intTypePromotion=3

Xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid

Chia sẻ: Hạnh Thơm | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
22
lượt xem
1
download

Xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu nhằm Xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High performance liquid chromatography) và ứng dụng để xác định hệ số phân bố Logp của palmitoyl pyrazinamid. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG PALMITOYL<br /> PYRAZINAMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC<br /> VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHÂN BỐ LOG P<br /> CỦA PALMITOYL PYRAZINAMID<br /> Nguyễn Duy Phương*, Phạm Đình Duy*, Phan Văn Hồ Nam*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Tiền chất của pyrazinamid, palmitate pyrazinamid, được tổng hợp mới để bào chế tiểu phân<br /> xốp nhằm đạt được yêu cầu riêng của hệ phân phối thuốc đến phổi. Để kiểm soát chất lượng hoạt chất mới<br /> n|y, đề t|i “X}y dựng quy trình định lượng palmitate pyrazinamid bằng phương ph{p HPLC v| ứng dụng<br /> để khảo sát hằng số LogP của hợp chất n|y” được thực hiện.<br /> Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương ph{p<br /> HPLC, ứng dụng để khảo sát hệ số phân bố log P của palmitoyl pyrazinamid.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò c{c điều kiện sắc ký bằng HPLC. Tiến hành thẩm<br /> định quy trình theo hướng dẫn của ICH. Sử dụng phương ph{p thêm chuẩn để định lượng palmitoyl<br /> pyrazinamid trong c{c pha để x{c định hệ số phân bố Log P của hoạt chất này.<br /> Kết quả: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid với c{c điều kiện sắc ký là:<br /> Cột sắc ký Intersil, 250 x 4,6 mm x 5 µm; Nhiệt độ cột 30 oC; Bước sóng phát hiện 268 nm; Pha động gồm<br /> 100% ACN; Tốc độ dòng 1 mL/phút; Thể tích tiêm 20 µL; Nồng độ mẫu 150 µg/mL. Quy trình định lượng<br /> này đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ lặp lại, tính tuyến tính, độ đúng, v| được ứng dụng để<br /> x{c định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39, không khác biệt nhiều<br /> so với dự đo{n bằng các phần mềm chuyên dụng.<br /> Kết luận: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid. X{c định được hệ số phân<br /> bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39.<br /> Từ khóa: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OF PALMITATE PYRAZINAMIDE<br /> BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND THE APPLICATION<br /> IN FINDING ITS PARTITION COEFFICIENT (LOG P)<br /> Nguyen Duy Phuong, Pham Dinh Duy, Phan Van Ho Nam<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1 - 2018: 197 - 203<br /> Introduction: A precursor of pyrazinamide, palmitate pyrazinamide, was synthesized to form small<br /> particles that met predetermined requirements for lung-distributing system. To monitor the quality of this<br /> novel substance, the study “Quantitative determination of palmitate pyrazinamide by high performance<br /> liquid chromatography and the application in finding its partition coefficient (log P)” was conducted.<br /> Objectives: Establish qualification and validation processes of palmitoyl pyrazinamide via HPLC<br /> system, applied to investigate its partition coefficient (log P).<br /> *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam<br /> ĐT: 0909615007<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Email: phanvanhonam@ump.edu.vn<br /> <br /> 197<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Materials and Methods: Examine various HPLC conditions. Appraise validation process based on<br /> ICH guiedlines. Standard addition method was carried out to determine palmitoyl pyrazinamide contents in<br /> different phases and to figure out its partition coefficient.<br /> Results: HPLC conditions for the qualification process of palmitoyl pyrazinamide: Intersil column<br /> (250 x 4.6 mm x 5 µm); column temperature 30 oC; wave length 268 nm; mobile phase ACN 100%; flow<br /> rate 1mL/min; injection column 20 µL; sample content 150 µL/mL. This process met requirements of<br /> system suitability, repeatability, linearity and accuracy and was applied to find out palmitoyl<br /> pyrazinamide's partition coefficient (4.39), which comparatively similar to prediction of softwares.<br /> Key words: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P<br /> một nguyên liệu mới sử dụng làm thuốc, cũng<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> nhƣ sẽ là tiền đề cho việc xây dựng tiêu chuẩn<br /> Pyrazinamide (PZA) là một trong 4 kháng<br /> chất lƣợng cho các chế phẩm bào chế từ nó.<br /> sinh chính dùng trong ph{c đồ điều trị bệnh<br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> lao của Tổ chức Y tế thế giới (WHO)(5). Bên<br /> cạnh các dạng thuốc có tác dụng toàn thân,<br /> Đối tƣợng nghiên cứu<br /> việc nghiên cứu các hệ phân phối thuốc kháng<br /> Palmitoyl pyrazinamid đƣợc tổng hợp tại<br /> lao đến phổi đƣợc xem nhƣ một chiến lƣợc<br /> Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ<br /> thay thế thuốc dùng đƣờng uống v| tiêm để<br /> Chí Minh.<br /> có đƣợc nồng độ thuốc cao hơn v| t{c dụng<br /> Chất đối chiếu<br /> trực tiếp hơn đến các tổn thƣơng tại cơ quan<br /> Palmitoyl pyrazinamide đƣợc tổng hợp và<br /> đích l| phổi(4). Các tiểu phân xốp mang PZA là<br /> x{c định công thức cấu tạo cũng nhƣ độ tinh<br /> một ứng viên tiềm năng, tuy nhiên, vì khi c{c<br /> khiết tại Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành<br /> tiểu phân xốp đƣợc phân phối tới phổi thì<br /> phố Hồ Chí Minh đạt tiêu chuẩn là chất<br /> PZA đƣợc hòa tan và hấp thu vào hệ tuần<br /> chuẩn, có h|m lƣợng 99,98% tính trên chế<br /> hoàn nhanh chóng, nồng độ thuốc tại chỗ sẽ<br /> phẩm làm khan.<br /> không duy trì l}u d|i, hơn nữa nồng độ PZA<br /> Hóa chất – dung môi<br /> đo đƣợc trong đại thực bào phế nang thấp có<br /> thể không đủ để tiêu diệt các vi khuẩn lao thể<br /> Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1không hoạt động(1). Do vậy, sử dụng tiền chất<br /> heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd<br /> của PZA, palmitate pyrazinamide (PP), để bào<br /> đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Acetonitril<br /> chế tiểu phân xốp sẽ giúp nó bền hơn về mặt<br /> (ACN), methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng<br /> khí động học, và sự phóng thích PZA vào dịch<br /> (Merck).<br /> phế quản phổi sẽ giảm dẫn đến sự hấp thu<br /> Trang thiết bị<br /> vào tuần hoàn giảm, giúp đạt đƣợc yêu cầu<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> của hệ trị liệu mới này(3). Việc kiểm soát chất<br /> Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang<br /> lƣợng hoạt chất mới này là một yêu cầu không<br /> 2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP<br /> tránh khỏi nhƣng vì l| một chất đƣợc tổng<br /> 224D (Sartorius, Đức). M{y đo pH Metrohm<br /> hợp mới nên chƣa có công bố n|o định lƣợng<br /> 744 (Metrohm, Đức). Bể siêu âm Elma T840<br /> hoạt chất này. Do vậy đề t|i “X}y dựng quy<br /> DH (Elma, Đức).<br /> trình định lƣợng palmitate pyrazinamid bằng<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> phƣơng ph{p HPLC v| ứng dụng để khảo sát<br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> hằng số LogP của hợp chất n|y” đƣợc thực<br /> hiện với mong muốn góp phần xây dựng tiêu<br /> Công thức phân tử của PP là C21H35O2N3,<br /> chuẩn chất lƣợng và khảo sát hằng số logP cho<br /> có khối lƣợng phân tử M = 361,53 g/mol<br /> <br /> 198<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Hình 1: Công thức cấu tạo của palmitoyl<br /> pyrazinamid<br /> PP là một hợp chất kém phân cực trong đó<br /> có nh}n pyrazin tƣơng đối phân cực hơn so<br /> với các phần cấu trúc còn lại dẫn đến hợp chất<br /> này dễ tan trong cloroform, rất kém tan trong<br /> nƣớc. Các tạp chất liên quan có thể có bao gồm<br /> nguyên liệu palmitoyl clorid và pyrazinamide<br /> còn tồn dƣ l| c{c hợp chất rất hoặc tƣơng đối<br /> phân cực. Do vậy phƣơng ph{p sắc ký lỏng<br /> pha đảo đƣợc lựa chọn vì tính phổ biến, dung<br /> môi pha động phân cực ít độc hại hơn, v| dễ<br /> dàng phát triển để định lƣợng, thử tinh khiết<br /> các hợp chất và chế phẩm liên quan. Đầu dò<br /> dãy diod quang - photodiode array detector<br /> (PDA) cũng đƣợc ƣu tiên để nghiên cứu vì PP<br /> có 2 đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng λ =<br /> 220,5 nm và 268,0 nm. Trong khi PZA có 2<br /> đỉnh hấp thu cực đại là 207 nm và 268 nm.<br /> Tiến hành khảo sát 4 hệ pha động khác nhau:<br /> ACN – Acid acetic 1% (85:15); ACN – Acid<br /> acetic 1,5% (90:10); ACN 100%; MeOH-H2O<br /> (95:5); 2 loại cột sắc ký pha đảo C18:<br /> Phenomenex; Intersil; và cố định các yếu tố<br /> khác bao gồm: nhiệt độ cột 30 0C, thể tích tiêm<br /> mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút.<br /> <br /> Thẩm định quy trình định lượng PP<br /> Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng<br /> dẫn của ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù<br /> hợp của hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến<br /> tính, độ chính xác, độ đúng. Sau khi đƣợc<br /> thẩm định, quy trình này sẽ đƣợc ứng dụng<br /> để tìm hệ số phân bố log P của PP.<br /> Mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng<br /> Pha dung dịch PP chuẩn và thử có nồng<br /> độ 150 ppm trong ACN: cân chính xác 150 mg<br /> PP chuẩn hoặc PP nguyên liệu cho vào bình<br /> định mức 100 ml. Thêm khoảng 65 ml ACN,<br /> siêu âm 5 phút. Thêm ACN vừa đủ thể tích,<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> lắc đều. Hút chính xác 10 mL dung dịch này<br /> pha loãng thành 100 mL, lắc đều, lọc qua<br /> màng lọc 0,45µm. Mẫu trắng là dung môi pha<br /> mẫu thử.<br /> <br /> Xác định hệ số phân bố của palmitoyl<br /> pyrazinamid<br /> Dựa vào phần mềm MarvinSketch 17,7 và<br /> MarvinView 17,7 của ChemAxon để chọn pH<br /> mà ở đó PP chỉ tồn tại ở dạng không ion hóa,<br /> pH mà PP tồn tại ở dạng không ion hóa là 3,8<br /> – 4,0.<br /> Pha dung dịch chuẩn nồng độ 55,5 ppm<br /> trong pha octanol hoặc trong pha nƣớc. Trong<br /> pha nƣớc sử dụng dung dịch đệm pH = 3,8 (hệ<br /> đệm CH3COOH/CH3COONa 0,1 M) để pha<br /> dung dịch<br /> Hút chính xác 20 mL dung dịch chuẩn<br /> trong pha nƣớc cho vào mỗi bình lắng gạn 60<br /> mL, sau đó cho tiếp mỗi bình lắng gạn 20 mL<br /> dung dịch chuẩn trong pha octanol. Thực hiện<br /> tất cả là 3 bình lắng gạn. Lắc phân bố mỗi bình<br /> trong 30 phút, tiếp đục để ổn định ở nhiệt độ<br /> phòng trong 24 giờ.<br /> Hút chính xác 2 mL từ pha octanol cho vào<br /> bình định mức 100 mL, thêm dung môi<br /> Acetonitril vừa đủ 100 mL. L|m tƣơng tự cho<br /> 2 bình định mức còn lại tƣơng ứng với các<br /> bình lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy<br /> trình định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên.<br /> Hút chính xác 10 mL dung dịch chuẩn 55,5<br /> ppm, và 2 mL dung dịch trong pha nƣớc cho<br /> v|o bình định mức 20 mL. Lắc đều, thực hiện<br /> tƣơng tự đối với 2 bình định mức 20 mL còn<br /> lại tƣơng ứng với c{c pha nƣớc trong bình<br /> lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy trình<br /> định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên.<br /> Nồng độ PP trong pha octanol đƣợc tính<br /> nhƣ sau:<br /> <br /> 199<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Nồng độ PP trong pha nƣớc đƣợc tính nhƣ<br /> sau:<br /> <br /> H%: h|m lƣợng % PP chuẩn tính theo chế<br /> phẩm làm khan<br /> CPha<br /> octanol<br /> <br /> Hệ số phân bố: Log P<br /> <br /> : Nồng độ của PP trong pha<br /> <br /> octanol<br /> <br /> CPha nƣớc: Nồng độ của PP trong pha octanol<br /> <br /> Trong đó:<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> Sthử: diện tích pic thử<br /> <br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> <br /> Schuẩn: diện tích pic chuẩn<br /> <br /> Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu<br /> chuẩn 100 ppm đƣợc thể hiện qua bảng 1.<br /> <br /> N: hệ sô pha loãng (N=50)<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu chuẩn 100 ppm khi thay đổi pha động và cột sắc ký<br /> Pha động khảo sát<br /> ACN – Acid acetic 1% (85:15)<br /> ACN – Acid acetic 1,5% (90:10)<br /> ACN 100%<br /> MeOH-H2O (95:5)<br /> <br /> Thông số pic<br /> Diện tích<br /> Nồng độ Thời gian<br /> Cột sắc ký<br /> mẫu (ppm) ưu (phút) (µAu x giây)<br /> Phenomenex<br /> 100,0<br /> 21,734<br /> 961499<br /> Intersil<br /> 100,0<br /> 23,935<br /> 2742253<br /> Intersil<br /> 100<br /> 9,651<br /> 2989975<br /> Intersil<br /> 99,6<br /> 14,644<br /> 3961137<br /> <br /> Độ phân Hệ số kéo<br /> giải RS<br /> đuôi T<br /> <br /> Chiều<br /> cao<br /> 20506<br /> 66896<br /> 272879<br /> 209545<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> 10,56<br /> 24,08<br /> 5,74<br /> <br /> 1,48<br /> 1,23<br /> 1,11<br /> 1,12<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ thu được khi khảo s{t điều kiện sắc ký kh{c nhau: a) Pha động ACN – Acid acetic 1%<br /> (85:15) / cột Phenomenex; b) Pha động ACN – Acid acetic 1,5% (90:10) / Cột Intersil; c) Pha động ACN<br /> 100% / Cột Intersil; d) Pha động MeOH – H2O (95:5) / Cột Intersil<br /> phát hiện: 268 nm; Pha động: 100% CAN;<br /> Điều kiện sắc ký thích hợp đƣợc lựa<br /> Tốc độ dòng: 1 mL/phút; Thể tích tiêm: 20<br /> chọn để tiến h|nh c{c bƣớc tiếp theo là: Cột<br /> µL; Nồng độ mẫu: 150 µg/mL.<br /> sắc ký: Intersil, 250 x 4,6 mm; 5 µm; Nhiệt<br /> độ cột: 30 o C; Detector: PDA; Bƣớc sóng<br /> <br /> 200<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Thẩm định quy trình định lƣợng PP<br /> <br /> Tính tương thích hệ thống<br /> Bảng 2: Kết quả khảo s{t tính tương thích của hệ<br /> thống trên mẫu chuẩn (n=6)<br /> Thời Diện<br /> Hệ số<br /> Số đĩa<br /> Độ<br /> gian tích pic<br /> dung<br /> lý<br /> phân<br /> ưu (µAu x<br /> ượng<br /> thuyết<br /> giải<br /> (phút) giây)<br /> K<br /> TB<br /> RSD%<br /> <br /> Hệ số<br /> % diện<br /> kéo<br /> tích pic<br /> đuôi<br /> <br /> 9.617 4486292 73778<br /> <br /> 1.57<br /> <br /> 5.25<br /> <br /> 1.15<br /> <br /> 99.58<br /> <br /> 0.13<br /> <br /> 0.26<br /> <br /> 1.02<br /> <br /> 1.02<br /> <br /> 0.01<br /> <br /> 0.18<br /> <br /> 0.74<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> bằng phƣơng ph{p HPLC do tất cả các thông<br /> số sắc ký thu đƣợc qua 6 lần tiêm mẫu chuẩn<br /> 150 ppm đều có RSD ≤ 2%; hệ số kéo đuôi của<br /> pic PP nằm trong khoảng 0,9 – 1,5; Số đĩa lý<br /> thuyết N ≥ 2000.<br /> <br /> Tính đặc hiệu<br /> Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử,<br /> mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng, thu đƣợc<br /> kết quả nhƣ hình 3<br /> <br /> Kết quả thu đƣợc cho thấy hệ thống phù<br /> hợp cho việc phân tích PP trong nguyên liệu<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> (e)<br /> <br /> (f)<br /> <br /> Hình 3: Kết quả khảo s{t độ đặc hiệu của phương pháp: a) Sắc ký đồ của mãu trắng; b) Sắc ký đồ của mẫu chuẩn;<br /> c) Sắc ký đồ của mẫu thử; d) Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn; e) Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến của PP thu<br /> được từ pic chính của sắc ký đồ mẫu thử; f) Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic PP trong mẫu thử<br /> pic cho thấy pic PP trong mẫu thử tinh khiết (hình<br /> Kết quả thu đƣợc cho thấy: phổ UV-Vis tại<br /> 3f), Chiều cao mẫu thử thêm chuẩn tăng tƣơng<br /> thời gian lƣu của pic PP trong mẫu thử và mẫu<br /> ứng với lƣợng thêm vào (hình 3d). Do đó, có thể<br /> chuẩn giống nhau, thời gian lƣu của pic trong<br /> khẳng định qui trình ph}n tích có tính đặc hiệu.<br /> mẫu chuẩn (hình 3b) tƣơng đƣơng với thời gian<br /> lƣu của pic PP trong mẫu thử (hình 3c), mẫu trắng<br /> là dung môi hòa tan mẫu ACN không cho pic của<br /> PP trên sắc ký đồ tại thời gian lƣu 9,59 phút (hình<br /> 3a), sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Tính tuyến tính<br /> Dựa vào phần mềm Excel, lập đƣợc<br /> đƣờng tuyến tính biểu diễn sự tƣơng quan<br /> giữa nồng độ và diện tích đỉnh (Hình 4): ŷ<br /> <br /> 201<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản