /> Bác gái bệnh nhân HA<br /> <br /> Hình 2. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901, DXS9897<br /> của gia đình mã số HA11<br /> Kết quả trên cho thấy với marker dị hợp tử DXS9901, DXS 9897, mẹ và chị của bệnh nhân<br /> xuất hiện 2 đỉnh, mỗi đỉnh tương ứng với 1 allele. Ở đỉnh trùng với đỉnh của bệnh nhân chính là<br /> đỉnh của allele đột biến Xb, tức là bệnh nhân sẽ nhận allele đột biến này từ người mẹ, mẹ và chị<br /> gái bệnh nhân mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử. Bác gái bệnh nhân không có đỉnh<br /> trùng với đỉnh của allele đột biến Xb nên không mang gen bệnh. Kết quả này cũng trùng khớp với<br /> kết quả xác định người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen tức là cả mẹ bệnh<br /> nhân và chị gái bệnh nhân là người lành mang gen bệnh.<br /> - Phả hệ gia đình HA11:<br /> <br /> Nữ bình thường<br /> <br /> Nam bình thường<br /> <br /> Nữ mang gen bệnh<br /> <br /> Nam bị bệnh<br /> <br /> Nam bị bệnh đã tử vong<br /> <br /> Bệnh nhân tham gia vào<br /> nghiên cứu<br /> <br /> Hình 3. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA11<br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 27<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Hình trên cho thấy, trong 4 thành viên nữ (I1, II1, II2, III1) của gia đình bệnh nhân HA11 đã xác<br /> định được:<br /> - 2 thành viên nữ chắc chắn mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử là mẹ và bà ngoại<br /> bệnh nhân (II2; I1) (vì có một con trai bị bệnh và có ít nhất 1 người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh).<br /> - 1 thành viên nữ (II1 – bác bệnh nhân) không mang gen F8 đột biến ở trạng thái dị hợp tử.<br /> - 1 thành viên nữ (II1 – chị bệnh nhân) là người lành mang gen bệnh.<br /> Kết quả phân tích bằng kỹ thuật Microsa-<br /> <br /> 2. Xác định người lành mang gen bệnh<br /> <br /> tellite - DNA cũng trùng khớp với kết quả xác<br /> định người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật<br /> <br /> Hemophillia A bằng kỹ thuật Microsatellite<br /> DNA<br /> <br /> giải trình tự gen tức là mẹ và chị gái bệnh<br /> <br /> Áp dụng quy trình xác định người lành<br /> <br /> nhân là người lành mang gen bệnh, bác gái<br /> <br /> mang gen bệnh bằng kỹ thuật Microsatellite-<br /> <br /> không phải là người lành mang gen bệnh.<br /> <br /> DNA cho các thành viên nữ trong 7 gia đình<br /> <br /> Tiến hành tương tự với gia đình HA37,<br /> HA02 cũng cho kết quả tương đồng giữa 2<br /> <br /> của các bệnh nhân Hemophillia A chưa xác<br /> định được đột biến chỉ điểm trên bệnh nhân.<br /> <br /> phương pháp giải trình tự gen và Microstellite-<br /> <br /> * Kết quả phát hiện người lành mang gen<br /> <br /> DNA. Như vậy, kết quả phát hiện người lành<br /> <br /> F8 bị đột biến bằng kỹ thuật Microsatellite-<br /> <br /> mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen<br /> <br /> DNAcủa gia đình bệnh nhân HA42:<br /> <br /> và kỹ thuật Microsatellite - DNA cho kết quả<br /> trùng khớp nhau.<br /> <br /> Ở gia đình HA42 marker dị hợp tử được<br /> tìm là FXS 7153, F8int22:<br /> <br /> Allele đột biến<br /> <br /> Allele đột biến<br /> <br /> Hình 4. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS7153, F8int22<br /> của gia đình mã số HA42<br /> Kết quả trên cho thấy ở marker dị hợp tử: FXS7153, F8int22, mẹ của bệnh nhân xuất hiện 2<br /> đỉnh, mỗi đỉnh tương ứng với 1 allele. Ở đỉnh trùng với đỉnh của bệnh nhân chính là đỉnh của allele đột biến Xb, tức là bệnh nhân sẽ nhận allele đột biến này từ người mẹ, mẹ bệnh nhân mang<br /> <br /> 28<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br />