HỌC VIỆN QUÂN Y
HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020
Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis
TS. Đinh Thị Thu Hằng
1
Hà Nội, T12 - 2020
ĐẶT VẤN ĐỀ Burkholderia pseudomallei và melioidosis
- Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe,
tử vong 40%.
- Phân bố: bùn đất, nước các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. - A. Whitmore (1911) - Melioidosis: cấp và mạn tính - triệu chứng không đặc hiệu, dễ
nhầm lẫn chẩn đoán, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”).
“Bom hẹn giờ Việt Nam”
Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. Chen, Y. L., et al. (2014). PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877.
2
Áp-xe do melioidosis
White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 3
Phân bố Melioidosis trên toàn cầu
- Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B. J. 2015)) - Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/
AIDS và lao) 1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D. et al. 2010, 2012).
- - NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia ( Limmathurotsakul D. et al. 2016), (Gohler A. et al. 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm.
4
Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. Rotz, L. D., et al. (2002). Emerg Infect Dis 8(2): 225-230.
B. pseudomallei gây bệnh
Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit) Đường lây: • Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe phủ tạng, NKH. Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD. • Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ.
5 (Perumal Samy R. et al. 2017)
Phòng và điều trị
- Chưa có vắc xin, phòng không đặc hiệu
- Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc
•
Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn công, 3- 6T duy trì (thể nặng 12T).
• Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các
ápxe phổi.
• Dễ tái phát, thời gian, kinh phí
=> Quân số, sức chiến đấu
6
B. pseudomallei và vũ khí sinh học
• B. pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí sinh học (VKSH).
• Hệ gen B. pseudomallei giống đến 99% so với B. mallei -
được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga
• Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B. pseudomallei để chế tạo
VKSH.
7
Hệ gen B. pseudomallei
Gene TTSS1 AF074878
NST số 1: 3.460 CDS Trao đổi chất, tăng trưởng
NST số 2: 2.395 CDS Thích ứng, tồn tại
Holden et al. (2004),10.1073/pnas.0403302101. 8
Các phương pháp xác định
Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày
Huyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu
không cao
PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực
- chưa đáp ứng thực tế hiện trường
9
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop mediated isothermal Amplification)
- Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm
là DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu quả cao (Notomi T. et al. 2000
).
- Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có
thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc.
10
Ưu điểm của LAMP
• Tiết kiệm • Độ nhạy, đặc hiệu cao • Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân • Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ • Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ không đổi từ 60 - 65°C. • Không đòi hỏi DNA tinh sạch cao. => Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, user- friendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to end users) - thực địa.
-
real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản hóa quá trình phát hiện B. pseudomallei
(Kaneko H. et al. 2007, (Njiru Z. K. 2012) 11
Thế giới
• Hơn 100 XN LAMP chẩn đoán mầm bệnh ở người và động
vật: virus Dengue (Parida M. et al. 2005), vi khuẩn lao (
Geojith G. et al. 2011), S. aureus (Lim K. T. et al. 2013), KST
sốt rét (Wu L. et al. 2015)... (Eiken Chemical Co. Ltd).
• B. pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá
ở Đông Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm
sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N. et al. 2008).
• Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi
tiết (Michelle Wong Tzeling J. et al. 2016).
12
B. pseudomallei ở Việt Nam?
• Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ tham chiến tại Việt Nam (Schulin T. et al. 2001)+ một số chó nghiệp vụ. ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B. pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R. et al. 2017).
• 6 BN nhiễm B. pseudomallei ngoại thành Hà Nội (1993). • 73 (+)/ 147 cánh đồng lúa miền Nam (1999). • Báo cáo các ca lâm sàng: BV Chợ Rẫy 2009-2011, 80 ca/ năm;
BV TƯ Quân đội 108 (2015), BV Bạch Mai (2016),…;
• TT Trung&cs(2016) NC đặc điểm phân bố B. pseudomallei ở
Bắc Trung Bộ, real-time PCR: 77 chủng/ 70 BN.
• Mưa lũ lịch sử, đến hết tháng 11/2020, ghi nhận số ca tăng đột
biến, 5 ca tử vong.
Quyết định 6101/QĐ-BYT 30/12/2019 HD chẩn đoán & điều trị bệnh Whitmore
BV quân đội + địa bàn đóng quân, lân cận? Công cụ phát hiện tại thực địa?
13
Đề tài cấp BQP: “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhanh tại hiện trường VK B. pseudomallei”. Mã số: 2019.75.027.
14
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu chủng B. p
PCR, cloning
Giải trình tự
Primer 3 PrimerExplorer V.5
B. pseudomallei, B. cepacia, P. aeruginosa
GenBank
Thiết kế mồi gen TTSS1
PCR, real-time PCR
real-time LAMP
Thiết lập LAMP
Đánh giá
PP: Thực nghiệm mô tả, phân tích trong PTN.
• Độ nhạy, độ đặc hiệu • So sánh
15
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Gene TTSS1 AF074878
PCR: primer BpF/R, sản phẩm: 723 bp
BpF
BpR
qBpF qBpR
Real-time PCR: primer qBpF/R, probe qBp-Pr, sp: 105 bp
LAMP và Real-time LAMP: các set primer LAMP gồm 2-3 cặp FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system)
TTSS1
16
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1
723 bp
PCR TTSS1-orf11 trên gel agarose 1,2% M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm; 2- 6: Mẫu B. pseudomallei Bp1-Bp5
17
Thiết kế phản ứng TTSS1 real-time PCR
Phản ứng real-time 20 µl PCR tối ưu : QuantiTect probe PCR 1X; qBp (F1+R1) 0,2 µM; probe qBp 0,05 µM; mồi IC (F+R) 0,2 µM; probe IC 0,05 µM; 5 µl DNA. Chu trình: (50oC/ 2 phút) (95oC/ 15m) (94oC/ 15s; 60oC/ 60s; 70oC/ 30s)x 45 chu kỳ.
Real-time PCR LOD95%=14,6 copy/rxn, độ tin cậy 95%.
PCR LOD: 500 copy/rxn
18
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nguồn
Thiết kế các bộ mồi LAMP TT Trình tự (5’-3’)
T T
Kích thước (bp) ên mồi
o gắn mồi (Ta: oC)
B
ộ mồi 1
215 1 F T 5
3 CCTGCTCCCACACCG 8,01
Chantratita N. và cs, 2008 [13] 2 B C 5
3 7,88
3 F
IP
4 B
CGCTTGCGCGTCAT CCACAGCAACGGAAAGAGCAGA- GCTTGCGGCCGAGATC GCCTCGATTGCGCGATCGCC- TGTTGCTAGCGGATTGTCA
242 IP Bộ mồi 2, bộ mồi 3 Bp-F3 CAATCTCACCAGCGTTCCA 60,01
1 2 B 5 thiết CCGGCCTCAATTCATC p-B3 9,48 Tự kế
3 B
p-FIP
B
p-FIP-4T
4 B 19 p-BIP
B
p-BIP-4T GCGCAGATGCCTGTCGATCA- CCGCCAACCTTTCCACA GCGCAGATTGCCTGTCGATCA- TTTTCCGCAACCTTCCAACA CGGCACAACCTGACAATCGC- TTCCGCGAACCTGGACT CGGCACAACCTGACAATCGC- TTTTTTCCGCGAACCTGGAACT
5 B T 6
p-LF CGGTAACTCAGCGGATCC 1,16
6 B C 6
p-LB CTTTCCCTGGTTTGCTCG 0,98
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế phản ứng LAMP
Quan sát bằng mắt thường
Điện di
UV
1 2 3
20
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xác định ngưỡng phát hiện
Sự thay đổi màu khi bổ sung SYBR Green I
Sự phát quang sau khi chiếu tia UV
LOD: 4 copy/µl
21 ĐTT Hằng, CD Hưng, BT Huyền, và cs. NC phát triển kỹ thuật LAMP đa mục tiêu phát hiện VK B. pseudomallei trên mẫu lâm sàng. CNSH toàn quốc 2020: 730-736.
Thiết kế, thử nghiệm các phản ứng real-time LAMP
Bộ mồi 1
Hệ thống Genie III (OptiGene, Anh), (45oC/3m), (65oC/30m), (98oC-> 80oC)/ramp rate 0,05oC/s),
Hệ thống RotorGene-Q
(65oC/ 1m)/30 chu kỳ; (80oC->98oC)/ 0,5oC/s
22
Đồ thị tín hiệu huỳnh quang phản ứng real-time LAMP xác định B. pseudomallei NC. Đối chứng âm là nước khử ion
Bộ mồi 2 và bộ mồi 3 (oligo 4T)
Hệ thống Genie III
Điện di sản phẩm của real-time LAMP gel agarose 2,0%. 1. Mẫu Bp1; 2, 4, 6. Mẫu Bc1, Bc2, Pa1 (Bộ mồi 2); 3, 5, 7. Mẫu Bc1-4T, Bc2-4T, Pa1-4T (Bộ mồi 3).
23
Tối ưu và đánh giá phản ứng real-time LAMP
Tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng real-time LAMP (bộ 2, máy Genie III)
0,2X
0,4X
0,6X
0,8X
1X
Nồng độ mồi
NA
24,45
22,37
21,38
20,15
Peak value (Mean, phút)
Chú thích: Mean. Giá trị trung bình, NA. Không xác định
Giá trị mồi tối ưu là 1X với nồng độ cụ thể của 3 cặp mồi Bp-FIP/BIP, Bp-F3/B3, Bp-LB/LF lần lượt là 1,6; 0,2; 0,4 µM. LOD: 4 copy/ µl (6/6 lần lặp lại), CV<2,5%
24
Đánh giá trên các chủng đối chứng
Mẫu chứng
B. pseudomallei VK khác
Tổng
30
0
30
Dương tính
Kĩ thuật LAMP
Âm tính
0
27
27
Tổng
30
27
57
• Độ nhạy: 100% • Độ đặc hiệu: 100%
KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
Thiết lập thành công p/ư real-time LAMP phát hiện nhanh VK B. pseudomallei.
Đánh giá trên các chủng B. pseudomallei, B. P. aeruginosa, ngưỡng phát hiện 4 cepacia, copy/μl, Se, Sp, LOD tương đương LAMP truyền thống, LOD thấp hơn real-time PCR và PCR, thời gian/ 30 phút.
Tối ưu, phát triển thành kit, đánh giá hiệu quả lâm sàng - công cụ hữu ích góp phần dự phòng, điều trị bệnh melioidosis.
XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN
27
Công trình được hoàn thành nhờ sự tài trợ của Chương trình CNSH phục vụ AN, QP (Bộ Quốc phòng) thông qua NV “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhanh tại hiện trường VK B. pseudomallei”. Mã số: 2019.75.027.
28
29
