zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Báo xấu

36
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản ứng PCR đơn cặp mồi, có thể xây dựng được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng Triệu Tiến Sang1, Trần Văn Khoa1, Nguyễn Thanh Tùng2 Lê Thị Thu Hiền3, Hoàng Xuân Cường4, Trần Ngọc Thảo My5 1 BM Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y 2 Viện Mô phôi và lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội 3 4 Phòng Khoa học Quân sự, Học viện Quân y Khoa Khoa học và Kỹ thuật, Trường Đại học Sorbonne, Pháp 5 TÓM TẮT được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1 Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận liên quan đến bệnh. Sau đó, chúng tôi ứng dụng quy (X-ALD) là một bệnh lí di truyền lặn liên kết giới trình này cho các mẫu tế bào phôi sinh thiết của gia tính hiếm gặp làm rối loạn chức năng tuyến thượng đình có tiền sử mắc bệnh nhằm sàng lọc các phôi thận, dây thần kinh tủy sống và chất trắng của hệ không mang alen gây bệnh loạn dưỡng não chất thần kinh. Theo các thống kê về dịch tễ học, bệnh trắng. Kết quả của nghiên cứu cho thấy đã có thể lí này gây ảnh hưởng đến 1 trên 15000 người, tuy phát hiện được alen đột biến ở 5/8 phôi (62,5%) và nhiên, tỷ lệ mắc bệnh trong thực tế được ước tính là 3 phôi còn lại (37,5%) không mang alen đột biến cao hơn nhiều nhờ vào việc áp dụng kết hợp các kĩ nên 3 phôi này tiếp tục được sử dụng trong các bước thuật hiện đại giúp chẩn đoán sớm bệnh. Khả năng sàng lọc tiền làm tổ tiếp theo trong quá trình thụ phát hiện ra bệnh ở thời điểm càng sớm sẽ giúp các tinh nhân tạo. gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng xây dựng những phương án sinh con cũng ĐẶT VẤN ĐỀ như chữa trị triệu chứng bệnh một cách chủ động Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận và an toàn. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi (X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD (MIM xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây #300100)), là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những thể X liên quan tới rối loạn quá trình β-oxi hóa tại gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn peroxisome. Bệnh do đột biến trên gen ABCD1 mã sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các hóa cho protein xuyên màng của peroxisome gây ra phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự dẫn tới sự tích tụ quá mức những chuỗi axit béo rất theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản dài (VLCFA - very long-chain fatty acid; ≥ C22) ở ứng PCR đơn cặp mồi, chúng tôi đã có thể xây dựng trong huyết tương và mô, bao gồm phần chất trắng Ngày nhận bài: 19/10/2020 Ngày phản biện: 20/11/2020 Ngày chấp nhận đăng: 09/12/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 17
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG ở não, tủy sống và vỏ thượng thận [2, 4]. Cho đến ảnh MRI não, xét nghiệm sinh hóa và phân tích di thời điểm hiện tại, thế giới đã ghi nhận nhiều ca mắc truyền đều tồn tại một nhược điểm chung là đều bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận xuất phát hiện ra người bệnh ở giai đoạn khá muộn [10]. hiện với tần suất tương tự giữa các quốc gia. Với tỷ Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm xây dựng một quy lệ mắc bệnh là khoảng 1 trên 14,700 trẻ sơ sinh (cả trình giúp chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm, đặc biệt nam lẫn nữ), đây chính là hội chứng rối loạn liên ở giai đoạn tiền làm tổ, có thể giúp những gia đình quan đến peroxisome phổ biến nhất từng gặp [9]. có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng có Tuy nhiên, tỷ lệ thực tế của căn bệnh này chưa được cơ hội sinh con không mang gen gây bệnh và sinh ra ước tính chính xác bởi hầu hết các khảo sát liên quan thế hệ sau một cách chủ động và an toàn. đến bệnh đều được thực hiện ở Mỹ hoặc các nước Tất cả những bệnh nhân mắc chứng ALD đều châu Âu, rất ít khảo sát được thực hiện tại châu Phi mang đột biến trên gen ABCD1 [8]. Đây là bệnh di và châu Á, đặc biệt là vùng Trung Đông [1]. truyền do alen lặn trên nhiễm sắc thể X qui định và Loạn dưỡng não chất trắng thường được phân cho tới thời điểm này chỉ xác định được khoảng 5% loại thành ba kiểu bệnh chính: X-ALD não, bệnh ca bệnh gây ra bởi các đột biến de novo. Gen ABCD1 lý thượng thận – tủy – rễ thần kinh (AMN), kiểu nằm ở gần cuối cánh dài của nhiễm sắc thế X: vị trí chỉ có bệnh Addison [3]. Đây đều là những thể Xq2.8 và có độ dài 19.9 kb bao gồm 10 exon. ABCD1 bệnh với những triệu chứng có ảnh hưởng nặng nề mã hóa cho một loại protein xuyên màng cấu tạo từ tới người mắc bệnh, đặc biệt là ở nam giới. Một số 745 amino axit được gọi là adrenoleukodystrophy triệu chứng lâm sàng chung giữa ba thể bệnh này protein, hay ALDP (protein ALD). Protein này nằm bao gồm thoái hóa hệ thần kinh (vận động, thị xuyên màng peroxisome thực hiện chức năng vận giác,…) và suy giảm tuyến thượng thận khiến cho chuyển VLCFA-CoA từ tế bào chất qua màng vào loạn dưỡng não chất trắng trở thành một căn bệnh bên trong bào quan để tham gia vào quá trình β-oxi phát triển nhanh chóng, nghiêm trọng và chưa thể hóa. Những đột biến trên gen ABCD1 sẽ gây ảnh xác định được một phác đồ điều trị dứt điểm thực hưởng trực tiếp tới protein ALD khiến cho protein sự hiệu quả [2]. bị thay đổi về mặt cấu trúc cũng như số lượng khiến Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán cho nó không thể thực hiện chức năng vận chuyển bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận, bao từ đó gây tích tụ các chuỗi axit béo rất dài trong tế gồm phương pháp chẩn đoán trước sinh và chẩn bào chất. Sự tích tụ này để lại ảnh hưởng tiêu cực tới đoán sau sinh. Đối với phương pháp chẩn đoán tế bào, đặc biệt là các tế bào hệ thần kinh [3]. Chính trước sinh, việc chọc dịch ối sau đó thực hiện một vì vậy, nghiên cứu tập trung vào phát hiện đột biến số xét nghiệm di truyền có thể đưa ra chẩn đoán về trên gen ABCD1 nhằm chẩn đoán bệnh loạn dưỡng tình trạng mắc bệnh của thai nhi, tuy nhiên đây là não chất trắng. Quy trình được xây dựng nhằm ứng phương pháp xâm lấn gây ảnh hưởng tiêu cực đến dụng lên các mẫu phôi sinh thiết của những gia đình sức khỏe người mẹ đồng thời phát hiện bệnh ở giai có tiền sử mắc bệnh X-ALD. đoạn muộn [5, 6]. Ngoài ra, một số phương pháp chẩn đoán sau sinh bao gồm việc sàng lọc ở trẻ sơ ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP sinh sử dụng kĩ thuật quang phổ khối kế tiếp (MS/ NGHIÊN CỨU MS) để đo nồng độ 26:0-lyso-PC hay các kĩ thuật Đối tượng nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng như chụp Mẫu máu của một cặp vợ chồng (vợ: N.T.T. – 18 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 26 tuổi; chồng: V.Đ.H. – 28 tuổi) có tiền sử gia biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên exon đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não 1 của gen ABCD1. Đồng thời, thực hiện quy trình chất trắng. Tám mẫu phôi thụ tinh nhân tạo của xác nhận lại đột biến bằng cách khảo sát đột biến cặp vợ chồng đó được nuôi cấy rồi sinh thiết, trên exon 1 gen ABCD1 trên hệ thống ABI 3500 trong đó 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào Genetic Analyzer và đều cho kết quả giống với giải ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6. trình tự thế hệ mới. Đây là một đột biến lặn nên thể Các mẫu được sinh thiết từ 3 đến 5 tế bào phôi đồng hợp tử mang 2 alen đột biến sẽ gây bệnh loạn ngày 5 hoặc ngày 6, rửa phôi bằng dung dịch PBS dưỡng não chất trắng. Ngoài ra, theo thống kê trên 1X + 1% PVP, lấy tế bào phôi vào ống PCR 0,2 ml. ngân hàng dữ liệu đột biến gen ABCD1, đột biến Tổng toàn bộ dung dịch cả tế bào và dung dịch c.854G>C chỉ được ghi nhận 2 lần trong quá khứ môi trường là 4 µl. nên đột biến được xác định ở bệnh nhân này có thể Các loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu đều được coi là xuất hiện lần thứ 3 trong lịch sử nghiên được bảo quản ở nhiệt độ âm. Toàn bộ cam kết liên cứu về bệnh [7]. quan đến mẫu bệnh phẩm và mẫu tế bào phôi sinh Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR: Dựa vào kết thiết cũng như hồ sơ, mô tả chi tiết về nghiên cứu đã quả giải trình tự của bệnh nhân N.T.T. cùng với trình được xét duyệt và thông qua bởi Hội đồng đạo đức tự gen ABCD1 được tham khảo trên ngân hàng trình trong nghiên cứu Y sinh học, Học viện Quân y. tự gen quốc tế GenBank, chúng tôi tiến hành thiết Vật liệu kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng công cụ NCBI Primer- Hóa chất và trang thiết bị: bộ kit tách chiết BLAST và đặt tổng hợp cặp mồi tại hãng Integrated G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON DNA Technologies (IDT), Hoa Kỳ. Cặp mồi nhận Biotechnology – Hàn Quốc); bộ kit REPLI-g® được ở dạng bột đông khô, vì vậy khi sử dụng, mồi Single Cell (QIAGEN – Đức); GoTaq Green sẽ được pha loãng bằng nước khử ion đến nồng độ Mastermix 2X (dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, hoạt động là 10 µM. buffer) (Promega – Hoa Kỳ); Agarose, TBE 1X, Tách chiết ADN từ máu toàn phần: ADN ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp – được tách chiết sử dụng bộ kit G-spinTM Total 1000 bp và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific Extraction của iNtRON Biotechnology: 200 μl – Anh); hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt yêu máu toàn phần được cho vào ống ly tâm 1,5 ml; cầu về kỹ thuật và an toàn phòng thí nghiệm tại thêm 200 μl BL Buffer, 20 μl Proteinase K, 5 μl Labo thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, RNase, trộn đều, ủ ở 56°C trong thời gian 15 Học viện Quân y. phút; thêm 200 μl EtOH 100%, trộn đều; chuyển Phương pháp 800 μl dung dịch từ ống ly tâm 1,5 ml vào cột lọc, Giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột biến: ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút ở 25°C, đổ Mẫu bệnh phẩm của người có tiền sử gia đình mắc dịch; chuyển hết toàn bộ dung dịch còn lại trong bệnh loạn dưỡng não chất trắng (N.T.T.) sẽ được ống vào cột lọc và lặp lại bước trước đó; thêm 700 gửi đi giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột μl Buffer WA vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút biến trên gen ABCD1. Sau khi có kết quả, mẫu sẽ trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; thêm 700 μl Buffer được làm giải trình tự Sanger nhằm xác nhận lại đột WB vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 biến đã được xác định bằng phương pháp NGS. Kết phút ở 25°C, đổ dịch; ly tâm 13000 vòng/phút quả giải trình tự thế hệ mới đã phát hiện được đột trong 1 phút ở 25°C làm khô màng lọc, chuyển TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 19
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG cột lọc sang một ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 85 µl nước khử ion, 0,5 µl mỗi mồi, 4,0 µl dịch ADN μl nước khử ion đã được ủ ở 56°C vào cột lọc, ủ tách chiết. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đơn ở nhiệt độ phòng tối thiểu 5 phút, ly tâm 13000 cặp mồi sẽ được thể hiện ở phần kết quả của quá vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, thu ADN ở ống ly trình tối ưu phản ứng. tâm 1,5 ml. ADN được đo nồng độ và giá trị A260/ Phát hiện đột biến gen ABCD1 bằng phương pháp A280 để kiểm tra chất lượng bằng máy SpectraMax PCR và giải trình tự theo phương pháp Sanger: Sau khi QuickDrop. xác định được nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng Khuếch đại toàn bộ hệ gen của mẫu tế bào phôi sinh PCR sẽ được tiến hành với cặp mồi đã được thiết thiết: Pha dung dịch D2 với tỷ lệ 33 µl Buffer DLB : 3 kế nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến. Sản µl DTT 1M; spin nhẹ các ống chứa tế bào phôi sinh phẩm phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di kiểm thiết và nhỏ lên thành mỗi mỗi ống 3 µl dung dịch tra và tinh sạch nhằm gửi đi giải trình tự Sanger để D2; ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ 65ºC trong khảo sát đột biến trên gen ABCD1. Quá trình này vòng 10 phút; thêm vào mỗi ống 3 µl Stop Solution; đầu tiên sẽ được ứng dụng với mẫu ADN của người spin nhẹ các ống và ủ tại nhiệt độ 4ºC trong vòng ít mẹ (N.T.T.) đã được làm giải trình tự NGS để so nhất là 3 phút; chuẩn bị hóa chất khuếch đại hệ gen sánh kết quả, sau đó mới được ứng dụng lên các theo tỷ lệ thể tích (cho một mẫu) như sau: 9 µl H2O mẫu tế bào phôi sinh thiết. sc, 29 µl REPLI-g Reaction Buffer, 2 µl REPLI-g sc DNA Polymerase; thêm vào mỗi ống chứa mẫu tế KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN bào phôi 40 µl hóa chất khuếch đại hệ gen đã chuẩn Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR bị rồi spin nhẹ, ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ Chúng tôi thiết kế cặp mồi có độ dài là 18 base – 30ºC trong vòng 2 giờ; bất hoạt enzyme REPLI-g độ dài lí tưởng để sử dụng trong nghiên cứu. Đồng sc DNA Polymerase bằng cách ủ mẫu tại nhiệt độ thời chúng tôi áp dụng một số tiêu chí để thiết 65ºC trong vòng 3 phút; mẫu ADN sau khi khuếch kế cặp mồi mong muốn như sau: kích thước sản đại sẽ được pha loãng tới nồng độ hoạt động trong phẩm PCR < 500 bp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của khoảng 2 – 20 ng/µl và kiểm tra nồng độ bằng máy mồi nằm trong khoảng từ 50º - 65ºC, tránh lặp lại SpectraMax QuickDrop. nhiều lần trong trình tự mồi dễ gây bắt cặp nhầm. Tối ưu hóa phản ứng PCR: Dựa và nhiệt độ nóng Qua đánh giá các thông số, chúng tôi sàng lọc kết chảy Tm của cặp mồi đã thiết kế, nghiên cứu thiết lập quả trên hệ thống và lựa chọn cặp mồi sao cho hợp phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi với dải nhiệt lí. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ABCD1 độ dao động quanh giá trị Tm ± 5ºC với tổng thể tích mong muốn là ABCD1F và ABCD1R chúng tôi là 25 µl với 12,5 µl GoTaq Green Mastermix 2X, 7,5 thiết kế sẽ được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Trình tự cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự tính. Trình tự đoạn mồi Kích thước sản phẩm Mã mồi Tm (°C) (F – Forward, R – Reverse) PCR (bp) ABCD1F 5’ - GTG TTC CTC ACG GCC AAC - 3’ 56,6 199 bp ABCD1R 5’ - CTC CCT GCC ACA CGC TTC - 3’ 59 20 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Kết quả tách chiết ADN từ máu toàn phần và kết đến 58ºC và từ 59ºC đến 64ºC, sau đó sản phẩm quả khuếch đại toàn bộ hệ gen mẫu tế bào phôi PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%. sinh thiết Kết quả điện di sản phẩm PCR của phản ứng tối Mẫu bệnh phẩm của người mẹ mang đột biến ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi ABCD1F và (NTT-ABCD1) sau khi tách chiết ADN và đo OD ABCD1R với dải gradient nhiệt độ từ 51ºC đến đạt nồng độ theo yêu cầu là 10,0 ng/µl với chỉ số 64ºC được thể hiện ở hình 1. A260/A280 là 2,0. Mẫu ADN này hoàn toàn đạt chất lượng để được sử dụng trong các bước tiếp theo của quy trình. Tám mẫu tế bào phôi sau khi được sinh thiết được tiến hành khuếch đại toàn bộ hệ gen và pha loãng với tỷ lệ thể tích 10 µl ADN : 200 µl nước khử ion. Kết quả nồng độ ADN các mẫu tế bào phôi sinh thiết sau khi được khuếch đại và pha loãng được thể hiện ở bảng 2. Dựa vào bảng kết quả, các mẫu tế bào phôi sinh thiết đã được khuếch đại hệ gen thành công và nồng độ ADN đã đạt ngưỡng phù hợp để được sử dụng cho các bước tiếp theo trong chu trình. Bảng 2. Kết quả nồng độ ADN sau khi khuếch đại toàn bộ hệ gen các mẫu tế bào phôi sinh thiết. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của phản Mã Nồng độ Mã Nồng độ ứng tối ưu với gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51ºC đến STT STT mẫu (ng/µl) mẫu (ng/µl) 64ºC. M: Thang chuẩn marker (100 bp). 1 TR1 23,5 5 TR5 18,5 Phân tích kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR đơn cặp mồi trên gel agarose 2% (hình 1) cho 2 TR2 21,0 6 TR6 20,3 thấy chỉ có băng sản phẩm với kích thước như tính 3 TR3 21,6 7 TR7 21,2 toán xuất hiện tại nhiệt độ gắn mồi từ 59 đến 61ºC – kích thước khoảng 199 bp. Kết quả điện di thu 4 TR4 19,7 8 TR8 19,4 được tại nhiệt độ gắn mồi 59ºC cho băng sáng rõ nhất, không có sản phẩm phụ và chính vì vậy, nhiệt Kết quả phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi độ 59ºC được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi để Quá trình tối ưu phản ứng PCR sử dụng tiến hành phản ứng PCR cho các bước tiếp theo. mẫu ADN của người mang gen gây bệnh (NTT- Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự kiểm tra ABCD1) làm khuôn để khuếch đại đoạn gen lại đột biến trên mẫu ADN của mẹ ABCD1. Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi Dựa vào nhiệt độ gắn mồi đã được xác định, xuôi và mồi ngược tương ứng là 56,6ºC và 59ºC, tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng chúng tôi tiến hành hai phản ứng PCR độc lập với là ADN của người mẹ mang alen đột biến (NTT- dải gradient nhiệt độ gắn mồi lần lượt từ 51ºC ABCD1) với chu trình nhiệt như sau: 95ºC trong TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 21
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 5 phút, 40 chu kỳ với 94ºC – 30s, 59ºC – 30s, 72ºC quả trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết – 30s, 72ºC trong 5 phút. Sản phẩm PCR được quả giải trình tự bằng phương pháp NGS – nghĩa điện di trên gel agarose 2% trong 25 phút với cường là đều có thể phát hiện đột biến c.854G>C. Từ độ dòng điện trong khoảng 125V và nhuộm với đây chúng tôi kết luận đã xây dựng được quy trình Ethidium bromide. Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến của phản ứng này được thể hiện ở hình 2 cùng với bệnh loạn dưỡng não chất trắng và sẽ ứng dụng kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger. quy trình này lên tám mẫu tế bào phôi sinh thiết đã có sẵn. Kết quả ứng dụng quy trình trên tế bào phôi sinh thiết Phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt đã được sử dụng ở bước trước sẽ được áp dụng cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi đã khuếch đại. Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2% và quan sát dưới ánh đèn tia UV như hình 3. Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng PCR với ADN của 8 mẫu tế bào phôi. M: Thang chuẩn marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1; TR1 – TR8: sản phẩm ADN sau khuếch đại Hình 2. Hình ảnh ứng dụng quy trình phát hiện đột Kết quả điện di sản phẩm ADN của 8 mẫu tế bào biến lên mẫu ADN NTT-ABCD1. (A): Hình ảnh điện phôi sinh thiết nhằm nhân bản đoạn gen ABCD1 di sản phẩm phản ứng PCR, M: Thang chuẩn marker cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại thành công (100 bp); (B): Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen đoạn gen mong muốn. Băng sản phẩm hiện lên sáng được khuếch đại bằng cặp mồi ABCD1F và ABCD1R và rõ ràng tại vị trí tương ứng với kích thước thang của mẫu NTT-ABCD1 chuẩn là khoảng 200 bp, chứng tỏ đoạn nhân lên có kích thước là 199 bp phù hợp như tính toán ban Qua hình ảnh điện di, sản phẩm ADN được đầu. Từ đây, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và giải khuếch đại có kích thước đúng như dự kiến và trình tự Sanger nhằm khảo sát đột biến c.854G>C không xuất hiện băng sản phẩm phụ. Sau đó, sản ở những mẫu phôi sinh thiết. Kết quả giải trình tự phẩm phản ứng PCR được tinh sạch và gửi đi giải được đọc bằng phần mềm BioEdit và được thể hiện rình tự Sanger với cặp mồi thiết kế, và cho ra kết ở bảng 1. 22 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng 1. Tổng hợp kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi TR1 – TR8. Mã Kết quả STT Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger mẫu chẩn đoán Bình thường, 1 TR1 không mang gen gây bệnh Bình thường, 2 TR2 mang gen gây bệnh Bình thường, 3 TR3 mang gen gây bệnh TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 23
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bình thường, 4 TR4 mang gen gây bệnh Bình thường, 5 TR5 không mang gen gây bệnh 6 TR6 Bị bệnh 24 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bình thường, 7 TR7 không mang gen gây bệnh Bình thường, 8 TR8 mang gen gây bệnh Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger mang alen đột biến sẽ tiếp tục được làm các xét cho thấy, trong tổng số 8 phôi sinh thiết sử dụng nghiệm sàng lọc tiền làm tổ (PGS - Preimplanta- trong nghiên cứu, có 3 phôi (37,5%) không mang tion Genetic Screening) để đánh giá chất lượng alen đột biến gây bệnh, 4 phôi (50%) mang alen phôi trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo. Đối đột biến gây bệnh ở thể dị hợp và 1 phôi (12,5%) với mẫu ADN của các phôi TR1, TR5 và TR7 mang alen gây bệnh ở thể bán dị hợp tử. Điều đều có kết quả bình thường và không có alen gây này đã chứng tỏ, những phôi mang alen gây bệnh bệnh sẽ được thực hiện giải trình tự theo phương trong quá trình giảm phân hình thành giao tử đã pháp giải trình tự thế hệ mới để sàng lọc các bất nhận được alen đột biến từ mẹ. Những phôi này thường về nhiễm sắc thể. Kết quả sàng lọc PGS sẽ được đánh giá là không phù hợp để sử dụng cho 3 phôi không mắc bệnh loạn dưỡng não chất cho quá trình chuyển phôi và những phôi không trắng được thể hiện ở hình 4. TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 25
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG đó ở phôi TR5 không phát hiện bất cứ bất thường nào trên bộ 24 nhiễm sắc thể. Vì vậy, chúng tôi đưa ra kết luận phôi TR5 có chất lượng tốt, phù hợp để tiến hành chuyển phôi vào cơ thể người mẹ trong quá trình thụ tinh nhân tạo. KẾT LUẬN Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất trắng và đồng thời ứng dụng được quy trình phát hiện đột biến gen nhằm chọn được phôi thụ tinh nhân tạo không mang alen gây bệnh. Tuy nhiên cần mở rộng thí nghiệm nhằm ứng Hình 4. Kết quả giải trình tự thế hệ mới của quá trình dụng quy trình cho các thành viên khác trong đại sàng lọc tiền làm tổ bộ nhiễm sắc thể của 3 mẫu tế bào gia đình giúp chẩn đoán bệnh cho các phôi của phôi. (A): Kết quả của mẫu TR1; (B): Kết quả của các cặp vợ chồng khác bởi đột biến này có thể di mẫu TR5; (C): Kết quả của mẫu TR7 truyền cho nhiều thành viên từ đó luôn tồn tại khả Với kết quả giải trình tự như trên, bằng việc sử năng sinh con mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng dụng các công cụ tin sinh cũng như thống kê sinh mang đột biến c.854G>C. Cần nghiên cứu mở học, có thể nhận thấy rằng cả hai phôi TR1 và TR7 rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các đều có bất thường về bộ nhiễm sắc thể, cụ thể hơn đột biến khác trên gen ABCD1 và có thể nghiên phôi TR1 có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình số 11, còn phôi TR7 có bất thường về số lượng ở cho các đột biến liên quan đến các bệnh hiếm di những nhiễm sắc thể 2, 4, 6, 8, 11, 11, 18, trong khi truyền đơn gen khác. ABSTRACT Establishment of the procedure to detect ABCD1 gene mutations related to X-linked Adrenoleukodystrophy Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare sex-linked recessive disorder that disrupts adrenal gland function, the spinal nerves, and the white matter of the nervous system. According to recent epidemiological statistics, this disease affects 1 in 15,000 people, however, the actual incidence rate is estimated to be much higher with the combined application of modern genetic techniques used for early diagnosis. The earlier the diagnose of the disease, the safer and the more active for families with a history of X-ALD to develop plans for childbirths and treatments of disease's symptoms. Therefore, in this study, we developed an early pre- implantation diagnosis process to help families with the background of having the disease but wish to have healthy children. By combining the use of sequencing methods, especially Next-Generation Sequencing (NGS) and Sanger sequencing with other molecular techniques such as PCR, we were able to develop a procedure to detect mutations on the ABCD1 gene which is involved in the disease. We then applied this 26 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG procedure to the family's biopsied embryonic cells with the disease in order to screen for embryos that do not carry alleles that cause X-ALD. The results of the study showed that we were able to detect mutant alleles in 5/8 embryos (62.5%) while the remaining 3 embryos (37.5%) did not carry mutant alleles; therefore, these 3 embryos could further be used in pre-implantation screening tests during in-vitro fertilization. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ashrafi M. R., M. Amanat, M. Garshasbi, R. Kameli, Y. Nilipour, M. Heidari, Z. Rezaei and A. R. Tavasoli (2020), “An update on clinical, pathological, diagnostic, and therapeutic perspectives of childhood leukodystrophies”, Expert Review of Neurotherapeutics, 20(1), pp. 65-84. 2. Engelen M., S. Kemp, M. De Visser, B. M. van Geel, R. J. Wanders and P. Aubourg (2012), “X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD): clinical presentation and guidelines for diagnosis, follow-up and management”, Orphanet journal of rare diseases, 7(1), pp. 51. 3. Kemp S. (2014), Molecular Genetics of X-linked Adrenoleukodystrophy, eLS, pp. 4.KempS.,I.C.Huffnagel,G.E.Linthorst,R.J.WandersandM.Engelen(2016),“Adrenoleukodystrophy– neuroendocrine pathogenesis and redefinition of natural history”, Nature Reviews Endocrinology, 12(10), pp. 606-615. 5. Lan F., Z. Wang, L. Ke, H. Xie, L. Huang, H. Huang, X. Tu, D. Zheng, J. Zeng and H. Li (2010), “A rapid and sensitive protocol for prenatal molecular diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy”, Clinica Chimica Acta, 411(23-24), pp. 1992-1997. 6. Maier E. M., A. A. Roscher, S. Kammerer, K. Mehnert, E. Conzelmann and A. Holzinger (1999), “Prenatal diagnosis of X‐linked adrenoleukodystrophy combining biochemical, immunocytochemical and DNA analyses”, Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis 19(4), pp. 364-368. 7. Moser A. B., N. Kreiter, L. Bezman, S. E. Lu, G. V. Raymond, S. Naidu and H. W. Moser (1999), “Plasma very long chain fatty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls”, Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association the Child Neurology Society, 45(1), pp. 100-110. 8. Mosser J., A.-M. Douart, C.-O. Sarde, P. Kioschisi, R. Feil, H. Moser, A.-M. Poustka, J.-L. Mandel and P. Aubourgi (1993), “Adrenoleukodystrophy gene shares unexpected homology”, Nature, 361(pp. 25. 9. Turk B. R., C. Theda, A. Fatemi and A. B. Moser (2020), “X‐linked adrenoleukodystrophy: Pathology, pathophysiology, diagnostic testing, newborn screening and therapies”, International Journal of Developmental Neuroscience, 80(1), pp. 52-72. 10. Zhu J., F. Eichler, A. Biffi, C. N. Duncan, D. A. Williams and J. A. Majzoub (2020), “The Changing Face of Adrenoleukodystrophy”, Endocrine Reviews, 41(4), pp. 1-17. TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 27

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.