TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN
ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ
CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu
Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch.
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học, Trung
Tâm Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ Quốc gia.
Trong những năm gần đây thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus
thuringiensis gọi tắt là (Bt) đã được ứng dụng an toàn và có
hiệu quả để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học. B.
thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry
sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả
diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy,
cánh cứng và hai cánh. Các nhà khoa học đã có rất nhiều cố
gắng để phân lập vi khuẩn này và thu được nhiều bộ sưu
tập các chủng B. thuringiensis rất phong phú. Số các chủng
B. thuringiensis phân lập thì nhiều nhưng mỗi chủng chỉ
chứa một số nhóm gen cry gây độc với một số loài côn
trùng nhất định. Để sàng lọc các chủng B. thuringiensis có
chứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự gen
độc tố đó là vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho các
nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như:
nhằm tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có
phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều
loài côn trùng quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry
thích hợp vào từng loại cây trồng để bảo vệ chúng trước sự
tấn công của côn trùng. Chúng tôi đã tiến hành thăm dò sự
tồn tại gen cry1Ab của một số chủng B. thuringiensis var.
kurstaki phân lập ở Việt Nam, tạo dòng và xác định trình tự
đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1Ab đó và so sánh với
trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân
hàng dữ liệu gen Quốc tế.
I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
I.1. Tách chiết ADN tổng số:
Tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Maniatis
[10]: các chủng B. thuringiensis được lên men lắc trên môi trường LB ở 370C qua đêm. Ly tâm ở 6.000v /phút, thu cặn
tế bào. Bổ sung 567l TE(10:1), 30l SDS 10%, 3l
proteinaza K, ủ ở 370C trong 1 giờ. Bổ sung 180 l NaCl
5M, ủ ở 650C trong 10 phút. Bổ sung 800l chloroform, ly
tâm ở 10000v/10phút, thu 600 l dịch nổi, bổ sung 300l
chloroform và 300l phenol, trộn đều rồi ly tâm
10.000v/10phút, thu 600l dịch nổi. Bổ sung 600l
chloroform để loại phenol, ly tâm 10000v/10phút, thu
400l dịch nổi. Bổ sung 40l NaOAC và 1ml cồn 100%, ủ
ở - 200C sau 4 giờ, ly tâm 14000v/20phút, thu cặn ADN.
Rửa lại với 1ml cồn 70% tiếp tục thu cặn bằng ly tâm
14000v/20phút. Sấy khô cặn trong tủ cấy vô trùng, loại
RNaza bằng cách bổ sung 20lTE-RNaza và ủ ở 370C/ 1
giờ.
Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp
phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và được tính bằng biểu
thức:
A260 x 50 x hệ số pha loãng = g ADN/ml
Sau khi xác định nồng độ, ADN được kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1%.
I.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab bằng
kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng
trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử
ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim
Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ
50ng/l).
Sử dụng cặp mồi TY6(5’-
GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và
TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’) để
nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab. Các
sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose
1%
I.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab.
Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của
Sambrook và cs [10]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạo
ra ở mục I.2 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1. Phản ứng
gắn gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sản
phẩm PCR:3l; vectơ PCRTM2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủ
qua đêm ở nhiệt độ 140C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắn
vào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. coli
chứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môi
trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D-
Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADN
plasmid từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch
chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứa
ADN plasmid, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung
dịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ
100g/ml.
I.4. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1Ab.
Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào
chủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzim
học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia
Biotech với máy xác định trình tự ADN tự động ALF-
Express của Hãng Pharmacia. Phân tích kết quả được tiến
hành với chương trình PC/Gene.
II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam nhận được
từ bộ sưu tập chủng giống B. thuringiensis của Bộ môn Vi
sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch. Các chủng B.
thuringiensis này đã được công bố là có hiệu lực diệt đặc
hiệu cao 100% đối với các loài sâu ngài gạo, và 90%-100%
đối với sâu tơ, sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu
khoang 80-90% và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông
50-60%.
II.1. Kiểm tra ADN của 10 chủng B. thuringiensis var.
kurstaki bằng điện di trên gel agarose 1%
ADN tổng số sau khi đã tách chiết từ 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập được điện di trên gel
agarose 1% với đệm TAE, sau đó nhuộm gel với Ethidium
bromid (EtBr). Gel được soi dưới ánh sáng tử ngoại, nếu
ADN nguyên vẹn sẽ tạo thành một băng sáng tập trung ở vị
trí trên cùng của bản gel do chúng có kích thước và trọng
lượng phân tử lớn nên chạy chậm và ở vị trí cao nhất. Nếu
ADN bị đứt gãy thành các đoạn có kích thước nhỏ hơn thì
chúng sẽ chạy nhanh hơn và tạo thành một dải sáng dài
gồm nhiều băng phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản gel.
Dựa vào hình ảnh điện di, chúng ta có thể đánh giá chất
lượng của các mẫu ADN được tách chiết.
Hình 1: Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra
ADN TỔNG SỐ TÁCH TỪ CÁC CHỦNG B.
THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập: từ kênh (1-10)
theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S,
H13 ).
Qua ảnh điện di ở hình 1 chúng tôi nhận thấy các mẫu
ADN tổng số tách được từ 10 chủng B. thuringiensis
kurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét
ở phía trên của bản gel, không có các vạch phụ, các mẫu
ADN tách được là nguyên vẹn và không bị đứt gãy, đảm
bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
II.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ
các chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập bằng kỹ
thuật PCR:
Tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và TY14 để nhân bản
đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab của 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập và hai chủng chuẩn B.
thuringiensis var. kurstaki A1 và B. thuringiensis var.
aizawai M1. Kết quả thể hiện ở hình 2.
Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc
hiệu, không có sản phẩm phụ. Ở cả 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập có duy nhất một sản
phẩm PCR đặc hiệu vào khoảng 238 bp theo lý thuyết
giống với sản phẩm PCR của chủng B. thuringiensis var.
kurstaki chuẩn (kênh 2, 4-13). Như vậy cả 10 chủng B.
thuringiensis var. kurstaki phân lập đã mang gen cry1Ab.
Riêng chủng chuẩn B. thuringiensis aizawai M1 không có
sản phẩm PCR đặc hiệu, vì vậy chủng này không chứa gen
cry1Ab.
Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab
của các chủng B. thuringiensis
phân lập và chủng B. thuringiensis chuẩn.
Chú thích: Kênh (1-2): chủng chuẩn B. thuringiensi var.
aizawai M1, B. thuringiensis var. kurstaki A1; Kênh 3: chỉ
thị phân tử (ADN cắt bằng Hind III và EcoR I) từ trên
xuống (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584,
1330, 983, 831, 564 bp); kênh (4-13) các chủng phân lập
theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S,
H13 ).
II.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ
chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập.
Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab từ
chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập vào vectơ PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp. Sau đó biến nạp
vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5. Nhờ quá trình
nhân lên của vi khuẩn mà vectơ tái tổ hợp cũng được nhân
theo. Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ
hợp từ vi khuẩn E. coli đã biến nạp. Kiểm tra plasmid tái tổ
hợp bằng cách cắt với enzim giới hạn EcoR I, sản phẩm cắt
được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả
được thể hiện ở hình 3.
Hình 3. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các
plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen
cry1Ab cắt bằng EcoR I.
Chú thích: Kênh 1: sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu
của gen cry1Ab; Kênh 2,3,5: Plasmid cắt bằng EcoR I ;
Kênh 4: plasmid của khuẩn lạc xanh; Kênh 6: Chỉ thị phân
tử (ADN cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuống
21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330,
983, 831, 564 bp).
Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmid tái tổ hợp được cắt
bởi enzim EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab
được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sản
phẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 2, 3, 5). Kênh 2
cho thấy plasmid của khuẩn lạc xanh không mang đoạn
ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước
vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid. Như
vậy chúng tôi đã chọn được 3 dòng có đính sản phẩm PCR
là đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab và được vi khuẩn E.
coli nhân lên theo mong muốn. Tuy nhiên để khẳng định
một cách chắc chắn điều này, cần xác định trình tự đoạn
ADN đã được gắn vào vectơ.
II.4. Xác định trình tự nucleotid đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry 1Ab.
Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki
H15 phân lập được xác định có chiều dài 236 cặp bazơ bao
gồm số lượng các nucleotid như sau: 81A, 39 C, 62G, 54T.
Hình 4. Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo
dòng từ chủng B. thuringiensis. kurstaki H15 phân lập,
đoạn ADN này dài 236 cặp bazơ.
II.5. So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1Ab.
Chúng tôi đã tiến hành so sánh độ tương đồng giữa trình tự
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B.
thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam so với
trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong ngân
hàng dữ liệu gen Quốc tế, kết quả được thể hiện ở hình 5.
Hình 5. So sánh trình tự nucleotid giữa đoạn ADN đặc hiệu
của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var.
kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam (VNCRYIAb) và đoạn
ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố
trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế (QTCRYIAb).
Kết quả ở hình 5 cho thấy trình tự đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki
H15 phân lập của Việt nam có độ tương đồng cao so với
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công
bố năm 1986 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã số
ACM 15271. Độ tương đồng đạt 98,73%. Chúng chỉ khác
nhau bởi 3 nucleotid, đó là các nucleotid ở vị trí thứ 84,
167, 222.
II.6. Dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab
Chúng tôi đã tiến hành dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1Ab sang protein nhờ chương trình phần mềm
PC/Gene. Kết quả được thể hiện ở hình 6.
Hình 6. Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn ADN
đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis
var. kurstaki H15 phân lập ở Việt nam.
Kết quả ở hình 6 cho thấy đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki
H15 phân lập của Việt nam có thể dịch thông sang một
đoạn protein có chiều dài 78 axit amin.
III. KẾT LUẬN:
Đã nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab từ 10
chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập bằng kỹ thuật
PCR với cặp mồi TY6 và TY14. Kết quả cho thấy tất cả 10
chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam
đều mang gen cry1Ab.
Đã tạo dòng và xác định trình tự đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15
phân lập, đoạn ADN này có chiều dài 236bp, có thể mã hoá
cho một đoạn protein có chiều dài 78 axit amin. Trình tự
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B.
thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt nam có độ
tương đồng cao so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab
do Geiser và cs công bố năm 1986 trong Ngân hàng dữ liệu
gen Quốc tế mã số ACM 15271. Độ tương đồng đạt tới
98,73%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Choi, S. K., B. T. Koo, S. Shin, S. H. Park, J.I. Kim.
(1995), “Screening of nested deletion mutants for DNA
sequencing by direct electrophoresis of bacterial cultures”.
Anal. Biochem. 230, p. 182-183.
2. Chilcott, C. N. and P.J. Wigley. (1992), “Isolation and
Toxicity of Bacillus thuringiensis from Soil and Insect
Habitats in New Zealand”. Journal of Invertebrate
Phathology 61, p. 244-247.
3. Ferre, J., M.D. Real, J. Van Rie, S. Jansens, and M.
Peferoen. (1991), “Resistance to the Bacillus thuringiensis
bioinsecticide in a field population of Plutella xylostella is
due to a change in a midgud membrane receptor”. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, p.5119-5123.
4. Geiser M., S. Schweitzer, C. Grimm. (1986), "The
hypervariable region in the genes coding for
entomopathogenic crystal proteins of Bacillus
thuringiensis: nucleotide sequence of the kurhd1 gene of
subsp. kurstaki HD1"; Gene 48, p.109-118.
5. Herman Hoft and H.R. Whiteley. (1989), “Insecticidal
Crystal Proteins of Bacillus thuringiensis”. Microbiological
Review, p. 242-255.
6. Kalman, S., K. L Kiehne, K. J. Libs, and T.
Yamatomo. (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene
from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp–galleriae”.
Applied and Environmental Microbiology, p.1131-1137.
7. Klier A. (1985), Biopestiside opportunities and
Challegene for management insect. Parteun International
Symposia.
8. Koo, B. T., S. H. Park, S. K. Choi, B. S. Shin, J. I.
Kim, J. H. Yu. (1995), “Cloning of a novel crystal protein
gen Cry 1 K from Bacillus thuringiensis subsp. Morrisoni”.
FEMS Microbiology Letter 134, p.159-164.
9. Kumaraswami N.S., M. Higuchi, T. Maruyama, T.
Hayakava. (2001), “Comparative study of proteins and
neutral glycoceramides of midgut epithelial cell membrane
in Cry1Ac susceptible and highly resistant Diamondback
moth”. 4th Pacific Rim Conference on the Biotechnology
of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact,
p66.
10. Maniatis, T; E.F. Fritisch, and Sambrook. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
11. Lopez-Meza, J. E. and J. E. Ibarra. (1996),
“Characterization of a Novel Strain of Bacillus
thuringiensis”. Applied and Environmental Microbiology,
p.1306-1310.
12. Lecadet, M. M. at al. (1996), Collection of Bacillus
thuringiensis and Bacillus sphaericus. I.E.B.C, catalogue
No.1.
13. Park S. H., B. T. Koo, B. S. Shin, S. K. Choi, Y. M.
Jeong, J. G Pan, and J. I. Kim. (1997), “Characterization of
1925 Bacillus thuringiensis isolates from plants in Korea”.
Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 25, No. 2, p.159-
165.
14. Philip F. Entwistle, Jenny S. Cory, Mark J. Bailey
and Stephen Higgs. (1993), Bacillus thuringiensis, An
Environmental Biopesticides: Theory and Practice. Jon
Wiley and Sons, Ltd, Baffins lane, Chichester, West Sussex
Po19 1UD, England.
SUMMARY
Cloning and sequencing specific DNA fragment of
cry1Ab gene from some B. thuringiensis var. kurstaki
strains isolated in Vietnam
Bui Thi Huong, Nguyen Thuy Chau
Microbiology Department, Post Harvest Technology
Institute.
Đinh Duy Khang
Molecular Microbiology Department, Institute of
Biotechnology,
National Centre for Natural Science and Technology.
Bacillus thuringiensis is a Gram-positive, spore-forming
bacterium that produced parasporal crystal toxins active
against Lepidopteran, Dipteran and Coleopteran insects. B.
thuringiensis crystal protein genes have been designed cry,
cry1 gene group encodes bipyramidal protein active mainly
against Lepidoptera insects of which Cry1Ab protein have
insecticide activity to Manduca Sexta, Heliothis virescens,
Spodoptera lituralis, Plodia interpunctella, Plutella
xylostella ,,,
We carried out screening some B. thuringiensis isolates in
Viet Nam habouring cry1Ab gene. PCR method was used
to identify cry1Ab gene. Ten B. thuringiensis var. kurstaki
with highly toxic activity were obtained from Collection of
microorganism of Microbiology Department, Post Harvest
Technology Institute. The cloning and sequencing of
specific DNA fragments of cry1Ab genes from ten
abovementioned B. thuringiensis var. kurstaki strains were
carried out. Total DNA of these B. thuringiensis isolates
were isolated then analysed by electrophoresis on 1%
agarose gel. The result showed that total DNA isolated was
not broken; it could be used as DNA template for the PCR.
Oligonucleotid primer pairs of TY6 and TY14 were used to
amplify the specific DNA fragments of cry1Ab gene by
PCR; concentration of total DNA in PCR was 100ng/25l.
The PCR components of 25l of total volume included:
13,6l of H2O, 2,5l of dNTP, 2,5l of buffer, 2l of
primer, 0,4l of Tag-polymeraza enzim, 2l of DNA
template (50ng/l). The PCR conditions were: denaturation
at 940C for 3 min, followed by 30 amplification cycles (940C, 50 sec; 600C, 50 sec; 720C, 1min and 20sec) and
extension at 720C for 8 min. The content of 5l of PCR
products was analyzed by electrophoresis on 1% agarose
gel. The result showed that all of ten B. thuringiensis var.
kurstaki isolates produced only one PCR product of about
236 bp, this result indicated that all of ten B. thuringiensis
var. kurstaki isolates harboured cry1Ab gene but no cry1C
gene. The amplified DNA fragment from B. thuringiensis var. kurstaki H15 strain was ligated in to PCRTM 2.1 vector
and transformed into E. coli DH5. E. coli cell carrying
recombinant plasmid were grown in LB medium containing ampicillin, IPTG and followed by incubation at 370C or 300C for 24 hours. The white colonies were screened as
transformants. This recombinant plasmid was isolated and
purified from transformed E. coli DH5, then it was
examined carefully by cutting of restrict enzim EcoRI.
Sequences of DNA fragment were determined by the dideoxy chain termination method with 32P dATP on
Autosequencer ALF-Exp
ress. The sequence data were compared with reference
gene. The results showed that specific DNA fragment of
cry1Ab gene had 236bp in length including 81A, 39C, 62G,
54T. It could be translated into a protein fragment of 78
amino acids. This DNA fragment was homology 98,73% in
comparison with DNA fragment of the same gene
published by Geiser et al in International Gene Bank
Database.
Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Lê Quang Huấn.
