intTypePromotion=3

Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Chia sẻ: Sunshine_6 Sunshine_6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

0
61
lượt xem
11
download

Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid đ-ợc nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3’ thừa, chéo có ADN đơn 5’ thừa. Nghiên cứu này dùng một ph-ơng pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn. Ph-ơng pháp gi.i trình tự Sanger đ-ợc sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nh-ng dùng chất không phóng xạ. Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài đ-ợc cắt bằng enzym...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

  1. TCNCYH 23 (3) 2003 X¸c ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu enzym giíi h¹n b»ng ph©n tÝch ®Çu tËn cïng cña c¸c ®o¹n ADN bÞ c¾t Lª ThÞ Kim TuyÕn ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng, Hµ Néi C¸c enzym giíi h¹n c¾t ADN kÐp ë c¸c vÞ trÝ ®Æc hiÖu ngoµi hoÆc trong tr×nh tù nucleotid ®−îc nhËn ra vµ ®Ó l¹i 3 d¹ng c¸c ®Çu tËn cïng: ph¼ng; chÐo cã ADN ®¬n 3’ thõa, chÐo cã ADN ®¬n 5’ thõa. Nghiªn cøu nµy dïng mét ph−¬ng ph¸p cho phÐp x¸c ®Þnh kiÓu c¾t cña c¸c enzym giíi h¹n. Ph−¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù Sanger ®−îc sö dông ®Ó ph©n tÝch ADN ë xung quanh vÞ trÝ c¾t nh−ng dïng chÊt kh«ng phãng x¹. Song song c¸c ®o¹n ADN tæng hîp kÐo dµi ®−îc c¾t b»ng enzym giíi h¹n. Ph¶n øng Klenow mang hai ho¹t tÝnh lµ tæng hîp ADN 5’→ 3’ vµ exonucleasa 3’→ 5’ cho phÐp x¸c ®Þnh kiÓu c¾t cña enzym giíi h¹n. KÕt qu¶ ®· cho phÐp x¸c ®Þnh vÞ trÝ c¾t cña hai enzym míi. §iÓm c¾t Sml I n»m trong tr×nh tù ®èi xøng ®−îc nhËn: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. BciV I nhËn ra mét tr×nh tù kh«ng ®èi xøng vµ c¾t ngoµi vÞ trÝ nhËn : 5’ - GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑ - 5’. I. §Æt vÊn ®Ò tr×nh tù ®èi xøng hoÆc ngoµi vÞ trÝ nhËn c¸ch xa vµ nucleotid ®èi víi c¸c tr×nh tù kh«ng ®èi Trong y häc viÖc chÈn ®o¸n vµ nghiªn cøu xøng. Hai enzym míi ®−îc t×m ë ViÖt Nam, bÖnh lý ë møc ®é ADN ngµy cµng quan träng. Sml I nhËn ra tr×nh tù ®èi xøng 5’-CTPuPyAG- §Ó ph©n tÝch ®−îc c¸c ADN genom cÇn dïng 3’ [3] vµ BciV I nhËn ra tr×nh tù kh«ng ®èi ®Õn ph¶n øng c¾t ADN giíi h¹n ®Ó t¹o thµnh c¸c m¶nh nhá cã kÝch th−íc nhÊt ®Þnh. Ph¶n xøng 5’-GTATCC-3’/3’-CATAGG [4] ®−îc øng nµy ®−îc xóc t¸c b¾ng c¸c enzym giíi h¹n x¸c ®Þnh vÞ trÝ c¾t. thuû ph©n ADN ë c¸c vÞ trÝ quyÕt ®Þnh sau khi Môc tiªu c«ng tr×nh nµy lµ x¸c ®Þnh tÝnh ®Æc ®· nhËn tr×nh tù ®Æc hiÖu gåm tõ 4 ®Õn 8 bp. hiÖu c¸c enzym giíi h¹n b»ng ph©n tÝch vÞ trÝ TËp hîp c¸c enzym giíi h¹n lµ hÕt søc ®a d¹ng c¾t cña nã trªn ADN. vµ cã nguån gèc phong phó lµ c¸c vi khuÈn II. Ph−¬ng ph¸p vµ vËt liÖu kh«ng ph©n biÖt lo¹i chi. HiÖn nay, trªn thÕ nghiªn cøu giíi ®· thu thËp h¬n 200 enzym giíi h¹n cã 1. C¸c sinh phÈm tÝnh ®Æc hiÖu kh¸c nhau. NÕu tÝnh ®ñ c¸c lo¹i ADN ®Ých M13 mp18 vµ ADN måi ng−îc tr×nh tù tõ 4 ®Õn 8 nucleotid cã tÝnh liªn tôc hay cã vÞ trÝ 944-924 g¾n biotin. kh«ng, sè enzym giíi h¹n ph¶i h¬n 1000 [1]. Víi môc ®Ých cã ®−îc enzym ®Ó cã thÓ c¾t ADN ®Ých pUC19 vµ ADN måi ng−îc cã vÞ ADN ë bÊt cø vÞ trÝ mong muèn nµo, chóng t«i trÝ 2627-2608 g¾n biotin. tiÕp tôc kh¶o s¸t c¸c enzym giíi h¹n cã tÝnh Sml I vµ BciV I lµ hai enzym giíi h¹n míi ®Æc hiÖu míi [2]. ®−îc t×m ë hai chñng vi khuÈn thiªn nhiªn ph©n §Õn nay, c¸c enzym giíi h¹n ®−îc x¸c ®Þnh lËp t¹i ViÖt Nam tõ Stenotrophomonas chñ yÕu b»ng c¸c tr×nh tù nucleotid ®−îc nhËn maltophilia vµ Bacillus circulans. Sml I nhËn ra trªn ADN. Nh−ng c¸c enzym giíi h¹n nhËn tr×nh tù 5’-CTPyPuAG-3’. BciV I nhËn tr×nh tù ra cïng mét tr×nh tù cã thÓ c¾t ADN ë c¸c vÞ trÝ 5’-GGATAC-3’ /5’-GTATCC-3’. kh¸c nhau n»m trong vÞ trÝ nhËn ®èi víi c¸c 106
  2. TCNCYH 23 (3) 2003 2. Ph−¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù nucleotid §o¹n ADN c¾t víi Sml I [H×nh 1, (-)] kÕt Ph−¬ng ph¸p cña Sanger [5] ®−îc sö dông thóc b»ng nucleotid C n»m trong tr×nh tù nhËn nh−ng dïng c¸c ho¸ chÊt kh«ng phãng x¹. C¸c ra. Sau khi ph¶n øng víi Klenow, ®o¹n ADN ®o¹n ADN ®iÖn di trªn gel acrylamid ®−îc ®−îc dµi ra thªm 4 nucleotid lµ TTGA. Sù tæng truyÒn lªn mµng nyl«ng theo ph−¬ng ph¸p hîp nµy chøng tá r»ng ®Çu tËn cïng do Sml I ®Ó Southern blot [6]. C¸c ®o¹n ADN hiÖn lªn b»ng l¹i cã chuçi ®¬n 5’ thõa gåm cã 4 nucleotid. ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch häc dïng avidine, céng KÕt qu¶ nµy cho phÐp x¸c ®Þnh vÞ trÝ c¾t cña hîp biotin-phosphatase vµ c¬ chÊt CDP star t¹o Sml I lµ: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. s¶n phÈm ph¸t quang cña Phototope-Star Chemiluminescent Detection kit (New England BciV I nhËn tr×nh tù 5’-GGATAC-3’ /5’- Biolabs). GTATCC-3’ vµ c¾t pUC19 hai lÇn. VÞ trÝ c¾t 3. X¸c ®Þnh d¹ng c¾t cña c¸c ®o¹n ADN ®−îc ph©n tÝch lµ 2542 (H×nh 2). Tr×nh tù ®−îc giíi h¹n x¸c ®Þnh trªn gel nucleotid lµ 5’- §o¹n dµi ADN ®−îc tæng hîp vµ c¾t víi CGACCCTGCCGCTTACC GGATAC CC-3’. enzym giíi h¹n ph©n tÝch, 30 phót, 37°C. TiÕp C¸c ®o¹n ADN c¾t kÕt thóc b»ng “C” n»m theo 3 µg ADN c¾t ®−îc sö lý víi 2U Klenow, tr−íc tr×nh tù nhËn ra GGATAC c¸ch 5 ñ 5 phót ë nhiÖt ®é phßng. nucleotid. Ph¶n øng Klenow ®Ó l¹i mét ®o¹n ADN nhá h¬n mét nucleotid kÕt thóc b»ng G. III. KÕt qu¶ KÕt qu¶ chØ r»ng phÇn exonucleasa cña Klenow Sml I c¾t ADN cña phag¬ M13mp18 t¹i bèn ®· ph©n huû chuçi ADN ®¬n 3’ thõa gåm cã vÞ trÝ. Mét trong c¸c vÞ trÝ c¾t lµ 868. H×nh 1 chØ mét nucleotid. VÞ trÝ c¾t cña BciV I lµ: 5’- tr×nh tù ADN cña M13mp18 xung quanh vÞ trÝ ®ã lµ: GTATCC(N)6↓-3’/3’-CATAGG (N)5↑-5’. 3’-GAGTAGTAATTGGG CTTGAG ATGGTTT-5’. + A T G C - C - T AG C + H×nh 1: VÞ trÝ c¾t Sml I: H×nh 2: VÞ trÝ c¾t BciV I: 5’C ↓T Pu Py A G 3’ 5’GTATCC(N)6 ↓ 3’ 3’G A Py Pu T ↑ C 5’ 3’CATAGG(N)5 ↑ 5’ -: kh«ng cã Klenow +: cã Klenow -: kh«ng cã Klenow +: cã Klenow 107
  3. TCNCYH 23 (3) 2003 IV. Bµn luËn kÐp, Klenow kh«ng cã t¸c ®éng vµ ADN vÉn gi÷ nguyªn. §Õn nay, c¸c enzym giíi h¹n ®−îc x¸c ®Þnh chñ yÕu b»ng c¸c tr×nh tù nucleotit ®Æc hiÖu Ph−¬ng ph¸p ®−îc ¸p dông trong tr−êng nhËn ra. Nh−ng vÞ trÝ c¾t cã thÓ xÈy ra ë nhiÒu hîp cña hai enzym giíi h¹n ®−îc t×m ë ViÖt ®iÓm kh¸c nhau hoÆc ngay trong c¸c tr×nh tù cã Nam. VÞ trÝ c¾t cña Sml I lµ 5’- C↓ TPuPy A↑G tÝnh chÊt ®èi xøng hoÆc ë ngoµi c¸c tr×nh tù - 3’ n»m ngay trong tr×nh tù ®èi xøng ®−îc kh«ng ®èi xøng c¸ch vµi nucleotit [7]. C¸c nh©n ra. VÞ trÝ c¾t cña BciV I lµ: 5’- enzym giíi h¹n nhËn cïng mét tr×nh tù cã kh¶ GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’ n¨ng c¾t ë c¸c vÞ trÝ kh¸c nhau nh− tr−êng hîp n»m phÝa ngoµi tr×nh tù kh«ng ®èi xøng c¸ch cña Sma I vµ Xma I [8]. Tuy nhiªn nh÷ng vÞ trÝ vµi nucleotit. c¾t nµy sÏ gÇn nhau c¸ch xa mét vµi nucleotit Ph−¬ng ph¸p nµy kh«ng dïng phãng x¹ th«i. Do vËy c¸c h×nh v¹ch cña mét ADN hoµn toµn phï hîp víi nhiÒu phãng thÝ nghiÖm chuÈn c¾t víi c¸c enzym giíi h¹n nhËn ra cïng kh«ng cã ®iÒu kiÖn lµm thÝ nghiÖm víi c¸c chÊt mét tr×nh tù sÏ hiÖn lªn gièng nhau khi quan s¸t phãng x¹. trªn gel agarose. Ph−¬ng ph¸p dïng trªn cho phÐp x¸c ®Þnh d¹ng ADN tËn cïng do enzym V. KÕt luËn giíi h¹n ®Ó l¹i, trªn c¬ së ®ã cã thÓ kÕt luËn vÞ Ph−¬ng ph¸p ®−îc t¶ trong c«ng tr×nh nµy trÝ c¾t mét c¸ch chÝnh x¸c. cho phÐp ph©n tÝch c¸c ®Çu tËn cïng cña c¸c Dùa vµo ph−¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù Sanger ®o¹n ADN giíi h¹n. Trªn c¬ së ®ã cã thÓ x¸c kÕt qu¶ thu ®−îc cho phÐp quan s¸t c¸c ®o¹n ®Þnh thªm mét ®Æc ®iÓm quan träng cña mét ADN kh¸c nhau mét nucleotit ®èi víi c¸c ph©n enzym giíi h¹n nhÊt ®Þnh lµ ®iÓm c¾t cña nã. tö gåm tõ 30 ®Õn 200 nucleotit. Do ®ã c¸c Hai enzym giíi h¹n míi t×m ë ViÖt Nam ®· ADN chuÈn M13mp18 vµ pUC19 ®−îc tæng ®−îc ph©n tÝch. hîp tõ c¸c ADN måi n»m tõ 50 ®Õn 100 VÞ trÝ c¾t Sml I lµ 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. nucleotit tr−íc vÞ trÝ c¾t cña enzym giíi h¹n ®ang x¸c ®Þnh. Song song ADN ®−îc tæng hîp VÞ trÝ c¾t BciV I lµ 5’- GTATCC(N)6 ↓ - kÐo dµi vµ c¾t b»ng enzym giíi h¹n cho biÕt 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’ nucleotit cuèi cïng cña phÇn kÐp ë c¸c tËn Tµi liÖu tham kh¶o cïng c¾t. Ba d¹ng tËn cïng cã thÓ xuÊt hiÖn: Ph¼ng do ADN lµ hoµn toµn kÐp; chÐo víi 1. Schildkraut I. (1984). Screening and ADN ®¬n 3’ thõa; chÐo víi ADN ®¬n 5’ thõa. characterizing restriction endonucleases. Genet. Ph¶n øng Klenow cho phÐp ph©n biÖt gi÷a 3 Eng., 6: 117-140. kh¶ n¨ng ®ã v× enzym mang 2 ho¹t tÝnh 2. Lª ThÞ Kim TuyÕn, Vò ThÞ Kim Liªn, exonucleasa thuû ph©n ADN ®¬n 3’→5’ vµ Vò Hång Nga (1996). Ph¸t hiÖn enzym giíi endonucleasa tæng hîp ADN ®¬n 5’→3’ [9]. h¹n trong vi khuÈn tù nhiªn ph©n lËp ë ViÖt- Hai ho¹t tÝnh ®ã kÕt thóc t¹o ra c¸c chuçi ADN Nam. Héi nghÞ khoa häc chuyªn ®Ì vi sinh häc, hoµn toµn kÐp. Nh− thÕ kÕt luËn dùa vµo 3 t×nh dÞch tÔ häc, miÔn dÞch häc, th¸ng 1/1996, huèng cã thÓ x¶y ra lµ: ADN ®¬n 3’ thõa, phÇn Thµnh phè Hå ChÝ Minh: 112-116. exonucleasa cña enzym Klenow ®Ó l¹i s¶n phÈm ADN nhá h¬n; ADN ®¬n 5’ thõa, phÇn 3. Lª ThÞ Kim TuyÕn, Vò ThÞ Kim Liªn endonucleasa tæng hîp ®Ó l¹i s¶n phÈm ADN (1997). Sml I, mét enzym giíi h¹n míi t¸ch dµi h¬n; ADN c¾t ph¼ng cã ®Æc ®iÓm hoµn toµn chiÕt tõ chñng Stenotrophomonas maltophilia. T¹p chÝ Y häc Dù phßng, VII, 4 (34): 11-16. 108
  4. TCNCYH 23 (3) 2003 4. Lª ThÞ Kim TuyÕn, Vò Hång Nga. Ph¸t 7. Szybalski W., Kim S. C., Hasan N. and hiÖn vµ x¸c ®Þnh mét enzym giíi h¹n míi BciV Podhajska A. J. Class-IIs restriction enzymes-a I, t¸ch tõ Bacillus circulans. T¹p chÝ Y häc Dù review. Gene, 1991, 100: 13-26. phßng, 1997, VII, 4 (34): 5-10. 8. Endow S.A., Roberts R.J. Two 5. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R.. restriction-like enzymes from Xanthomonas DNA sequencing with chain-terminating malvacearum. J. Mol. Biol., 1977, 112: 521- inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 529. 74:5463-67. 9. Klenow H., Henningsen I. Selective 6. Southern E.M.. Detection of specific elimination of the exonuclease activity of the sequences among DNA fragments separated by deoxyribonucleic acid polymerase from gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98 : Escherichia coli B by limited proteolysis. Proc. 503-517. Natl. Acad. Sci., 1970, 65:168. Summary Nucleotide analysis of restricted fragment DNA extremities for characterizing the restriction enzyme cutting activity The analysis of genomic DNA requires mostly its restriction into small fragments of definite sizes. This reaction is catalyzed by restriction enzymes recognizing specific sequences 4-8 nucleotides long. Each restriction enzyme is characterized by one recognition nucleotide sequence and its cut site on DNA. So far, more than 200 restriction enzymes with different specificities have been found. If considering all the possibilities of palindrome sequences of 4-8 nucleotides, interrupted or not, the number of restriction enzymes should be more than one thousand. With the purpose to get a collection of restriction enzymes that cut DNA anywhere, we still continue to find restriction enzymes having new specificities. This study presents a method able to characterize unknown restriction enzymes by analyzing the cutting extremities of restricted fragments. The method is based on the Sanger sequencing of DNA around the cut site. The non-radioactive chemical biotin has been used instead of 32P. The cut sites of two new enzymes have been determined. For Sml I, the cut site occurs within the recognition nucleotide sequence: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. Bci VI recognizing a non-palindrome sequence cuts outside this sequence: 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’. 109

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản