Xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG PALMITOYL<br /> PYRAZINAMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC<br /> VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHÂN BỐ LOG P<br /> CỦA PALMITOYL PYRAZINAMID<br /> Nguyễn Duy Phương*, Phạm Đình Duy*, Phan Văn Hồ Nam*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Tiền chất của pyrazinamid, palmitate pyrazinamid, được tổng hợp mới để bào chế tiểu phân<br /> xốp nhằm đạt được yêu cầu riêng của hệ phân phối thuốc đến phổi. Để kiểm soát chất lượng hoạt chất mới<br /> n|y, đề t|i “X}y dựng quy trình định lượng palmitate pyrazinamid bằng phương ph{p HPLC v| ứng dụng<br /> để khảo sát hằng số LogP của hợp chất n|y” được thực hiện.<br /> Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương ph{p<br /> HPLC, ứng dụng để khảo sát hệ số phân bố log P của palmitoyl pyrazinamid.<br /> Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò c{c điều kiện sắc ký bằng HPLC. Tiến hành thẩm<br /> định quy trình theo hướng dẫn của ICH. Sử dụng phương ph{p thêm chuẩn để định lượng palmitoyl<br /> pyrazinamid trong c{c pha để x{c định hệ số phân bố Log P của hoạt chất này.<br /> Kết quả: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid với c{c điều kiện sắc ký là:<br /> Cột sắc ký Intersil, 250 x 4,6 mm x 5 µm; Nhiệt độ cột 30 oC; Bước sóng phát hiện 268 nm; Pha động gồm<br /> 100% ACN; Tốc độ dòng 1 mL/phút; Thể tích tiêm 20 µL; Nồng độ mẫu 150 µg/mL. Quy trình định lượng<br /> này đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ lặp lại, tính tuyến tính, độ đúng, v| được ứng dụng để<br /> x{c định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39, không khác biệt nhiều<br /> so với dự đo{n bằng các phần mềm chuyên dụng.<br /> Kết luận: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid. X{c định được hệ số phân<br /> bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39.<br /> Từ khóa: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P<br /> <br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE DETERMINATION OF PALMITATE PYRAZINAMIDE<br /> BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND THE APPLICATION<br /> IN FINDING ITS PARTITION COEFFICIENT (LOG P)<br /> Nguyen Duy Phuong, Pham Dinh Duy, Phan Van Ho Nam<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1 - 2018: 197 - 203<br /> Introduction: A precursor of pyrazinamide, palmitate pyrazinamide, was synthesized to form small<br /> particles that met predetermined requirements for lung-distributing system. To monitor the quality of this<br /> novel substance, the study “Quantitative determination of palmitate pyrazinamide by high performance<br /> liquid chromatography and the application in finding its partition coefficient (log P)” was conducted.<br /> Objectives: Establish qualification and validation processes of palmitoyl pyrazinamide via HPLC<br /> system, applied to investigate its partition coefficient (log P).<br /> *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam<br /> ĐT: 0909615007<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Email: phanvanhonam@ump.edu.vn<br /> <br /> 197<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Materials and Methods: Examine various HPLC conditions. Appraise validation process based on<br /> ICH guiedlines. Standard addition method was carried out to determine palmitoyl pyrazinamide contents in<br /> different phases and to figure out its partition coefficient.<br /> Results: HPLC conditions for the qualification process of palmitoyl pyrazinamide: Intersil column<br /> (250 x 4.6 mm x 5 µm); column temperature 30 oC; wave length 268 nm; mobile phase ACN 100%; flow<br /> rate 1mL/min; injection column 20 µL; sample content 150 µL/mL. This process met requirements of<br /> system suitability, repeatability, linearity and accuracy and was applied to find out palmitoyl<br /> pyrazinamide's partition coefficient (4.39), which comparatively similar to prediction of softwares.<br /> Key words: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P<br /> một nguyên liệu mới sử dụng làm thuốc, cũng<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> nhƣ sẽ là tiền đề cho việc xây dựng tiêu chuẩn<br /> Pyrazinamide (PZA) là một trong 4 kháng<br /> chất lƣợng cho các chế phẩm bào chế từ nó.<br /> sinh chính dùng trong ph{c đồ điều trị bệnh<br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> lao của Tổ chức Y tế thế giới (WHO)(5). Bên<br /> cạnh các dạng thuốc có tác dụng toàn thân,<br /> Đối tƣợng nghiên cứu<br /> việc nghiên cứu các hệ phân phối thuốc kháng<br /> Palmitoyl pyrazinamid đƣợc tổng hợp tại<br /> lao đến phổi đƣợc xem nhƣ một chiến lƣợc<br /> Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ<br /> thay thế thuốc dùng đƣờng uống v| tiêm để<br /> Chí Minh.<br /> có đƣợc nồng độ thuốc cao hơn v| t{c dụng<br /> Chất đối chiếu<br /> trực tiếp hơn đến các tổn thƣơng tại cơ quan<br /> Palmitoyl pyrazinamide đƣợc tổng hợp và<br /> đích l| phổi(4). Các tiểu phân xốp mang PZA là<br /> x{c định công thức cấu tạo cũng nhƣ độ tinh<br /> một ứng viên tiềm năng, tuy nhiên, vì khi c{c<br /> khiết tại Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành<br /> tiểu phân xốp đƣợc phân phối tới phổi thì<br /> phố Hồ Chí Minh đạt tiêu chuẩn là chất<br /> PZA đƣợc hòa tan và hấp thu vào hệ tuần<br /> chuẩn, có h|m lƣợng 99,98% tính trên chế<br /> hoàn nhanh chóng, nồng độ thuốc tại chỗ sẽ<br /> phẩm làm khan.<br /> không duy trì l}u d|i, hơn nữa nồng độ PZA<br /> Hóa chất – dung môi<br /> đo đƣợc trong đại thực bào phế nang thấp có<br /> thể không đủ để tiêu diệt các vi khuẩn lao thể<br /> Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1không hoạt động(1). Do vậy, sử dụng tiền chất<br /> heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd<br /> của PZA, palmitate pyrazinamide (PP), để bào<br /> đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Acetonitril<br /> chế tiểu phân xốp sẽ giúp nó bền hơn về mặt<br /> (ACN), methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng<br /> khí động học, và sự phóng thích PZA vào dịch<br /> (Merck).<br /> phế quản phổi sẽ giảm dẫn đến sự hấp thu<br /> Trang thiết bị<br /> vào tuần hoàn giảm, giúp đạt đƣợc yêu cầu<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> của hệ trị liệu mới này(3). Việc kiểm soát chất<br /> Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang<br /> lƣợng hoạt chất mới này là một yêu cầu không<br /> 2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP<br /> tránh khỏi nhƣng vì l| một chất đƣợc tổng<br /> 224D (Sartorius, Đức). M{y đo pH Metrohm<br /> hợp mới nên chƣa có công bố n|o định lƣợng<br /> 744 (Metrohm, Đức). Bể siêu âm Elma T840<br /> hoạt chất này. Do vậy đề t|i “X}y dựng quy<br /> DH (Elma, Đức).<br /> trình định lƣợng palmitate pyrazinamid bằng<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> phƣơng ph{p HPLC v| ứng dụng để khảo sát<br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> hằng số LogP của hợp chất n|y” đƣợc thực<br /> hiện với mong muốn góp phần xây dựng tiêu<br /> Công thức phân tử của PP là C21H35O2N3,<br /> chuẩn chất lƣợng và khảo sát hằng số logP cho<br /> có khối lƣợng phân tử M = 361,53 g/mol<br /> <br /> 198<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Hình 1: Công thức cấu tạo của palmitoyl<br /> pyrazinamid<br /> PP là một hợp chất kém phân cực trong đó<br /> có nh}n pyrazin tƣơng đối phân cực hơn so<br /> với các phần cấu trúc còn lại dẫn đến hợp chất<br /> này dễ tan trong cloroform, rất kém tan trong<br /> nƣớc. Các tạp chất liên quan có thể có bao gồm<br /> nguyên liệu palmitoyl clorid và pyrazinamide<br /> còn tồn dƣ l| c{c hợp chất rất hoặc tƣơng đối<br /> phân cực. Do vậy phƣơng ph{p sắc ký lỏng<br /> pha đảo đƣợc lựa chọn vì tính phổ biến, dung<br /> môi pha động phân cực ít độc hại hơn, v| dễ<br /> dàng phát triển để định lƣợng, thử tinh khiết<br /> các hợp chất và chế phẩm liên quan. Đầu dò<br /> dãy diod quang - photodiode array detector<br /> (PDA) cũng đƣợc ƣu tiên để nghiên cứu vì PP<br /> có 2 đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng λ =<br /> 220,5 nm và 268,0 nm. Trong khi PZA có 2<br /> đỉnh hấp thu cực đại là 207 nm và 268 nm.<br /> Tiến hành khảo sát 4 hệ pha động khác nhau:<br /> ACN – Acid acetic 1% (85:15); ACN – Acid<br /> acetic 1,5% (90:10); ACN 100%; MeOH-H2O<br /> (95:5); 2 loại cột sắc ký pha đảo C18:<br /> Phenomenex; Intersil; và cố định các yếu tố<br /> khác bao gồm: nhiệt độ cột 30 0C, thể tích tiêm<br /> mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút.<br /> <br /> Thẩm định quy trình định lượng PP<br /> Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng<br /> dẫn của ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù<br /> hợp của hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến<br /> tính, độ chính xác, độ đúng. Sau khi đƣợc<br /> thẩm định, quy trình này sẽ đƣợc ứng dụng<br /> để tìm hệ số phân bố log P của PP.<br /> Mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng<br /> Pha dung dịch PP chuẩn và thử có nồng<br /> độ 150 ppm trong ACN: cân chính xác 150 mg<br /> PP chuẩn hoặc PP nguyên liệu cho vào bình<br /> định mức 100 ml. Thêm khoảng 65 ml ACN,<br /> siêu âm 5 phút. Thêm ACN vừa đủ thể tích,<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> lắc đều. Hút chính xác 10 mL dung dịch này<br /> pha loãng thành 100 mL, lắc đều, lọc qua<br /> màng lọc 0,45µm. Mẫu trắng là dung môi pha<br /> mẫu thử.<br /> <br /> Xác định hệ số phân bố của palmitoyl<br /> pyrazinamid<br /> Dựa vào phần mềm MarvinSketch 17,7 và<br /> MarvinView 17,7 của ChemAxon để chọn pH<br /> mà ở đó PP chỉ tồn tại ở dạng không ion hóa,<br /> pH mà PP tồn tại ở dạng không ion hóa là 3,8<br /> – 4,0.<br /> Pha dung dịch chuẩn nồng độ 55,5 ppm<br /> trong pha octanol hoặc trong pha nƣớc. Trong<br /> pha nƣớc sử dụng dung dịch đệm pH = 3,8 (hệ<br /> đệm CH3COOH/CH3COONa 0,1 M) để pha<br /> dung dịch<br /> Hút chính xác 20 mL dung dịch chuẩn<br /> trong pha nƣớc cho vào mỗi bình lắng gạn 60<br /> mL, sau đó cho tiếp mỗi bình lắng gạn 20 mL<br /> dung dịch chuẩn trong pha octanol. Thực hiện<br /> tất cả là 3 bình lắng gạn. Lắc phân bố mỗi bình<br /> trong 30 phút, tiếp đục để ổn định ở nhiệt độ<br /> phòng trong 24 giờ.<br /> Hút chính xác 2 mL từ pha octanol cho vào<br /> bình định mức 100 mL, thêm dung môi<br /> Acetonitril vừa đủ 100 mL. L|m tƣơng tự cho<br /> 2 bình định mức còn lại tƣơng ứng với các<br /> bình lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy<br /> trình định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên.<br /> Hút chính xác 10 mL dung dịch chuẩn 55,5<br /> ppm, và 2 mL dung dịch trong pha nƣớc cho<br /> v|o bình định mức 20 mL. Lắc đều, thực hiện<br /> tƣơng tự đối với 2 bình định mức 20 mL còn<br /> lại tƣơng ứng với c{c pha nƣớc trong bình<br /> lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy trình<br /> định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên.<br /> Nồng độ PP trong pha octanol đƣợc tính<br /> nhƣ sau:<br /> <br /> 199<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Nồng độ PP trong pha nƣớc đƣợc tính nhƣ<br /> sau:<br /> <br /> H%: h|m lƣợng % PP chuẩn tính theo chế<br /> phẩm làm khan<br /> CPha<br /> octanol<br /> <br /> Hệ số phân bố: Log P<br /> <br /> : Nồng độ của PP trong pha<br /> <br /> octanol<br /> <br /> CPha nƣớc: Nồng độ của PP trong pha octanol<br /> <br /> Trong đó:<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> Sthử: diện tích pic thử<br /> <br /> Khảo sát điều kiện sắc ký<br /> <br /> Schuẩn: diện tích pic chuẩn<br /> <br /> Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu<br /> chuẩn 100 ppm đƣợc thể hiện qua bảng 1.<br /> <br /> N: hệ sô pha loãng (N=50)<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu chuẩn 100 ppm khi thay đổi pha động và cột sắc ký<br /> Pha động khảo sát<br /> ACN – Acid acetic 1% (85:15)<br /> ACN – Acid acetic 1,5% (90:10)<br /> ACN 100%<br /> MeOH-H2O (95:5)<br /> <br /> Thông số pic<br /> Diện tích<br /> Nồng độ Thời gian<br /> Cột sắc ký<br /> mẫu (ppm) ưu (phút) (µAu x giây)<br /> Phenomenex<br /> 100,0<br /> 21,734<br /> 961499<br /> Intersil<br /> 100,0<br /> 23,935<br /> 2742253<br /> Intersil<br /> 100<br /> 9,651<br /> 2989975<br /> Intersil<br /> 99,6<br /> 14,644<br /> 3961137<br /> <br /> Độ phân Hệ số kéo<br /> giải RS<br /> đuôi T<br /> <br /> Chiều<br /> cao<br /> 20506<br /> 66896<br /> 272879<br /> 209545<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> 10,56<br /> 24,08<br /> 5,74<br /> <br /> 1,48<br /> 1,23<br /> 1,11<br /> 1,12<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ thu được khi khảo s{t điều kiện sắc ký kh{c nhau: a) Pha động ACN – Acid acetic 1%<br /> (85:15) / cột Phenomenex; b) Pha động ACN – Acid acetic 1,5% (90:10) / Cột Intersil; c) Pha động ACN<br /> 100% / Cột Intersil; d) Pha động MeOH – H2O (95:5) / Cột Intersil<br /> phát hiện: 268 nm; Pha động: 100% CAN;<br /> Điều kiện sắc ký thích hợp đƣợc lựa<br /> Tốc độ dòng: 1 mL/phút; Thể tích tiêm: 20<br /> chọn để tiến h|nh c{c bƣớc tiếp theo là: Cột<br /> µL; Nồng độ mẫu: 150 µg/mL.<br /> sắc ký: Intersil, 250 x 4,6 mm; 5 µm; Nhiệt<br /> độ cột: 30 o C; Detector: PDA; Bƣớc sóng<br /> <br /> 200<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> Thẩm định quy trình định lƣợng PP<br /> <br /> Tính tương thích hệ thống<br /> Bảng 2: Kết quả khảo s{t tính tương thích của hệ<br /> thống trên mẫu chuẩn (n=6)<br /> Thời Diện<br /> Hệ số<br /> Số đĩa<br /> Độ<br /> gian tích pic<br /> dung<br /> lý<br /> phân<br /> ưu (µAu x<br /> ượng<br /> thuyết<br /> giải<br /> (phút) giây)<br /> K<br /> TB<br /> RSD%<br /> <br /> Hệ số<br /> % diện<br /> kéo<br /> tích pic<br /> đuôi<br /> <br /> 9.617 4486292 73778<br /> <br /> 1.57<br /> <br /> 5.25<br /> <br /> 1.15<br /> <br /> 99.58<br /> <br /> 0.13<br /> <br /> 0.26<br /> <br /> 1.02<br /> <br /> 1.02<br /> <br /> 0.01<br /> <br /> 0.18<br /> <br /> 0.74<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> bằng phƣơng ph{p HPLC do tất cả các thông<br /> số sắc ký thu đƣợc qua 6 lần tiêm mẫu chuẩn<br /> 150 ppm đều có RSD ≤ 2%; hệ số kéo đuôi của<br /> pic PP nằm trong khoảng 0,9 – 1,5; Số đĩa lý<br /> thuyết N ≥ 2000.<br /> <br /> Tính đặc hiệu<br /> Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử,<br /> mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng, thu đƣợc<br /> kết quả nhƣ hình 3<br /> <br /> Kết quả thu đƣợc cho thấy hệ thống phù<br /> hợp cho việc phân tích PP trong nguyên liệu<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> (d)<br /> <br /> (e)<br /> <br /> (f)<br /> <br /> Hình 3: Kết quả khảo s{t độ đặc hiệu của phương pháp: a) Sắc ký đồ của mãu trắng; b) Sắc ký đồ của mẫu chuẩn;<br /> c) Sắc ký đồ của mẫu thử; d) Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn; e) Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến của PP thu<br /> được từ pic chính của sắc ký đồ mẫu thử; f) Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic PP trong mẫu thử<br /> pic cho thấy pic PP trong mẫu thử tinh khiết (hình<br /> Kết quả thu đƣợc cho thấy: phổ UV-Vis tại<br /> 3f), Chiều cao mẫu thử thêm chuẩn tăng tƣơng<br /> thời gian lƣu của pic PP trong mẫu thử và mẫu<br /> ứng với lƣợng thêm vào (hình 3d). Do đó, có thể<br /> chuẩn giống nhau, thời gian lƣu của pic trong<br /> khẳng định qui trình ph}n tích có tính đặc hiệu.<br /> mẫu chuẩn (hình 3b) tƣơng đƣơng với thời gian<br /> lƣu của pic PP trong mẫu thử (hình 3c), mẫu trắng<br /> là dung môi hòa tan mẫu ACN không cho pic của<br /> PP trên sắc ký đồ tại thời gian lƣu 9,59 phút (hình<br /> 3a), sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Tính tuyến tính<br /> Dựa vào phần mềm Excel, lập đƣợc<br /> đƣờng tuyến tính biểu diễn sự tƣơng quan<br /> giữa nồng độ và diện tích đỉnh (Hình 4): ŷ<br /> <br /> 201<br /> <br />