Xây dựng bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò bằng phương pháp sinh học phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này xây dựng bộ KIT để phân biệt thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt này trở nên đơn giản hơn. Kết quả này hi vọng góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò bằng phương pháp sinh học phân tử

Kỷ yếu Hội nghị khoa học XÂY DỰNG BỘ KIT PHÂN BIỆT THỊT HEO VÀ THỊT BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Hồ Viết Thế*, Ngô Thị Kim Anh, Phạm Thị Tuyết Trinh Nguyễn Hiếu Thuyên, Hồ Lê Quỳnh Trinh Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: thehv@cntp.edu.vn TÓM TẮT Xác định các loại thịt bằng phương pháp sinh học phân tử trở nên phổ biến trong những thập niên qua vì mức độ chính xác cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex PCR thông qua việc khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên hai gene ty thể là COI và ND5. Kết quả tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR đượ hoàn thiện thành bộ KIT. Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng bộ KIT đạt độ chính xác cao và có thể áp dụng cả ở thịt tươi và các sản phẩm thịt đã qua chế biến. Từ khóa: Thịt bò, thịt heo, multiplex PCR, KIT. DEVELOP MOLECULAR BIOLOGY- BASED KIT TO DISTINGUISH BETWEEN PORK AND BEEF Ho Viet The*, Ngo Thi Kim Anh, Pham Thi Tuyet Trinh Nguyen Hieu Thuyen, Ho Le Quynh Trinh Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: thehv@cntp.edu.vn ABSTRACT Identifying meat by molecular markers has become ubiquitous in the past decades. In this study, multiplex PCR –based detectionn KIT was developed to distinguish between pork and beef relying on the presence of specific DNA fragments on two mitochondrial genes consisting of COI and ND5. After optimization, the obtained KIT could differentiate beef from pork with high accuracy and this KIT is also applicable for identifiying both raw meats and meat-proccessed products. Keywords: Beef, pork, multiplex PCR, KIT. MỞ ĐẦU sinh học phân tử nên các phương pháp phân Cùng với sự phát triển về kinh tế, nhu cầu sử biệt thịt dựa vào DNA cho kết quả chính xác dụng thực phẩm chất lượng cao cũng tăng hơn. Trong đó, phương pháp PCR dễ thực theo, đặc biệt trong đó có thịt bò [1]. Tuy hiện, cho kết quả chính xác với độ nhạy cao nhiên, hiện nay nhiều trường hợp người buôn trong thời gian ngắn [3]. Năm 1999, nhóm bán vì lợi nhuận đã dùng hóa chất để làm giả nghiên cứu của Matsunaga đã phát hiện 6 loại thịt bò từ nguyên liệu là các loại thịt khác [2]. thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt tươi và Điều này gây ảnh hưởng đến việc kinh doanh, thịt chế biến bằng kỹ thuật multiplex PCR [4]. sản xuất cũng như sức khỏe người tiêu dùng. Gần đây, Kitpipit và cộng sự đưa ra những Vì vậy, việc tìm ra phương pháp phân biệt thịt bước tiến mới trong việc phát hiện các loại thịt heo và thịt bò một cách nhanh chóng, chính bằng cách thực hiện PCR trực tiếp mà không xác phục vụ người tiêu dùng cùng các nhân cần tách chiết DNA trước với primer được viên kiểm tra thực phẩm là hết sức cần thiết. thiết kế từ cytochrome ty thể (cyt b), Những phương pháp phân biệt thịt heo, thịt bò cytochrome oxidase I (COI), và 12s rRNA [5]. hiện nay chủ yếu dựa trên màu sắc, mùi vị, độ Phương pháp hiện đại và chính xác nhất hiện dai của thịt bò nhưng đối với những loại thịt nay để phát hiện và phân biệt các loại thịt là bò tẩm hóa chất hay các sản phẩm đã qua chế PCR định lượng [6], tuy nhiên phương pháp biến thì phương pháp trên cho độ chính xác này đòi hỏi thiết bị hiện đại và hóa chất đắt thấp hoặc không thể thực hiện [2]. Trong tiền nên chưa được sử dụng phổ biến. Một những thập niên gần đây, nhờ sự phát triển của bước cải tiến mới của phương pháp PCR là 171
Kỷ yếu Hội nghị khoa học multiplex PCR, đây là kỹ thuật giúp nhanh loại thịt này được thu thập tại các chợ và siêu chóng phát hiện nhiều gen mục tiêu trong thị. Sau khi thu thập, mẫu được mã hóa bảo cùng một phản ứng từ đó rút ngắn được thời quản ở -80 oC đến khi sử dụng. gian đưa ra kết quả cũng như tận dụng được Phương pháp các thiết bị PCR truyền thống có mặt phổ biến Mẫu được rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tiến ở các phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này hành tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lương chúng tôi xây xây dựng bộ KIT để phân biệt Quý Phương [7]. Tuy nhiên, chúng tôi thay thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplexđổi thời gian ly giải thịt từ 30 phút lên 1 giờ PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt và tủa DNA bằng isopropan thay vì sử dụng này trở nên đơn giản hơn. Kết quả này hi vọng ethanol tuyệt đối. DNA sau khi tách chiết góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại được định tính bằng phương pháp điện di đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản 110V trong 20 phút và định lượng bằng phẩm chế biến từ thịt. phương pháp đo quang phổ. Sau đó, tiến hành phản ứng PCR với các cặp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU primer được thiết kế dựa trên đoạn gene COI Vật liệu đối với heo và đoạn gene ND5 đối với bò Mẫu được thu thập từ lò mổ, siêu thị và các (Bảng 1). Các cặp primer đã được sử dụng chợ ở trên địa bàn quận Tân Phú, thành phố trong nghiên cứu của các nhóm Spychaj [8] và Hồ Chí Minh. Các sản phẩm chế biến từ hai Motalib [9]. Bảng 1. Trình tự các primer xuôi và ngược Độ dài Tài liệu sản Thịt Trình tự (5’ – 3’) Gene tham phẩm khảo (bp) 5’- GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3’ Heo COI 294 [8] 5’- TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3’ 5’- GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGG-3’ Bò ND5 106 [9] 5’- GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAG-3’ Phản ứng PCR được thực hiện theo từng cặp primer Sau đó, quy trình multiplex PCR hoàn thiện được với từng loại DNA mẫu thịt khác nhau của heo và sử dụng để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các bò. Sau đó chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mẫu thực phẩm chế biến từ thịt. DNA tối ưu cho phản ứng PCR, bao gồm các nồng độ 50 ng/µl, 100 ng/µl, 150 ng/µl và nồng độ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN primer tối ưu bao gồm các nồng độ 5 µM, 10 µM, Kết quả tách chiết DNA 15 µM cho mỗi phản ứng. Sau khi tối ưu hóa các Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi được thể hiện ở nồng độ DNA và nồng độ primer ở thí nghiệm Hình 1. Các band DNA thu được sau khi ly trích rõ trước, chúng tôi thử nghiệm tính chuyên biệt của ràng, nồng độ khá cao. Đối với các mẫu DNA tách các cặp primer trong phản ứng multiplex PCR. chiết từ thực phẩm được trình bày ở Hình 2. Kết Tiếp theo, chúng tôi tối ưu hóa nồng độ các cặp quả điện di cho thấy DNA bị đứt gãy và nhiễm tạp primer cho phản ứng multiplex PCR và tối ưu hóa nhiều nên các band mờ, kéo các vạch dài. Nguyên nhiệt độ bắt cặp ở các nhiệt độ 52oC, 53oC, 54oC, nhân có thể là do trong các sản phẩm này chứa 55oC, 56oC, 57oC. Tổng thể tích phản ứng PCR là nhiều bột, các chất phụ gia, ít thịt và đã qua chế biến 20 µl, bao gồm: MyTaqTM HS Mix White 2X 8 nên gây cản trở cho việc tách chiết. Tuy nhiên, nồng µl, primer 1 µl, DNA mỗi loại thịt 1 µl và nước. độ DNA thu được khá cao, chứng tỏ quy trình có Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt thể tách chiết được DNA trong các sản phẩm từ thịt. như sau: biến tín ban đầu 94oC - 1 phút; 35 chu kỳ: DNA được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR và 94oC - 1 phút, 54oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; kéo multiplex PCR (Hình 7 và Hình 8). dài kết thúc 72oC - 5 phút . 172
Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình 1a. Kết quả tách chiết DNA từ thịt tươi (H1, H2: mẫu thịt heo tươi; B1, B2: mẫu thịt bò tươi) Hình 1b. Kết quả tách chiết DNA từ các sản phẩm thịt đã qua chế biến (XH, XB: xúc xích heo, bò; CH: chả heo; BV: bò viên) Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nồng độ quả PCR tốt nhất [10]. Nghiên cứu của Jonker và DNA cho mỗi loại thịt cs (2008) chỉ ra rằng nồng độ DNA trong khoảng Nồng độ DNA và nồng độ primer có ảnh hưởng 50 đến 250 ng không gây ra các phản ứng chéo giữa quan trọng đến tính chính xác, độ nhạy của phản các DNA động vật. Vì vậy, chúng tôi tiến hành ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Bên khảo sát các nồng độ primer và nồng độ DNA cho cạnh đó, vào năm 2013 Marin và cộng sự cũng đã phản ứng PCR phát hiện DNA thịt heo và thịt bò. tiến hành tối ưu hóa nồng độ primer để thu được kết Kết quả được trình bày ở Hình 2 và Hình 3. Hình 2. Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA heo. (M: thang chuẩn DNA) 173
Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình 3. Kết quả tối ưu hóa nồng độ DNA và nồng độ primer cho phản ứng PCR phát hiện DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Từ kết quả quan sát được ở Hình 2 và Hình 3 cho thấy các sản phẩm khuếch đại chuyên biệt cho heo và bò có kích thước phù hợp với các nghiên cứu trước [8,9]. Chúng tôi nhận thấy nồng độ primer có ảnh hưởng lớn tới kết quả phản ứng PCR vì ở cùng 1 nồng độ DNA nhưng cho những sản phẩm khuếch đại có độ sáng khác nhau tăng dần theo nồng độ primer. Đối với phản ứng phát hiện thịt heo, nồng độ DNA ở 5 µM cho kết quả tốt nhất, trong khi đó nồng độ 10 µM phù hợp với việc phát Hình 4. Kết quả multiplex PCR chuyên biệt hiện thịt bò hơn. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn (N: mẫu đối chứng âm; 1: primer heo, primer bò và nồng độ tối ưu cho phản ứng như sau: nồng độ DNA heo; 2: primer heo, primer bò và DNA bò; 3: DNA 50 ng/µl cho hai loại thịt và nồng độ primer primer heo, primer bò, DNA heo và DNA bò; M: heo, bò lần lượt là 5 µM, 10 µM để thực hiện phản thang chuẩn DNA) ứng multiplex PCR cho thịt heo và thịt bò ở thí Kết quả cho thấy các mẫu không bị nhiễm chéo, các nghiệm tiếp theo. band sản phẩm khuếch đại rõ ràng, kích thước Kết quả thử nghiệm tính chuyên biệt các cặp tương ứng với các nghiên cứu trước [8,9]. Các cặp primer trong phản ứng multiplex PCR primer có tính chuyên biệt cao có thể đáp ứng cho Trong phản ứng multiplex PCR việc kết hợp nhiều các phản ứng multiplex PCR phân biệt thịt heo và primer và nhiều DNA sẽ dễ dẫn đến trường hợp thịt bò. nhiễm chéo hay còn gây ra hiện tượng dương tính Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer và nhiệt độ giả nên việc tìm ra được cặp primer chuyên biệt cho bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR mỗi loại DNA là rất quan trọng. Chính vì vậy, Do khi kết hợp nhiều primer với các nồng độ không chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ chuyên biệt phù hợp trong một phản ứng multiplex PCR sẽ xảy trong phản ứng multiplex của hai cặp primer đã ra sự khuếch đại không đồng đều giữa các locus, chọn. Kết quả được trình bày ở Hình 4. một số sản phẩm khuếch đại có thể khó quan sát được sau phản ứng [11]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ primer cho phản ứng này, kết quả được trình bày ở Hình 5. 174
Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình 5. Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex PCR phát hiện DNA heo và DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Quan sát Hình 5, chúng tôi thấy có sự khác biệt khi độ primer bò 10 µM (giếng số 5) để thực hiện phản kết hợp các nồng độ primer khác nhau trong một ứng multiplex PCR heo, bò và viết hướng dẫn sử phản ứng multiplex PCR. Kết quả này cho thấy cần dụng cho bộ KIT. có nồng độ primer tương ứng khi kết hợp các Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp cũng là một yếu tố primer trong một phản ứng multiplex PCR. Trước quan trọng trong multiplex PCR vì mỗi cặp primer đó, nhóm nghiên cứu của Markoulatos cũng đã sử có nhiệt độ bắt cặp khác nhau nên khi kết hợp trong dụng các nồng độ primer khác nhau trong một phản một phản ứng cần tìm được một nhiệt độ phù hợp ứng multiplex PCR [12]. Ở Hình 5, các mẫu ở để kết quả của phản ứng là tốt nhất [11]. Nên chúng giếng số 5, 6, 8, 9 cho hai sản phẩm khuếch đại heo tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng và bò đều sáng rõ và dễ quan sát. Vì vậy, chúng tôi multiplex PCR heo và bò. Kết quả được trình bày quyết định chọn nồng độ primer heo 5 µM, nồng ở Hình 6. Hình 6. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo, bò (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC) Tại Hình 6, kết quả thu ở tất cả các nhiệt độ bắt cặp Chúng tôi thử nghiệm với các mẫu thực phẩm được khảo sát đều cho sản phẩm khuếch đại rõ, sáng đều lấy từ các khu chợ và siêu thị khu vực quận Tân như nhau. Nên ở các nhiệt độ đã khảo sát không Phú, thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu được thử: gây ra sự thay đổi cho sản phẩm multiplex PCR heo xúc xích heo, chả quế, xúc xích bò và bò viên. Kết và bò. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ quả tách DNA được thể hiện ở Hình 1b. Qua đây bắt cặp là 57oC làm nhiệt độ thích hợp nhất cho cho thấy rằng DNA của sản phẩm từ thịt bị đứt gãy phản ứng multiplex PCR heo và bò. Vì ở nhiệt độ làm chất lượng giảm đi rõ rệt so với DNA ly trích bắt cặp cao, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm sẽ thấp từ thịt tươi (Hình 1a), tuy nhiên kết quả ly trích hơn, ngoài ra quy trình PCR cũng sẽ tiến hành DNA ly trích từ sản phẩm từ thịt qua chế biến vẫn nhanh hơn do mức dao động giữa nhiệt độ biến tính phù hợp để thực hiện phản ứng PCR phát hiện riêng và nhiệt độ bắt cặp thấp hơn. biệt từng loại thì (Hình 7) hoặc phản ứng muliplex Thử nghiệm trên một số sản phẩm thực phẩm PCR để phát hiện cùng lúc 2 loại thịt (Hình 8). 175
Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình 7. Kết quả PCR đơn của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Hình 8. Kết quả multiplex PCR của DNA từ mẫu thực phẩm đã qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bò, BV: bò viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Qua kết quả ở Hình 8, chúng tôi nhận thấy trong nước không sử dụng thịt heo như các nước đạo Hồi. các sản phẩm xúc xích heo, bò viên và xúc xich heo Duy nhất mẫu chả heo là không phát hiện diện có sự hiện diện của DNA cả bò và heo, chứng tỏ có DNA từ bò, chứng tỏ quy trình sản xuất sản phẩm sự lẫn tạp trong thành phần nguyên liệu hoặc sự pha này đạt tiêu chuẩn chất, và điều này cũng có thể dễ trộn của các loại thịt này. Đối với mẫu xúc xích bò hiểu vì đây là sản phẩm của một công ty thực phẩm và bò viên là hành vi gian dối trong kinh doanh sản lớn trên thị trường. Từ quy trình trên, chúng tôi phát xuất vì có sự sai khác với các nguyên liệu được in triển thành bộ KIT phân biệt thịt heo và thịt bò trên bao bì, đây là điều cần phải thanh kiểm tra kỹ (Hình 9). hơn, nhất là ở các mặt hàng xuất khẩu sang các Hình 9. Bộ kít phát hiện và phân biệt thịt heo và thịt bò dựa trên kỹ thuật multiplex- PCR. KẾT LUẬN công quy trình multiplex PCR để phân biệt thịt heo Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành và thịt bò. Quy trình này cũng có khả năng phát hiện 176
Kỷ yếu Hội nghị khoa học sự có mặt của thịt heo, thịt bò trong một số sản thực phẩm và sản phẩm chế biến từ thịt. Với bộ KIT phẩm thực phẩm đã qua chế biến. Qua nghiên cứu này, chúng tôi cũng đang tiếp tục hoàn thiện để sản này cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc sử dụng phẩm này có thể sớm triển khai vào thực tế. sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện thịt heo và thịt bò trong các nguyên liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Phòng thương mại và công nghiệp Việt Nam, 2016, wesite:http://vcci-hcm.org.vn/diem-nhan-thi- truong/nganh-thit-viet-nam-%E2%80%93-co-hoi-va-thach-thuc-tt6357.html. Http://tuoitre.vn/lai-phat-hien-thit-heo-gia-bo-1082770.htm. Martín I, García T, Fajardo V, López-Calleja I, Rojas M, Pavón MA, Hernández PE, González I, Martín R. (2007). Technical note: detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction. Meat Science 76: 721-729. Matsunaga, T., Chikuni K., Tanabe R. et al. (1999). A quick and simple method for the identification of meat species and meat product by PCR assay. Meat science 51 (2): 143-148. Kitpipit, T., Thanakiatkrai, P., & Chotigeat, W. (2013). Direct PCR-FINS: Wildlife species identification without DNA extraction. Forensic Science International, Genetics Supplement Series. Iwobi, A., Sebah, D., Kraemer, I. et al. (2015). "A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat". Food Chemistry 169: 305-313. Lương Quý Phương (2006), Sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR phát hiện gene halothan trên heo, Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Spychaj A, Marlena Szalata, Ryszard Słomski and Edward Pospiech (2015). Identifi cation of Bovine, Pig and Duck Meat Species in Mixtures and in Meat Products on the Basis of the mtDNA Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Sequence, Pol. J. Food Nutr. Sci., 66(1): 31–36. Motalib Hossain M. A., Eaqub Ali, Sharmin Sultana, Asing, Sharmin Quazi Bonny, Md. Abdul Kader and M. Aminur Rahman (2017). Quantitative Tetraplex Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay with TaqMan Probes Discriminates Cattle, Buffalo, and Porcine Materials in Food Chain, Journal of Agricultural and Food Chemistry 65(19):3975-3985. Marín A, Takafumi Fujimoto, Katsutoshi Arai (2013). Rapid species identification of fresh and processed scallops by multiplex PCR, Food Control, 32: 472-476. Henegarui .O, Heerema .N.A, Dlouhy.S.R, Vance .G.H và Vogt .P.H (1997). Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques Journal, 23: 504-511. 177