intTypePromotion=1
ADSENSE

Xây dựng quy trình chiết xuất và phương pháp định lượng Stigmasterol trong cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Bình Bình | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

42
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hiện nay, xu hướng và yêu cầu tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu theo WHO nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng là phải xây dựng được quy trình xác định hàm lượng hoạt chất hoặc chất đặc trưng chiếm tỷ lệ lớn trong dược liệu. Vì vậy trong bài báo này, các tác giả giới thiệu kết quả nghiên cứu phương pháp định lượng stigmasterol trong cây ráy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình chiết xuất và phương pháp định lượng Stigmasterol trong cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG<br /> STIGMASTEROL TRONG CÂY RÁY (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch)<br /> BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Trần Hữu Dũng<br /> Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế<br /> Đặng Thị Ngọc Hoa<br /> Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Quy trình chiết xuất stigmasterol toàn phần từ bột dược liệu ráy (Alocasia odora<br /> (Roxb.) C. Koch) trên soxhlet trong 5 giờ trong dung môi chloroform được thực hiện và kiểm<br /> soát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng khi triển khai trên hệ dung môi n-hexan/ethyl axetat<br /> (8:2), xác định vết bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. Hàm lượng stigmasterol được xác<br /> định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột C8 với nhiệt độ cột 300C<br /> ± 1, hệ dung môi pha động là acetonitril/đệm phosphate (93:7) pH 4,8 với tốc độ dòng 1ml/phút,<br /> thể tích tiên 20µl, bước sóng phát hiện tại 195nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với<br /> các thông số sắc ký có RSD < 2%. Khoảng tuyến tính của nồng độ stigmasterol được khảo sát<br /> từ 10–300ppm (r = 0,9995). Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích<br /> hợp với tỷ lệ phục hồi của stigmasterol từ bột ráy đạt 95,2%, giới hạn định lượng là 10ppm.<br /> <br /> I. Đặt vấn đề<br /> Cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) hay còn gọi là môn bạc hà, ráy bạc<br /> hà, bạc hà; đôi khi còn gọi là ráy dại, dã vu. Thân rễ ráy được dùng làm thuốc trong<br /> phạm vi kinh nghiệm nhân dân, chủ yếu chữa bệnh ngoài da như mề đay đơn ngứa, lỡ<br /> khó chữa, sần da chảy nước (nấu nước tắm rửa), xát vào nơi bị lá han gây ngứa tấy;<br /> nhiều nơi dùng với tác dụng giảm đau do vẹo cổ, đau xương khớp, điều trị gan nhiễm<br /> mỡ [1], [3].<br /> Phytosterol là một trong những thành phần hóa học của cây ráy có hoạt tính sinh<br /> học và hàm lượng cao. Stigmasterol là một trong những thành phần chính của<br /> phytosterol, có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong<br /> tổng hợp progesterone, và là tiền chất của vititam D3 [3], [4], [6].<br /> Hiện nay, xu hướng và yêu cầu tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu theo WHO<br /> nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng là phải xây dựng được quy trình xác định hàm<br /> lượng hoạt chất hoặc chất đặc trưng chiếm tỷ lệ lớn trong dược liệu [2], [7]. Vì vậy,<br /> 43<br /> <br /> trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu kết quả nghiên cứu phương pháp định lượng<br /> stigmasterol trong cây ráy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).<br /> 2. Thực nghiệm nghiên cứu<br /> 2.1. Xử lý mẫu nghiên cứu<br /> Thân rễ ráy (Alocasia odora (Roxb.) thu hái vào tháng 12 năm 2009, gọt bỏ vỏ,<br /> rửa sạch bằng nước, thái từng lát mỏng 2-5mm, sấy âm can, đặt trong tủ sấy đến khô,<br /> nghiền mịn, thu được bột ráy, bảo quản trong bình nhựa kín.<br /> Chuẩn stigmasterol 95% của Sigma-aldrich (No: 027K5302), bản Silica gel F254<br /> (Merck), máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector, cột Sulpenco C8<br /> và C18 (150 x 4,6mm, 5µm) và các dung môi hoá chất tinh khiết (PA và HPLC).<br /> 2.2. Khảo sát hệ dung môi triển khai sắc kí lớp mỏng định tính stigmasterol<br /> Dung dịch thử: bột ráy khuấy từ trong 2 giờ với CHCl3/MeOH = 2:1(v/v), lọc<br /> qua giấy lọc. Dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 800C, sau<br /> đó trung hòa bằng KOH 20%/MeOH đến pH > 7, chiết trong ete dầu hoả và loại nước<br /> bằng Na2SO4 khan, cô dịch ete thu được cắn. Hòa tan cắn trong 1ml CHCl3 để chấm sắc<br /> ký.<br /> Dung dịch chuẩn: cân 11.4mg stigmasterol hòa tan trong 1ml CHCl3<br /> Triển khai trên bản Silica gel F254 với các hệ dung môi khác nhau: n-hexan/ethyl<br /> acetate (9:1), n-hexan/ethyl acetate (8:2), n-hexan/ethyl acetate (7:3), CHCl3/MeOH<br /> (98:2) và CHCl3/CH3COCH3 (8:2) để chọn hệ pha động thích hợp nhất [2]. Phát hiện<br /> peak phytosterol bằng thuốc thử Liebermann-Burchard.<br /> 2.3.Xây dựng quy trình chiết stigmasterol toàn phần bằng phương pháp chiết<br /> Soxhlet<br /> Cân 5g bột ráy, ngâm lạnh 12 giờ với các hệ dung môi chiết CHCl3/MeOH (1:1),<br /> (2:1) và CHCl3 100%, chiết Soxhlet với cùng hệ dung môi ngâm lạnh trong 3 giờ, ở<br /> 650C để chọn hệ dung môi thích hợp nhất cho việc khảo sát thời gian chiết kiệt<br /> stigmasterol tại 3, 4 và 5h để chọn thời gian chiết tối ưu [6]. Hiệu quả chiết xuất được<br /> đánh giá bằng tín hiệu peak stigmasterol trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard<br /> sau khi dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 800C.<br /> 2.4. Xây dựng phương pháp định lượng stigmasterol trên HPLC<br /> Khảo sát các điều kiện cột sắc ký pha đảo (C8 và C18), các hệ dung môi triển<br /> khai acetonitril (ACN): đệm phosphate 0,025M với các tỷ lệ khác nhau (90:10, 93:7,<br /> 95:5), tại các pH đệm khác nhau (5,3; 5,8; 6,5; 4,8) và thay đổi tốc độ dòng khác nhau<br /> (1,0; 1,2; 1,5ml/phút) trên máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector<br /> [6].<br /> 44<br /> <br /> Dung dịch thử: cắn thu được sau khi thuỷ phân được hòa tan trong 2ml MeOH.<br /> Dung dịch chuẩn: hòa tan 20mg stigmasterol trong 100ml MeOH. Các dịch được<br /> lắc siêu âm 5 phút để hoà tan, sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào máy.<br /> Quy trình phân tích HPLC được xây dựng, tối ưu hoá các thông số tỷ lệ pha<br /> động, pH, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện và thẩm định tính tương thích hệ thống,<br /> độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng (tỷ lệ phục hồi) và giới hạn định lượng (LOQ).<br /> 3. Kết quả và bàn luận<br /> Kết quả khảo sát các hệ dung môi triển khai trên TLC (Hình 1) cho thấy trong<br /> các hệ dung môi pha động khảo sát, hệ n-hexan/ethyl axetat (8:2) cho peak stigmasterol<br /> tách rõ ràng với các vết kề cận, có hệ số phân bố Rf =0,64 nằm trong khoảng thích hợp<br /> (0,3 – 0,7). Peak stigmasterol cho màu xanh lục đặc trưng của nhóm phytosterol với<br /> thuốc thử Liebermann-Burchard.<br /> <br /> Hình 1. Các hệ dung môi triển khai trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard<br /> (a) CHCl3/CH3COCH3 (8:2), (b) CHCl3/MeOH (98:2), (c) n-hexan/ethyl acetate (9:1), (d) nhexan/ethyl acetate (8:2) và (e) n-hexan/ethyl acetate (7:3)<br /> <br /> Kết quả khảo sát các dung môi chiết xuất stigmasterol toàn phần trong bột ráy<br /> bằng chiết Soxhlet cho thấy sau 3h chiết xuất, dịch chiết CHCl3 thu được hàm lượng<br /> hoạt chất nhiều nhất, thể hiện bằng cường độ peak stigmasterol đậm hơn so với tín hiệu<br /> peak của dịch CHCl3/MeOH (1:1) và (2:1) trong cùng điều kiện chiết xuất. Thời gian<br /> chiết kiệt tối ưu nhất khi dùng CHCl3 là 6h, thể hiện bằng việc không thể phát hiện vết<br /> của stigmasterol trên bả dược liệu thu được.<br /> Quá trình khảo sát các thông số, điều kiện sắc ký thích hợp cho quá trình định<br /> lượng stigmasterol bằng HPLC được thể hiện trong Hình 2.<br /> Khi triển khai phân tích phytosterol trên HPLC với pha động là ACN/đệm<br /> phosphate 0,025M (95:5), pH=5,8 [6], tốc độ dòng 1,2ml/phút, chúng tôi thấy với cột<br /> C8 ở nhiệt độ 300C ± 1 cho sự phân giải giữa các peak hoạt chất của nhóm phytosterol<br /> tốt hơn so với cột C18 trong cùng điều kiện.<br /> <br /> 45<br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ mẫu stigmasterol (a) và mẫu dịch chiết thuỷ phân trên cột C8, nhiệt độ cột<br /> 300C± 1, pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7), pH=4,8, tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích<br /> tiêm 20μl, λmax=195nm.<br /> <br /> Khi thay đổi tỷ lệ của ACN trong pha động từ 95% đến 93%, sự phân giải của<br /> peak stigmasterol so với hai peak hai bên cải thiện rất rõ, tuy nhiên khi hạ tỷ lệ ACN<br /> xuống 90%, peak stigmasterol bị dính vào peak ra trước đó. Do vậy, chúng tôi chọn tỷ<br /> lệ ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7) là thích hợp nhất để khảo sát pH thích hợp.<br /> Khi thay đổi lần lượt các pH 4,8; 5,3; 5,8; 6,5, kết quả phân tích cho thấy khi hạ<br /> pH pha động ACN/đệm phosphate 0,025M (93:7) xuống thì khả năng tách của peak<br /> stigmasterol so với các peak hai bên rất cải thiện, tại pH=4,8 cho khả năng tách peak<br /> stigmasterol tốt nhất, peak sắc nhọn và đối xứng, các chân peak hầu như không dính vào<br /> chân peak trước và sau nó.<br /> Khi thay đổi tốc độ dòng từ 1,0; 1,2; 1,5ml/phút trên hệ pha động ACN/đệm<br /> phosphat = 93:7, pH 4,8. Kết quả cho thấy tại tốc độ dòng 1ml/phút, chân peak<br /> stigmasterol tách rời hoàn toàn khỏi chân peak ra liền trước nó, trong khi với tốc độ<br /> dòng lớn hơn (1,2 và 1,5ml/phút), dù thời gian phân tích có ngắn lại, nhưng độ phân giải<br /> lại giảm. Cũng qua khảo sát các bước sóng phát hiện trên Detector PAD, chúng tôi nhận<br /> thấy tại bước sóng 195nm cho tín hiệu peak là cao nhất, phù hợp với sự phát hiện các<br /> hoạt chất nhóm phytosterol.<br /> 3.1. Thẩm định phương pháp HPLC<br /> - Tính tương thích hệ thống<br /> Bảng 1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký<br /> <br /> Lần đo<br /> <br /> Thời gian<br /> lưu (phút)<br /> <br /> Hệ số phân<br /> giải(1)<br /> <br /> Số đĩa lý<br /> thuyết<br /> <br /> Hệ số bất<br /> đối xứng<br /> <br /> Diện tích<br /> peak<br /> <br /> 1<br /> <br /> 14,71<br /> <br /> 1,57<br /> <br /> 10712<br /> <br /> 1,10<br /> <br /> 10573308<br /> <br /> 2<br /> <br /> 14,64<br /> <br /> 1,55<br /> <br /> 10701<br /> <br /> 1,13<br /> <br /> 10568175<br /> <br /> 3<br /> <br /> 14,62<br /> <br /> 1,56<br /> <br /> 10671<br /> <br /> 1,11<br /> <br /> 10584571<br /> <br /> 46<br /> <br /> 4<br /> <br /> 14,63<br /> <br /> 1,56<br /> <br /> 10718<br /> <br /> 1,09<br /> <br /> 10581461<br /> <br /> 5<br /> <br /> 14,64<br /> <br /> 1,55<br /> <br /> 10679<br /> <br /> 1,10<br /> <br /> 10582939<br /> <br /> 6<br /> <br /> 14,59<br /> <br /> 1,57<br /> <br /> 10726<br /> <br /> 1,09<br /> <br /> 10578733<br /> <br /> Mean<br /> <br /> 14,64<br /> <br /> 1,56<br /> <br /> 10701<br /> <br /> 1,10<br /> <br /> 10578198<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,26<br /> <br /> 0,57<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 1,36<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> (1)<br /> <br /> : hệ số phân giải giữa peak stigmasterol với peak trước nó.<br /> <br /> Tính tương thích của hệ thống sắc ký được xác định bởi tiến hành tiêm lặp lại 6<br /> lần trên một mẫu thử, với các điều kiện chạy sắc ký đã chọn ở trên. Kết quả khảo sát<br /> tính tương thích của hệ thống được trình bày tại Bảng 1.<br /> Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là tương thích cho việc<br /> phân tích định lượng stigmasterol trong bột dược liệu ráy (RSD ≤ 2%).<br /> - Tính đặc hiệu<br /> Dựa vào thời gian lưu và hình dáng sắc nhọn, đối xứng của peak stigmasterol<br /> thu được khi phân tích mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn (hình 3), kết hợp so sánh phổ<br /> UV của peak mẫu thử so với phổ stigmasterol chuẩn thu được khi quét phổ trên detector<br /> PDA từ 190 – 400nm (Hình 4) cho thấy peak stigmasterol trong dung dịch thử có thời<br /> gian lưu (14.64 phút) và phổ UV tương ứng với peak stigmasterol chuẩn. Phương pháp<br /> phân tích sắc ký trên cho tính đặc hiệu cao.<br /> <br /> Hình 3. Sắc ký đồ mẫu dịch chiết thuỷ phân (a) và dịch chiết thuỷ phân thêm chuẩn (b)<br /> <br /> Hình 4. Phổ đồ UV mẫu stigmasterol chuẩn (a) và mẫu dịch chiết thuỷ phân (b)<br /> 47<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2