Xây dựng kỹ thuật Microsatellite - DNA phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> XÂY DỰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE - DNA PHÁT HIỆN<br /> NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A<br /> Trần Vân Khánh, Trần Quốc ðạt, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn<br /> Trường ðại học Y Hà Nội<br /> <br /> Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt yếu tố ñông<br /> máu FVIII. Xác ñịnh ñột b iến trên gen mã hoá yếu tố FVIII (F8) ñã ñược nghiên cứu khá phổ biến. Cho ñến<br /> nay, khoảng hơn 1000 ñột b iến trên gen F8 ñã ñược b áo cáo. Xác ñịnh ñột b iến gen, phát hiện người lành<br /> mang gen bệnh và tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc b ệnh.<br /> Việc phát hiện người lành mang gen b ệnh thường ñược thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp<br /> trên gen F8 dựa vào ñột b iến chỉ ñiểm của bệnh nhân. Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện<br /> thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có<br /> thể ñược áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis). Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây<br /> dựng kỹ thuật microsatellite - DNA ñể xác ñịnh tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia<br /> ñình bệnh nhân HA dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết<br /> quả phát hiện ñột biến trực tiếp b ằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia ñình b ệnh nhân HA bao gồm b ệnh nhân<br /> và các thành viên nữ trong gia ñình ñã ñược lựa chọn vào nghiên cứu. Kết quả cho thấy, 6 thành viên nữ<br /> của 3 gia ñình b ệnh nhân HA (mẹ, b ác họ, chị họ hoặc em gái) ñã ñược phát hiện là người lành mang gen<br /> bệnh. Microsatellite - DNA có thể ñược sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả ñể phát hiện người lành mang<br /> gen b ệnh HA ở Việt Nam.<br /> <br /> Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh, microsatellite - DNA<br /> <br /> <br /> I. ðẶT VẤN ðỀ<br /> công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A tại<br /> Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn Việt Nam ñã có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh<br /> trên nhiễm sắc thể giới t ính X gây nên do nhân ñược chẩn ñoán và quản lí ñã tăng lên<br /> thiếu hụt yếu tố ñông máu FV III. Gen bệnh ñáng kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30%,<br /> nằm trên nhiễm sắc t hể X k hông có alen còn ña số người mang gen chưa ñược chẩn<br /> tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy, ñoán và quản lí [4]. Chẩn ñoán chính xác và<br /> người mẹ mang gen bệnh có thể truyền bệnh ñiều trị sớm căn bệnh này có ý nghĩa quan<br /> cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% trọng nhằm hạn chế tối ña t ình trạng chảy<br /> con gái của họ [ 1; 2]. Bệnh có thể di truy ền máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh<br /> qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh nhân trở thành tàn tật.<br /> trong cùng một gia ñình. Tại Việt Nam ước Xác ñịnh ñột biến trên gen mã hoá yếu tố<br /> tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia FVIII (F8) ñã ñược nghiên cứu khá phổ biến.<br /> và khoảng 30.000 người mang gen bệnh Cho ñến nay, khoảng hơn 1000 ñột biến trên<br /> hemophilia A [3]. Mặc dù trong thời gian qua, gen F8 ñã ñược báo cáo. Có nhiều loại ñột<br /> biến khác nhau ñã ñược phát hiện trên gen F8<br /> ðịa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm Nghiên cứu bao gồm: ñột biến ñiểm, ñột biến xoá ñoạn,<br /> Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội<br /> ñột biến ñảo ñoạn…[ 5]. Xác ñịnh ñột biến gen,<br /> Email: tathanhvan@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 10/8/2015 phát hiện người lành mang gen bệnh và tư<br /> Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015 vấn di t ruyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp<br /> <br /> <br /> 14 TCNCYH 96 (4) - 2015<br />  TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh. Người - Xác ñịnh tình trạng mang gen của các<br /> phụ nữ có nguy cơ cao mang gen bệnh nếu thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân bằng<br /> người ñó có con trai bị bệnh hemophilia A kỹ thuật microsatellite - DNA.<br /> hoặc là con gái của người mẹ mang gen 2.3. Các k< thu=t s? d@ng trong nghiên<br /> bệnh; hoặc chị em con dì với người bị bệnh c/u<br /> hemophilia A [6]. Việc phát hiện người lành<br /> mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng * Tách chi(t DNA<br /> kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp t rên gen + DNA ñược tách chiết theo phương pháp<br /> F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi<br /> [7; 8]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ,<br /> không phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát dì, chị gái).<br /> hiện ñột biến gặp khó k hăn do cấu trúc gen + Kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA ñược<br /> lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể ñược tách chiết: bằng phương pháp ño quang, dựa<br /> áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.<br /> (Linkage analysis) [9 - 14]. V ì vậy, nghiên cứu<br /> * Xác ñHnh ñ7t bi(n gen F8<br /> này ñược tiến với mục tiêu: Phát triển kỹ thuật<br /> - Kỹ thuật giải trình tự gen xác ñịnh ñột<br /> microsatellite - DNA phát hiện người lành<br /> biến ñiểm.<br /> mang gen bệnh cho các thành viên nữ trong<br /> Sử dụng 35 cặp mồi ñược thiết kế bao phủ<br /> gia ñình bệnh nhân Hemophilia A.<br /> toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon c ủa gen F8<br /> II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ñược khuếch ñại bằng kỹ thuật PCR và tiến<br /> hành giải trình tự theo 2 chiều [5].<br /> 1. ðối tượng<br /> - K< thu=t microsatellite - DNA<br /> 5 gia ñình bệnh nhân HA bao gồm 5 bệnh<br /> nhân nam và các thành viên nữ trong gia ñình Sử dụng các cặp mồi FXS 9897 và DXS<br /> ñã ñược lựa chọn vào nghiên cứu. 1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể<br /> Các mẫu máu ñược thu thập tại Viện khuyếch ñại các vùng trình tự lặp lại S TR [9;<br /> Huyết học - Truyền máu Trung ương và Trung 11]. Thành phần của phản ứng PCR: 1X ñệm<br /> tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường ðại PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;<br /> học Y Hà Nội. 0,5 unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O,<br /> tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng P CR:<br /> 2. Phương pháp<br /> 940 C/30 giây; [940 C/ 12 giây, 620 C/30 giây,<br /> 2.1. Thi(t k( nghiên c/u mô t3 c4t 720 C/30 giây] x 35 chu kỳ; 720 C/5 phút. Sản<br /> ngang phẩm k huếch ñại P CR ñược ñiện di trên hệ<br /> thống sequencing của hãng Beckman coulter.<br /> 2.2. N7i dung nghiên c/u<br /> Kết quả ñược phân tích bằng phần mềm<br /> - Xây dựng phả hệ gia ñình bệnh nhân He- GeneMapper v3.2 soft ware.<br /> mophilia A.<br /> - Xác ñịnh tình trạng mang gen của các 3. ðạo ñức nghiên cứu<br /> <br /> thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân dựa Bệnh nhân và người nhà hoàn t oàn tự<br /> vào dạng ñột biến c hỉ ñiểm ñã phát hiện ñược nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân<br /> trên bệnh nhân. hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi<br /> <br /> <br /> 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 15<br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> không ñồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên giúp cho c ác bác sỹ tư vấn di truy ền hoặc lựa<br /> cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ chọn phác ñồ ñiều t rị phù hợ p. Các thông tin<br /> ñược thông báo về kết quả xét nghiệm gen ñể cá nhân sẽ ñược ñảm bảo bí mật.<br /> <br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật giải trình tự gen<br /> Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23:<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23 c ó một con trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã<br /> số HA23), tiền sử bệnh gia ñình không rõ ràng, vì vậy bà ngoại, mẹ, bác và các chị họ bệnh nhân<br /> có thể là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.<br /> 2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật microsatellite-DNA<br /> Sử dụng các cặp mồi FXS 9897 và DXS1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếc h ñại<br /> các vùng trình tự lặp lại S TR. K ết quả cho thấy ñã phát hiện ñược alen ở trạng thái ñồng hợ p tử<br /> khi sử dụng cặp mồi FXS 9897, trong khi ñó cặp mồi DXS 1108 ở trạng thái dị hợp tử.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 16 TCNCYH 96 (4) - 2015<br />  TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen của gia ñình mã số HA23<br /> <br /> Hình ảnh giải t rình tự exon 23 gen F8 của người mẹ (II3), bác gái (II1), và chị gái họ (III2 ) của<br /> bệnh nhân HA 33 xuất hiện 2 ñỉnh chồng lên t ại vị t rí ñột biến ñã phát hiện ñược ở bệnh nhân<br /> HA33 (III3) (c.6425T > A), chứng tỏ mẹ và chị gái họ bệnh nhân mang gen F8 ñột biến ở trạng<br /> thái dị hợp tử.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 17<br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> <br /> <br /> Alen bình thường Alen ñột biến<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh ñiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108<br /> của gia ñình mã số HA23<br /> <br /> Kết quả t rên cho thấy ở vùng t rình tự lặp lại DXS1108, mẹ, bác gái và chị gái họ của bệnh<br /> nhân xuất hiện 2 ñỉnh, mỗi ñỉnh tương ứng với 1 alen. Ở ñỉnh trùng với ñỉnh của bệnh nhân chính<br /> là ñỉnh của alen ñột biến Xb, tức là bệnh nhân sẽ nhận alen ñột biến này từ người mẹ. Bác gái và<br /> chị gái họ bệnh nhân có 1 ñỉnh trùng với ñỉnh của alen ñột biến Xb chứng tỏ bác gái và chị gái họ<br /> của bệnh nhân là người lành mang gen bệnh. Kết quả này cũng trùng khớp với kết quả xác ñịnh<br /> người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen tức là cả mẹ bệnh nhân, bác gái và chị<br /> gái họ bệnh nhân là người lành mang gen bệnh.<br /> Tương tự như vậy, khi sử dụng cả 2 kỹ thuật giải t rình tự gen và microsat ellite - DNA ñể xác<br /> ñịnh tình trạng mang gen trên 4 gia ñình HA còn lại, kết quả cho thấy 2 người mẹ bệnh nhân và 1<br /> thành viên gia ñình (em gái bệnh nhân) c ũng là người lành mang gen bệnh. Trong khi ñó mẹ và<br /> các thành viên của 2 gia ñình HA còn lại không phải là người lành mang gen bệnh (bảng 1).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 18 TCNCYH 96 (4) - 2015<br />  TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen yếu tố VIII ñột biến<br /> <br /> TT Exon Dạng ñột biến Mẹ bệnh nhân Thành viên gia ñình bệnh nhân<br /> <br /> c.6425T > A<br /> 1 23 Mang gen bệnh Bác gái và chị họ mang gen bệnh<br /> p.Leu2142Stop<br /> <br /> c.6545G > A<br /> 2 23 Mang gen bệnh Em gái mang gen bệnh<br /> p.Arg2182His<br /> <br /> c. 549 A > T<br /> 3 3 Mang gen bệnh<br /> p.Lys126Asp<br /> <br /> c.2196insA;<br /> 4 13 Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh<br /> p.674 Y → Stop<br /> c.2186delTCT<br /> 5 13 Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh<br /> p.Phe672del<br /> <br /> <br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> người mẹ (denovo mut ation) [7]. ðiều này có<br /> Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết thể giải thíc h cho 2 người mẹ bệnh nhân<br /> với nhiễm sắc thể giới tính X và không có alen không phải là người lành mang gen bệnh ở<br /> tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Nhiều nghiên trong nghiên cứu này mặc dù con của họ<br /> cứu ñã tiến hành xác ñịnh ñột biến gen F8 ñược phát hiện là có ñột biến trên gen F8. Ba<br /> trên bệnh nhân Hemophilia A và cho ñến nay người mẹ của 3 gia ñình và các thành viên nữ<br /> khoảng hơn 1000 ñột biến trên gen F8 ñã của 3 gia ñình còn lại ñược xác ñịnh là người<br /> ñược báo cáo. Có nhiều loại ñột biến khác lành mang gen bệnh bằng cả 2 kỹ thuật giải<br /> nhau ñã ñược phát hiện trên gen F8 bao gồm: trình tự gen trực tiếp và microsatellite - DNA.<br /> ñột biến ñiểm, ñột biến xoá ñoạn, ñột biến ñảo Thông thường, việc phát hiện người lành<br /> ñoạn…[5]. Kết quả xác ñịnh ñột biến gen F8 mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng<br /> trên bệnh nhân là cơ sở khoa học cho những kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp t rên gen<br /> phân tích phát hiện ñột biến gen ñối với các F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân.<br /> thành viên trong gia ñình bệnh nhân và phát Tuy nhiên, trong một số trường hợp không<br /> hiện người lành mang gen bệnh, chẩn ñoán phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột<br /> trước sinh ñể ñưa ra những tư vấn di truyền là biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ<br /> giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và thuật phân t ích gián tiếp c ó thể ñược áp dụng<br /> làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [7; 8]. Trong số các dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage<br /> bà mẹ ñược xác ñịnh người lành mang gen analysis) [7; 8].<br /> bệnh, khoảng 2/3 ñược phát hiện là người Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển<br /> lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợ p tử, kỹ thuật microsatellite - DNA ñể xác ñịnh tình<br /> còn lại 1/3 các trường hợp người mẹ không trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ<br /> mang gen bệnh, ñột biến xuất hiện ở người trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A dựa<br /> con trai bị bệnh là ñột biến mới phát sinh trong vào phân tíc h các vùng trình tự lặp lại (short<br /> quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc từ tandem repeat - S TR), so sánh với kết quả<br /> <br /> <br /> <br /> 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 19<br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> phát hiện ñột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trùng khớ p với kết quả xác ñịnh người lành<br /> trình tự gen. Trình tự lặp lại là các ñoạn lặp mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải t rình tự<br /> nối tiếp ngắn từ 2 ñến 6 cặp base, nằm ở các gen.<br /> ñoạn intron, có t ính ña hình rất cao và ñược<br /> V. KẾT LUẬN<br /> phân bố khắp trong bộ gen. Các trình tự nhỏ<br /> dưới 1000 bas e tạo nên bởi c ác trình tự lõi ðã hoàn thiện quy trình xác ñịnh người<br /> khoảng 2 ñến 4 base lặp lại nhiều lần (từ 10 lành mang gen bệnh ở các thành viên nữ<br /> ñến 60 lần). Do k ích thước nhỏ nên các trình trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A bằng<br /> tự này ñược gọi là các trình tự lặp lại ngắn - kỹ thuật Microsatellite - DNA.<br /> STR và s ố lần lặp lại c ủa các t rình tự nhỏ<br /> Lời cám ơn<br /> này ñặc trư ng c ho từ ng c á thể và mang t ính<br /> di truy ền. Trình tự lặp lại ngắn ñược ứng Nghiên cứu ñược thực hiện với sự hỗ trợ<br /> dụng chẩn ñoán xác ñịnh huy ết thống, xác kinh phí bởi ðề tài cấp nhà nước “Xây dựng<br /> ñịnh người mang gen và chẩn ñoán trước quy trình chẩn ñoán trước làm tổ bằng kỹ<br /> sinh…[ 9 - 14]. Trong nghiên cứu này, các thuật microsatellte DNA ñể sàng lọc một số<br /> cặp mồi sử dụng khuếc h ñại trình tự lặp lại bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới<br /> trên gen F8, nhằm xác ñịnh alen mang ñột tính” thuộc thuộc chương trình K C04. 17/11-<br /> biến Xb và alen không mang gen ñột biến X. 15.<br /> Với kết quả phân tíc h trình tự lặp lại ngắn,<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> người mẹ hoặc các thành viên nữ trong gia<br /> ñình khác sẽ có 2 ñỉnh tương ứ ng vớ i 2 alen 1. Gill Swallow (2013). Guideline for the<br /> do họ có 2 nhiễm sắc thể X, bệnh nhân nam Obstetric Management of Carriers of<br /> nhận nhiễm sắc thể Y từ bố và một nhiễm Haemophilia A and B, NHS Nottingham<br /> sắc thể X từ mẹ, nên sẽ chỉ có 1 trình tự lặp University Hospitals Cookie Disclaime.<br /> lại giống của mẹ vì gen F8 chỉ có trên nhiễm<br /> 2. Trần Thị Liên, Trần Thị Thanh Hương<br /> sắc thể X; t rên hình ảnh ñiện di sẽ cho một<br /> (2014). Di truyền ñơn gen, Di truyền y học,<br /> ñỉnh duy nhất tương ứng với trình tự lặp lại<br /> Nhà xuất bản giáo dục, 146 - 149.<br /> ngắn trên nhiễm sắc thể X nhận từ mẹ. ðỉnh<br /> của alen ñột biến s ẽ ñược xác ñịnh dựa trên 3. Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Mai<br /> (2009). Quản lí, chẩn ñoán và ñiều trị hemo-<br /> ñỉnh alen c ủa bệnh nhân. Trong t rường hợp<br /> philia ở Việt Nam: Quá khứ - Hiện tại – Tươ ng<br /> các thành viên gia ñình bệnh nhân có 1 ñỉnh<br /> b lai, Y học Việt Nam, 2, 3 - 12.<br /> trùng với ñỉnh c ủa alen ñột biến X chứng tỏ<br /> họ là người lành mang gen bệnh và ngược 4. Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí,<br /> lại không trùng với ñỉnh của alen ñột biến Nguyễn Thị Nữ và cộng sự (2012). Nghiên<br /> chứng tỏ họ không phải là người lành mang cứu phát hiện Hemophilia dựa vào phả hệ gia<br /> gen bệnh. Nghiên cứu của chúng tôi c ho t hấy ñình các bệnh nhân ñã ñược chẩn ñoán tại<br /> 6 thành viên nữ của 3 gia ñình bệnh nhân viện Huyết học – Truyền máu Trung ương,<br /> Hemophilia A (mẹ, bác họ, c hị họ hoặc em Báo cáo Hội nghị nghiên cứu sinh Trường ñại<br /> gái) ñã ñược phát hiện là người lành mang học Y Hà Nội lần thứ XVIII, 156 - 162.<br /> gen bệnh dựa trên phân t ích kết quả trình tự 5. Azza A.G. Tantawy (2010). Molecular<br /> lặp lại ngắn. K ết quả này cũng hoàn t oàn genetics of hemophilia A: Clinical perspec-<br /> <br /> <br /> 20 TCNCYH 96 (4) - 2015<br />  TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> tives. The Egyptian Journal of Medical Human genetic counselling in Chinese haemophilia<br /> Genetics, 11, 105 - 114. A pedigrees. Haemophilia, 18(4), 621 - 625.<br /> 6. Street AM, Ljung R, Lavery SA (2008). 11. Saha A, Nayak S, Mani KR et al<br /> Management of carriers and babies with hae- (2011). A set of five microsat ellite markers<br /> mophilia. Haemophilia, 14(3), 181 - 187. linked to F8 gene can detect haemophilia<br /> A carriers across India. Haemophilia, 17(5),<br /> 7. Goodeve A. C (1998). Advances in car-<br /> 928-935.<br /> rier detection in haemophilia. Haemophilia, 4<br /> 12. Massaro JD, Wiezel CE, Muniz YC et<br /> (4), 358 - 364.<br /> al (2011). A nalysis of five polymorphic DNA<br /> 8. Shetty S, Ghosh K, Bhide A, Mohanty markers for indirect genetic diagnosis of hae-<br /> D (2001). Carrier detection and prenatal ldiag- mophilia A in the B razilian population.<br /> nosis in families with hemophilia. Natl Med J<br /> Haemophilia, 17(5), 936 - 943.<br /> India, 14, 81 - 83.<br /> 13. Hussein IR, El-Be shlawy A, Salem A,<br /> 9. Machado FB, Medina - Acosta E et al (2008).The use of DNA markers for car-<br /> (2009). High-resolution combined linkage rier detection and prenatal diagnosis<br /> physical map of short tandem repeat loci on of haemophilia A in Egy ptian fami-<br /> human chromosome band Xq28 for lies.Haemophilia, 14(5), 1082 - 1087.<br /> indirect haemophilia A carrier detection. 14. de Carvalho FM, de Vargas<br /> Haemophilia, 15(1), 297 - 308. Wolfgramm E et al (2007). A nalysis of Factor<br /> 10. Ding QL, Lu YL, Dai J et al (2012). VIII polymorphic mark ers as a means for<br /> Characterisation and validation of a novel carrier detection in Brazilian families with<br /> panel of the six short tandem repeats for haemophilia A. Haemophilia, 13(4), 409 - 412.<br /> <br /> Summary<br /> DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER<br /> USING MICROSATELLITE DNA<br /> Hemophilia A is an inherited X - linked coagulation disorder caused by factor VIII (FV III)<br /> deficiency. Genetic mutations in the gene encoding FV III (F8) have been extensively studied.<br /> Over a thousand different mutations have been reported in the F8 gene. Carrier detection and<br /> genetic counseling are effective solutions to prevent and reduc e the incidence of disease. Carrier<br /> are preferably performed by direct mutation det ection; however, in certain situations, indirect<br /> family studies may also be useful in c ases of undetectable mutation due to F8 gene large<br /> structure. We aimed to utilize a combination of direct and indirect techniques for the diagnosis of<br /> carrier of Hemophilia A. Linkage analysis is a common indirect method for the detection of female<br /> carriers in families wit h Hemophilia A. In t his study, we compared results obtained from link age<br /> using short tandem repeat-S TRs linkage (microsatellite - DNA) with those by sequencing analysis.<br /> 10 hemophilia A families including patients and female members were recruited for this study. By<br /> sequencing analysis, five Hemophilia A patients and their family members (mother, aunt, cousins<br /> and sister) showed small point mutation including missense mutation and insertion in F8 gene<br /> while Micros atellite-DNA revealed the transmission of a mut ant allele inside each family. In<br /> <br /> <br /> 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 21<br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> conclusions, the combination of direct and indirect molecular genetics approaches is a successful<br /> method and mic rosatellite - DNA is a c ost-effective approach to provide carrier diagnostics of<br /> hemophilia A in Vietnam.<br /> <br /> Keywords: Hemophilia, carriers, microsatellite - DNA<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 22 TCNCYH 96 (4) - 2015<br />