Báo cáo khoa học: Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh
T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp, TËp 1, sè 4/2003
TuyÓn chän c¸c chñng Bacillus thuringiensis cã kh¶ n¨ng diÖt s©u t¬ vµ s©u xanh Selection of Bacillus thuringiensis strains with insectidal activity against armyworm
(Plutella xylostella) and diamondback moth (Heliothis armigera)
NguyÔn ThÞ Hoµi Hµ1, Ng« Giang Liªn2
Summary
Over 20 species of natunally occurring insect - specific bacteria have been isolated from the soil, insects and plants, but only a few have been studied intensively. Much attention has been given to Bacillus thuringiensis, a species that produces microbial insecticed toxic to specific groups of insects. Insecticidal activity of four strains of Bacillus thuringiensis from the Museum of the Center of Applied Microbiology has been tested against Plutella xylostella and Heliothis armigera.
Keywords: Bacillus thuringiensis strains, insectidal activity, Plutella xylostella, Heliothis
armigera. .
2. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p
Vi
sinh vËt: C¸c
chñng Bacillus thuringiensis ®−îc nhËn tõ B¶o tµng Gièng chuÈn vi sinh vËt, Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi. Bèn chñng Bacillus thuringiensis ký hiÖu lµ 8-2, AM4, H- H1 vµ G3
(Coleoptera)
c¸nh
bé
vµ
1. Më ®Çu1 Bacillus thuringiensis (Bt) lµ vi khuÈn gram d−¬ng, sinh tinh thÓ diÖt c«n trïng trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö. Tuy lµ mét lo¹i vi khuÈn ®−îc ph¸t hiÖn kh¸ muén nh−ng Bt ®8 ®−îc nghiªn cøu rÊt kü ë nhiÒu quèc gia kh¸c nhau vµ chÕ phÈm Bt ®−îc sö dông thµnh c«ng nhÊt trong b¶o vÖ thùc vËt (Asano, 1996). C¸c tinh thÓ ®éc cña Bt cã thÓ diÖt ®−îc nhiÒu lo¹i c«n trïng thuéc bé 2 c¸nh (Diptera) bé c¸nh vÈy cøng (Lepidoptera) vµ mét sè lo¹i c«n trïng kh¸c. S©u t¬ (Plutella xylostella) vµ s©u xanh (Heliothis armigera Hubner) lµ nh÷ng loµi s©u g©y h¹i nghiªm träng cho c¸c lo¹i rau trång. V× vËy trong ph¹m vi bµi b¸o nµy chóng t«i ®Ò cËp tíi kh¶ n¨ng sinh tr−ëng, t¹o thµnh bµo tö còng nh− kh¶ n¨ng diÖt s©u xanh vµ s©u t¬ cña c¸c chñng Bt ®Ó chän ra c¸c chñng Bt cã kh¶ n¨ng diÖt c¸c lo¹i s©u nµy.
Bèn chñng vi khuÈn nµy ®Òu ch−a cã tinh thÓ h×nh th¸p ®«i vµ ®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng lªn men nªu d−íi ®©y. ë nhiÖt ®é 30oC l¾c 220 vßng/phót. Thêi gian nu«i cÊy thÝch hîp cho tõng chñng biÕn ®éng tõ 30 - 40 giê. M«i tr−êng lªn men (g/l): Bét ®Ëu t−¬ng: 15; Bét ng«: 10; §−êng kÝnh: 20; Cao nÊm men: 1; Mét sè muèi kho¸ng. pH = 7,0. Ph©n tÝch ®Þnh l−îng protein theo ph−¬ng ph¸p Lowry (Lowry vµ cs, 1951) vµ ph©n tÝch ®Þnh tÝnh protein theo Laemmili (Laemmili vµ cs, 1970).
1 Trung t©m CNSH- §H Quèc gia Hµ Néi 2 Khoa Sinh, §H Khoa häc Tù nhiªn- §HQG
260
TuyÓn chän c¸c chñng bacillus Thuringiensis...
B¶ng 1. Kh¶ n¨ng diÖt s©u xanh vµ s©u t¬ cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis 8-2, G3, AM4, H-H1
Chñng gièng chøa c¸c nhãm gen Cry kh¸c nhau LC50 sau 4 ngµy xö lý SDS-PAGE (kDa) S¶n phÈm PCR S©u t¬ (Plutella xylostella) S©u xanh (Heliothis armigera)
0,42 1,09 130 Bacillus thuringiensis 8-2
Bacillus thuringiensis G3 0,.23 2,30 130
0,87 3,44 130 Bacillus thuringiensis AM4
Thö nghiÖm sinh häc: do ViÖn B¶o vÖ
armigera), s©u t¬ (Plutella xylostella) cña c¸c chñng ®8 tuyÓn chän. C¶ 4 chñng ®Òu cã LC50 t−¬ng øng lµ 0,07 - 0,87 ®èi víi s©u t¬, Trong khi ®ã ®èi víi s©u xanh LC 50 cña chóng chØ ®¹t tõ 1,09 - 4,15, cao nhÊt lµ chñng 8-2.
Sö dông kü thuËt PCR ®Ó nhËn diÖn gen Cry cña Bt, sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu LepIA, LepIB vµ LepIIA, LepIIB b»ng ph−¬ng ph¸p Asano (Asano, 1996). thùc vËt thùc hiÖn. §èi t−îng thÝ nghiÖm: S©u xanh vµ s©u t¬ tuæi 2
3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. KiÓm tra ho¹t tÝnh diÖt s©u cña 4 chñng Bacillus thuringiensis Theo Dulmage (1981) viÖc s¶n sinh protein tinh thÓ ®éc cña Bacillus thuringiensis phô thuéc rÊt nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn nu«i cÊy vµ thµnh phÇn m«i tr−êng. VËy 4 chñng Bacillus thuringiensis ®Òu chøa tinh thÓ ®éc cã kh¶ n¨ng diÖt s©u nh− thÕ nµo. Ph¶n øng (PCR) sÏ x¸c ®Þnh ®−îc nhanh c¸c chñng nghi ngê Bacillus thuringiensis cã hay kh«ng cã ho¹t tÝnh diÖt s©u (Asano, 1996; Jackson vµ cs, 2000).
Dïng måi (primer) chän läc nh»m t¹o ra s¶n phÈm mang tÝnh ®Æc thï cña nh÷ng gen m8 ho¸ (encoding). C¸c måi nµy mang ®Æc tr−ng nhãm, ®−îc sö dông ®Ó ph¸t hiÖn c¸c ®o¹n ADN ®Æc thï trong chñng Bacillus thuringiensis. KÕt qu¶ cho thÊy 4 chñng vi khuÈn Bacillus thuringiensis cho s¶n phÈm PCR t−¬ng øng víi 490 bp, 986 bp sö dông c¸c gen tinh thÓ CryIA(a), CryIA(b) tæng hîp protein cã träng l−îng ph©n tö 130kDa. Protein nµy lµ tiÒn ®éc tè, d−íi t¸c dông cña proteaza vµ pH kiÒm trong ruét Êu trïng sÏ biÕn thµnh protein ®éc 67 KDa g©y ®éc ®èi víi Êu trïng cña s©u xanh vµ s©u t¬ (Asano, 1996; Wu vµ cs; 1985; Yamamodo vaf cs; 1983).
S©u xanh (Heliothis armigera) vµ s©u t¬ (Plutella xylostella) g©y h¹i chñ yÕu cho rau thuéc hä c¶i (Brassciaceae) ®Æc biÖt lµ c¶i xanh vµ trªn c¸c rau mµu kh¸c. KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 1 lµ ho¹t tÝnh diÖt s©u xanh (Heliothis
KÕt qu¶ ghi ë b¶ng 2 cho thÊy r»ng c¶ 4 chñng vi khuÈn nãi trªn ®Òu t¹o bµo tö sau 34 - 40 giê nu«i cÊy vµ chñ yÕu ®¹t ®−îc kho¶ng 0,66 - 0,78 x109 bµo tö/ml. ChØ sè pH ban ®Çu
0,07 130 Bacillus thuringiensis H-H1 4,15 CrylA(a), CrylA(b) CrylA(a), CrylA(b) CrylA(a), CrylA(b) CrylA(a), CrylA(b)
261
NguyÔn ThÞ Hoµng Hµ, Ng« Giang Liªn
B¶ng 2. Kh¶ n¨ng sinh tr−ëng vµ t¹o thµnh bµo tö cña c¸c chñng Bacillus thuringiensis
Chñng gièng Tû lÖ t¸ch bµo tö (%) pH thêi ®iÓm cuèi
Bacillus thuringiensis 8-2 Bacillus thuringiensis G3 Bacillus thuringiensis AM4 Bacillus thuringiensis H-H1 8-2, G3, AM4, H-H1 trong nu«i cÊy ch×m. H×nh d¹ng tinh thÓ Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Th¸p ®«i Tæng sè bµo tö (x109/ml) 0,62 0,74 0,78 0,66 70 76 78 72 8,0/40 giê 7,8/36 giê 8,2/34 giê 7,6/40 giê Hµm l−îng protein (µg/ml) 634 726 600 720
lµ 7,0 (pH cña thêi ®iÓm 0 giê). pH gi¶m xuèng khi c¸c chñng b−íc vµo pha logarit lµ 6,0 vµ pH t¨ng dÇn ®Õn 7,6 - 8,2 ë giai ®o¹n kÕt thóc sù nu«i cÊy. Sù biÕn ®æi pH trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy c¸c chñng nãi trªn còng t−¬ng tù nh− kÕt qu¶ cña nhiÒu nghiªn cøu kh¸c khi trong m«i tr−êng cã ®−êng, ban ®Çu chóng
®−îc chuyÓn ho¸ thµnh c¸c s¶n phÈm trung gian lµ c¸c axit h÷u c¬ vµ c¸c axit amin, sau ®ã khi c¸c s¶n phÈm nµy ®−îc tiªu thô hÕt th× pH cña m«i tr−êng t¨ng dÇn ®Õn 7,6 - 8,2 ë giai ®o¹n kÕt thóc. Së dÜ pH t¨ng lµ do hµm l−îng amoniac (NH3) ®−îc tÝch luü trong m«i tr−êng nu«i cÊy. Sö dông ph−¬ng ph¸p nhuém
H×nh 1. Tinh thÓ ®éc cña chñng Bacillus thuringiensis ®−îc tuyÓn chän chôp d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc (®é phãng ®¹i 1000 lÇn)
262
TuyÓn chän c¸c chñng bacillus Thuringiensis...
tiªu b¶n cã thÓ cho thÊy râ h×nh ¶nh tÕ bµo d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc: phÇn lín lµ c¸c tÕ bµo h×nh que, t¹o ®«i hoÆc chuçi, t¹o bµo tö vµ tinh thÓ.
4. KÕt luËn
Bacillus thuringiensis by PCR and isolation of unique insecticidal bacteria. Memories Fac. Agr. Hokkaido Univ. 19: 529-563.
Jackson. T. A. D. J. Saville., 2000. Bioassay of replicating Bacteria Against Soil-dweeling insect pests. In "Bioassay of entomopathogenic microbes and nematodes" by A. Navon. K. R. S. Ascher. CABI Publishing. page 73-93.
C¶ 4 chñng Bacillus thuringiensis 8-2, G3, AM4, H-H1 ®Òu cã ho¹t tÝnh diÖt s©u t¬ kh¸ cao. LiÒu l−îng g©y chÕt víi s©u t¬ LC50 t−¬ng øng víi 4 chñng trªn lµ 0,42; 0,23; 0,87; 0,07. Trong khi ®ã c¸c chñng nµy cã ho¹t tÝnh diÖt s©u xanh thÊp h¬n (LC50 t−¬ng øng lµ 1,09; 2,30; 3,44; 4,15).
Laemmili U.K., 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 277: 680- 685.
C¶ 4 chñng vi khuÈn nãi trªn ®Òu t¹o bµo tö sau 34 - 40 giê nu«i cÊy vµ ®¹t ®−îc l−îng bµo tö kho¶ng 0,66 - 0,78 x109 bµo tö/ml.
Lowry O.H., Rosebrough A.L. and Randall R.J., 1992. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. Padiman, M.
C¸c chñng Bt 8-2, Bt G3, Bt AM4 vµ Bt H- H1 ®Òu cã tinh thÓ h×nh th¸p ®«i vµ chøa c¸c gen CryIA(a), CryIA(b) tæng hîp protein cã träng l−îng ph©n tö 130 kDa.
Wu D, and chang N.F., 1985. synergism in mosquitotocidal activity of 26 and 65 kDa proeins from Bacillus thuringiensis is subsp, israentensis Crystal FEBS -190: 232-236
Tµi liÖu tham kh¶o Asano, S., 1996. Identification of cry gene from
Yamamodo I, Garcia. A., 1983. Immunologicol the entomocidol proteins of insecticidal its properties of thuringiensis and Bacillus activity. J. Invertebr. Pathol, 41: 122-130.
