ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN Ở BỆNH NHI BETA-THALASSEMIA MIỀN BẮC VIỆT NAM
Nguyễn Hoàng Nam, Dương Bá Trực
1
Bệnh viện Nhi trung ương
HNNKTQ TpHCM 30/11-1/12-18
ĐẶT VẤN ĐỀ
• Beta-thalassemia là bệnh di truyền phổ biến ở Việt Nam, do giảm hay không tổng hợp được mạch beta globin của Hb, do đột biến gen beta-globin.
• Nghiên cứu về đột biến gen beta-globin gây beta-
thalassemia giúp ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh.
• Mục tiêu nghiên cứu:
“ Nghiên cứu một số đặc điểm đột biến gen beta-globin ở
bệnh nhân beta-thalassemia phía bắc Việt Nam ”
2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu
• 104 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán : 55 là beta-
thalassemia,
49 là beta-thalassemia / HbE vào Bệnh viện Nhi trung ương.
• Tuổi - Dưới 5 tuổi
: 89 (85,6%), trong đó < 1 tuổi 50 (44,4%)
- Từ 5-10 tuổi
: 12 (11,5%)
- Từ 10-15 tuổi : 3 ( 2,9%)
• Giới : Nam / Nữ : 59/45 (1,3/1)
• Dân tộc
- Kinh
: 71 (68,3%), - Ít người gồm Thái, Tày,
Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bố Y : 33 (31,7%).
• Địa phương : Hà Nội và 28 tỉnh thành miền bắc.
3
Phương pháp nghiên cứu
• Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang. bằng các kỹ thuật
• Phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, BVNTƯ :
lâm sàng và xét nghiệm, tại BVNTƯ
- Tách DNA từ máu ngoại biên với bộ kít QIA gen DNA của Đức. - Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến điểm
thường gặp ở Châu Á là CD41/42, CD17, IVS1-1, -28,
IVS2-654, CD71/72, IVS1-5, CD95, CD26 (HbE).
4
- Giải trình tự gen khi không thấy đột biến với Multiplex ARMS-PCR - Sử dụng kỹ thuật GAP-PCR để phát hiện đột biến xóa đoạn nếu cần.
Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin
Bệnh nhân β-thalassemia
Thu thập mẫu máu và tách DNA
Phát hiện đột biến gen bằng Multiplex PCR và ARMS-PCR
Có đột biến gen
Không thấy đột biến gen
Giải trình tự gen
Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử
Có đột biến gen
Phát hiện đột biến xóa đoạn bằng GAP- PCR
Một số đột biến gen -globin phát hiện bằng kỹ thuật ARMS
1 2 3 4 5 6 7 8
654
Nội kiểm -28 17
Nội kiểm
43 71-72
Panel 2: 7-8 7: Di hợp tử IVS 2-654 8: Mẫu nội kiểm không DNA
Panel 1: 1-6 1: Dị hợp tử -28 2: Dị hợp tử kép -28/71-72 3: Dị hợp tử Codon 17 4: Dị hợp tử Codon 43 5: Thang DNA 100 bp 6: Mẫu nội kiểm không DNA
Phân tích đột biến gen theo chức năng và vị trí
ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+- thalassemia)
- Vùng khởi động (promotor) - Vị trị 5’UTR (5’ - Vùng không phiên mã)
7
ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA (Kiểu hình β+ hay β0-thalassemia)
- Vị trí nối (splice junction) - Vị trí nối đòng thuận (consensus splice site) - Exon - Intron - Vị trí 3’UTR. ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0-thalassemia) - Codon khởi đầu (Initiation Codon) - Codon vô nghĩa (Nonsense Codon) - Dịch khung (Frameshift)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN GÂY BETA-THALASSEMIA Đã phát hiện 208 alen đột biến gen ở 104 bệnh nhân β-thalasemia
Kiểu hình
Tỷ lệ %
Đột biến gen β – globin ở β – thalassemia CD 41/42 (-TCTT) CD 17 (AA – TAG) CD 26 (GAG – AAG)
CD 71/72 (+ A) IVS 2 -654 (C – T) - 28 (A – G) - 88 (C – T) CD95 (TAC – TAA) IVS 1 – 1 (G – T) IVS 1- 5 (G – C)
β0 β0 HbE β0 β+ β+ β++ β0 β0 β0 β+
Các đột biến hiếm gặp c-140 (C – T) c-441-c442 ins AC 2.3kb – deletion Tổng
Số alen đột biến 63 62 49 10 6 6 3 2 2 2 3 1 1 1 208
30,3 30,0 23,5 4,8 2,9 2,9 1,4 1,0 1,0 1,0 1,4 0,5 0,5 0,5 100
Các đột biến gen β -globin phát hiện ở 104 bệnh nhân
Phân bố đột biến gen beta-globin theo dân tộc
Kinh
Tày
Thái
Đột biến gen β – globin
Khác (Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bổ Y)
% 25 25 50
% 50 30 5 5
5
% 18,2 40,9 13,7 4,5 4,5 9,1
CD41/42 CD17 CD26 CD71/72 IVS 2-654 - 28 - 88 CD95 IVS 1-1 I VS 1-5 Đột biến hiếm gặp Cộng
n 43 41 33 8 5 3 3 2 2 1 1 142
% 30,3 29,9 23,2 5,6 3,5 2,1 5,6 1,4 1,4 0,7 0,7 100
n 10 6 1 1 0 1 0 0 0 0 1 20
5 100
n 6 6 12 0 0 0 0 0 0 0 0 24
n 4 9 3 1 1 2 0 0 0 1 1 22
4,5 4,5 100
100
Tần số các đột biến gen beta-globin ở β-thalassemia tại Việt Nam
Miền Bắc
Miền Bắc 2.000
Miền Trung 2013
Miền Nam 2002
Miền Nam 1988
Đột biến
[Saovaros, và cs.]
[Hảo LT. và cs.]
[Triết LPM.]
[Filon, Trực, cs.]
(Nghiên cứu này)
34,5% 48,3% - 3,5% 13,8%
30,3% 30,0% 23,5% 4,8% 2,9% 2,9% 1,4% 1,0% 1,0% 1,0% 0,5% 0,5% 0,5% -
+ + + - - - - - + - - - - -
35,7% 25% - 7,3% 7,3% 7,3 - - 6,0% - - - - 11,8%
CD41/42 CD17 CD26 CD71/72 IVS 2-654 -28 -88 CD95 IVS 1-1 IVS 1-5 c-140 c441-c442 ins AC 2.3 kb deletion Khác
43.5% 13.0% - 8.7% 13.0% - - - 4.4% - - - - 17.4%
- - - - - - - -
Phân bố đột biến gen β– thalassemia phổ biến ở Châu Á
*Việt Nam [Nghiên cứu này]
*Các nước khác [Southat F.2011]
Nhận xét: Các đột biến phổ biến ở Việt Nam khá giống với Trung Quốc,Thái Lan: giống một phần với Myanma, Indonesia, Malaysia.
Tần xuất đột biến Beta Thalassemia phổ biến ở các nước châu âu và địa trung hải
Quốc gia
Đột biến
Quốc gia
Đột biến
Pháp
Italia
Tây Ban Nha
Hy Lạp
Bồ Đào Nha
Cyprus
95,70%
Sardinia
Vương Quốc Anh
41,00% CD39 C – T IVS 1-110 G – A 23,50% IVS 1-6 T – C 10,10% 10,10% IVS 1-1 G – A IVS 1-110 G – A 43,10% 20,90% CD39 C – T 13,50% IVS 1-1 G – A 8,60% IVS 1-6 T – C IVS 1-110 G – A 78,40% IVS 1-6 T – C 6,40% IVS 2-745 C – G 5,70% CD39 C – T CD39 C – T CD6 – A IVS 2-745 C – G
41,90% CD39 C – T IVS 1-110 G – A 25,70% 10,50% IVS 1-1 G – A 8,60% IVS 1-6 T – C CD39 C – T 50,00% IVS 1-110 G – A 16,50% 12,60% IVS 1-6 T – G 11,50% IVS 1-1 G – A 37,30% CD39 C – T IVS 1-1 G – A 21,00% 19,00% IVS 1-1 T – C IVS 1-110 G – A 11,50% 34,80% CD39 C – T 13,00% CD 121 G – A 8,70% IVS 1-1 G – A 8,70% CD5 – CT
Phân bố đột biến gen β -globin theo vị trí
Exon 1 (30%)
Exon 2(59,6%)
Intron 1 (1,9%)
Intron 2 (2,9%)
Vùng khởi động (4,3%)
Đột biến khác (1,4%)
Phân bố các đột biến gen β-globin ở theo chức năng gen
Chức năng gen
Số lượng 9
Tỷ lệ % 4,3
(Kiểu hình β+ thalassemia)
ĐỘT BIẾN SAO MÃ - Yếu tố điều hòa khởi động
- 28 (A – G) - 88 (C – T)
10
4,8
186
89,4
-Dịch khung
ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA(Kiểuhình β0hay β+thal) - Vị trí đầu kết nối IVS 1-1 (G – T) IVS 1-5 (G – C) IVS 2-654 (C – T) ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0 thalassemia) -Codon vô nghĩa CD17 (AAG – TAG) CD26 (GAG – AAG) CD95 (TAC – TAA) CD 41/42 (- TTCT) CD71/72 (+A)
Đột biến ít gặp khác
Cộng
3 208
1,4 100
Phân bố đột biến theo kiểu gen Kiểu phối hợp đột biến
Số bệnh nhân Kiểu gen Tỷ lệ %
38,46 β0β0
40 17
9 8
Đồng hợp tử CD41/42 - CD41/42 CD17 - CD17
8,7 7,7
23
Dị hợp tử kép CD41/42 - CD17 CD17 - CD71/72 CD41/42 - CD71/72 CD41/42 - CD95 CD41/42 - IVS1.5
15 3 3 1 1
14,4 2,9 2,9 0,96 0,96
0,96
1
β+β+
Dị hợp tử kép IVS2.654 - 2,3kb del
1
0,96
Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)
Kiểu phối hợp đột biến
Số bệnh nhân
Tỷ lệ %
14 13,46
Kiểu gen β0β+
Đị hợp tử kép -28 - CD17 -28 - CD41/42 -88-CD41/42 CD17 - IVS2.654 CD41/42 - IVS2.654 CD71/72 - IVS2.654 IVS1.1 - IVS2.654 -140 - CD17 CD17- c441.c442 ins A
3 2 2 2 1 1 1 1 1
2,9 1,9 1,9 1,9 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96
‘
Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)
Kiểu phối hợp đột biến Số bệnh nhân Tỷ lệ %
47 45,20 Kiểu gen β0βE
Dị hợp tử phối hợp HbE CD17 -CD26 CD41/42 - CD26 CD71/72 - CD26 IVS1.1 - CD26 IVS1.5 - CD26 CD95 - CD26
21,2 19,2 2,9 0,96 0,96 0,96
21 20 3 1 1 1
2 β+βE 1,92
Dị hợp tử phốihợp HbE -28 - CD26 -88 - CD26
0,96 0,96
1 1
KẾT LUẬN
Các đột biến gen beta-globin đã phát hiện :
• Đã phát hiện 208 alen đột biến ở 104 bệnh nhân, với 13 dạng :
- 4 đột biến phổ biến là CD41/42, CD17, CD26, và
CD71/72 với tỷ lệ 30,3%, 30%, 23,5% và 4,8%;
- 6 đột biến ít phổ biến là :
-28, IVS2-654, -88, CD95, IVS1-1, IVS1-5;
- 3 đột biến hiếm là:
-140, c441-c442 ins AC , và 2,3kb deletion.
19
• Không khác biệt nhiều về đột biến giữa các dân tộc, chỉ thấy CD26 gặp nhiều ở người Thái hơn Kinh và Tày. CD41/42 gặp nhiều ở Tày hơn Kinh
Đặc điểm đột biến gen beta-globin ở Việt Nam :
• Đột biến ở quá trình dịch mã RNA (80,4%) nhiều hơn hoàn thiện RNA và sao mã; nhiều ở exon (89,6%), ít hơn ở intron và vùng khởi động.
• Đa số đột biến có kiểu hình β0 (68%), βE (23,5%), đột biến β+ ít
• Đã phát hiện 25 kiểu phối hợp đột biến, 5 kiểu phối hợp phổ biến :
CD17-CD26, CD41/42-CD26, CD41/42-CD17, CD41/42-CD41/42, CD17-CD17. Kiểu gen β0 βE phổ biến nhất (45,3%), tiếp theo β0 β0 (38,4%), β0 β+ (13,4%), β+ βE (1,92%), cuối cùng là β+ β+ (0,96%).
Từ đó có thể kết luận :
Phần lớn β-thalassemia ở Việt Nam là β0-thalassemia
20
