Xây dựng qui trình định lượng và khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT TỐC ĐỘ<br /> PHÓNG THÍCH HOẠT CHẤT CỦA THUỐC DÁN CLONIDIN<br /> Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Thuốc dán clonidin trị cao huyết áp có nhiều ưu điểm hơn dạng uống nên đang được quan tâm<br /> nghiên cứu phát triển. Hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng chế phẩm này là hàm lượng và độ phóng<br /> thích hoạt chất. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng và khảo sát khả năng<br /> phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin.<br /> Phương pháp: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ thuốc dán. Thăm dò các điều kiện sắc ký về pha động:<br /> không có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào một tác nhân tạo cặp ion.<br /> Thăm dò quy trình thử độ hòa tan sử dụng phương pháp cánh khuấy trên đĩa ; tiến hành khảo sát các các yếu<br /> tố pH môi trường (H3PO4 0,001M; đệm HCl pH 4,5; đệm HCl pH 3,5 ; HCl 0,1 N), tốc độ cánh khuấy (50 vòng/<br /> phút, 100 vòng / phút), thời gian lấy mẫu.<br /> Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng thuốc dán clonidin bằng HPLC với các điều kiện sắc ký:<br /> cột C18, thành phần pha động gồm 1,21g Natri 1-heptansulfonat trong 600 ml nước: 400 ml methanol và 1 ml<br /> acid phosphoric, chỉnh pH=3; phát hiện bằng đầu dò PDA tại bước sóng 210 nm, tốc độ dòng: 1 ml/ phút, thể tích<br /> tiêm mẫu: 20 µl.Với phương pháp chiết clonidin từ thuốc dán sử dụng 10 ml cloroform để phá nền dính và 10 ml<br /> HCl 0,003% để chuyển clonidin từ dạng base sang dạng acid tan trong HCl 0,003%, lấy lớp acid định lượng. Đã<br /> xây dựng được được quy trình thử độ hòa tan: phương pháp cánh khuấy trên đĩa, môi trường 500 ml HCl 0,1 N,<br /> tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút, thời gian lấy mẫu 1-2-4-6-8-10-12 giờ<br /> Kết luận: Phương pháp định lượng trên được chứng minh là phù hợp để định lượng clonidin trong thuốc<br /> dán và trong môi trường thử độ hòa tan. Đồng thời đề tài đã khảo sát được quy trình thử độ hòa tan cho thuốc<br /> dán clonidin, quy trình cho kết quả ổn định.<br /> Từ khóa: Clonidin, thuốc dán hấp thu qua da, độ hòa tan thuốc dán.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DEVELOPING THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDIN IN TRANSDERMAL<br /> PATCHES AND SURVEYING THEIR RELEASE RATE<br /> Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Nguyen Thien Hai, Nguyen Duc Tuan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 7 - 13<br /> Objectives: Clonidine patches as an antihypertensive agent have more advantages than oral dosage forms,<br /> therefore the development of clonidine patches is regarded. Two important qualitative evaluation factors are the<br /> content and release rate of clonidine. This topic is done with the goal: development of the assay method and<br /> dissoluion tests for clonidine transdermal patches.<br /> Method: Probe conditions extracted clonidine from patches. Exploration phase chromatographic conditions:<br /> no buffer solution, using a buffer solution, in addition to an artificial ion pair. The dissolution test was performed<br /> using apparatus 5 (Paddle over Disk); and examing the pH of medium (0.001 M H3PO4; HCl buffer pH 4.5; HCl<br /> * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> 7<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> buffer pH 3.5; HCl 0.1 N), the paddle speed (50 rpm, 100 rpm), and the sample times.<br /> Results: The quantitative test has been developed using HPLC with chromatographic conditions: column<br /> C18, the mobile phase consists of 1.21 g sodium 1-heptansulfonat in 600 ml water: 400 ml methanol and 1 ml<br /> phosphoric acid, adjust to pH = 3; detected by PDA detector at 210 nm.%); flow rate: 1ml/minute; injected sample<br /> volume: 20 µl. The extraction method of clonidine from the patches used 10 ml cloroform and 10 ml and HCl<br /> 0.003% (cloroform was used to destroy the adhesive layer, HCl 0.003% was used to change Clonidine base into<br /> Clonidine hydrochloride), the acid layer was taken to assay. The dissolution test has been developed using<br /> apparatus paddle over disk, 500 ml HCl 0.1 N, 50 rpm, sampled times: 1-2-4-6-8-10-12 hr.<br /> Conclusion: The quantitative method has been developed and demonstrated that was suitable to quantify the<br /> clonidine in the patches and in the dissolution medium. The topic has also developed the dissolution testing<br /> process for clonidine patches<br /> Key words: Clonidin, Transdermal patch, Dissolution transdermal patches<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Nguyên liệu<br /> <br /> Dạng thuốc dán hấp thu qua da<br /> (Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày<br /> càng được quan tâm phát triển rộng rãi do có rất<br /> nhiều ưu điểm hơn dạng uống. Thuốc dán điều<br /> trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế phẩm<br /> Catapres – TTS chứa dược chất clonidin để điều<br /> trị tăng huyết áp. Tại Việt Nam, thuốc dán thấm<br /> qua da clonidin 2,5 và 7,5mg đã được Khoa<br /> Dược – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh<br /> bào chế thành công. Để phát triển dạng thuốc<br /> này thì cần có những chỉ tiêu kiểm soát chất<br /> lượng, hai tiêu chí chất lượng quan trọng là: hàm<br /> lượng hoạt chất trong thuốc dán và tốc độ phóng<br /> thích hoạt chất. Do đó đề tài này được thực hiện<br /> với mục tiêu:<br /> <br /> Chất chuẩn<br /> Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm<br /> lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng<br /> 04 / 2014 do Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM<br /> cung cấp.<br /> <br /> - Xây dựng quy trình định lựợng thuốc dán<br /> clonidin.<br /> - Khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất của<br /> thuốc dán clonidin.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Thuốc dán Clonidin 2,5 mg của Khoa dược,<br /> Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh.<br /> Thuốc<br /> <br /> đối<br /> <br /> chiếu:<br /> <br /> Catapres-TTS®<br /> <br /> 2,5mg/3,5cm hạn dùng tháng 05/2013 của công<br /> 2<br /> <br /> Hóa chất, dung môi<br /> Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt<br /> tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. Methanol đạt<br /> tiêu chuẩn sắc ký.<br /> <br /> Trang thiết bị<br /> Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type<br /> PTWS3C, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> Alliance 2965, đầu dò dãy diod quang (Waters,<br /> Mỹ). Máy đo pH Metrohm 744 (Metrohm, Đức).<br /> Máy siêu âm Elma (Elma, Đức).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong<br /> thuốc dán bằng HPLC với đầu dò PDA<br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> Clonidin là một chất có tính base, phân cực<br /> nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn. Qua<br /> tham khảo các tài liệu(1) định lượng clonidin<br /> trong thuốc dán điều kiện sắc ký ban đầu được<br /> đề nghị như sau:<br /> Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x<br /> 4,6 mm; 5 µm).<br /> <br /> ty Boehringer Ingelhem, Đức.<br /> <br /> 8<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> Tốc độ dòng: 1 ml/phút<br /> Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 210 nm<br /> Thể tích tiêm mẫu: 20 µl<br /> Pha động A (không có dung dịch đệm):<br /> methanol – nước (40:60) được điều chỉnh đến pH<br /> 3 bằng acid phosphoric.<br /> Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn<br /> hợp methanol – nước (40:60) được thêm 1 ml<br /> acid phosphoric rồi điều chỉnh đến pH 3 bằng<br /> KOH 30%.<br /> Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml<br /> hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21g<br /> natri 1-heptansulfonat và 1 ml acid phosphoric<br /> rồi điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%.<br /> Khảo sát 3 hệ pha động trên để chọn điều<br /> kiện sắc ký thích hợp thoả mãn các yêu cầu<br /> sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác<br /> (nếu có) và có hệ số đối xứng nằm trong<br /> khoảng 0,8 – 1,5.<br /> Khảo sát điều kiện chiết clonidin trong thuốc dán:<br /> Cách 1: Dựa theo chuyên luận USP 32 (1)<br /> dùng tetrahydrofuran để chiết clonidin trong<br /> thuốc dán<br /> Cách 2: Chọn cloroform làm dung môi để<br /> chiết clonidin trong thuốc dán vì clonidin base<br /> rất dễ tan trong cloroform. Nồng độ dung dịch<br /> HCl 0,003% đủ để chuyển hết clonidin base sang<br /> acid. Chiết clonidin HCl trong miếng thuốc dán<br /> bằng cách lắc rung(vortex) với cloroform trong<br /> thời gian 5, 10, 15, 20 phút thì thấy diện tích đỉnh<br /> của sắc ký đồ tăng lên theo thời gian và sau 20<br /> phút thì diện tích đỉnh của clonidin HCl không<br /> có sự khác nhau trong kết quả định lượng.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Mẫu thử<br /> Lấy miếng thuốc dán ra khỏi bao bì, cắt<br /> miếng thuốc dán có diện tích 1cm2 (1cm x 1cm),<br /> loại bỏ lớp bảo vệ bao phủ lên trên bề mặt bắt<br /> dính của lớp chứa hoạt chất, cho vào chai có nắp<br /> đậy chặt dung tích khoảng 25 ml (đường kính<br /> khoảng 2 cm), thêm chính xác 10 ml cloroform.<br /> Lắc rung mạnh trong 20 phút. Thêm chính xác 10<br /> ml dung dịch HCl 0,003% (g/ml). Lắc rung mạnh<br /> tiếp 5 phút. Để yên ở nhiệt độ phòng từ 20 phút<br /> đến 30 phút. Lấy lớp trên (lớp nước acid), lọc<br /> qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký.<br /> Hàm lượng clonidin, C9H9Cl2N3, tính bằng<br /> mg trong một miếng thuốc dán 1 cm2 được tính<br /> theo công thức:<br /> <br /> X =<br /> <br /> 1<br /> 230,1<br /> ST<br /> × CC × 10 ×<br /> ×<br /> 1000 266,6<br /> SC<br /> <br /> Trong đó:<br /> ST: diện tích pic của clonidin HCl trong mẫu<br /> thử.<br /> SC: diện tích pic của clonidin HCl trong mẫu<br /> chuẩn.<br /> CC: Nồng độ clonidin HCl trong dung dịch<br /> chuẩn (µg/ml)<br /> 230,1: phân tử lượng của clonidin<br /> 266,6: phân tử lượng của clonidin HCl<br /> Thẩm định qui trình định lượng<br /> Gồm tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu,<br /> tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.<br /> <br /> Qui trình thử độ hòa tan thuốc dán<br /> Dựa trên USP 32 và một số tài liệu tham<br /> khảo khác (2,3) về thử độ hòa tan thuốc dán<br /> <br /> Chuẩn bị mẫu<br /> Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid gốc:<br /> <br /> Các điều kiện, yếu tố xác định<br /> <br /> Hòa tan clonidin HCl chuẩn trong nước cất<br /> để được dd chuẩn gốc có nồng độ 0,1 mg/ml và<br /> bảo quản ở 0 – 4 oC<br /> <br /> PTWS3C. Thiết bị kiểu cánh khuấy trên đĩa (thiết<br /> <br /> Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid:<br /> Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước cất<br /> để có dung dịch chuẩn nồng độ 60 µg/ml<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type<br /> bị loại 5 theo USP 32). Mặt kính (d = 8cm), lưới (d<br /> = 8cm), kẹp<br /> Thể tích môi trường: 500ml<br /> Nhiệt độ: 32 ± 0,5 oC<br /> <br /> 9<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Khoảng cách từ bề mặt dưới cánh khuấy đến<br /> bề mặt lưới: 25 ± 2mm<br /> Thể tích lấy mẫu: 2ml.<br /> <br /> Thời điểm lấy mẫu: 1- 2 - 4 - 6 - 8 - 10 12…giờ<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Các yếu tố cần khảo sát<br /> <br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> <br /> Môi trường: H3PO4 0,001 M, HCl (pH =4,5),<br /> HCl (pH= 3,5), HCl 0,1 N<br /> <br /> Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký được thể<br /> hiện qua hình 1.<br /> <br /> Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút và 100<br /> vòng/phút<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C và chiết clonidin trong<br /> thuốc dán bằng cloroform (d) với pha động C.<br /> Do đó chọn cách xử lí thuốc dán bằng cách chiết<br /> Nhận xét: Với pha động A, pic clonidin xuất<br /> với cloroform được lựa chọn.<br /> hiện rất sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút.<br /> Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu<br /> khoảng 4,58 phút nhưng bị kéo đuôi. Pha động<br /> C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 10 phút,<br /> pic clonidin tách hoàn toàn pic tạp và có hệ số<br /> đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vì vậy pha<br /> động C được lựa chọn.<br /> <br /> Thẩm định qui trình định lượng clonidin<br /> trong thuốc dán<br /> <br /> Khảo sát điều kiện chiết clonidin trong<br /> thuốc dán<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên<br /> mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6)<br /> <br /> Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký cho thấy<br /> khi chiết clonidin trong thuốc dán bằng<br /> tetrahydrofuran thì mẫu còn lẫn nhiều tạp và pic<br /> clonidin chưa tách hẳn khỏi pic tạp (Hình 2).Còn<br /> khi chiết clonidin trong thuốc dán bằng<br /> cloroform thì loại được phần lớn tạp và pic<br /> clonidin tách hoàn toàn khỏi pic tạp (Hình 1d).<br /> <br /> 10<br /> <br /> Khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6)<br /> Kết quả phân tích lặp lại 6 lần mẫu thuốc thử<br /> được trình bày ở bảng 1.<br /> <br /> Diện tích Thời gian Hệ số Số đĩa lý Độ<br /> pic (µAu x lưu (phút) đối xứng thuyết phân<br /> giây)<br /> (As)<br /> (N)<br /> giải (Rs)<br /> TB<br /> 6699881 10,6239 1,1115 11264<br /> 5,45<br /> RSD<br /> 1,41%<br /> 1,65%<br /> 0,45%<br /> 0,64% 0,95%<br /> <br /> Nhận xét: RSD của các thông số khảo sát gồm<br /> diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý<br /> thuyết, độ phân giải đều có RSD < 2%, chứng tỏ<br /> qui trình có tính phù hợp hệ thống.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 1d. Sắc ký đồ mẫu thuốc dán khi chiết với clororm<br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ mẫu thuốc dán khi chiết với tetrahydrofuran<br /> pic clonidin trong mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu<br /> Tính đặc hiệu<br /> trắng (hình 4) không có pic trùng với pic<br /> Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và<br /> clonidin, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh<br /> mẫu trắng theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết<br /> khiết của pic cho thấy pic clonidin trong mẫu thử<br /> quả cho thấy: phổ UV-Vis tại thời gian lưu của<br /> tinh khiết (hình 5). Do đó, có thể khẳng định qui<br /> pic clonidin trong mẫu thử và mẫu chuẩn giống<br /> trình phân tích có tính đặc hiệu.<br /> nhau (hình 3), thời gian lưu của pic trong mẫu<br /> thử (hình 1d) tương đương với thời gian lưu của<br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> Hình 3: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b)<br /> <br /> Hình 4: Sắc ký đồ mẫu trắng<br /> Hình 5: Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic<br /> clonidin HCl trong mẫu thử<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> 11<br /> <br />