CHẨN ĐOÁN VI SINH TRONG THỰC HÀNH VIÊM PHỔI
Phạm Hùng Vân
Quệt MŨI SAU Phát hiện virus
QUYỆT HỌNG Không ý nghĩa
CẤY DNT
ĐÀM hay BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM Màng não
CẤY MÁU Máu
Màng phổi
DỊCH MÀNG PHỔI
Bệnh phẩm đàm
Lấy đàm ngay khi có thể Phải hướng dẫn bệnh nhân súc miệng
bằng nước sạch
Phải hướng dẫn bệnh nhân khạc đàm
sau một hơi hít thật sâu
Tránh lấy nước bọt, dịch nhầy cổ họng
Dùng phương tiện thích hợp để cho bệnh nhân lấy đàm
Dễ cho đàm vào, Đánh giá được mẫu đàm, Tránh ngoại nhiễm,an toàn
Lấy đàm ở người không khạc được đàm
Khí dung NaCl 2-4%
NTA (Naso Tracheal Aspirate)
Lấy qua chổi bảo vệ
Dịch rửa khí phế quản
Chuyên chở và lưu giữ mẫu đàm
Đàm lấy xong phải chuyển ngay đến
phòng thí nghiệm
Ngay sau khi có mẫu đàm, phải tiến hành khảo sát vi sinh ngay, không chậm trễ
Nếu không khảo sát ngay, giữ trong tủ mát nhưng không quá 2 giờ kể từ khi lấy mẫu
Khảo sát vi thể mẫu đàm
Đánh giá độ tin cậy dựa trên phết
Bạch cầu > 25, biểu mô < 10: TIN CẬY
Gram: quan sát quang trường x100 •
Bạch cầu > 25, biểu mô > 10: TIN CẬY VỪA
•
•
Bạch cầu < 25, biểu mô > 10: KHÔNG TIN CẬY Đánh giá tác nhân gây bệnh: quan sát
vùng bạch cầu
Mẫu tin cậy vừa:
Mẫu không tin cậy:
Nhiều TB bạch cầu Nhiều TB biểu mô
Không thấy TB bạch cầu Tế bào biểu mô >10
Mẫu tin cậy:
Mẫu tin cậy:
Nhiều TB bạch cầu Tế bào biểu mô <10
Nhiều TB bạch cầu Không có TB biểu mô
Song cầu Gram [-] giống M. catarrhalis
Song cầu Gram [+] giống S. pneumoniae
Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H. influenzae
Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H. influenzae
Tröïc khuaån Gram [-] lôùn
Kết quả Gram phát hiện > 1 loại vi khuẩn Vd:
• Song cầu Gram [+] • Trực khuẩn Gram [-] • Trực khuẩn Gram [+]
Quan sát nhầm vùng tế bào biểu mô
Cấy đàm tại phòng thí nghiệm
Tủ ấm CO2
Tủ ấm thường
Đủ các loại môi trường, vật liệu 1. Phân lập vi khuẩn khó mọc
BA máu cừu CA có bacitracin
2. Phân lập vi khuẩn Gram [-]
MC
Kính hiển vi
3. Môi trường định danh 4. Môi trường kháng sinh đồ 5. Đĩa kháng sinh 6. Phương tiện là MIC
Thách thức trong cấy đàm
Có nhiều loại
là vi khuẩn gây bệnh là khó mọc, do vậy phải cấy ngay và có đủ các loại môi trường cần thiết
Phải bắt được vi khuẩn gây bệnh từ mẫu tạp nhiễm, do vậy phải lấy đúng bệnh phẩm và phải đánh giá để chọn đúng vi khuẩn gây bệnh mọc trên mặt thạch phân lập
? ?
? ?
Chọn đúng vi khuẩn gây bệnh
Nguyên tắc chọn VK gây bệnh
Ưu tiên 1: Chọn vi khuẩn phù hợp với hình ảnh vi khuẩn thấy trong vùng bạch cầu của phết nhuộm Gram mẫu đàm Ưu tiên 2: Chọn vi khuẩn ưu thế (định
lượng hay bán định lượng
Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều nhưng cũng có thể không phải là vi khuẩn gây bệnh mà chỉ là VK quần cư, vi khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết α)
Cấy đàm định lượng
Mẫu đàm được pha loãng trong dung
dịch tan đàm rồi cấy định lượng
Xác định tác nhân gây bệnh dựa vào
định lượng • ≤ 104/ml Tạp nhiễm • ≥ 105/ml Tác nhân gây bệnh
Mẫu lấy qua chổi bảo vệ
• ≥ 103/ml Tác nhân gây bệnh
Lưu ý: Vi khuẩn tạp nhiễm vùng hầu họng ở mẫu tin cậy vừa hay không tin cậy có thể có số định lượng ≥ 105/ml. Do vậy phải khảo sát trực tiếp xem vi khuẩn quanh vùng bạch cầu
Cấy đàm bán định lượng
Mẫu đàm được cấy
phân lập 3 chiều trên môi trường phân lập Chọn khúm vi khuẩn mọc trên vùng thứ 4 hay vùng thứ 3
Lưu ý: Vi khuẩn tạp nhiễm vùng hầu họng ở mẫu tin cậy vừa hay không tin cậy có thể mọc đến vùng thừ 4. Do vậy phải khảo sát trực tiếp xem vi khuẩn quanh vùng bạch cầu
Tá nhân vi khuẩn gây CAP và CAP/COPD Kết quả nuôi cấy mẫu đàm 271 bệnh nhân
12,18
11,81
9,59
7,75
5,17
2,95
2,58
2,21
1,11
1,11
0,74
0,37
0,37
CAP, community-acquired pneumonia; COPD, chronic obstructive pulmonary disease; GAS, Streptococci Group A; GBS, Streptococci Group B; GNR, Gram-negative rod; MTB, M. tuberculosis; SAU, S. aureus; MRS, methicillin resistant S. aureus; SCN, S. epidermidis.
Van PH, et al. Vietnam Pulmonary Society. REAL STUDY 2016-2017. Medical News – Practical Respiratory 2018;3:51–63.
Tác nhân vi khuẩn gây CAP ở trẻ em Results from culture
Bui Le Huu Bích Van (2015)1
Luận văn thạc sĩ. Đối tượng: 32 bệnh nhi CAP không đáp ứng điều trị KS bước đầu nhập viện NĐ1. Bệnh phẩm: NTA tin cậy 6 (18.75%) cấy [+] (K. pneumoniae: 2, E. coli: 1, P. aeruginosa: 1, H. influenzae: 1, E. faecium: 1)
Trần Quang Khải (2016)2
Luận văn thạc sĩ. Đối tượng: 66 bệnh nhi viêm phổi thùy. Bệnh phẩm: NTA tin cậy Tất cả [−] với nuôi cấy
Ngô Chí Thịnh (2017)3
CAP, community-acquired pneumonia; NTA, naso-tracheal aspirate.
1. Unpublished data based on thesis report by Bui Lê Hữu Bích Vân, et al, 2015. 2. Unpublished data based on thesis report by Trần Quang Khải, et al, 2016. 3. Unpublished data based on thesis report by Ngô Chí Thịnh, et al, 2017.
Luận văn CKII. Đối tượng: 48 bệnh nhi viêm phổi nặng không đáp ứng KS điều trị. Bệnh phẩm: NTA tin cậy Tất cả [−] với nuôi cấy
Tác nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng DỮ LIỆU TỪ ANH & BỈ
Tác nhân Cộng đồng Bệnh viện ICU
Tại UK Finch R. Clin. Microbiol. Inf. 2001; 7(suppl3): 30-38
(n=336) (n=1137) (n=185)
S. pneumoniae 36.0 39.0 21.6
H. influenzae 10.2 5.2 3.8
M. pneumoniae 1.3 10.8 2.7
Virus 13.1 12.8 9.7
Tại Bỉ Ieven et al. ECCMID 2004
(n=44) (n=103)
S. pneumoniae 27.3 35.0
H. influenzae 2.3 4.8
M. pneumoniae 18.2 6.8
Virus 12.2 16.7
TÁC NHÂN VI SINH VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG
Legionella
Khác H. influenzae
C. pneumoniae M. pneumoniae S. pneumoniae M. catarrhalis
16%
6%
40%
10%
7%
1%
20%
S. pneumoniae và H. influenzae là vk hàng đầu gây nhiễm trùng hô hấp
Reimer and Carroll. Clin Infect Dis. 1998;26:742-748. Marrie. Infect Dis Clin North Am. 1998;12:723-740. Bartlett et al. Clin Infect Dis. 1998;26:811-838.
Nhiễm trùng hô hấp dưới TÁC NHÂN VI SINH CHỦ YẾU?
Các tác nhân vi khuẩn cộng đồng như PNE, HIN không phải là các nhân vi sinh chủ yếu gây bệnh?
Tại sao nuôi cấy vi sinh thất bại?
LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI Lý do chủ quan khó khắc phục
Tác nhân thường gặp lại khó nuôi cấy (S. pneumoniae, H. influenzae), đòi hỏi các môi trường phân lập ít có sẵn
Mẫu không tin cậy do lẫn nước bọt
(tạp khuẩn hầu họng)
Bệnh phẩm ít được cấy ngay do chậm gửi đến PTN, do không được cấy ngay Không biết cách đánh giá kết quả nuôi
cấy để chọn đúng VK gây bệnh
Expert opinion of speaker.
LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI Lý do khách quan không thể khắc phục
Bệnh nhân dùng kháng sinh trước nên các vi khuẩn này không còn sống trong mẫu đàm (nhưng vẫn còn trong các dịch lót phế nang hay mô phổi)[1]
Tác nhân không nuôi cấy được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng (vi khuẩn không điển hình, virus)[1]
Blood culture (only 14% positive)[2]
1. Expert opinion of speaker. 2. Luna HIR, et al. The Ochsner Journal 2001;3:85-93.
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VẪN NHIỀU HẠN CHẾ
Phát hiện kháng nguyên hòa tan VK gây bệnh (như S. pneumoniae, L. pneumophila) trong nước tiểu: Độ nhạy thấp[1]
Phát hiện kháng nguyên trong mẫu đàm, quyệt mũi sau bằng ELISA, MDHQ: Phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Độ nhạy thấp[2]
Huyết thanh học tìm kháng thể đặc hiệu phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Nếu là IgG thì phải huyết thanh kép cách 10 ngày; nếu là IgM thì phải có giá trị cắt và tùy chất lượng kit[2]
Expert opinion of speaker.
ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IgG, immunoglobulin G; IgM, immunoglobulin M.
1. Horita N, et al. Respirology 2013;18:1177–1183. 2. Torres A, et al. Eur Respir J 2016;48:1764–1777.
Cấy máu Thách thức trong cấy máu
Không phải tất cả mọi trường hợp CAP đều
cấu máu [+] (Tối đa chỉ 14-16%)
Coi chừng ngoại nhiễm. Kết quả [+] trong 24 giờ, hay cả 2 chai cấy cùng [+] một loại VK thường ít khi là ngoại nhiễm
Nguyên tắc PCR cơ sở của độ nhạy và độ đặc hiệu tuyệt vời
ADN đích
4
1
PCR
1 Biến tính (94o C)
Nuôi cấy
2
2 Bắt cặp
(55-65o C)
PCR chính là nuôi cấy nhưng là nuôi cấy đoạn gen của VSV nên PCR đặc hiệu không khác nuôi cấy
PCR đạt độ nhạy phát hiện một mãnh NA của VSV có trong mẫu nhờ nguyên tắc khuếch đại NA từ một thành hàng tỷ rồi mới phát hiện
3
3 Kéo dài (72o C)
Taq polymerase
Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học quyết định bởi bộ gen
n
Xác định dựa vào kích thước hay trình tự đoạn gen
PCR, polymerase chain reaction; DNA, deoxyribonucleic acid; RNA, ribonucleic acid; RTPCR, reverse transcription polymerase chain reaction.
Expert opinion of speaker.
“Streamline” Real-time PCR MÔ HÌNH DÀNH CHO PHÒNG THÍ NGHIỆM LÂM SÀNG
CÁC BP KHÁC NHAU (Máu, mô, đàm, mủ, dịch cơ thể)
# 1 h r 3 0
TÁCH CHIẾT DNA/RNA NKDNARNAprep-MAGBEAD Một bộ thuốc thử cho DNA và RNA Chỉ 5 bước thực hiện Độ nhạy gấp 100 lần thủ công Tương thích cho KingFisher
tách chiết DNA/RNA Các thiết bị KingFisher
REAL-TIME PCR/RTPCR NKReal-time PCR/RTPCR kit
# 2 h r 3 0
Chọn lựa tuỳ tác nhân Chứng nội kiểm soát chất ượng Cùng một chương trình real-time Tương thích nhiều máy real-time
PCR, polymerase chain reaction; DNA, deoxyribonucleic acid; RNA, ribonucleic acid; RTPCR, reverse transcription polymerase chain reaction.
Expert opinion of speaker.
Real-time PCR Các thiết bị Real-time PCR
Real-time PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY VIÊM PHỔI
Mẫu thử ĐÀM
Xác định tác nhân dựa vào KQ định lượng
Tách chiết NA
Thực hiện Real-time PCR
VIRUS
VK không điển hình
Vi khuẩn điển hình VK không điển hình Virus M. tuberculosis VK Candida, Aspergillus cộng đồng P. carinii, P. jiroveci
≥105/ml Có phát hiện Có phát hiện Có phát hiện VK Ghi nhận số lượng VI NẤM Bệnh viện Ghi nhận số lượng
L. pneumophila M. pneumoniae C. pneumoniae B. pertussis B. parapertussis C. Trachomatis
S. aureus (MR, MS) S. epidermidis E. faecalis, E. faecium E. coli, K. pneumoniae P. aeruginosa A. baumannii E. cloacae
Influenzavirus A, B, C Parainfluenzavirus 1, 2, 3 Rhinovirus RSV, Measle Adenovirus
S. pneumoniae H. influenzae M. catarrhalis S. pyogenes S. agalactiae S. suis H. influenzae b
C. albican, C. tropicalis C. parapsilosis C. krusei, C. glabrate A. fumigatus, A. niger, A. terrus, A. flavus P. carinii P. jiroveci
M. tuberculosis
PCR, polymerase chain reaction; RSV, respiratory syncytial virus; MR, methicillin resistant; MS, methicillin sensitive; CA, community-acquired; NA, nucleic acid.
CAP và CAP/COPD người lớn nhập viện KẾT QUẢ NUÔI CẤY VS REAL-TIME PCR ĐÀM
34,32
Nghiên cứu REAL 2016-2017 (N-271). Website HHH TP.HCM
Van PH, et al. Vietnam Pulmonary Society. REAL STUDY 2016-2017. Medical News – Practical Respiratory 2018;3:51–63.
20,3
Real-time PCR
Culture [+] (loại bỏ thường trú) 42.1% Predominant pathogens
Gram-negative rods
Nuôi cấy
12,18
11,81
11,44
10,7
9,59
Real-time PCR [+] Predominant pathogens
7,75
6,64
69% S. pneumoniae H. influenzae
6,27
5,17
4,4
2,96
2,95
2,95
2,95
2,58
2,21
1,85
1,48
1,48
1,48
1,11
1,11
1,11
0,74
0,74 0,74
0,37
0,37 0,74
0,37
0,37
Trẻ em CAP thất bại KS ban đầu Real-time PCR results (culture [+] : 18.75%)
Multi-pathogens are predominant (N=32)
Pathogens
%
Pathogens
%
M. pneumoniae 3.13 S. pneumoniae 34.38
B. pertussis 3.13 S. pneumoniae + M. pneumoniae 15.63
RSV 3.13 S. pneumoniae + virus 3.13
E. coli 3.13 S. pneumoniae + virus + HA 12.52
K. pneumoniae 3.13 H. influenzae 3.13
PCR, polymerase chain reaction; CAP, community-acquired pneumonia; HA, hospital bacteria; RSV, respiratory syncytial virus.
Unpublished data based on thesis report by Bui Lê Hữu Bích Vân, et al, 2015.
(-) 12.50 H. influenzae + HA 3.13
Viêm phổi thùy ở trẻ em Real-time PCR results (culture [+]: 0%)
Multi-pathogens are predominant (N=66)
Pathogens
%
Pathogens
%
MTB
1.52
SP + HI + MC + MP
1.52
MP
37.88
SP + HI
4.55
SP
13.64
SP + HI + MC
3.03
SP + MP
22.73
HI + MP
1.52
SP + MP + MTB
1.52
HI
1.52
SP + MC + MP
3.03
SP + HA
1.52
(-)
4.55
HA, hospital bacteria; HI, H. influenzae; MC, M. catarrhalis; MP, M. pneumoniae; MTB, M. tuberculosis; SP, S. pneumoniae; PCR, polymerase chain reaction.
Unpublished data based on thesis report by Trần Quang Khải, et al, 2016.
Viêm phổi nặng ở trẻ em REAL-TIME PCR RESULTS (culture+: 0%)
Pathogens
Pathogens
%
%
ADE PNE+pINF3 4.17 2.08
RSV PNE+RSV 4.17 2.08
pINF3 PNE+ADE 2.08 2.08
Multi-pathogens are predominant
MP PNE+ECO 4.17 2.08
PNE PNE+KLP 29.17 2.08
PNE+MP PNE+HI 16.67 10.42
PNE+MP+ECO 2.08 2.08 PNE+HI+MP
PNE+MP+pINF1 2.08 2.08 PNE+HI+MC+MRSA
Ngô Chí Thịnh. CK. II thesis 2017
PNE+MP+pINF3 2.08 8.33 (-)
CAP ở người lớn ngoại trú Real-time PCR vs. culture (cultured pathogens)
65,95
63,79
58,62
PCR Cấy Cultured
N=232
)
%
S. epidermidis
S. pneumoniae SP H. influenzae HI M. catarrhalis MC GAS Streptococci Group A GBS Streptococci Group B H. influenzae type b Hib SAU S. aureus SE Efecl E. faecalis
P. aeruginosa Pseudomonas sp. A. baumannii
Eaero E. aerogenes E. cloacae Eclo E. coli Eco KLP K. pneumoniae Eagg E. agglomerans Pmira P. mirabilis PSA PS? AB Fungi
29,31
( s n e g o h t a P
Real-time PCR [+] Nuôi cấy [+] Real-time PCR kết hợp nuôi cấy
92.7% 82.8% 94.0%
11,64
9,48
9,48
7,33
7,76
6,90
3,88
6,03
2,16
2,59
2,16
0,86
2,59
2,16
1,72
1,72
0,86
0,86
0,43
0,86 2,59 0,43
0,86 0,43
0,43
0,43
CAP, community-acquired pneumonia; PCR, polymerase chain reaction.
Vietnam Pulmonary Society (2018). Van PH. EACRI Study 2017-2018, unpublished data.
CAP ở người lớn ngoại trú Real-time PCR results (tác nhân không nuôi cấy được)
Case with virus [+] Case with atypical bacteria [+]
27.2% 10.8%
11,21
)
%
7,76
Mycoplasma MY M. pneumoniae MP BP B. pertussis FluA Influenza virus A FluB Influenza virus B Para1 Parainfluenza 1 Para3 Parainfluenza 3 Rhino Rhinovirus RSV Respiratory syncytial virus hMPV Human metapneumovirus Adeno Adenovirus
N=232
( s n e g o h t a P
4,31
3,88
2,59
2,59
1,72
1,29
1,29
0,86
0,86
MY
MP
BP
FluA
FluB Para1 Para3 Rhino RSV hMPV Adeno
Vietnam Pulmonary Society 2018. Van PH. EACRI Study 2017-2018, unpublished data.
CAP, community-acquired pneumonia; PCR, polymerase chain reaction.
CAP ở người lớn ngoại trú Real-time PCR and culture
Mono Bacteria
2.16 SP+CA
1.29 SP+HI+CA
5.17
Mono Virus
3.45 SP+HI+Virus
8.19
2.59 SP+Virus
Mono SP
2.16 SP+HI+CA+Virus
0.86
5.17 SP+CA+Virus
Mono HI
0.86 SP+HI+CA+HA
4.31
7.76 SP+Virus+Fungi
SP+HI
0.43 SP+HI+CA+Virus+HA 1.72
20.69 SP+Fungi
HI+Virus
0.43 SP+HI+Fungi
0.43
1.72 SP+CA+Virus+HA
HI+CA
1.29 SP+HI+CA+Fungi
0.43
3.02 SP+HA
Multi-pathogens are predominant
HI+CA+Virus
0.43 SP+HI+HA
7.33
0.43 SP+HA+Fungi
HI+CA+HA
1.29 SP+HI+HA+Fungi
0.43
0.43 SP+Virus+HA
HI+HA
0.43 HA
0.86
1.72 SP+Virus+HA+Fungi
HI+HA+Fungi
0.43 HA+Fungi
1.29
0.86 CA+Fungi
HI+Virus+HA
0.86 HA+Virus
0.43
1.29 CA+HA
Virus+Fungi
0.43 HA+Virus+Fungi
0.43
0.43 CA+Virus+HA
Negative
6.03
% values
CAP, community-acquired pneumonia; PCR, polymerase chain reaction; HI, H. influenzae; SP, S. pneumoniae; CA, community bacteria (M. catarrhalis, M. pneumoniae); HA, hospital bacteria (Gram [-],Gram[+]).
Vietnam Pulmonary Society (2018). Van PH. EACRI Study 2017-2018, unpublished data.
Phát hiện tác nhân vi sinh gây CAP Vai trò xét nghiệm vi sinh
Các phương pháp vi sinh kinh điển có những giới hạn khó hay không thể khắc phục. Các phương pháp miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao1
Các phương tiện như định danh/KSĐ tự động, MALDI-TOF không giúp để cải thiện các hạn chế này1
Real-time PCR là giải pháp tốt nhất vì làm tăng chất lượng và số lượng phát hiện tác nhân vi sinh gây bệnh và phù hợp với điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm vi sinh bệnh viện hiện nay1,2
1. Expert opinion of speaker. 2. Templeton KE, et al. Clinical Infectious Diseases 2005;41:345–351.
ATB, antibiotic; CAP, community-acquired pneumonia; PCR, polymerase chain reaction; MALDI-TOF, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight.
Phát hiện tác nhân vi sinh gây CAP Vai trò xét nghiệm vi sinh
Bệnh phẩm
o Đàm, NTA, dịch rửa phế quản o Giữ lạnh được trong 24 hrs o Giữ lâu hơn ở -18 đến -20oC o Dễ chuyên chở
Kết quả trong 1 ngày
Giúp lâm sàng điều chỉnh KS ban đầu nhanh chóng, nhiều khi giúp cho kháng sinh trúng đích ngay từ đầu
CAP, community-acquired pneumonia; NTA, naso-tracheal aspirate.
Expert opinion of speaker.
Kết quả có giúp chọn KS điều trị?
S. pneumoniae kháng macrolide, bactrim, cephalo 2rd
Nếu [+] tác nhân vi khuẩn cộng đồng • HIN và M. catarrhalis thường tiết β-lactamase •
Nếu [+] tác nhân atypical • Macrolide, fluoroquinolone
ĐIỀU TRỊ TRÚNG ĐÍCH NGAY TỪ ĐẦU
Nếu [+ tác nhân bệnh viện
S. aureus, SCN: tye lệ cao MRSA, MSSA E. coli, K. pneumoniae: ESBL A. baumannii: XDR P. aeruginosa: MDR
• • • •
