Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở: Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

---------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ

BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Trần Thanh Thúy

TP. HỒ CHÍ MINH - 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

---------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ

BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Trần Thanh Thúy

TP. HỒ CHÍ MINH - 2006

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về probiotic ....................................................................................................... 3 1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu probiotic .......................................................................................... 3 1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng trong probiotic ................................. 3 1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic .......................................................................................... 5 1.1.4. Vai trò của probiotic ........................................................................................................ 8 1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN .......................................... 11 1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic ........................................................................................ 13 A. Vi khuẩn lactic .................................................................................................................... 13 Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 14 1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................................ 14 1.2.2. 1.2.3. Quá trình lên men lactic ................................................................................................. 16 1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình ............................................................................................ 16 1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình ............................................................................................... 17 1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn lactic ..................... 17 1.2.4.1. Nguồn cacbon ............................................................................................................. 17 1.2.4.2. Nguồn nitơ .................................................................................................................. 18 1.2.4.3. Các muối vô cơ ........................................................................................................... 18 1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng ................................................................................................... 18 1.2.4.5. Oxy .............................................................................................................................. 19 1.2.4.6. Nhiệt độ ....................................................................................................................... 19 1.2.4.7. pH ................................................................................................................................ 20 1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20 B. Nấm men ............................................................................................................................. 21 1.3. Tổng quan về heo .............................................................................................................. 24 1.3.1. Vị trí phân loại của heo .................................................................................. 24 1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con .............................................................................. 24 1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa .......................................................................................... 24 1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột ........................................................................ 25 1.3.3. Các bệnh đƣờng ruột ở heo con ..................................................................................... 25 1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli ........................................................................... 25 1.3.3.2. Tiêu chảy do Saimonella (Phó thƣơng hàn) ................................................................ 26 1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị .................................................................................... 26 1.3.4.1. Phòng bệnh.................................................................................................................. 26 1.3.4.2. Điều trị ........................................................................................................................ 27

Định lƣợng axit lactic bằng phƣơng pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25], 30 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .................................... 30

Khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng tạo sinh

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 29 2.1. Vật liệu .............................................................................................................................. 29 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................................... 29 2.1.2. Môi trƣờng (xem Phần phụ lục) ..................................................................................... 29 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................................. 29 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch [13] .................................................. 29 2.2.2. Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37] .................................................................................................................................. 29 2.2.3. [36], [37] 2.2.4. 2.2.5. Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch [12], [13], [25], [36], [37]. ................................................................................................................ 32 2.2.6. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic ................................... 33 2.2.7. Phƣơng pháp bảo quản giống VK lactic bằng phƣớng pháp đông khô ......................... 34 2.2.8. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch [12], [13], [36], [37] ........................................................................................... 35 2.2.9. Khảo sát sự sinh trƣởng và và các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đo mật độ quang [12], [13] ................................................... 35 2.2.10. khối của tế bào nấm men bằng phƣơng pháp cân sinh khối tƣơi ............................................. 38 2.2.11. Phƣơng pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37] ............... 38 2.2.12. Tạo chế phẩm probiotic ............................................................................................... 39 2.2.13. Phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa ..................................... 40 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN............................................................................. 42 3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ................................................................................................................................... 42 3.1.1. Phân lập và sơ bộ tuyển chọn Vklactic .......................................................... 42 3.1.2.Tuyển chọn các chủng VK lactic - probiotic .................................................................. 42 3.1.2.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng ..................................................................... 43 3.1.2.2. Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định ........................................................ 44 3.1.2.3. Khảo sát hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh ................................................. 46 3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .......................................................................................................................................... 48 3.2.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 .................................................. 48 3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N4, L2................................................... 48 3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men ......................................................... 52 3.3.1. Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae .................... 52 3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định ............................................ 53 3.3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men ......................... 54 3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối các chủng nghiên cứu ............................................................................................................................................ 55 A. Vi khuẩn lactic .................................................................................................................... 55

3.4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................. 55 3.4.2. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic .............................................................................................................................. 57 3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy ........................................................................................................ 57 3.4.2.2. pH ban đầu .................................................................................................................. 59 3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ ..................................................................................................... 60 3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men ................................................................................................ 62 3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon ................................................................................................ 63 3.4.2.6. Nồng độ saccharose .................................................................................................... 64 3.4.3. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ƣu ........................................................................................................................................ 65 B. Nấm men ............................................................................................................................. 66 3.5. Tạo chế phẩm probiotic .................................................................................................... 68 3.5.1. Đông khô các chủng VSV.............................................................................................. 68 3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm ................................ 68 3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic ................................................................................... 71 3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm .......................................................................................... 72 3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng vsv sau quá trình đông khô ...................................... 72 3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm ................. 73 3.7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic .................................................... 75 3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa .................................. 76 3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa ............................................................................ 76 3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa ................................................................................... 78 3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn .................................................................................................... 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................................................... 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC .......................................................... 84 PHỤ LỤC.................................................................................................................................... i

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CNSH Công nghệ sinh học

ĐHNN Đại học Nông nghiệp

ĐHQG Đại học Quốc gia

ĐHSP Đại học Sƣ phạm

MT Môi trƣờng

PTN Phòng thí nghiệm

SHPT Sinh học phân tử

TB Tế bào

TBC Tế bào chất

TG Thế giới

VK Vi khuẩn

VN Việt Nam

VSV Vi sinh vật

Mẫu 1.10

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ

Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm

probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.

Mã số: CS.2005.23.92

Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy Tel:0908 402 475

Email: thanhthuydhsp2000@yahoo.com.

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :

1. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2. TS. Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.

Thời gian thực hiện: 1 năm.

1. Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế

phẩm có khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả.

2. Nội dung chính:

- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có hoạt tính cần thiết của

chủng probiotic.

- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV đã

tuyển chọn.

- Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.

- Tạo chế phẩm probiotic.

- Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.

- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.

3. Thành quả chính đạt đƣợc (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội):

- Đã có 2 bài báo :

"Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02", Tạp chí Khoa

học Trƣờng ĐHSP TP.HCM năm 2006.

" Đặc điểm các chủng vi khuẩn lactic dùng trong chế phẩm probiotic phòng và trị

bệnh tiêu chảy cho heo," Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trƣờng ĐHBK Hà Nội, năm 2006).

- Hoàn thành 1 luận văn Thạc Sĩ Sinh học, 2 cử nhân Sinh học.

Mẫu 1.10

SUMMARY

Project Title:

Onfirst study on utilliation microorganisms stains to produce the preparation

probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs

Code number: CS.2005.23.92

Coordinator: Dr. Trần Thanh Thủy Tel: 0908 402 475

Implementing Institution : Hồ Chí Minh city University of Pedagogy

Cooperating Institution(s):

Dr. Nguyễn Thị Hoài Hà - Center of Biotechnology Việt Nam national University, Hà

Nội

Dr. Võ Thị Hạnh - Institute of Tropical Biology, National center for Science and

Technology of Việt Nam.

Duration: from...6/ 2005 to ...6/2006

Objectives:

On first study on utilization microorganisms stains to produce the preparation

probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs

Main contents:

- Isolation and selection of some acid lactic bacteria, yeast strains with high probiotic

activity.

- Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains.

- Studies the optimal conditions for their receiving biomass .

- Research on technology to produce probiotic.

- To appraise the quality of products.

- On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls.

Results obtained :

+ " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the

digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20th scientfic conference Ha Noi University of

Technology, 10/2006.

+ "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02,

Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006.

+ Finish 1 dissertation of Biology master, 2 dỉssertation Biology bachelors.

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực

phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Những năm gần đây, nhóm

VSV này đƣợc biết đến nhiều hơn với chức năng "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế

dịch bệnh cho ngƣời và vật nuôi. Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh vật sống có lợi

giúp cải thiện sự cân bằng hệ VSV tự nhiên nơi đƣờng ruột, có khả năng cạnh tranh và đối

kháng với mầm bệnh, tiết các chất trung hòa các độc tố, tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, bổ

sung các dƣỡng chất (protein, khoáng, vitamin), kích thích miễn dịch trên cơ thể ngƣời cũng

nhƣ vật nuôi.

Trong chăn nuôi heo, bệnh tiêu chảy là căn bệnh khá phổ biến, gây thiệt hại không

nhỏ đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh này

thƣờng dẫn đến hiện tƣợng loạn khuẩn khiến tiêu chảy kéo dài cùng với những hậu quả

nghiêm trọng cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ môi trƣờng sinh thái. Phƣơng pháp hữu hiệu

nhất khắc phục tình trạng này là tái lập cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột bằng cách bổ sung

một hệ vi khuẩn có lợi mới dƣới dạng các chế phẩm probiotic.

Phòng bệnh bằng chế phẩm tiền sinh học hay còn gọi là probiotic nhằm tăng cƣờng

khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu bền và an toàn sinh học.

Trên thị trƣờng hiện đang lƣu hành nhiều loại chế phẩm probiotic ngoại nhập nhƣ Bye (Mỹ),

Neo-Perk-Porcine (Anh), Lacfeed 66G (Nhật),... cho kết quả tốt nhƣng không ổn định và giá

thành còn cao.

Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc

phục tình trạng trên là việc làm hết sức cần thiết trong điều kiện hiện nay. Đó cũng chính là

lý do khiến chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng các vi sinh

vật tạo chế phẩm Probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo"

Mục tiêu của đề tài:

Sử dụng một số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả

năng phòng và trị bệnh đƣờng ruột cho heo con hiệu quả.

Nhiệm vụ của đề tài:

1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có các hoạt tính cần thiết

của một chủng probiotic.

2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV

đã tuyển chọn.

3. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.

4. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống và tạo chế phẩm probiotic.

5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.

6. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.

7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mô PTN.

Đề tài được thực hiện tại:

- Phòng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trƣờng ĐHSP Tp.HCM

- Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM.

- Phòng thí nghiệm CNSH và SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG

Hà Nội.

- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm tại trại chăn nuôi heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách,

tỉnh Sóc Trăng.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về probiotic

1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic

Khái niệm probiotic đầu tiên đƣợc mô tả nhƣ là hệ VSV trong thức ăn bổ sung cho

ngƣời và vật nuôi.

Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có

chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus" [46].

Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô

tả những VSV có khả năng kích thích sinh trƣởng của một số vật nuôi.

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trƣởng của

heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46].

Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác nhƣ Lee (Singapore),

Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều thống nhất trong định nghĩa

: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt

cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột" [41], [42],

[46].

1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic

Hiện biết có khoảng gần 20 loài VK đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotic. Các VK

lactic có lợi giữ vai trò chính đƣợc sử dụng nhƣ L. acidophỉlus, Lactobacillus delbrueckii

subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve,Enterococcus

faecium , ...

Chúng có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của VSV gây bệnh.

Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đƣờng ruột, tạo môi trƣờng không thuận lợi cho

VSV có hại phát triển. Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H202, sản xuất các

enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B1, B2, B6, B12), khử độc

tố trong đƣờng ruột [1], [42], [46].

Tham gia vào thành phần VSV probiotic còn có nấm men nhƣ Saccharomyces

cerevisiae và Sac. bouiardij. Nấm men ngoài khả năng làm cân bằng hệ VSV trong đƣờng

ruột còn có vai trò tạo ra sinh khối nhanh, sinh khối giàu axit amin, các vitamin (nhóm B, D),

tiết các chất có khả năng hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng lên men chuyển hóa

glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi khác trong đƣờng ruột hoạt động và

sinh sản. Nấm men còn tiết các enzym tiêu hóa nhƣ amylase, protease,... và còn có khả năng

đề kháng lại với tất cả các kháng sinh (trừ kháng sinh nấm). Chính vì vậy, chúng có thể tồn

tại ở bất cứ nơi nào trong đƣờng ruột của vật nuôi mà hoàn toàn không bị kháng sinh tiêu diệt

[1], [11], [42], [46].

Có thể tóm tắt đặc điểm chung của VSV probiotic là :

- Có khả năng gắn vào tế bào.

- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại.

- Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.

- Tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.

- Không lan truyền rộng, không gây ung thƣ và không gây bệnh.

Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56]

Chức năng Dạng sản phẩm

Sữa lên men Kích thích hệ thống miễn dịch

Tăng cƣờng sức khỏe Sữa lên men Sản phẩm, nhà sản xuất, xuất xứ LC1, Nestlé (Mỹ, Pháp, Ý, Anh, Đức) PAIGEN TWINU, Cp-Meiji (Thái Lan)

Lactinex, Hynson (Mỹ) Tăng cƣờng sức khỏe Thuốc bột Chủng VK lactic sử dụng L. bulgaricus L. johnsonii L. bulgaricus L. acidophilus L. bulgaricus L. acidophilus

Bột mịn

BioI, Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM (Việt Nam) L. acidophilus Saccharomyces sp.

L. acidophilus Bột mịn Organic Green, Han Poong (Nam Triều Tiên)

Viên viên nhộng Ultra levure (Pháp) Saccharomyces boulardii

Endomycosis CG2 Chế phẩm dạng bột mịn Emitan (Trƣờng ĐHNN I Hà Nội) Phòng chống các rối loạn tiêu hóa, giảm tiêu hao thức ăn cho heo Phòng chống bệnh tiêu chảy cho heo Phòng chống rối loại tiêu hóa, tăng cƣờng sức khỏe Chữa chứng tiêu chảy, tăng chuyển hóa thức ăn

1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic

- Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh

Khi cung cấp thƣờng xuyên các VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông

khô cho ngƣời và động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ngày), chúng sẽ

phát triển, chiếm ƣu thế và cạnh tranh với các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh

dƣỡng, về khối lƣợng các chất sinh ra bởi VSV [15], [41], [42], [46].

- Sản xuất các chất kháng khuẩn

Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic không chỉ là axit lactic mà còn bởi

những chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ axit hữu cơ, ethanol, H2O2, diacetyl,... [11], [46], [48].

Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh axit lactic thì nhóm VK

lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác nhƣ axit acetic, axit formic, axit

propionic,... Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trƣờng và khi pH đạt đến một mức

nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đƣờng ruột. Chẳng hạn nhƣ các VSV gây

thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các VSV gây

bệnh nhƣ E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium,

Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn). Một số loài nhƣ Lactococcus lactis,

Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H202 khi chuyển từ môi trƣờng kị khí sang hiếu khí.

H2O2 có khả năng ức chế Staphylococus aureus một loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn.

[1], [11]. Hoạt tính ức chế của Diacetyl tăng lên trong môi trƣờng axit, ức chế mạnh hơn đối

với VK G- và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao).

- Kháng khuẩn do sinh bacteriocin

Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein có khả năng ức chế các VK có quan

hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đó. Những nghiên cứu gần đây cho thấy

một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G+ và G-.

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt nhƣ sau : bacteriocin đƣợc hút bám

trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, làm giảm thế năng của màng, gây những thƣơng tổn

không thể khắc phục đƣợc. Sau đó, chúng dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội

bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các axit

amin tích tụ và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài môi trƣờng qua các lỗ thủng

trên màng. Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lƣợng [41], [42], [46], [48].

Zymocin là một loại kháng sinh do một số chủng nấm men tiết ra nhằm chống lại sự

cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần. Chúng có bản chất là

polipeptit hay glucoprotein. Do tính chọn lọc cao nên zymocin còn có tiềm năng chống lại

một số bệnh nan y. Theo Nguyễn Kim Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả

năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả),

trung hòa nội độc tố của E. coli, Vibrio cholerae nên đƣợc dùng trị tiêu chảy cấp tính cho

ngƣời.

- Cân bằng hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột

Đã có nhiều bằng chứng cho thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV

đƣờng ruột nhờ chế phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men. Khi cho bệnh nhân bị

chứng rối loạn dạ dày hay đƣờng ruột sử dụng L. acidophilus, B. biỷidum và B. breve sẽ làm

gia tăng số lƣợng của Lactobacillus và giảm số lƣợng của E. coli trong ruột. Bệnh nhân sử

dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi trong đƣờng ruột

nên ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp. và L. acidophilus để phục hồi hệ

VK đƣờng ruột cho những bệnh nhân này [46].

1.1.4. Vai trò của probiotic

a. Với con ngƣời

- Phòng và trị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm khuẩn ở dạ dày, đường ruột.

Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2

số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể,...

[11], [41], [46]. Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đông

khô cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và

ít nôn mửa, không tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46].

- Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa

Khi cơ thể thiếu enzym B-galactosidase, đƣờng lactose sẽ không đƣợc tiêu hóa thành

glucose và galactose và bị chuyển ngay xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi

những VK đƣờng ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi

cho việc tiêu hóa sữa. Nhƣng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lƣợng lactose sẽ giảm đi, đồng

thời enzym B-galactosidase đƣợc tăng cƣờng nhờ VK lactic sẽ có tác dụng làm giảm đi

những triệu chứng của bệnh này.

- Phòng và trị một số bệnh khác

Việc sử dụng các chế phẩm Probiotic hay sữa chua với liều lƣợng thích hợp sẽ có khả

năng chữa khỏi trên 50% số ngƣời bị táo bón, làm giảm lƣợng cholesterol, cải thiện tình trạng

bệnh nhân bị bệnh gan mãn

tính [41], [46]. Những bệnh nhân nhiễm trùng đƣờng hô hấp và đƣờng niệu có hàm lƣợng

Candida ở trong phân (10 5 tế bào/g phân) rất cao. Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, hàm

lƣợng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46].

Các VK lactic trong chế phẩm probiotic còn có khả năng làm giảm các enzym

Nitroreductase, Azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thƣ thành chất gây

ung thƣ [11], [46]. Chúng có khả năng làm thoái hóa khối u hạn chế sự giảm bạch cầu trong

điều trị phóng xạ, kéo dài sự sống cho bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung và ung thƣ bàng quang

[46], [48].

Bên cạnh đó, nấm men trong chế phẩm probiotic còn có khả năng cung cấp các

vitamin thuộc nhóm B đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, protein giúp tăng cƣờng

sức đề kháng cho ngƣời bệnh, cho những ngƣời ăn kiêng.

b. Với vật nuôi

- Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn

Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho

ngƣời sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK lactic có

chức năng cải thiện khu hệ VSV đƣờng ruột, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, tận dụng thức

ăn,...

Nghiên cứu trên heo con 4 tuần tuổi và heo trƣởng thành với 4 lô thí nghiệm. Kết quả

thu đƣợc cho thấy, khi sử dụng L. acidophilus với liều lƣợng 750mg/kg thức ăn đối với heo 4

tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159 kg và tăng khả năng chuyển

hóa thức ăn. Axit

lactic giúp heo con gia tăng khối lƣợng cơ thể nhƣng nó không có tác dụng trên heo trƣởng

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên

heo con và heo trưởng thành [46]

thành [15], [42], [42], [46].

Chỉ tiêu Đối chứng Lactobacillus S. faecium Axit lactic

0 Lƣợng chế phẩm lấy vào 750mg/kg thức ăn 1250mg/kg thức ăn 220mg/kg thức ăn

Heo con : Tăng trọng trung bình mỗi ngày (kg) 0,145 0,159 0,134 0,145

Hệ số tiêu tốn thức ăn 3,09 2,43 2,82 2,61

Heo trƣởng thành : Tăng trọng trung bình mỗi ngày (kg) 0,84 0,83 0,83 -

Hệ số tiêu tốn thức ăn 3,17 3,20 3,20 -

Bổ sung chế phẩm Saccharomyces cerevisiae cho heo con đang bú có khả năng làm

giảm tỷ lệ tiêu chảy 4,8%, làm tăng trọng lƣợng heo con sau cai sữa từ 2-3% so với đối chứng

và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn trong 17ngày [ll], [42], [46]. - cải thiện sự đề kháng bệnh

Khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia 2 lô thí nghiệm. Ở lô có sử dụng chế phẩm

probiotic - VBP (B. pseudolongum preparation), còn lô đối chứng không sử dụng chế phẩm.

Khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lƣợng 0,5g/ ngày, liên tục

trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần. Kết quả là hiếm thấy bệnh

tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu heo mới sinh. Trong khi đối chứng có hơn

60% mắc bệnh tiêu chảy. Hơn thế, các độc tố đƣờng ruột do các

VK gây bệnh sinh ra có thể đƣợc trung hòa bởi probiotic. Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và

Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]

giảm tỷ lệ chết trên heo con do tiêu chảy.

Vật nuôi Probiotic Liều sử dụng Ảnh hƣởng

B. pseudolongum l g/ngày Bò đực cai sữa Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu chảy

B. pseudolongum 0,5 g/ngày Heo còn bú Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn

L. bulgaricus Heo cai sữa 500 ml/1l 36 g/1l Tỷ lệ % E. coli thấp ở trực tràng, giảm tỷ lệ chết ỡ heo

1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN

a. Những nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc

Ở Việt Nam hiện nay, có thể kể đến các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này của

Viện Thú y quốc gia :

+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo con

(Đào Trọng Đạt, Vũ Đình Hƣng, 1962).

+ Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột của gia súc (Lê

Thị Tài và cộng sự, 1968 - 1978).

+ Chế phẩm VSV (Saccharomyces boulardi) với bệnh phân trắng heo con (Phan

Thanh Phƣợng và cộng sự, 1968 - 1978).

+ Chế phẩm Biolactyl để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Phan Thanh Phƣợng và

cộng sự, 1979 - 1984).

+ Chế phẩm BioI để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Viện Sinh học nhiệt đới TP.

HCM, 2003).

Các nghiên cứu trên khẳng định việc sử dụng chế phẩm probiotic đều cho kết quả tốt

trong phòng, trị bệnh đƣờng ruột cũng nhƣ khả năng điều hòa và kích thích sự sinh trƣởng

của heo.

Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của

Nga trong phòng trị bệnh đƣờng tiêu hóa trên heo và gà. Kết quả thu đƣợc là trọng lƣợng heo

tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát

(VITOM.3).

Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm

EM1 trên heo con đã cho thấy chế phẩm này có tác dụng ức chế đối với E. coli, Salmonella,

Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Sreptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết

quả số lƣợng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và heo tăng trọng nhanh.

b. Những nghiên cứu và ứng dụng ở ngoài nƣớc

Theo Lema và cộng sự (2001), để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã

trộn các VK probiotic với liều 6 x 106 CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho

thấy lô 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lô khác. Khác biệt này hoàn toàn

có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng probiotic.

Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hƣởng của probiotic LSP 122 đến việc

phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên

4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK B. toyoi với liều 106 tế bào/kg thức ăn và lô

4 sử dụng B. licheniformis với liều 106 và 107 tế bào/kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm

giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đối chứng (P< 0,05). Ngoài ra, tăng

trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn ở lô thí nghiệm cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó, lô

sử dụng 107 tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất. Theo Tuomola và cộng sự (1999),

làm thí nghiệm dùng các VK probiotic cho thấy Lactobacillus, L. johnsonii và L. rhamnosus

làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng S. typhimurium bị giảm khả năng bám

dính đến 77% bởi L. johsonii và 83% bởi L. casei.

Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm

có thành phần vi khuẩn probiotic khác nhau nhƣng đều có chung kết luận là probitic đã ảnh

hƣởng có lợi trên nhiều mặt với cơ thể vật nuôi. 1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic

A. Vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách đƣợc axit lactic từ sữa

bò lên men chua.

Năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản

ứng lên men.

Năm 1857, Louis Pasteur (Pháp) chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt

động của một nhóm VK đặc biệt gọi là VK lactic.

Năm 1873, Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium

lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập

đƣợc nhiều loại VK lactic khác nhau và

công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic đã đƣợc hình thành từ năm 1881.

Trong tự nhiên, VK lactic có mặt ở nhiều nơi : trong phân, rác, niêm mạc ruột,... Đặc

biệt có nhiều trong sản phẩm lên men chua. VK lactic ngày càng đƣợc ứng dụng trên qui mô

lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,...

[1], [11], [14], [47], [50].

1.2.1. Đặc điểm hình thái

VK lactic là tên gọi của một nhóm VK thu nhận năng lƣợng nhờ phân giải

cacbonhydrat và sinh ra axit lactic. Chúng đƣợc xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc

dù nhóm VK này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que dài và cả

VK hình cầu), song về mặt sinh lí chúng lại tƣơng đối thống nhất với nhau trong các đặc

điểm sau :

+ Đều là VK Gram dƣơng (G+).

+ Không tạo thành bào tử.

+ Hầu hết không di động.

+ Là VSV hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí không bắt buộc.

+ Đều thuộc loại đa khuyết dƣỡng. 1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic

VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus,

Vagococcus và Bifìdobacteriwn. Những VSV đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thực

phẩm thuộc về các chi

nhƣ Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó Lactobacillus chiếm

vị trí quan trọng nhất [11], [14], [47], [50].

* Streptococcus

Tế bào hình cầu hay oval, đƣờng kính nhỏ hơn 2 m, dạng đôi hay chuỗi ngắn hoặc

dài, ƣa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 370C. Có khả năng phân giải nhiều loại đƣờng nhƣ

glucose, mantose, lactose. Chúng đóng góp vào việc tạo hƣơng vị cho sản phẩm, nhất là chất

lƣợng sữa.

* Lactobacillus

Tế bào hình que dài hoặc ngắn, thƣờng dạng chuỗi, kích thƣớc dao động trong khoảng

0.5-1.2 X 1 - 10 m. Tế bào không di động; gram dƣơng; không sinh bào tử. Chúng là dạng

kỵ khí không bắt buộc, có thể tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 50 C- 530 C nhƣng nhiệt độ tăng

trƣởng tối thích từ 300 C - 400 C. Chúng có thể sống ở pH < 5. Một số chủng thuộc loại kỵ khí

nghiêm ngặt.

Lactobacillus gồm 25 loài, chia thành 3 nhóm đồng hình bắt buộc, dị hình bắt buộc, dị

hình tùy ý. Các nhóm VK lactic này đều tạo ra axit lactic nhƣng axit do từng nhóm tạo ra

khác nhau về cấu hình đồng phân của axit lactic. Lacctobacillus đƣợc sử dụng nhiều trong

công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt cũng nhƣ trong việc tạo các chế phẩm

probiotic.

* Leuconostoc

Tế bào hình oval xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài. Chúng có nhu

cầu cao về mặt dinh dƣỡng. Lên men dị hình tạo axit lactic và các sản phẩm phụ nhƣ axit

acetic, etanol, CO2; Có khả năng tạo hƣơng

thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất nhƣ acetylmetyl carbinol hay acetonin [ll], [14],

[47], [50].

* Bifidiobacterium

Là những trực khuẩn kị khí ; lên men lactic dị hình ; sản phẩm chính là là axit lactic

và axit acetic (tỷ lệ 3:1) cùng với một lƣợng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic ; khác biệt

với các VK lên men lactic dị hình khác là không sinh CO2. Chúng thuộc loại ƣa ấm, nhiệt độ

sinh trƣởng tối thích từ 310 C - 410 C [11], [14], [47], [50].

1.2.3. Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đƣờng với sự tích lũy axit lactic trong

môi trƣờng. Có thể tóm tắt theo phƣơng trình sau:

Các loài VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose. Một vài loài VK lactic lên

men đƣờng tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit

lactic còn tạo rƣợu và CO2, nhóm này gọi là lên men dị hình [11], [14], [47], [50].

1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình

Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (Embden -

Meyerhof - Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%). Mức độ tạo thành các

sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi.

Phƣơng trình tóm tắt:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP

glucose axit lactic

Một số VK lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis, Lactobacillus

acidophilus, L.casei, L. cremoris, L.helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, S.

thermophilus, p. cerevisiae [47], [50].

1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (40%), còn có các sản

phẩm khác nhƣ axit succinic, rƣợu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất khí còn lại (20%)

[14], [47], [50].

Phƣơng trình tóm tắt:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + x Kcal

glucose axit lactic etanol

Một số VK lactic lên men dị hình thƣờng gặp là Leuconostoc mensenteroides,

Leuconostoc cremoris, L. brevis, L. fermentum,... [11], [14], [47].

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic

1.2.4.1. Nguồn cacbon

Nguồn cacbon quan trọng nhất cho VK lactic là monosaccarit và disaccarit. Các

nguồn cacbon này đƣợc dùng để cung cấp năng lƣợng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra

các axit hữu cơ nhƣ axit malic, axit pyruvic,... Tùy từng loại VK lactic khác nhau mà ta chọn

nguồn thức ăn cacbon cho phù hợp.

1.2.4.2. Nguồn nitơ

Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp đƣợc các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ.

Để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi

trƣờng. Chỉ một số ít các loài có khả năng sinh tổng hợp đƣợc các hợp chất chứa nitơ hữu cơ

từ nguồn nitơ vô cơ. Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dƣỡng rất quan trọng

cho quá trình phát triển sinh khối của VK lactic [14], [47], [50].

1.2.4.3. Các muối vô cơ

2\ s2\ Mg2+, Mn2+,... đặc biệt là Mn2+. Chính Mn2+ ngăn cản quá trình tự phân của tế bào

VK lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ nhƣ Cu2+, Fe2+ hoặc Fe3+, K+, PO4" hoặc

PO3

và nó cần thiết cho quá trình sống bình thƣờng của VK lactic. Đối với Lactobacillus thì Mg2+,

Mn2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra axit lactic. Ngoài ra, Mg2+ còn là

chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp VK sử dụng tốt hơn các loại

đƣờng [47], [50].

1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng

Đối với VK lactic, các chất sinh trƣởng bao gồm một trong các loại nhƣ các gốc kiềm

purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo, các thành phần của màng tế bào và

các vitamin thông thƣờng,... Các chất này có vai trò quan trọng trong việc gia tăng sinh khối

và sinh axit lactic của các chủng VK lactic... Rất ít VK lactic có khả năng sinh tổng hợp đƣợc

vitamin [14], [47], [50]. Ngoài vitamin và axit amin, VK lactic còn có nhu

cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển. Chẳng hạn nhƣ các axit hữu cơ nhƣ axit

acetic, axit citric, axit oleic,...

1.2.4.5. Oxy

Đa số VK lactic là loài hô hấp tùy tiện. Chúng không có hệ enzym hô hấp xitocrom

cũng nhƣ hệ enzym catalase. Chúng vẫn có khả năng oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy

phân tử. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng hệ enzym peroxydase có trong VK lactic có thể

thực hiện các chức năng thay cho hệ enzym dehyrogenase, khi đó oxy đƣợc sử dụng nhƣ là

chất nhận hydro. Quá trình oxy hóa ở VK lactic thƣờng kèm theo việc tạo thành H202. Một số

VK lactic (Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus faecaỉis, Lactobacillus brevis,...) có thể

khử đƣợc H202 thành H20 cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hoa [11], [14], [47],

[50].

Phƣơng trình tóm tắt

Peroxydase

NADH + H+ + H202 NAD+ + H20 + 1/2 02

1.2.4.6. Nhiệt độ

Khoảng nhiệt độ phát triển của VK lactic khá rộng. Nói chung đa số VK lactic có thể

phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 150C - 400C. Nhiệt độ ảnh hƣởng nhiều nhất đến các phản

ứng enzym. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ƣu trong khoảng 400C - 450C đƣợc gọi là VK

ƣa nhiệt. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ƣu trong khoảng 200C- 400C đƣợc gọi là loại ƣa

ấm [14], [47], [50]. Các VK lactic sống trong đƣờng ruột ngƣời và động vật hầu hết thuộc

loại ƣa ấm.

1.2.4.7. pH

Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzym của chúng, chịu tác động mạnh của

pH. Mỗi enzym đều có vùng pH tối ƣu mà tại đó hoạt lực của enzym là mạnh nhất. Đa số các

VK lactic có pH tối ƣu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilius) ; 5,5 - 6,5 (Pediococcus) ;

6,3 - 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống VK lactic có thể chịu đƣợc là

khác nhau. Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu đƣợc pH = 3,2 -3,5 ; Pediococcus có thể chịu

đƣợc pH = 3,5 - 4,4.

Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các loại

VSV khác. Sau đó khi lƣợng axit tích lũy đủ lớn thì chính VK lactic cũng bị ức chế. Sự axit

hoa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào axit lactic. Chính axit lactic lại là một chất ức chế,

đặc biệt là khi nó ở dạng không phân ly. Axit lactic là một axit có độ phân ly trung bình (pKa

= 3,86) (Gatje, Gottsegalk, 1991).

1.2.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ

đời sống

VK lactic đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ công nghiệp,

nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học, trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục

vụ đời sống. Trong công nghiệp, VK lactic đƣợc sử dụng để lên men thu nhận axit lactic.

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, VK này đƣợc dùng để lên men các sản phẩm từ sữa,

từ thịt, tạo ra các phụ gia thực phẩm. Đáng kể nhất hiện nay, là việc ứng dụng VK lactic trong

sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp và các vấn đề chống ô nhiễm và bảo vệ

môi trƣờng.

Trong chăn nuôi, ngƣời ta sử dụng VK lactic để ủ chua thức ăn gia súc. Trong quá

trình lên men, ngoài axit lactic còn có một số chất có giá trị nhƣ chất thơm, vitamin, kháng

sinh,... Do đó, thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dƣỡng, góp phần làm tăng

năng suất trong chăn nuôi. Một số chủng VK lactic thƣờng dùng là L. plantarum,

Leuconostoc mesenteroides.

Hiện nay có rất nhiều các chế phẩm probiotic ra đời để phục vụ cho chăn nuôi. Khi

đƣa probiotic vào đƣờng tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát

triển và nhân nhanh số lƣợng, tạo môi trƣờng axit ở ruột non và ruột già, tiết ra các chất

kháng sinh làm ức chế và tiêu diệt các VSV có hại, không cho chúng phát triển. Từ đó, làm

giảm các bệnh về đƣờng tiêu hoa nhƣ tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, hoại thƣ, táo bón,... Ngoài

ra, chúng còn tiết ra các axit hữu cơ và các enzym tiêu hóa nhƣ protease, pectinase,... làm

tăng hệ số chuyển hóa thức ăn ở gia súc, gia cầm [11], [14], [47], [50].

Cùng với các biện pháp hóa học, các chế phẩm sinh học cũng ra đời để phục vụ cho

trồng trọt. Các chế phẩm gây tiếng vang mạnh mẽ hiện nay là chế phẩm EM hay chế phẩm vi

sinh hữu hiệu. Chế phẩm này đƣợc coi là có hiệu quả rất mạnh trong việc cải tạo đất, tăng

năng suất cây trồng và giải quyết các vấn nạn về ô nhiễm môi trƣờng. Quan trọng là VK

lactic không tạo ra các sản phẩm độc hại cho các VSV sống chung trong chế phẩm cũng nhƣ

cho môi trƣờng sống và cây trồng [11], [14], [47], [50].

B. Nấm men

Nấm men là đại diện của VSV nhân chuẩn. Chúng có dạng hình cầu, hình trứng, hình

ovan, hình elip,... Một số nấm men có khả năng hình thành khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả. Kích

thƣớc trung bình 3-5x5- 10 micromet. Cấu tạo TB nấm men gồm :

Thành tế bào dày 25nm, cấu tạo bởi glucan, manan cùng với khoảng 15% protein ở

hầu hết nấm men. Chức năng của thành là bảo vệ hình dạng, duy trì áp suất thẩm thấu, điều

hòa quá trình trao đổi chất tế bào.

Màng tế bào cấu tạo nhƣ màng cơ bản với độ dày 75 - 80nm. Chức năng của màng

điều hòa quá trình trao đổi các chất qua màng. Bên trong màng là khối tế bào chất chứa các

bào quan nhƣ riboxom, ti thể, không bào, mạng lƣới nội chất, thể Golgi cùng với các chất dự

trữ.

Riboxom có 2 loại 70S chứa trong ti thể, 80S phân bố tự do trong TBC . Riboxom là

nơi tổng hợp protein cho TB.

Ti thể hình elip, cấu trúc màng kép, cấu tạo protein và lipit và các hạt cơ bản. Ti thể là

trung tâm hô hấp và giải phóng năng lƣợng cho TB.

Không bào là những khoang nhỏ đƣợc bao bởi màng mỏng bên trong chứa dịch bào

với thành phần gồm protit, lipit, gluxit, các chất khoáng. Vai trò của không bào điều hòa áp

suất thẩm thấu của tế bào.

Mạng lưới nội chất gồm 2 loại là mạng lƣới nội chất có hạt và mạng lƣới nội chất

không hạt. Đó là hệ thống các túi dẹt, ống phân nhánh, thông với nhau và có vai trò tích cực

trong quá trình trao đổi chất của tế bào.

Thể Golgi gồm nhiều túi nhỏ dẹt không thông với nhau. Chức năng thể này là sắp xếp,

bao gói, phân loại, chọn lọc các đại phân tử và chuyển đến những nơi cần thiết.

Nhân của nấm men có cấu tạo điển hình với màng nhân và nhân con. Nhân thƣờng có

hình cầu hay bầu dục, đƣờng kính 2 micromet. Thành phần hóa học của nhân gồm protein,

ADN, ARN, các enzim. Trong thể nhiễm sắc ADN liên kết với protein histon tạo thành

những sợi nucleoprotein dày khoảng 10nm. Nhân tham gia điều khiển mọi hoạt động sống

của tế bào.

Thành phần hóa học của nấm men nhƣ sau: protit từ 45 - 54%, gluxit 25-35%, lipit

1,5 - 5%, các chất khoáng từ 6 - 12% gồm cả các yếu tố đại lƣợng và vi lƣợng. Protit nấm

men có giá trị sinh học rất cao vì chứa tất cả các axit amin không thay thế. Về trữ lƣợng axit

amin không thay thế thì protit nấm men gần với protit động vật. Về giá trị dinh dƣỡng nấm

men không thua kém bột cá, bột thịt. Ngoài ra, nấm men còn chứa rất nhiều VTM nhóm B

(mg/ khối lƣợng khô) gồm B1 - 156,0; B2 - 100; B3 - 100; B4 - 710; B6 - 20; PP - 22, H -

0,6; axit folic - 13. Các loài nấm men nhƣ Sac. cerevisiae, Sac. uvarum chứa nhiều vitamin

D2 và D3. Đặc biệt VTM nấm men có hoạt tính gấp 2 - 3 lần VTM tổng hợp.

Nấm men sinh sản vô tính chủ yếu bằng nảy chồi, số ít sinh sản bằng phân đôi. Sinh

sản hữu tính bằng bào tử túi.

Chúng có thể phát triển tốt trong môi trƣờng ở nhiệt độ 20 - 400C; pH: 4-6; hàm lƣợng

oxy 10-15 mmol/l/h với nồng độ đƣờng thích hợp 10 - 20%. VTM nhóm B, các nguyên tố

khoáng nhƣ P, K, Cl, Mg, Ca,... có tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của nấm men. Nấm

men phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhƣ đất, bề mặt trái cây, lá, hoa hay các cây lƣơng thực

và thực phẩm khác. Trong điều kiện yếm khí chúng lên men đƣờng tạo thành

rƣợu, còn trong điều kiện hiếu khí chúng tạo thành sinh khối tế bào. Chính vì vậy, nấm men

đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, trong nông

nghiệp, y tế và đời sống. Do thành phần dinh dƣỡng phong phú và có giá trị nên sinh khối

nấm men thƣờng đƣợc bổ sung vào nguồn thức ăn cho ngƣời và gia súc hoặc sản xuất các chế

phẩm sinh học phục vụ đời sống, chăn nuôi và trồng trọt.

1.3. Tổng quan về heo

1.3.1. Vị trí phân loại của heo

Loài : Sus domesticus

Giống : Sus

Họ : Suidae

Bộ : Artiodactyla (Bộ guốc chẩn)

Lớp : Mammalia (Thú)

Ngành : Chordata (Dây sống)

1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con

1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa

Heo con mới sinh, sự tiết các enzym tiêu hóa ở dạ dày và ruột non còn yếu, chỉ đủ sức

tiêu hóa các loại thức ăn đơn giản, dễ tiêu nhƣ sữa mẹ. Khả năng tiết HCL của dạ dày rất ít,

chỉ đủ để hoạt hóa men pepsinogen thành pepsin, lƣợng axit tự do quá ít, không đủ làm tăng

độ toàn của dạ dày. Do pepsin hoạt động yếu, sự tiêu hóa protein sữa phải nhờ enzym trypsin

của tuyến tụy. Trong 2 tuần tuổi đầu tiên, heo con không có enzym amylase của tuyến tụy.

Amylase của tuyến nƣớc bọt tiết nhiều nhất vào lúc 2 - 3 tuần tuổi, sau đó giảm 50%. Trƣớc

20 ngày đến một tháng tuổi,

dạ dày heo con hầu nhƣ không tiêu hóa đƣợc protein thực vật. Do vậy, vi khuẩn bất lợi theo

đƣờng miệng có khả năng sống sót ở dạ dày, phát triển ở ruột non và gây ra tiêu chảy. Số

lƣợng và hoạt tính của các enzym tiêu hóa sẽ tăng dần theo ngày tuổi và đến tuần thứ 7 mới

đạt đƣợc mức độ nhƣ heo trƣởng thành [15], [16], [17].

1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột

Khi heo mới sinh, hệ VSV đƣờng ruột chƣa có hoặc có rất ít. Nhờ quá trình bú mẹ và

liếm láp trên nền chuồng mà VSV từ bên ngoài đã dần đi vào đƣờng tiêu hoa của heo con.

Hầu hết VSV từ bên ngoài đi vào đƣờng tiêu hóa sẽ bị tiêu diệt và thải ra ngoài. Một số ít

thích nghi đƣợc sẽ sinh sản, phát triển và tạo thành hệ VSV đƣờng ruột và đƣợc chia làm 2

loại:

+ Loại VSV tùy nghi thay đổi tùy theo thức ăn, môi trƣờng đƣờng tiêu hóa, sức đề

kháng của cơ thể,... nhƣ nấm men, nấm mốc, Proteus, Salmonella, Klebsiella, E. coli,

Clostridium, Shigeỉla, ... đa số chúng thích nghi với môi trƣờng pH trung tính đến kiềm [15],

[16], [17].

+ Loại VSV bắt buộc thích nghi với môi trƣờng dạ dày - ruột và tham gia phân giải

các chất dinh dƣỡng. Chẳng hạn nhƣ VK lactic, VK sản sinh amylase và protease, một số VK

tổng hợp vitamin nhóm B. Các VSV gây thối rữa lại là nguồn gây bệnh đƣờng ruột (E. Coli)

cho vật nuôi [15], [22], [23].

1.3.3. Các bệnh đường ruột ở heo con

1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli

- Nguyên nhân : Có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy ở heo con nhƣ do bộ máy

tiêu hoa của heo con phát triển chƣa hoàn chỉnh, do điều

kiện chăm sóc, nuôi dƣỡng kém, không đƣợc bú sữa mẹ, do heo con bị nhiễm lạnh, do bú quá

nhiều làm cho thức ăn không tiêu, do không đƣợc cung cấp đầy đủ chất sắt, vệ sinh chuồng

trại kém làm cho mầm bệnh xâm nhập vào đƣờng tiêu hóa gây tiêu chảy ở heo con. Nguyên

nhân chủ yếu do các VK gây bệnh nhƣ E. coli và Salmonella choleraesuis [15], [22], [23],

[32].

1.3.3.2. Tiêu chảy do Saimonella (Phó thƣơng hàn)

Thời gian nung bệnh 3-4 ngày. Tỷ lệ heo con theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh cao

hơn các lứa tuổi khác. Thể viêm cấp tính xảy ra trên heo con theo mẹ với các triệu chứng nhƣ

tiêu chảy phân vàng, nhiều nƣớc, sốt vừa (40,60 C- 41,50 C), sau vài ngày vi trùng xâm nhập

vào phổi gây viêm phổi, có thể thấy xuất huyết ở vùng da mỏng sau 5-6 ngày mắc bệnh, heo

con suy nhƣợc nặng, nằm liệt, có thể co giật nhẹ rồi chết, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% [15],

[22].

1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị

1.3.4.1. Phòng bệnh

Phòng bệnh cần phải chú trọng đến sự giảm tỷ lệ ô nhiễm E. coli cƣờng độc ở môi

trƣờng xung quanh bằng chế độ vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện chăn nuôi thích hợp,

đồng thời bảo đảm miễn dịch cao. Một trong những yếu tố quan trọng nhất để phòng bệnh

tiêu chảy do E. coli là duy trì cho heo con môi trƣờng thích hợp (320 C - 340 C đối với heo

chƣa cai sữa và 280 C - 300 C cho heo vừa mới cai sữa). Khẩu phần ăn cần đƣợc cải tiến nhằm

giảm sự khu trú E. coli trong ruột. Việc bổ sung axit lactic vào

nƣớc uống có thể làm giảm độ pH trong dạ dày và sẽ ức chế sự nhân lên nhanh chóng của

VK E. coli gây bệnh.

1.3.4.2. Điều trị

a. Điều trị bằng kháng sinh

Trong thực tế rất nhiều loại kháng sinh đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh tiêu chảy do

E. coli, Salmonella, cầu trùng,... nhƣ ampicillin, tetracyclin, chloramphenicol, cephalothin,

gentamicin, neomicin, ... Nguyên nhân hiệu quả thuốc kháng sinh bị giảm là do sự nhờn

thuốc của VK đƣờng ruột. Ngoài kháng sinh có thể dùng các chế phẩm sulíamid và nitrofuran

để điều trị. Tuy nhiên việc điều trị bằng kháng sinh dài ngày thƣờng dẫn đến tiêu chảy kéo

dài do sự mất cân bằng sinh thái của hệ VSV đƣờng ruột cùng với dƣ lƣợng kháng sinh tồn

dƣ trong sản phẩm gây hậu quả khôn lƣờng cho sức khỏe ngƣời dùng.

b. Điều trị bằng các chế phẩm probiotic

Trong đƣờng ruột của động vật, hệ VSV luôn ổn định sẽ bảo đảm trạng thái cân bằng

cho hoạt động của đƣờng ruột. Khi hệ VSV đƣờng ruột đƣợc cân bằng thì những VSV có lợi,

phần lớn là VK lactic chiếm đến 90%, hoạt động hữu ích cho đƣờng ruột. Nếu sự cân bằng bị

phá vỡ thì những VK có hại cạnh tranh phát triển, gây rối loạn đƣờng tiêu hóa, gây tiêu chảy.

Loại VK thƣờng gặp là E. coli, Enterococcus, Clostridium, Proteus,...

Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã chế nhiều chế phẩm khác nhau từ

các VK hữu ích - nhóm VK lactic và chủ yếu là từ Lactobacillus. Đôi khi, ngƣời cũng bổ

sung thêm nấm men vào các chế

phẩm này nhằm cung cấp thêm nguồn vitamin, protein, tạo sự cân bằng cho hệ VSV đƣờng

ruột.

Các chế phẩm probiotic dùng trong gia súc có thể đƣợc đƣa vào cơ thể dƣới dạng

nƣớc. Ở nƣớc ta, các chế phẩm B. subtilis, yaourt, men tiêu hóa, biolactyl đều là dạng thuốc

nƣớc dùng cho gia súc uống. Chế phẩm probiotic cũng có thể đƣợc chế tạo thành dạng bột

hoặc dạng hạt để trộn vào thức ăn.

Tóm lại, việc sử dụng chế phẩm probitic trong chăn nuôi ngoài khả năng phòng, trị

tiêu chảy mà còn đem lại nhiều lợi ích khác trên nhiều mặt ở vật nuôi.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Nguyên liệu

Nguồn phân lập từ các loại thực phẩm lên men lactic, các chế phẩm men tiêu hóa

nhƣ Lactéol fort, Lactomin plus, Untra levure.

Các chủng VK kiểm định : Santeu sp., Streptococcus sp., B. subtilis, B. pimitilis,

Prabli sp., Sal. typhimurium, Sar. lutea, Serratia sp., Shi. flexneri, Klebsiella sp.,

Enterococcus sp, E. coli, Sai. choleraesuis do Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐHQG Hà Nội

và Viện Pasteur Tp.HCM cung cấp.

Enzym -amylase và protease do Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM cung cấp. Đĩa

giấy kháng sinh chuẩn do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp.

2.1.2. Môi trường (xem Phần phụ lục)

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phương pháp Koch [13]

2.2.2. Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phương pháp cấy chấm điểm [12], [13],

[25], [36], [37]

Dựa vào đặc tính của chủng VK lactic trên MT cacbonat - agar là CaCO3 sẽ tan khi

tác dụng với axit lactic tạo nên vòng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn lạc. Xác định khả

năng sinh axit lactic sau 4 ngày bằng hiệu số (D - d, mm).

D : Đƣờng kính vòng phân giải CaCO3.

d : Đƣờng kính khuẩn lạc VK lactic. 2.2.3. Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25],

[36], [37]

Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nƣớc cất và 1 hoặc 2 giọt phenolphtalein 1%

trong cồn. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi màu hồng xuất hiện bền trong 30 giây thì

0T = số ml NaOH x 10

dừng lại. Đọc số ml NaOH 0,1N đã chuẩn rồi ghi lại. Tính độ axit bằng công thức :

% axit lactic = 0T x 0,009

(0T: Độ Therner, 1 độ Therner tƣơng ứng với 0,00 9g axit lactic) 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

2.2.4.1. Các đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic

* Quan sát hình thái khuẩn lạc [12], [13], [36].

* Quan sát hình thái tế bào bằng tiêu bản nhuộm Gram [12], [13], [36].

2.2.4.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá [12], [13, [36], [37]

Nguyên tắc : Dựa vào sự chuyển hóa màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng

dƣơng tính hay âm tính với các đối tƣợng nghiên cứu.

Tiến hành : dựa vào khóa phân loại của Bergey’s, với các chỉ tiêu cơ bản sau :

* Khả năng di động;

* Kiểu hô hấp;

* Hoạt tính catalase;

* Thủy phân tinh bột, cazein;

* Khả năng sinh khí từ glucose;

* Nhiệt độ;

* pH ban đầu, nồng độ muối thích hợp cho sự phát triển;

* Khả năng axit hóa môi trƣờng;

* Khả năng lên men các loại đƣờng.

Căn cứ vào khả năng lên men một số loại đƣờng tạo thành axit lactic của VK. Sự có

mặt của axit lactic sẽ làm thuốc thử phenol trong MT từ màu đỏ chuyển thành màu vàng.

Pha chế các MT - MRS trong đó glucose đƣợc thay bằng các loại đƣờng cần nghiên

cứu : saccharose, maltose, galactose, lactose, sorbitol, dextrin. Điều chỉnh pH MT hơi ngả về

kiềm, có bổ sung chất chỉ thị màu đỏ phenol, khử trùng 1 atm. Bổ sung 1% (v/v) dịch VK vào

MT ứng với những nguồn cacbonhydrat khác nhau. Nuôi cấy tĩnh ở 300 C/2 ngày. Nếu VK

lên men loại đƣờng nào thì chúng sẽ sinh axit làm pH của MT đó giảm và có màu vàng.

* Xác định các dạng đồng phân của axỉt lactic đƣợc tạo ra bằng enzim

Xác định các dạng đồng phân của axit lactic cho biết những thông tin quan trọng để

xác định tên loài đặc biệt là các loài thuộc chi Lactobacilus. Phần lớn các loài thuộc chi này

có dạng đồng phân của axit lactic là L-LDH. Sử dụng bộ kít F-kit (Beolinger Manheim Co.

Ltd, Germany) để xác định các đồng phân của axit lactic. Phƣơng pháp này cần có máy đo

quang phổ ở bƣớc sóng 254 nm.

* Xác định axit diaminopimelic của vi khuẩn

Nguyên tắc : Ninhydrin phản ứng với nhóm - NH2 của xit diaminopimelic ở 1000 C

tạo ra các sản phẩm có màu tím đỏ.

Tiến hành : Cho khoảng 50mg tế bào ƣớt vào ống thủy tinh có nút vặn. Thủy phân TB

bằng ống nghiệm có 1 ml 6N HC1 ở 1000 C tại nồi ổn nhiệt khô. Làm lạnh dịch thủy phân tới

nhiệt độ phòng.

Bổ sung 2ml nƣớc cất vô trùng. Loại bỏ phần cặn bằng giấy lọc. Chấm chừng 3ml

dung dịch lên giấy sắc ký bản mỏng. Dùng 1 microlit của 0,01M DL-diaminopimelic axit làm

dung dịch chuẩn. Đặt sắc ký bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol -

nƣớc - 6N HC1 - piridin (80 : 26 : 4 : 10) trong 3 giờ hoặc lâu hơn. Phun dung dịch 0,2%

ninhydrin (để nhận biết các axit amin trong nƣớc bão hòa n-butanol) lên giấy sắc ký bản

mỏng, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000 C trong 5 phút. vết DAP - isome tách rời, xuất hiện

trên giấy màu tím đỏ. L-isome (Rf 0,29), DAP - isome (Rf 0,24) và xuất hiện chậm hơn axit

amino khác chạy nhanh hơn so với các meso- isome (Rf 0,37 - 0,80).

2.2.5. Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ

thạch [12], [13], [25], [36], [37].

Dựa vào sự khuyếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy vào MT thạch, chỗ nào

có chất ức chế khuyếch tán nơi đó VSV kiểm định không mọc đƣợc và tạo thành vòng vô

khuẩn.

Hoạt tính ức chế đƣợc đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm).

D : Đƣờng kính vòng ức chế

d : Đƣờng kính lỗ khoan, d = 9 mm.

(*) Chuẩn bị ống nghiệm chứa 15 ml môi trƣờng MPA-agar để nguội đến 400 C. Sau

khi trộn với VK kiểm định rồi mới đổ ra đĩa petri. Đợi thạch đông rồi đục lỗ có đƣờng kính 9

mm.

Phƣơng pháp tiến hành đƣợc tiến hành theo sơ đồ sau

Các chủng vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn kiểm định

Nuôi trong MPA dịch thể ở 300 C trong 18 giờ Nuôi trong MRS dịch thể ở 300 C trong 18 giờ

Trộn đều 30μl dịch huyền phù VSV kiểm định vào 15ml MPA (*)

Ly tâm 4500 vòng/phút trong 15 phút để loại sinh khối -Khoan lỗ d = 9mm

Nhỏ 0,1 ml dịch ly tâm vào lỗ thạch

Giữ trong tủ lạnh 40 C trong 4 - 8 giờ

Chuyển sang nuôi ở 300C trong 18 giờ

Hình 2.1. Phương pháp khoan lỗ thạch

Kiểm tra vòng vô khuẩn

2.2.6. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic

* Phƣơng pháp dùng đĩa giấy kháng sinh chuẩn [12], [13]

Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên MT thạch, ức chế các VSV mẫn cảm với

chúng và tạo ra vòng vô khuẩn. Những VSV nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì

không tạo vòng kháng khuẩn.

Hoạt hóa các chủng VK lactic cần nghiên cứu. Dùng pipet vô trùng hút 30 l dịch

huyền phù VK lactic nhỏ vào giữa đĩa petri có chứa MT-MRS agar. Dùng que gạt vô trùng

dàn đều dịch VK khắp mặt thạch.

Sau khi mặt thạch khô, dùng cặp vô trùng cẩn thận đặt các khoanh giấy lên trên bề

mặt hộp petri đã cấy VK lactic sao cho các khoanh giấy cách đều nhau và cách tâm 2,5 cm.

Mỗi hộp đặt 3 đĩa giấy kháng sinh. Đặt các hộp vào tủ ấm 370 C trong 16 - 18 giờ rồi lấy ra

kiểm tra kích thƣớc vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa giấy kháng sinh. Nếu vòng vô khuẩn

từ 15-25 mm, VK lactic không có khả năng kháng kháng sinh; nếu vòng vô khuẩn từ 11 - 14

mm, VK đƣợc coi là có khả năng đề kháng rất yếu với kháng sinh; nếu vòng vô khuẩn < 10

mm, VK đƣợc coi là có khả năng đề kháng với kháng sinh; còn nếu không có vòng vô khuẩn,

VK đƣợc coi là có khả năng đề kháng mạnh với các chất kháng sinh.

2.2.7. Phương pháp bảo quản giống VK lactic bằng phướng pháp đông khô

Các chủng VK lactic đƣợc nuôi trên MT MRS dịch thể với những điều kiện tối ƣu tới

pha cân bằng (18 đến 24 giờ), ly tâm với tốc độ 3500 vòng/15 phút để thu sinh khối. Cho sinh

khối tế bào của từng chủng vào từng ống đông khô chuyên dùng có sẵn 2 ml MT bảo quản

(sữa gầy 10% + glutamat 1%), để các ống đông khô vào tủ lạnh (50C) khoảng 12 giờ cho MT

thật đông. Sau khi MT bảo quản đông lại, chuyển các ống đông khô vào máy đông khô, điều

chỉnh các thông số : nhiệt độ từ -450C đến -500C, áp suất chân không 20 mBar, thời gian

đông khô từ 24 đến 27 giờ. Mẫu đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ

lạnh.

2.2.8. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên

môi trường thạch [12], [13], [36], [37]

Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml mẫu nhỏ vào

giữa đĩa petri có chứa môi trƣờng MRS-agar và gạt đều khắp mặt thạch. Mỗi độ pha loãng

cấy 3 đĩa. Sau 2 - 3 ngày, đếm số lƣợng khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa, từ đó tính số lƣợng

tế bào VK lactic trong 1g mẫu hay 1 ml mẫu.

Số tế bào/ 1 ml mẫu = M . a . 10n . N

M : Số khuẩn lạc trung bình của 3 đĩa petri;

a : Số giọt đếm đƣợc trong lml dịch mẫu;

n : Hệ số pha loãng;

N : Hệ số tính theo khối lƣợng khô tuyệt đối của mẫu (=1) 2.2.9. Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang [12], [13]

VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng

truyền suốt bị giảm. Do đó, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán (độ đục) có mối

tƣơng quan thuận với số lƣợng VSV trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD đo

đƣợc tại bƣớc sóng 600 nm trên máy quang phổ.

Nhân giống : Bổ sung 1% (v/v) giống vào các ống nghiệm chứa 10 ml MT- MRS dịch

thể, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng trong 24 giờ. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân

giống vào các ống nghiệm chứa các loại MT nuôi cấy cần khảo sát. Nuôi cấy ở nhiệt độ

phòng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm : 0; 1; 2; 3; 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48 giờ.

Dựa vào giá trị OD600 đo đƣợc và số khuẩn lạc đếm đƣợc ở mỗi giá trị OD600 tƣơng

ứng, suy ra mật độ tế bào tƣơng ứng với các giá trị OD600 ở các thời điểm khác nhau. Xác

định số lƣợng tế bào ứng với mỗi giá trị OD600 đo đƣợc. Từ đó vẽ đồ thị sinh trƣởng của các

chủng.

2.2.9.1. Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng nuôi cấy [12], [36], [37]

Dùng 5 loại MT khác nhau để khảo sát : MT MRS dịch thể, nƣớc chiết cà chua, nƣớc

chiết giá đậu, có chất tăng trƣởng, không có chất tăng trƣởng.

Tiến hành đo tƣơng tự nhƣ phần 2.2.5. Dựa vào giá trị OD600, chọn ra MT thích hợp

nhất cho sự sinh trƣởng của VK.

2.2.9.2. Ảnh hƣởng của pH ban đầu [12], [13], [36], [37]

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc

chiết cà chua. Chỉnh pH ban đầu bằng NaOH 1N và CH3COOH 1N về các giá trị pH khác

nhau : 3,5; 4; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7; 7,5. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống

nghiệm chứa các loại MT ứng với từng giá trị pH trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 300 C. Tiến

hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ.

2.2.9.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy [12], [13], [36], [37]

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc

chiết cà chua. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở

các nhiệt độ khác nhau : 250 C, 300 C, 350 C, 400 C, 500 C. Tiến hành đo OD600 tại các thời

điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định đƣợc ở nhiệt độ nào tối ƣu cho sinh

trƣởng của các chủng VK.

2.2.9.4.. Ảnh hƣởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo thành sinh khối [12], [13],

[36], [37]

Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên MT có nguồn nitơ khác nhau

sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc

chiết cà chua với các nguồn nitơ : cao nấm men, dịch chiết nấm men, pepton. Bổ sung 1%

(v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng

chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác

định đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho sinh trƣởng của các chủng VK.

2.2.9.5. Ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men [12], [13], [36], [37]

Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc chiết cà chua với các nồng độ cao

nấm men tƣơng ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào

các ống nghiệm tƣơng ứng với các nồng độ trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng

chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ.

2.2.9.6. Ảnh hƣởng của các nguồn thức ăn cacbon đến sự tạo thành sinh khối [12],

[13], [36], [37]

Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc chiết cà chua với các nguồn

cacbon : glucose, saccharose, maltose, galactose, lactose. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống

vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo

OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ.

2.2.9.7. Ảnh hƣởng của nồng độ saccharose [12], [13], [36], [37]

Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nồng độ saccharose

khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.

Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nƣớc

chiết cà chua với các nồng độ saccharose tƣơng ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung

1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho

từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0; 12; 24; 36; 48 giờ. Dựa vào giá trị

OD600, có thể xác định đƣợc nồng độ saccharose thích hợp cho sinh trƣởng của các chủng

VK.

2.2.10. Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng tạo sinh khối

của tế bào nấm men bằng phương pháp cân sinh khối tươi

Giống nấm men đƣợc hoạt hóa sau 24h trên máy lắc với tốc độ 130 vòng/phút và

chuyển vào MT lên men thu sinh khối ở những điều kiện pH, nhiệt độ, nồng độ oxy, nguồn

nitơ, nguồn cacbon,... cần khảo sát. Ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 4500 vòng/phút. Cân lƣợng

sinh khối tạo thành tại các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24h,...

2.2.11. Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37]

Nguyên tắc

Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn giữa các chủng VK lactic nhằm phát huy hiệu quả tác động

tổng hợp của các chủng VK lactic trong chế phẩm probiotic.

Phƣơng pháp

Tiến hành nhân giống VK lactic, sau đó phối trộn các chủng theo 4 tỷ lệ thể tích

(ml/ml) (1 : 1 : 1 ; 2 : 1 : 1 ;1 : 2 : 1 ; 1 : 1 : 2). Xác định hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ

phối trộn với các VK kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch. Chọn tỷ lệ phối trộn nào

cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.

Phối trộn các chủng VK lactic sau đông khô theo tỷ lệ có hoạt tính kháng khuẩn tốt

nhất để tạo chế phẩm probiotic.

2.2.12. Tạo chế phẩm probiotic

Nhằm làm tăng hiệu quả của chế phẩm. Có thể phối trộn sinh khối VK lactic đã đông

khô cùng với enzym amylaza và proteaza^(l:l) vào chế phẩm probiotic với tỷ lệ 1g chế phẩm

probiotic : l,5g enzym : 1 kg thức ăn. Sau khi phối trộn với enzym, chế phẩm probiotic đƣợc

đóng gói và bảo quản trong bao nhôm, đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng.

2.2.13. Phương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa

2.2.13.1. Điều kiện thí nghiệm

- Chế phẩm P-SP-01 trộn đều vào thức ăn với liều lg chế phẩm/kg thức ăn.

- Tổng số heo con thí nghiệm : 50 con 28 ngày tuổi (sau cai sữa). Heo phát triển bình

thƣờng, không bị bệnh và đã đƣợc tiêm phòng.

- Trọng lƣợng heo : 0,68kg/con .

- Thời điểm bổ sung chế phẩm probiotic: ngày 3 lần sáng, trƣa, chiều.

- Thời gian thí nghiệm : 30 ngày.

- Địa điểm : Trại chăn nuôi heo của anh Bùi Thủy Lâm và chị Ngũ Ái Nữ, 443/1 Ấp

Đông Hải, Xã Đại Hải, Huyện Kế Sách, Tỉnh Sóc Trăng.

Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo bảng sau :

Phân bố Các lô thí nghiệm

Chỉ tiêu

Số lƣợng heo con Lô ĐC 1 10 Lô ĐC 2 10 Lô 3 10 Lô 4 10 Lô 5 10

Tên chế phẩm sử dụng Không BioI P-SP-01 P-SP-01 P-SP-01

Liều sử dụng/kg thức ăn Không 109 tế bào 109 tế bào 109 tế bào 109 tế bào

2.2.13.2. Đánh giá các chỉ tiêu

a. Tỷ lệ tiêu chảy

Theo dõi và ghi nhận hàng ngày số con tiêu chảy ở từng lô

Tỷ lệ tiêu chảy (%) = x 100 Tổng số ngày con tiêu chảy Tổng số ngày con nuôi

b. Tỷ lệ tái phát

Tỷ lệ tái phát (%) = x 100 Số con tái phát Tổng số con khỏi bệnh

c. Tỷ lệ chết do tiêu chảy

Là số heo chết do tiêu chảy đƣợc tính suốt trong quá trình thí nghiệm.

Tỷ lệ chết (%) = x 100 Số con chết do tiêu chảy Số con nuôi

d. Tăng trọng heo con trong thời gian thí nghiệm

Tăng trọng (kg) = Trọng lƣợng ngày kết thúc thí nghiệm - Trọng lƣợng bắt đầu thí

nghiệm .

e. Tiêu tốn thức ăn

Tính lƣợng thức ăn tiêu thụ của các lô thí nghiệm bắng hiệu tổng lƣợng thức ăn cho

heo ăn trừ đi lƣợng thức ăn thừa trong mỗi ngày.

Tiêu tốn thức ăn = x 100 Tổng Kg thức ăn tiêu thụ Tổng Kg tăng trọng

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với yêu

cầu tạo chế phẩm probiotic.

3.1.1. Phân lập và sơ bộ tuyển chọn VK lactic

Từ các nguồn thực phẩm lên men nhƣ sữa chua, dƣa chua, tôm chua, nem chua, kim

chi,... và từ các chế phẩm men tiếu hóa nhƣ Antibio, Lactomin plus, Lactéol fort, Untra

levure, tiến hành phân lập VK lactic theo phƣơng pháp Koch ở độ pha loãng thích hợp trên

MT cacbonat agar, MT - MRS và chúng tôi đã thu đƣợc 34 dạng khuẩn lạc khác nhau tạm gọi

là 34 chủng.

Bƣớc đầu, căn cứ vào khả năng sinh axit lactic và kháng khuẩn của các chủng, chúng

tôi sơ bộ chọn đƣợc 10 chủng có hoạt tính cao nhất để bảo quản và tiếp tục nghiên cứu sâu

hơn.

Chủng nấm men Saccharomyces sp.02 nằm trong bộ sƣu tập giống của phòng thí

nghiệm Vi sinh học.

3.1.2.Tuyển chọn các chủng VK lactic - probiotic

* Để chọn đƣợc các VSV theo yêu cầu, chúng tôi đƣa ra tiêu chí tuyển chọn VK lactic

nhƣ sau :

- Là VK hiện diện bình thường trong đường ruột của heo.

- Tạo axít lactic cao, chịu pH thấp của MT.

- Có khả năng ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh, VK gây thối.

- Đề kháng được các chất kháng sinh đường ruột.

- Làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thu các chất dinh dưỡng.

Để đạt đƣợc yêu cầu này, chúng tôi lần lƣợt khảo sát các chỉ tiêu sau làm cơ sở cho sự

tuyển chọn.

3.1.2.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng

Chúng tôi tiến hành định tính và định lƣợng axit lactic của các chủng bằng cách đo

kích thƣớc vòng phân giải CaCO3 trên MT cacbonat - agar sau 48h cùng với phƣơng pháp

chuẩn độ Therner dịch nuôi cấy VK sau 24 giờ, kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.1. và

minh họa trong hình 3.1.

STT Ký hiệu

Nguồn gốc phân lập chủng

Bảng 3.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng VK lactic Vòng phân giải CaCO3 (D - d, mm) 22 20 20 16 16 18 17 18 18 20

Hàm lƣợng axit lactic (g/l)

Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L2 và chủng B sau 48h

Mắm tôm chua Kim chi Lactomin plus Sữa chua Sữa chua Dƣa cải chua Antibio Dƣa giá Kim chi Nem chua Phản ứng với uphenmen + + + + + + + + + + 1,46 1,44 1,42 1,27 1,26 1,29 1,25 1,31 1,36 1,40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B N4 L2 B1 N1 K4 K5 C7 L1 L3

* Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, tất cả các chủng VK khảo sát trên đều là VK

lactic. Trong số các chủng trên có 3 chủng : B, N4, L2, có kích thƣớc vòng phân giải CaCO3

lớn hơn cả (D - d 20 mm), tƣơng ứng với hàm lƣợng axit lactic cao nhất ( 1,40 g/1). Từ

đó, cho thấy kết quả định tính và định lƣợng axit lactic trên các mẫu khảo sát của chúng tôi là

hoàn toàn thống nhất.

3.1.2.2. Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định

Tiếp tục khảo sát hoạt tính đối kháng của 10 chủng VK lactic trên với 13 chủng VK

kiểm định chuyên gây bệnh đƣờng ruột cho ngƣời và vật nuôi bằng phƣơng pháp khoan lỗ

thạch. Hoạt tính ức chế, đối kháng của VK đƣợc đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm). Kết quả

Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng của VK lactic đối với VK kiểm định (D - d, mm)

trong

Kí hiệu chủng

Gram Khả năng gây bệnh VK kiểm định B

E. coli Khả năng dối kháng của VK lactic với VK kiểm định (D - d, mm) B1 N1 N4 K4 K5 C7 L1 L2 13 7 L3 7 12 7 6 4 6 8 14 G-

s. typhimurium s. choleraesuis Klebsiella sp. Serratia sp. G- G- G- G- 22 27 23 16 6 7 16 16 8 8 13 17 28 25 17 15 6 7 16 13 6 5 17 13 5 4 16 14 10 8 19 11 29 22 17 17 7 7 14 14

G- Shigella flexneri 28 31 27 35 31 25 28 27 32 31

Viêm ruột, tiêu chảy Sốt thƣơng hàn Trực khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Trực khuẩn lị

VK cơ hôi gây bệnh đƣờng ruột

Prabli sp. Santeu sp. Sarcỉna lutea Enterococcus sp. Bacillus pimitilis Streptococcus sp. Bacillus subtilis G- G- G- G+ G+ G+ G+ 21 25 0 9 24 29 27 19 17 0 9 7 18 20 15 17 0 0 7 21 17 20 23 0 9 22 28 25 11 21 0 2 7 15 21 17 20 0 7 7 14 15 14 17 0 7 7 13 22 17 21 6 11 7 16 23 21 24 9 9 22 17 26 19 18 3 9 5 18 24

* Nhận xét

Chúng tôi nhận thấy, hầu nhƣ tất cả các chủng VK khảo sát đều có khả năng ức chế

với các chủng VK kiểm định ở mức độ khác nhau. Trong đó, chủng B, N4, L2 có khả năng ức

chế các VK gây bệnh đƣờng ruột khá mạnh (D - d >= 14 - 29 mm), có phổ kháng khuẩn rộng

(ức chế cả VK G- lẫn VK G+). Đặc biệt, cả ba chủng đều có khả năng ức chế mạnh đối với

các VK gây bệnh thƣơng hàn và tiêu chảy cho heo nhƣ Salmonella typhimurium, Salmoneỉla

choleraesuis (D - d >= 22 - 27 mm), ức chế rất mạnh đối với Shigella flexneri (D - d > 28 -

35 mm). Đây là trực khuẩn lị có tỷ lệ kháng lại các kháng sinh rất cao. Chúng ức chế khá

Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng E. coli và S. typhimurium của chủng B, N4 và L2

mạnh với E. coli (D - d > 12 - 14 mm).

Kết quả trên cho thấy axit lactic là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến

khả năng kháng khuẩn của VK lactic. Nhƣ vậy, các chủng có khả năng ức chế mạnh, phổ

kháng khuẩn rộng đồng thời là các chủng có khả năng sinh axit cao.

3.1.2.3. Khảo sát hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh

Bằng phƣơng pháp dùng đĩa giấy kháng sinh chuẩn, chúng tôi tiến hành xác định hoạt

tính đề kháng với thuốc kháng sinh của 10 chủng VK lactic. Các kháng sinh là : gentamycin

(Ge), neomycin (Ne), nalidixic axit (Ng), kanamicin (Ka), ampicilin (Am), tetracilin (Te),

cloramphenicon (Clo), ceftazidim (Ce) đƣợc sử dụng với liều tối thiểu có khả năng ức chế sự

phát triển của vsv gây bệnh (5 - 30 microgam).

Xác định kích thƣớc vòng vô khuẩn trên các đĩa giấy kháng sinh chuẩn sau 48h. Nếu

D - d > 15 - 25 mm, kháng sinh đã có tác dụng và VK này đƣợc xem là không có khả năng đề

kháng với các chất kháng sinh; nếu D - d < 10 mm, tác dụng của kháng sinh là rất yếu hoặc

không có nên VK này đƣợc xem là có khả năng đề kháng với các chất kháng sinh.

Bảng 3.3. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của VK lactic

Hiệu số D - d càng nhỏ thì hoạt tính kháng kháng sinh càng mạnh.

Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh Số TT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ge + + + - + - - + - Ne + + - + - - - - + - Ng + + - + - - + - + - Kn + - - + - - - - + - Am - - + - - + + - - - Te - + - - - - - + - - Clo - - - - - - - - - + Ce - - - - + - + - - - Ký hiệu chủng B B1 N1 N4 K3 K4 C7 L1 L2 L3

Ghi chú : - : Không kháng + : Kháng

* Nhận xét

Nhƣ vậy, khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của các chủng VK trên không

đồng đều với 5 loại kháng sinh. Khả năng kháng nhiều nhất với Ge và Ng là 5 chủng, với Ne

là 4 chủng, với Am, Kn là 3 chủng, với Kn, Te, Ce là 2 chủng, với Clo chỉ 1 chủng. Chúng tôi

thấy có 3 trong 10 chủng có khả năng đề kháng tốt nhất với cả 4 loại kháng sinh là chủng B,

Hình 3.3. Hoạt tính kháng neomicin, kanamicin, gentamicin của chủng B, N4 và L2

N4 và L2.

Nhƣ vậy, trong quá trình điều trị bệnh tiêu chảy cho gia súc, có thể phối hợp sử dụng

chế phẩm probiotic với các chất kháng sinh (Ge, Ne, Ng, Kn) do các kháng sinh này không

có khả năng tiêu diệt và làm mất đi hoạt tính của 3 chủng VK lactic trên trong đƣờng ruột của

vật nuôi.

Tổng hợp các kết quả nghiên cứu trong phần 3.1.2 chúng tôi thấy 3 chủng có ký hiệu

là B, N4 và L2 có những đặc điểm ƣu việt hơn cả trong số 10 chủng về khả năng sinh axit

lactic cao, về tính kháng khuẩn mạnh với phổ kháng khuẩn rộng (cả VK Gram âm, Gram

dƣơng) và đề kháng đƣợc với nhiều loại kháng sinh nhất (4 loại). Do đó, 3 chủng này đƣợc

chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu tiếp.

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi

khuẩn lactic tuyển chọn

3.2.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2

Các đặc điểm hình thái ở VK là một trong những đặc điểm cơ bản nhất trong phân

loại VK theo phƣơng pháp truyền thống. Các chủng VK lactic đƣợc nuôi trên MT - MRS.

Sau 48h, quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào các chủng

qua tiêu bản nhuộm Gram. (Xem bảng 3.4 và hình 3.4)

Ba chủng VK lactic trên đều có tế bào hình que ngắn hay qua dài, gram dƣơng, không

di động, không sinh bào tử. Khuẩn lạc tròn lồi, kích thƣớc dao động từ 1,0 - 3,0 mm, màu

trắng sữa, mép nhẵn, có mùi chua thơm là những đặc điểm dễ nhận thấy khi phân lập VK

lactic. Theo Okada, 1992 đặc tính catalaza âm tính sẽ giúp khẳng định chính xác hơn kiểu lên

men đồng hình cũng nhƣ đặc tính kị khí không bắt buộc sẽ giúp ích nhiều cho việc nghiên

cứu ứng dụng và phân loại của 3 chủng.

3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N4, L2

Mỗi loại VSV đƣợc đặc trƣng bởi khả năng sử dụng khác nhau các loại hydratcacbon

và sử dụng các chất khác nhau làm nguồn cacbon và năng

lƣợng duy nhất. Khả năng sử dụng này sẽ dẫn đến việc tích lũy các axit hữu cơ, các sản phẩm

trung hòa và các loại khí.

Sự tạo thành axit căn cứ vào sự biến đổi độ pH của MT. Sự tạo thành bọt khí đƣợc

xác định bằng sự nổi của ống Duham trong MT. Khả năng đồng hóa nguồn thức ăn cacbon

xác định sau 48 - 240h nuôi cấy VK trên MT - MRS không có nguồn cacbon nhƣng có bổ

sung 1% các nguồn hydratcacbon với chất chỉ thị màu là phenol đỏ.

Khả năng lên men 21 loại đƣờng là đặc điểm đặc trƣng rất có ý nghĩa về mặt phân

Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của 3 chủng VK lactic

loại (Xem bảng 3. 5).

Đặc điểm

Hình thái khuẩn lạc

Hình dạng tế bào

Loai Gram Sinh bào tử Khả năng di động

Oxygen

Phản ứng catalaza B Tròn, nhẵn, màu trắng sữa, kt: 2-3 mm Hình que ngắn, xếp thành đôi + - - Kỵ khí không bắt buôc - Ký hiệu chủng N4 Tròn, nhẵn, màu trắng sữa, kt: 2-3 mm Hình que ngắn, xếp thành chuỗi + - - Kỵ khí không bắt buộc - L2 Tròn, nhỏ, màu trắngsữa, kt: 1-2 mm Hình que dài, xếp thành đám + - - Kỵ khí không bắt buộc -

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (a) và hình thái tế bào của chủng B, N4 và L2 chụp trên kính hiển vi điện tử quét

(x 15 000 - 20 000)

Bảng 3.5. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng VK lactic

Ký hiệu chủng

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

B Đồng hình Không + + + + + Mezo- DAP L - LDH N4 Đồng hình Không + + + + + Mezo- DAP L - LDH

Lên men Khả năng sinh khí Sinh trƣởng ở : 150C 500C pH = 3,5 pH = 9,5 NaCl = 6,5% Dạng peptidoglucal Dạng đồng phân của axit lactic Lên men đƣờng Glucose L-arabinose + + + - L2 Đồng hình Không + + + + + Mezo- DAP L - LDH; D-LDH + -

Raffinose D-ribose Maltose Manitol Saccharose Lactose D-Galactose Sorbitol Starch Cellobioza Fructoza D- gluconat L- rhamnoza L-sorboza Trehaloza D-xyloza Salicin Gelatin Melezitoza - +/- + + + + - + - - - +/- - - - - - - - - + + + + + - + - + - - - - + - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - + - +

Ghi chú : -: Âm tính; + : Dƣơng tính +/-: Mọc yếu

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi kết hợp với kết quả định danh đến loài của

Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội. Dựa vào khoá phân loại của

Bergey's (1986) và Okada (1992), kết quả phân loại 3 chủng nhƣ sau:

+ Chủng Lactobacillus sp. B là Lactobacillus agilis.

+ Chủng Lactobacillus sp. N4 là Lactobacillus salivarius.

+ Chủng Lactobacillus sp. L2 là Lactobacillus acidophilus.

Kết quả phân loại cho thấy 3 chủng VK lactic trên đều không sinh độc tố, ƣa ấm,

thƣờng sống trong khoang miệng, trong đƣờng ruột của ngƣời và gia súc. Với các đặc tính mà

chúng tôi đã khảo sát đƣợc, có thể yên tâm sử dụng các chủng trên để tạo chế phẩm probiotic

trong phòng và trị bệnh

tiêu chảy cho heo. Để tiện cho việc sử dụng, chúng tôi vẫn dùng các kí hiệu trƣớc đây (B, L2,

N4) cho các chủng VK lactic.

3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men

Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Saccharomyces sp.02 3.3.1. Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae

Bằng phƣơng pháp dùng đĩa giấy kháng sinh chuẩn, tiến hành theo dõi sự tạo thành

vòng vô khuẩn sau 24 giờ của chủng nấm men trên MT thạch đĩa. Kết quả trình bày ở bảng

3.6.

Tên kháng sinh

Neomycin Axit nalidixic Kanamycin Gentamycin Ampicillin Cloramphenicol Noefloxacin Tetracylin

Bảng 3.6. Khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của chủng Saccharomyces sp.02 Kết quả Nồng độ +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 10 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 5 g/đĩa +++ 30 g/đĩa

Chú thích : +++ Đề kháng rất mạnh

Kết quả cho thấy chủng nấm men trên có khả năng đề kháng rất mạnh với 8 chất

kháng sinh trị bệnh đƣờng ruột sau: neomycin, acid nalidixic, kanamycin,

gentamycin,ampicillin cloramphenicol, noefloxacin.

Nhƣ vậy, trong quá trình điều trị, có thể sử dụng các kháng sinh trên kết hợp với sử

dụng chế phẩm do nấm men Saccharomyces sp.02 không bị ảnh hƣởng bởi kháng sinh. Kết

quả này trùng với kết quả nghiên cứu của Phạm Thúy Hồng, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Nguyễn

Thanh Thủy, Đinh Duy Kháng, 1998.

3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định

Tên vi khuẩn kiểm định

Khả năng ức chế (D-d, mm) 25

E.coli Samonella typhymurium 23

Bảng 3.7. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của chủng Sac. cerevisiae Gây bệnh Viêm ruột, tiêu chảy Sốt thƣơng hàn ở ngƣời và tiêu chảy ở động vật

Vi khuẩn cơ hội gây bệnh đƣờng ruột

Tiêu chảy cho heo 20 18 20 25

Hình 3.6. Hoạt tính đối kháng của chủng S. cerevisiae với E. coli (a) với S. typhimurium (b)

Bacillus subtilis Streptococcus sp. Sacrina lutea Samonella choleraesuis

Hình 3.7. a) Khuẩn ty của chủng Saccharomyces sp.02

3.3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men

Bảng 3.8. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men

b) Nang bào tử của chủng nấm men Saccaromyces sp.02

Các đặc điểm Chủng Saccharomyces sp.02

Hình thái khuẩn lạc Tròn, bóng

Hình thái tế bào Dạng nẩy chồi Tròn, elip Đơn cực

Khuẩn ty Giả

Nang bào tử

Khả năng sử dụng nitrat Khả năng phân giải urê Đặc điểm của chi Saccharomyces (theo Lodder 1971) Khuẩn lạc dạng bột nhão, hơi bóng Tròn, elip Đa cực hay đơn cực Có hoặc không có khuẩn ty giả Trong nang bào tử có 1-4 bào tử, bào tử hình cầu, elip Không Không rõ

Khả năng lên men các loại đường Có khả năng lên men các loại đƣờng tƣơng tự

Trong nang bào tử có 1-4 bào tử, bào tử hình cầu Không Không Lên men đƣợc 6 trong 7 loại đƣờng khảo sát : glucose, maltose, fructose, saccarose, d- galactose, dextin; không lên men đƣờng lactose

So sánh các đặc điểm chủng nấm men Saccharomyces sp.02 với đặc điểm chung của

chi Saccharomyces theo khoa phân loại của Lodder (1971), của Cletus p. Kurtzman (1998)

chúng đều có các đặc điểm tƣơng đồng. Do

vậy, chúng tôi có thể khẳng định lại một lần nữa chủng nấm men Saccharomyces sp.02 thuộc

chi Saccharomyces.

Kết quả xác định và so sánh trình tự gen rADN 16S chủng Saccharomyces sp.02 với

trình tự gen rADN 16S đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản cho thấy

chủng này có độ tƣơng đồng cao tới 99% so với loài Saccharomyces cerevisiae (phòng Thí

nghiệm SHPT thuật Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG Hà Nội). Từ đó có thể kết luận

chủng này thuộc loài Saccharomyces cerevisiae.

Cho đến nay chƣa có một nghiên cứu nào chứng minh đƣợc loài nấm men này sinh

độc tố. Vậy là bƣớc đầu có thể yên tâm sử dụng chủng trên để nghiên cứu tiếp.

3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối

các chủng nghiên cứu

A. Vi khuẩn lactic

3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Quá trình tạo thành sinh khối tế bào phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện trong đó có

thành phần MT nuôi cấy. Do đó, việc nghiên cứu lựa chọn MT thích hợp cho yêu cầu này có

vai trò vô cùng quan trọng.

Trong 5 loại MT nghiên cứu, MT - MRS (MT2) là MT thích hợp nhất cho sự sinh

trƣởng và phát triển của 3 chủng VK lactic. Vì vậy, mà mật độ tế bào của 3 chủng B, N4, L2

gần mức cực đại ở thời điểm từ 12 đến 24 giờ (OD600 2,000). Có lẽ đây là MT đáp ứng tốt

nhất cho nhu cầu dinh dƣỡng của VK lactic do chứa đầy đủ các chất hữu cơ, vô cơ, các VTM

và các axit

hữu cơ cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của VK, đặc biệt là các loài thuộc chi

Lactobacilỉus.

Ở MT6 và MT7, tốc độ sinh trƣởng và phát triển của 3 chủng B, N4, L2 yếu nhất, mật

độ tế bào thấp hơn nhiều so với MT2, MT4, MT5.

MT nƣớc chiết cà chua (MT5), tốc độ sinh trƣởng và phát triển của 3 chủng B, N4, L2

khá mạnh, gần tƣơng đƣơng với MT - MRS ở thời điểm từ 12 đến 24 giờ. (Xem đồ thị 3.1,

Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của chủng B

Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của chủng N4

3.2, 3.3).

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Động học phát triển của 3 chủng trên MT nƣớc chiết cà chua vẫn giữ nguyên nhƣ khi

phát triển trên MT - MRS, nghĩa là giai đoạn phát triển logarit kéo dài khoảng 12 giờ sau đó

là giai đoạn ổn định. Nguyên nhân của hiện tƣợng này theo chúng tôi do MT cà chua rất giàu

vitamin, chất khoáng và axit hữu cơ. VK lactic hầu nhƣ không có khả năng tổng hợp đƣợc

vitamin, chất có vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào.

Tuy nhiên, việc sử dụng MT - MRS vốn rất phức tạp và không kinh tế nên ngƣời ta

thƣờng chọn các MT đơn giản, rẻ tiền hơn để thay thế MT trên trong sản xuất. Với tiêu chí

này, chúng tôi chọn MT nƣớc chiết cà chua (MT5) làm MT nhân giống để thu sinh khối các

chủng VK trên với khoảng thời gian hơn tốt nhất từ 24 - 36 giờ. Kết quả này phù hợp với kết

quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối của các

chủng vi khuẩn lactic

3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố của MT có ảnh hƣởng mạnh đến sự sinh

trƣởng và sinh tổng hợp của VSV. Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự gia tăng sinh khối tế

bào của 3 chủng B, N4, L2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 3 chủng trên ở các nhiệt độ 250C,

300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Xác định mật độ tế bào trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 600

nm trong thời gian từ 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 giờ. Kết quả đƣợc biểu diễn tiêu biểu

trên biểu đồ 3.1.

* Nhận xét

Sự sinh trƣởng, phát triển của các chủng phụ thuộc rõ rệt vào nhiệt độ. Khả năng này

thể hiện rõ nhất trong khoảng nhiệt độ 300C - 40 0C, mật độ tế bào của 3 chủng đạt ở mức cao

(OD600>= 1,375) sau 24 giờ nuôi cấy. Ở 250C, thời gian pha lag kéo dài với cả 3 chủng. Ở

nhiệt độ 350C, chủng B và N4 có tốc độ phát triển rất nhanh, sau 12 giờ nuôi cấy mật độ tế

bào gần ở mức cực đại (OD600>= 2,000) và phát triển ổn định ở mức cao trong thời gian lên

men tiếp theo. Điều đó chứng tỏ nhiệt độ này rất phù hợp cho sự hoạt động của các enzim

trong quá trình TĐC. Còn ở 300C mật độ tế bào của 2 chủng B, N4 chênh lệch không đáng kể

so với khi phát triển ở 350C. Đối với chủng L2, mật độ tế bào thấp nhất ở 250C (OD600 =

0,623) và đạt giá trị cao trong khoảng nhiệt độ từ 350C - 400C (OD600> 1,738) sau 24 giờ nuôi

cấy. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ

(2003).

Nhƣ vậy, nhiệt độ tối ƣu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và N4 là từ 300 C -

350C với chủng L2 là 350C - 400C. Đây là các khoảng nhiệt độ gần với nhiệt độ trong cơ thể

ngƣời và động vật nên rất có lợi khi sử

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

dụng chúng để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đƣờng ruột ở heo.

3.4.2.2. pH ban đầu

Trị số pH ban đầu trong MT có ảnh hƣởng quan trọng đến sự sinh trƣởng và sinh tổng

hợp của VSV. Đối với VK lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì sinh trƣởng của

chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH.

Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Để xác định ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của các chủng VK

lactic trên, pH MT đƣợc điều chỉnh đến các giá trị 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 bằng NaOH 1N và

CH3COOH 1N. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả đƣợc biểu diễn

trên biểu đồ 3.2.

* Nhận xét

Qua kết quả trên, chúng tôi nhận thấy 2 chủng B và N4 có thể sinh trƣởng và phát

triển khá tốt ở khoảng pH từ 5,5 đến 7. Ở pH 6,5 tốc độ sinh trƣởng của 2 chủng này đều ổn

định hơn và mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 12 giờ nuôi cấy (OD600 2,000). Nhƣ vậy,

pH ban đầu tối ƣu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và N4 trong khoảng từ 6,0 - 6,5.

Chủng L2 có thể phát triển ổn định trong khoảng pH từ 5,0 đến 6,5 và đạt giá trị cực

đại ở pH 5,5 sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 1,678). Nhƣ vậy, pH ban đầu tối ƣu cho sự tăng

sinh khối tế bào của chủng L2 trong khoảng từ 5,5 - 6,0.

Nhƣ vậy, pH ban đầu của MT là một trong những yếu tố quyết định sự sinh trƣởng và

phát triển của VK lactic. Chúng tạo điều kiện thuận lợi cho VK trong giai đoạn đầu của quá

trình đồng hóa và tổng hợp các chất cần thiết nên đã có ảnh hƣởng rõ rệt đến sự tạo thành

sinh khối VK lactic.

3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ

Để khảo sát vai trò của các nguồn nitơ đối với sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp của các

chủng B, N4, L2 trong MT nƣớc chiết cà chua, chúng tôi sử dụng các nguồn nitơ là cao nấm

men, dịch chiết nấm men, cao thịt, pepton. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ.

Kết quả đƣợc biểu diễn trên đồ thị 3.4 ; 3.5.

0 12 24 36 48

Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B

0 12 24 36 48

Thời gian ( giờ)

Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

* Nhận xét

Khi thay đổi nguồn nitơ trong thành phần MT nuôi cấy thì tốc độ sinh trƣởng của ba

chủng VK nói trên có sự thay đổi đáng kể. Cả ba chủng B, N4, L2 đều phát triển tốt trong MT

có nguồn nitơ là cao nấm men, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600

1,860), so với cao thịt (OD600 1,045), dịch chiết nấm men hoặc pepton (OD600 0,687).

Nguyên nhân do thành phần cao nấm men có nhiều chất hữu cơ phức tạp, rất cần cho sự tạo

thành sinh khối tế bào của các chủng VK lactic. Vậy là

có thể chọn MT cà chua với nguồn nitơ cao nấm men là MT nghiên cứu sự tạo thành sinh

khối của 3 chủng VK lactic trên. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả

nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).

3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men

Nuôi cấy ba chủng VK trên trong MT nƣớc chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%,

1,5%, 2,0%, 2,5% cao nấm men. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

đƣợc biểu diễn tiêu biểu trên biểu đồ 3.3.

* Nhận xét

Khi thay đổi nồng độ cao nấm men từ 0,5% đến 2,5% thì tốc độ phát triển của hai

chủng B, N4 khá ổn định và đạt mức cực đại (OD600 2,000) sau 24 giờ nuôi cấy. Ở nồng độ

1,5% cao nấm men, mật độ tế bào của hai chủng B, N4 có sự chênh lệch không đáng kể so

với các nồng độ còn lại và đầu ở mức thấp. Với chủng L2, cho kết quả tƣơng tự về tốc độ sinh

trƣởng

tăng rõ rệt ở nồng độ cao nấm men từ 2,0% đến 2,5% (OD600 2,005) so với các nồng độ

khác sau 24 giờ nuôi cấy.

Nhƣ vậy, để thu sinh khối tế bào của các chủng VK lactic trên có thể sử dụng MT

nƣớc chiết cà chua với nồng độ cao nấm men tối ƣu cho chủng B và N4 từ 1% - 1,5% và với

chủng L2 từ 1% - 2,0% là phù hợp.

3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon

Mục đích của thí nghiệm này là nhằm xác định nguồn đƣờng thích hợp nhất, rẻ tiền

nhất cho sự gia tăng sinh khối tế bào của ba chủng B, N4, L2.

Ba chủng VK trên đƣợc nuôi cấy với các nguồn đƣờng nhƣ glucose, saccharose,

maltose, galactose, lactose, ở các điều kiện tối ƣu đã đƣợc khảo sát.

Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả đƣợc biểu diễn tiêu biểu

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

trên biểu đồ 3.4.

* Nhận xét

Trong các loại đƣờng đƣợc khảo sát, tốc độ tăng trƣởng của cả ba chủng không thay

đổi nhiều, mật độ tế bào của chúng chênh lệch không

đáng kể. Nhƣ vậy, với tiêu chí là giảm giá thành cho sản phẩm, chúng tôi có thể sử dụng

saccharose thay thế cho glucose trong thành phần MT lên men thu sinh khối các chủng.

3.4.2.6. Nồng độ saccharose

Để lựa chọn nồng độ saccharose phù hợp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ba chủng B,

N4, L2 trên MT nƣớc chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% saccharose.

Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả đƣợc biểu diễn tiêu biểu trên biểu

đồ 3.5.

* Nhận xét: Chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 1,5% saccharose, mật độ tế bào của hai

chủng B, N4 tăng rõ rệt so với các nồng độ còn lại. Đối với chủng L2, tốc độ sinh trƣởng tăng

rõ rệt ở nồng độ saccharose từ 1,0% đến 2,5%, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

nuôi cấy (OD600 1,427), ở nồng độ 0,5% tốc độ sinh trƣởng chậm hơn.

Nhƣ vậy, để thu sinh khối các chủng VK khảo sát trong MT nƣớc chiết cà chua có thể

dùng nồng độ saccharose từ 1 - 1,5% với chủng B, N4 và 1 -2% với chủng L2 là phù hợp.

3.4.3. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong

điều kiện tối ưu

Tiến hành nuôi cấy tĩnh 3 chủng B, N4, L2 trên MT nƣớc chiết cà chua với các điều

kiện tối ƣu vừa khảo sát cho từng chủng. Xác định giá trị OD600, hàm lƣợng axit tổng, sự thay

đổi độ pH tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả đƣợc mô tả trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Động thái quá trình tạo sinh khôi, sinh axit lactic và độ pH của 3 chủng VK lactic Các giá trị N4

Thời gian (giờ) pH pH pH OD600 OD600 OD600

H. lƣợng a. lactic (g/l) H.lƣợng a. lactic (g/l)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 0,149 1,517 2,214 2,370 2,422 2,466 2,482 2,482 2,515 6,019 4,332 3,577 3,490 3,431 3,426 3,401 3,390 3,386 0,198 0,441 1,062 1,224 1,341 1,395 1,431 1,449 1,467 0,157 1,635 2,157 2,242 2,346 2,395 2,395 2,395 2,482 6,011 4,252 3,539 3,463 3,413 3,411 3,406 3,401 3,389 H. lƣợn g a. lactic (g/l) 0,207 0,459 1,053 1,260 1,314 1,359 1,404 1,422 1,440 0,131 0,586 1,005 1,430 1,827 1,974 2,016 2,054 2,121 5,360 4,568 3,685 3,606 3,585 3,563 3,517 3,502 3,476 0,288 0,414 0,981 1,134 1,179 1,224 1,242 1,278 1,332

* Nhận xét

Từ các kết quả trên cho thấy tại thời điểm từ 12 - 24 giờ, hàm lƣợng axit tổng tăng rõ

nhất từ 1,062 - 1,341 g/l, tƣơng ứng với sự giảm dần độ pH từ 4,332 đến 3,431, trong khi mật

độ tế bào đạt mức cao nhất với OD600 khoảng 1,517 - 2,422. Nhƣ vậy, mật độ tế bào tăng tỷ lệ

thuận với hàm lƣợng axit lactic và tỷ lệ nghịch với độ pH theo thời gian. Theo chúng tôi, thời

điểm tốt nhất cho việc thu sinh khối của chủng B, N4 và L2 là khoảng thời gian 24 - 36 giờ.

Đây là giai đoạn chuyển từ pha logarit sang pha phát

triển ổn định trong quá trình sinh trƣởng. Vì vậy, thu sinh khối ở giai đoạn này là tốt nhất.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng

(1998), Võ Thị Thứ và cộng sự (2003).

Tổng hợp kết quả nghiên cứu trong phần 3.4, chúng tôi có thể rút ra những điều kiện

Bảng 3.10. Tống hợp các điều kiện để thu sinh khối của 3 chủng VK lactic

tối ƣu cho quá trình thu sinh khối của 3 chủng VK lactic là:

Điều kiện tối ƣu

Chủng B Nƣớc cà chua 6 - 6,5 Cao nấm men 1 -1,5 Saccarose 1 -1,5 30 -350C 18 -30h Chủng N4 Nƣớc cà chua 6 - 6,5 Cao nấm men 1 -1,5 Saccarose 1 -1,5 30 -350C 18-30h Chủng L2 Nƣớc cà chua 5,5 - 6,0 Cao nấm men 1 -2 Saccarose 1 -2 35-400C 24 -3 6h

MT thay thế pH ban đầu Nguồn N Tỷ lệ cao NM (%) Nguồn C Tỷ lệ saccarose (%) Nhiệt độ MT (0C) Thời gian thu sinh khối (h) B. Nấm men

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của MT đến sự tạo thành sinh khối chủng Sac. cerevisiae,

chúng tôi đã xác định đƣợc các điều kiện tối nhƣ sau:

- Môi trƣờng cao nấm men.

- Tỷ lệ giống cấy ban đầu 10%.

- Nhiệt đệ là 350 C.

- pH ban đầu là 6,0.

- Chế độ lắc thông khí là 170 vòng/phút.

- Nồng độ cao nấm men là 0,3%.

- Nồng độ saccharose thích hợp là 3,5%.

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến

Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của cường độ thông khí đến

sự tạo thành sinh khối nấm men

sự tạo sinh khối nấm men

Đồ thị 3.8. Đồ thị tăng trưởng của chủng nấm

Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo thành

men trên các loại môi trường

sinh khối của chủng nấm men

- Thời gian thu sinh khối tốt nhất là 18 giờ.

3.5. Tạo chế phẩm probiotic

3.5.1. Đông khô các chủng VSV

Mục đích việc đông khô các chủng VSV nghiên cứu ngoài nhiệm vụ bảo quản giống

mà còn đƣợc dùng làm nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic.

Các chủng B, N4 và L2, đƣợc nuôi trên MT nƣớc chiết cà chua với những điều kiện tối

ƣu tới pha ổn định (24 đến 36 giờ), ly tâm (3500 vòng/15 phút) thu sinh khối. Chủng nấm

men đƣợc nuôi trên MT cao nấm men trong các điều kiện tối ƣu tới pha ổn định (18 - 21h), ly

tâm thu sinh khối. Cho sinh khối tế bào của từng chủng vào từng ống đông khô chuyên dùng

có sẵn 2 ml MT chứa các chất bảo quản (sữa gầy 10% + glutamat 1%). Để các ống đông khô

vào tủ lạnh (50C) khoảng 12 giờ, cho MT thật đông. Chuyển các ống đông khô vào máy đông

khô hiệu Virtis (Mỹ), điều chỉnh các thông số:

+ Nhiệt độ từ - 450C đến - 500C.

+ Áp suất chân không 20 mBar.

+ Thời gian đông khô từ 24 đến 27 giờ.

Mẫu VK lactic đông khô có dạng bột mịn, màu trắng sữa và mùi đặc trƣng. Mẫu nấm

men đông khô có dạng bột mịn, màu trắng ngà. Có thể bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ phòng

(300C) hoặc trong tủ lạnh (40C). (Xem hình 3.8)

3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm

3.5.2.1. Chế phẩm P-SP-01

Thành phần gồm 3 chủng VK lactic và enzim amylase và protease.

Mục đích của việc phối trộn các chủng nhằm phát huy cao nhất thế mạnh từng chủng

Hình 3.8. Đông khô 3 chủng VK lactic (a) và chủng Sac. cerevisiae (b)

và sự tƣơng tác hỗ trợ giữa các chủng trong chế phẩm.

Tiến hành phối trộn ba chủng B, L2 và N4 theo tỷ lệ khác nhau : 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1,

1:1:2 (v/v). Khảo sát hoạt tính đối kháng của từng tỷ lệ với một số chủng VK kiểm định bằng

phƣơng pháp khoan lỗ thạch. Tỷ lệ nào có khả năng kháng khuẩn cao nhất sẽ đƣợc chọn sử

Bảng 3.11. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định (D - d, mm)

dụng. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.11.

Tỷ lệ phối trộn

VK Kiểm định E. coli S. typhimurium S. choleraesuis Serratia sp. Streptococcus sp. Bacillus subtilis Khả năng đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với Vk kiểm định (D - d, mm) 1:2:1 19 15 29 17 31 28 1:1:2 14 13 19 15 29 24 2:1:1 15 14 20 12 28 25 1:1:1 15 14 25 11 26 25

* Nhận xét

Trong 4 tổ hợp phối trộn trên, chúng tôi nhận thấy tổ hợp 1:2:1 có hoạt tính đối kháng

với các VK kiểm định cao nhất (D - d = 17 - 31mm) so với 3 tổ hợp còn lại (D - d = 11 -

29mm). Khả năng đối kháng mạnh nhất với Streptococcus sp. (D - d = 31mm), S.

choleraesuis (D - d = 29mm) và khá mạnh với E. coli (D - d = 19mm) là 3 chủng VK gây

bệnh đƣờng ruột phổ biến ở gia súc nhƣ heo. Theo chúng tôi, tỷ lệ phối trộn này (1 : 2 : 1) có

tác dụng tốt trong việc duy trì hoạt tính đối kháng các VK kiểm định nên đƣợc chọn để tạo

chế phẩm probiotic.

3.5.2.2. Chế phẩm P-SP-02

Thành phần gồm sinh khối 3 chủng VK lactic, enzim amylase và protease có bổ sung

thêm sinh khối nấm men Sac. cerevisae.

Để xác định tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối VK lactic và nấm men, chúng tôi khảo sát

Bảng 3.12. Khả năng đối kháng VK kiểm định của các tỷ lệ phối trộn

các tỷ lệ theo thứ tự 1 : 1; 1 : 1,5; 1,5 : 1 và 1: 2. Kết quả ghi trong bảng sau:

Khả năng đối kháng VKKD của các tỷ lệ phối trộn ( D - d, mm)

Vi khuẩn kiểm định

E. coli S. choleraesuis 1 :1 23 21 1:1,5 30 27 1,5:1 26 25 1:2 24 22

Tổ hợp giống đƣợc chọn để tạo chế phẩm P-SP-02 là 1 : 1,5 (VK lactic/nấm men) vì

tỷ lệ này cho giá trị hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, cao hơn cả khi chƣa phối trộng các

chủng.

Hình 3.9. Khả năng đối kháng với VSV kiểm định của tổ hợp giống (VK lactic/nấm men) 1 : 1,5 3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic

S. choleraesuis E. coli

Trộn sinh khối Lac. agilis : Lac. acidophilus : Lac. salivarius theo tỷ lệ 1 :2 :1.

Enzim a amylase và protease do viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp đã dƣợc kiểm tra hoạt tính

trƣớc khi sử dụng. Phối trộn 2 loại enzim trên theo tỷ lệ 1: 1. Tỷ lệ enzim này đã đƣợc tham

khảo một số sản phẩm probiotic trên thị trƣờng và các công trình nghiên cứu trong đó có chế

phẩm Biol của Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. Hoạt tính của enzym a-amylase

đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Smith & Roe, kết quả đạt 1453,963 UI (mg tinh bột/g/phút).

Hoạt tính của enzym protease đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Anson cải tiến, kết quả đạt

21.867 Anson ( mol Tyrosin/g/phút). Theo Nguyễn Lân Dũng và Lê Ngọc Tú (1982), các

thông số khảo sát hoạt tính của enzym -amylase và protease nhƣ trên là khá cao và sẽ có tác

dụng tốt trong chăn nuôi.

Sinh khối 3 chủng VK lactic trộn với sinh khối nấm men theo tỷ lệ 1:1,5. Các nguyên

liệu đƣợc đƣa vào máy trộn siêu tốc và tự động đóng gói chế phẩm trong bao nhôm với trong

lƣợng 25g/gói.

* Chế phẩm probiotic P-SP-01 gồm :

- Sinh khối 3 chủng VK lacti : 10g

- Enzim a amylase và protease(tỷ lệ 1:1) : 15g

* Chế phẩm probiotic P-SP- 02 gồm :

- Sinh khối 3 chủng VK lactic và nấm men : 10g

- Enzim protease, amylase (tỷ lệ 1:1) là : 15g

Bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ phòng hay trong tủ lạnh (40C).

Hình 3.10. Chế phẩm probiotic P-SP-02

Thành phần Sacchoromyces sp.02 6g 1g Laclobacillius sp.B 2g Laclobacillus sp.L2 Lactobacillus sp.N4 1g 7,5g Protease 7,5g Amylase Công dụng Phòng trừ tiêu chảy cho heo Cách dùng Bổ sung lg/kg thức ăn Trọng lƣợng tịnh: 25

3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm

Để kiểm tra chất lƣợng chế phẩm chúng tối khảo sát các chỉ tiêu sau : 3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng vsv sau quá trình đông khô

Chất lƣợng và hiệu quả sử dụng chế phẩm phụ thuộc rất nhiều vào khả năng sống sót

của các chủng VSV đƣợc sử dụng trong các chế phẩm sau thời gian bảo quản.

Bảng 3.13. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau quá trình đông khô

Ký hiệu chủng Mật độ tế bào (CFU/g)

Sau 30 ngày Sau 60 ngày Sau 90 ngày

Trƣớc đông khô 2,76 x 1010 3,34 x 1010 3,37 x 109 9,44 x 107 2,26 x 1010 2,91 x 109 2,66 x 109 85,71 x107 9,28 x 109 9,70 x 109 9,44 x 109 67,04 x 109 6,22 x 109 7,85 x 109 6, 81 x109 6, 92 x 109 Chủng B Chủng N4 Chủng L2 Sac. sp 02

Sau 30 ngày số lƣợng tế bào của các chủng B, N4 và L2 thay đổi không đáng kể. Sau

60 ngày, đặc biệt sau 90 ngày đông khô, số lƣợng tế bào của các chủng tuy có giảm song vẫn

đạt trên 109 tế bào/1g chế phẩm. Điều đó chứng tỏ khả năng sống sót của các chủng VK

nghiên cứu là khá cao. Kết quả này rất phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thứ và

cộng sự (2003); Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng và cộng sự (2003). Các tác

giả đều cho rằng, mật độ tế bào của các chủng VSV trong chế phẩm probiotic khi sử dụng đạt

trên 109 tế bào/1g chế phẩm là tốt và sẽ cho hiệu quả cao nhất.

Bảng 3.14. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm

3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm

Gây bệnh Chủng VSV ức chế vỉ khuẩn kiểm định Sau đông khô

Sac. cerevisiae với E.coli Sac. cerevisiae với Sal. choleraesuis Chủng B với E.coli Chủng B với Sal. choleraesuis Chủng N4 với E.coli Chủng N4 với Sal. choleraesuis Chủng L2 với E.coli Chủng L2 với Sal. choleraesuis Viêm ruột, tiêu chảy Tiêu chảy ở heo Viêm ruột, tiêu chảy Tiêu chảy ở heo Viêm ruột, tiêu chảy Tiêu chảy ở heo Viêm ruột, tiêu chảy Tiêu chảy ởheo Khả năng ức chế (D-d, mm) Trước đông khô 25 25 14 27 12 25 13 22 23 22 13 26 11 24 13 22

Hình 3.11. Khả năng đề kháng với các kháng sinh của Saccharomyces sp.02 sau đông khô sau 60 ngày

(a) (b)

Hình 3.12. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định trước (a và c) và sau đông khô 60 ngày của Sac.

cerevisiae

Kiểm tra khả năng đề kháng với VK kiểm định và đề kháng với kháng sinh của Sac.

cerevisiae chúng tôi thấy kết quả tƣơng tự.

Với các đặc tính trên, chúng tôi có thể bƣớc đầu yên tâm khi sử dụng thử nghiệm các

chế phẩm probiotic của mình trên heo con sau cai sữa.

3.7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic

Hình 3.13. Sơ đồ quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic

* Giải thích quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm P-SP-01

Trƣớc hết là phân lập, tuyển chọn các chủng VK lactic, nấm men đáp ứng những yêu

cầu của công nghệ tạo chế phẩm probiotic.

Tiến hành nhân giống các chủng trong MT thích hợp.

Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình thu sinh khối từng chủng

Xác định tỷ lệ tổ hợp giống thích hợp cho từng loại chế phẩm và kiểm tra hoạt tính

enzim.

Tạo các chế phẩm P-SP-01 và P-SP-02.

Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau quá trình bảo quản.

Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa.

Hình 3.14. Chế phẩm P-SP-01 trước và sau khi đóng gói 3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa

Mục đích thí nghiệm là nghiên cứu tác dụng của chế phẩm P-SP-01 đến việc phòng,

trị bệnh tiêu chảy, hệ số chuyển hóa thức ăn và khả năng tăng trọng của heo con sau cai sữa

(giai đoạn từ 28 ngày đến 56 ngày tuổi). So sánh hiệu quả của chế phẩm P-SP-01 so với hiệu

quả của chế phẩm BioI (đối chứng) do Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM sản xuất và hiện

đang lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng.

3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa

Bổ sung và trộn đều 1g chế phẩm P-SP- 01/kg thức ăn cho heo con sau cai sữa 28

ngày tuổi.

Kết quả theo dõi tỷ lệ tiêu chảy ở heo con đƣợc tính bằng số ngày heo con tiêu chảy

tái phát trên tổng số ngày nuôi trong các lô thí nghiệm. Tỷ lệ tiêu chảy trung bình của 5 lô

đƣợc trình bày qua bảng 3.15 và biểu đồ 3.6.

Lô

Chỉ tiêu Tổng số ngày heo con bị tiêu chảy Tổng số ngày nuôi của các lô thí nghiệm Tỷ lệ tiêu chảy (%) Giảm so với ĐC (%)

Bảng 3.15. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Lô TN3 13 224 5,80 62,89

Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm

Lô ĐC2 27 224 12,05 22,90 Lô ĐC1 35 224 15,63 - Lô TN4 19 224 8,48 45,75 Lô TN5 20 224 8,93 42,87

* Nhận xét

Kết quả khảo sát cho thấy, ở các lô thí nghiệm có bổ sung chế phẩm P-SP-01 có tỷ lệ

tiêu chảy thấp hơn so với lô ĐC2 - bổ sung BioI và lô ĐC1 - không bổ sung chế phẩm. Việc

sử dụng chế phẩm cho heo con có tác dụng làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 42,87% - 62,89% so

với lô ĐC1. Điều này chứng tỏ, P-SP-01 ngoài tác dụng cạnh tranh và đối kháng để loại trừ

VK gây bệnh, còn cung cấp thêm một lƣợng VSV có lợi, giúp duy trì sự cân bằng hệ VSV

đƣờng ruột, từ đó làm giảm tình trạng tiêu chảy ở heo con. Đặc biệt, ở các lô thí nghiệm 3, 4,

5, không có tỷ lệ tái phát bệnh, còn ở lô không dùng chế phẩm tỷ lệ tái phát bệnh tiêu chảy

khá cao (66,66%) Kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với ghi nhận của một số tác giả

nhƣ Trần Thị Thu Thủy (2003), khi sử dụng Organic Green để phòng bệnh tiêu chảy ở heo

con cai sữa với liều 1,2 tỉ CFU/kg thức ăn liên tục trong 28 ngày, đã làm giảm 45,17% -

57,30% tỷ lệ tiêu chảy ở heo con so với lô đối chứng; Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè (2002),

sử dụng VITOM 1.1 liều 50mg/kgP, 2 ngày 1 lần trên heo con để phòng bệnh tiêu chảy, kết

quả đã giảm 47,5% số heo con mắc bệnh so với lô đối chứng,...

3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa

Kết quả khảo sát trọng lƣợng và sự tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56

ngày tuổi đƣợc trình bày qua bảng 3.16.

Bảng 3.16. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi Lô

Lô ĐC1 28 6,2 15,3 9,1 325 Lô ĐC2 28 7,1 17,9 10,8 385,7 Lô TN3 28 9,0 21,9 12,9 460,1 Lô TN4 28 5,8 15,3 9,5 339,3 Lô TN5 28 5,9 15,8 9,9 353,6

Biểu đồ 3.7. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm

Chỉ tiêu Thời gian thí nghiệm (ngày) Trọng lƣợng 28 ngày tuổi (kg/con) Trọng lƣợng 56 ngày tuổi (kg/con) Tăng trọng bình quân (kg/con) Tăng trọng trung bình trong 1 ngày (g/ngày/con)

* Nhận xét :Kết quả khảo sát cho thấy, tăng trọng bình quân ở các lô có bổ sung chế

phẩm (lô 3, 4, 5, ĐC2) đều cao hơn so với lô ĐC1. Tuy nhiên, tăng trọng bình quân giữa các

lô 3, 4, 5 không đều nhau. Theo Chiba (1996), trọng lƣợng heo con ở 4 tuần tuổi đƣợc xếp

hạng nhƣ sau : kém khi < 5 kg/con; trung bình khi đạt từ 5 - 7,2 kg/con và tốt khi > 7,2

kg/con. Chính trọng lƣợng ban đầu không đều nhau giữa các heo con đã ảnh hƣởng đến sự

không đều về khả năng chuyển hóa thức ăn và tăng trọng của heo. Vì thế mà ở lô 3, tăng

trọng bình quân rất cao so với các lô 4, 5 và lô ĐC2 (12,9kg/con so với 9,lkg/con ở lô ĐC1).

Nhƣ vậy, chỉ tiêu tăng trọng đạt cao nhất ở các lô có bổ sung chế phẩm. Kết quả của chúng

tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002). Các

tác giả đều cho rằng, ở tất cả các lô có bổ sung chế phẩm sinh học cho heo con, đều cho kết

quả tăng trọng cao hơn các lô đối chứng.

3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn

Các ghi nhận về ảnh hƣởng của chế phẩm probiotic đến hệ số tiêu tốn thức ăn của heo

con đƣợc tổng hợp trong bảng 3.17 và biểu đồ 3.8.

Lô Lô 3 Lô 4 Lô 5

Chỉ tiêu Số kg thức ăn tiêu thụ (kg/lô) Tăng trọng (kg/lô) Hệ số tiêu tốn thức ăn

Bảng 3.17. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm Lô ĐC1 121,5 72,7 1,67

Lô ĐC2 100 86,1 1,16 135 103 1,31 94,2 76,2 1,24 102 79 1,29

Biểu đồ 3.8. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm

* Nhận xét

Kết quả khảo sát cho thấy, hệ số tiêu tốn thức ăn ở các lô có bổ sung chế phẩm P-SP-

01 (lô 3 : 1,31; lô 4 : 1,24; lô 5 : 1,29) và BioI (lô ĐC2 : 1,16), đều thấp hơn rất nhiều so với

lô ĐC1 (1,67). Hệ số này gần xấp xỉ với 1,4 là giá trị của hệ số tiêu tốn thức ăn cho hiệu quả

kinh tế nhất theo kinh nghiệm của các nhà chăn nuôi.

Qua các kết quả trên cho thấy, khi bổ sung probiotic vào trong khẩu phần ăn, các

VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát triển, chúng kết hợp với các enzym hỗ trợ cho việc tiêu hóa

thức ăn làm cho heo con ăn nhiều hơn, hấp thụ dƣỡng chất tốt hơn dẫn đến tăng trọng mau

hơn và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên

cứu của Trần Thị Thu Thủy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002). Các tác giả đều cho rằng, ở tất

cả các lô có bổ sung chế phẩm sinh học, đều có hệ số tiêu tốn thức ăn thấp hơn so với các lô

đối chứng.

Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa (28 ngày tuổi) cho thấy khả

năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo của chế phẩm P-SP-01 cho kết quả khá tốt. Hiệu

quả này tƣơng đƣơng với hiệu quả sử dụng chế phẩm Biol của Viện sinh học nhiệt đới

TP.HCM hiện đang đƣợc lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng. Tuy nhiên, các số liệu ghi nhận

đƣợc mới chỉ là bƣớc đầu do số lƣợng heo con thử nghiệm còn hạn chế cùng với những khó

khăn khi triển khai thực nghiệm trong thời kỳ dịch cúm H5N1 có nguy cơ đang bùng phát ở

Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những thực nghiệm trên, chúng tôi đã có những kết luận sau :

1. Đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 3 chủng VK lactic, 1 chủng nấm men có những

đặc tính cần thiết của một chủng probiotic :

- Có khả năng sinh các chất kháng khuẩn cao.

- Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với các VSV kiểm định

(chuyên gây bệnh tiêu chảy cho heo) nhƣ E. colỉ, Salmonella choleraesuis.

- Có khả năng đề kháng tốt với các chất kháng sinh (trị đƣờng ruột) nhƣ neomicin,

nalidixic axit, kanamicin, gentamicin.

- Có khả năng duy trì các hoạt tính sinh học và sống sót cao sau quá trình đông khô.

2. Đã nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng trên

đến loài là :

Chủng B là Lactobacillus agilis.

Chủng N4 là Lactobacillus saỉivarius.

Chủng L2 là Lactobacillus acidophilus.

Chủng nấm men Sac. sp.02 là Sac. cerevisiae.

3. Đã xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu cho sự tạo thành sinh khối của 3 chủng VK

lactic và 1 chủng nấm men.

4. Đã khảo sát và xác định đƣợc công thức tạo 2 loại chế phẩm probiotic P-SP-01 và

P-SP-02.

5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau quá trình bảo quản từ 1 đến 2 và 3 tháng cho

thấy khả năng sống sót của các chủng khá cao, sau 3 tháng mật độ tế bào ở mức cho phép

(109 CFU/g). Chất lƣợng này tƣơng đƣơng với chế phẩm BioI đang lƣu hành rộng rãi trên thị

trƣờng.

6. Đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm P-SP-01 và P-SP-02 ở quy mô

phòng thí nghiệm.

7. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm PSP01 trên heo con sau cai sữa, giai đoạn 28 đến

56 ngày tuổi. Kết quả thu đƣợc : Tỷ lệ tiêu chảy 7,74% ; Tỷ lệ tái phát 0%; Tăng trọng trung

bình là 384,3g/ngày ; Hệ số tiêu tốn thức ăn 1,28%. So với lô sử dụng BioI, đạt chất lƣợng tốt

hơn hay tƣơng đƣơng.

ĐỀ NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu đạt đƣợc, để sớm đƣa chế phẩm vào ứng dụng thực tiễn,

chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề sau :

- Tiếp tục hoàn thiện quy trình công nghệ tạo các chế phẩm probiotic trên.

- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-02 trong phòng và trị tiêu chảy cho heo con

sau cai sữa làm cơ sở cho việc sản xuất và sử dụng chế phẩm quy mô đại trà.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp, Nxb Khoa học và kỹ thuật,

Hà Nội, tr.105 - 108.

2. Kiều Hữu Ảnh dịch (1983), Cơ sở hóa sinh của Vỉ sinh vật học Công nghiệp, Nxb Khoa

học và kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Liêu Ba, Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng

(2003), Đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus và Lactobacillus có khả năng

ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm, cá, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc,

Hà Nội, tr. 388-391.

4. Lý Kim Bảng, Lê Thanh Bình, Tạ Kim Chỉnh (1998), ứng dụng vi khuẩn lactic trong việc

bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, tập 10,

tr. 455 - 457.

5. Báo Sài gòn giải phóng (Ngày 10/12/1999), Vai trò của vi khuẩn lactic đối với cơ thể, tr. 4.

6. Lê Thanh Bình (20-26/10/1997), Vi khuẩn lactic và kỹ thuật gen, những vấn đề và triển

vọng trong sản xuất thực phẩm, Unesco Worshop Hà Nội, tr. 1-11.

7. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb

Đại học Quốc gia TP. HCM, tr. 55-69.

8. Nguyễn Thị Chính (chủ biên), Trƣơng Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học

Quốc gia Hà nội.

9. Trần Thị Dân (2004), Sinh sản heo nái và sinh lý heo con, Nxb Nông nghiệp, TP. HCM.

10. Trƣơng Văn Dung, Phạm Sỹ Lăng (chủ biên), Nguyễn Ngọc Nhiên, Lê Văn Tạo, Nguyễn

Hữu Vũ (2002), Một số bệnh mới do vi khuẩn và Mycoplasma ở gia súc - gia cầm

nhập nội và biện pháp phòng trị, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb

Giáo dục, Tr. 224 - 230.

12. Nguyễn Lân Dũng dịch (1980), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học và Trung học

chuyên nghiệp.

13. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn

Ty (1972, 1976, 1978), Một số phương pháp nghiên cứu vỉ sinh vật học, Tập I, II, III,

Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

14. Nguyễn Thành Đạt (2002), Cơ sở sinh học Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục.

15. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phƣợng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở lợn,

Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

16. Nguyễn Văn Đức (2005), Nguồn gen giống lợn móng cái, Nxb Lao động - Xã hội.

17. Hội chăn nuôi Việt Nam (2003), Cẩm nang chăn nuôi lợn, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

18. Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân, Võ Minh Sơn

(2003), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO

II và kết quả thử nghiệm trên ao nuôi tôm, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc,

Hà Nội, tr. 75 - 79.

19. Đinh Duy Kháng, Nguyễn Thị Ngọc Ánh, Phan Văn Chi (1998), Sản

xuất và xác định tính chất của kháng huyết thanh kháng Lactobacillus

acidophilus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, XXXVI, 2, tr. 7 - 11.

20. Đinh Duy Kháng và cộng sự (1988), Các thông số kỹ thuật quan trọng trong qui trình sản

xuất biolactovin trong thùng lên men 15l/mẻ, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 36,

số 4, tr. 30 - 34.

21. Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus

probiotic CH123 và CH126 phân lập từ đường ruột của gà, Hội nghị Công nghệ Sinh

học toàn quốc, Hà Nội, tr. 101 - 105.

22. Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trƣơng Văn Dung (2003), Bệnh phổ biến ở lợn và biện

pháp phòng trị, Tập 1,2, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

23. Trƣơng Lăng (2000), Hướng dẫn điều trị các bệnh lợn, Nxb Đà Nẵng.

24. Nguyễn Đức Lƣợng (1997), Công nghệ vi sinh vật, Tập 1, Trƣờng Đại học Bách khoa, tr.

192 - 201.

25. Nguyễn Đức Lƣợng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm

công nghệ sinh học, Tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc gia TP.

HCM.

26. Nguyễn Đức Lƣợng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mần (1997), Thực tập vi sinh vật học

thực phẩm, Trƣờng Đại học Kỹ thuật TP. HCM.

27. Nguyễn Hoài Nam (1986), Xác định hoạt lực khánh sinh bằng vi sinh vật, Tập 1, Nxb

Khoa học và Kỹ thuật.

28. Lƣơng Đức Phẩm (2001), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông

nghiệp, tr 86 - 87.

29. Nguyễn Nhƣ Pho, Trần Thị Thu Thủy (2003), Tác dụng của probiotic đến bệnh tiêu chảy

trên heo con, Hội nghị khoa học chuyên ngành Chăn nuôi thú y, Đại học Nông lâm

TP. HCM, tr. 14-20.

30. Nguyễn Hữu Phúc (1998), Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống ở Việt Nam

và các nước trong vùng. Nxb Nông nghiệp.

31. Lê Thị Bích Phƣợng, Võ Thị Hạnh, Trƣơng Thị Hồng Vân, Lê Tấn Hƣng (2003), Khảo

sát khả năng cạnh tranh và đối kháng của các vi sinh vật có trong chế phẩm BIO II

với vi khuẩn gây bệnh cho tôm, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr.

353-357.

32. Lƣơng đức Phẩm, 2005, Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật Hà Nội,

tr 226 - 247.

33. Trần Mỹ Quan, Nguyễn Thị Huyên, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Quang Tâm (2003),

Thực tập sinh hóa cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia TP.HCM.

34. Nguyễn Quang Tâm (2003), Giáo trình kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm, Trƣờng Đại

học Khoa học Tự nhiên (Tài liệu lƣu hành nội bộ).

35. Trần Thị Thanh (2003), Công nghệ vi sinh. Nxb Giáo dục.

36. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học. Nxb Giáo dục.

37. Trần Linh Thƣớc (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ

phẩm. Nxb Giáo dục.

38. Võ Thanh Thứ (1992), Nghiên cứu sản xuất BIOLACTOVIN để phòng và chống bệnh tiêu

chảy, rối loạn tiêu hóa, bệnh hoại thư, bệnh táo bón, Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4,

tr. 45 - 46.

39. Võ Thanh Thứ (1993), Nghiên cứu bảo quản dược chủng Lactobacillus acidophilus, Tạp

chí Sinh học.

40. Võ Thị Thứ, La Thị Nga, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng (2003), Nghiên cứu tạo

chế phẩm BIOCHE và đánh giá tác dụng của chế phẩm đến môi trường nước nuôi

tôm cá, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 119 - 122.

41. Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi sinh

vật. Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

42. Trần Thị Mỹ Trang, 2006, Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm

probiotic phòng và trị bệnh đƣờng ruột cho heo. Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng ĐHSP Tp.

HCM.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

43. F A. Skinner, Susan M. Passmore, R. R Davenport, 1980, Biology and activities of yeast,

A subsidiary of Harcour Brace Jovanovich.

44. Gerald W. Tannock (1999), Probiotics A Critical Review, University of Otago, Dunedin,

New Zealand.

45. Kirsop B. E and Doyle A (1991), Maintenance of microorganìsms and Cultured celỉs,

Amanual of Laboratory Methods, London.

46. M. Garriga, M. pascual, J.M. Monfort and M. Hugas (1998), Selection of lactobacillus for

chicken probiotic adjunts, J. of Appl, Microbiol, vol. 84, p. 125 - 132.

47. Young Ju kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), Study on the bacteriocin

produced hy Lactobacillus sản phẩm GM 7311, Department of Microbiology college

of nature Science Pukyong National University.

48. Yuan Kun Lee, Koji Nomoto, Seppo Salminen, Sherwood L. Gorbach (1999), Handbook

of probiotics, John Wiley & Sons, inc.

49. Seppo Salminen (1997), Lactic acid bacteria, University of turku, Finland.

50. S. Salminen, M.A. Deighton, Y. Benno, S.L. Gorbach (1998), Lactic acid bacteria in

health and disease, In lactic acid bacteria Microbiology and Funtional asspects.

Marcel Delker Inc, p. 211-252.

51.Wood. B. J. B (1985), Microbiology offermented foods, vol 1, Elsevier applied science

publishers, London and New yerle.

52.Wood. B. J. B and Holzapfel WH (1995), The genera of lactic acid bacteria, Blackie

Ademic and professional, codon, p. 19-48.

INTERNET

53. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a0900-Ink?F=lempl

54. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink?F=lempl

55. http://apresslp.gvpi.net/apfmicro/lpext.dll/fmicro/a0905-Ink?F=lempl

56. http://www.foodwatch.com.au/probiotic.html.

57. http:www.kluweronline.com/article.asp?PIPS=357672&PDE=l

58. http://www.probiotics.com/html/ProbioticProducƣPicturesofProbiotics.htm

59. http://www.enerex.ca/articles/lactic bacteria.htm

PHỤ LỤC

1. Các loại môi trƣờng nghiên cứu VK lactic

*MT cacbonat - agar (MT1) : MT dùng để phân lập VK lactic gồm : Cao thịt 2g ;

Tween 80 - 0,5ml; Glucose - 10g ; Cao nấm men - 10g ; Pepton - 5g ; CaCO3 - 5g ;

CH3COONa - 2g ; Dung dịch muối (*) -0,5ml; Thạch - 20g ; Nƣớc cất - 1000ml; pH = 6,8 ;

Thanh trùng ở 1210C/20 phút.

(*) Dung dịch muối:

MgSO4. 7H2O3 - 4g ; NaCl - 0,2g;

MnSO3. 4H20 - 2g; FeSO4 . 7H2O - 0,2g ; Nƣớc cất - l00ml;

*Môi Trường MRS (MT2) : Dùng để nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc điểm

sinh lý sinh hóa gồm :

Cao thịt - 10g ; Cao nấm men - 5g; Pepton - l0g; Glucose - 20g; K2 HPO4- 2g;

CH3COONa - 5g; MnSO4 - 0,05g;

MgSO4 . 7H2O - 0,2g; (NH4)3 C6H3O7 .2g; Tween 80 - 1 ml; Thạch - 20g; Nƣớc cất -

l000ml;

pH = 6,5 ± 0,2; Thanh trùng ở 1210C/20 phút.

* Môi Trường MPA (Meat extract - Pepton Agar) (MT3) : Dùng để nuôi cấy một số

chủng VSV kiểm định, gồm :

Cao thịt - 3g ; NaCl - 5g; Pepton - 10g; Thạch - 20g; Nƣớc cất -1000ml; Thanh trùng

ở 1210C/20 phút.

* MT nước chiết giá đậu (MT4) :

Nƣớc chiết giá đậu - 50% thể tích MT; Pepton - 20g ; Saccharose - 20g;

K2HPO4 - 0,2g ; MgS04.7H20 - 0,58g ; MnSO4.4H2O - 2g ; Nƣớc cất đủ - l000ml;

Thanh trùng ở 1210C/20 phút;

Dùng 300g giá đậu đun sôi với 1 lít nƣớc cất trong 30 phút, lọc lấy nƣớc trong.

* MT nước chiết cà chua (MT5) :

Nƣớc cà chua - 400ml ; Glucose - 10g ; Cao nấm men - 10g ; Dung dịch A - 5ml;

Dung dịch B - 5ml; Bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000 ml; Thanh trùng ở 1210C/20 phút;

MgSO4 Dung dịch A : K2HPO4 (2,5g), KH2PO4 (2,5g), H2O (250ml).

Dung dịch B. 7H2O (10g), NaCl (5g), FeSO4.7H2O (5g), MnSO4. 4H2O (5g), H2O

(250ml).

Dùng 0,5kg cà chua thái nhỏ đun sôi với 0,5 lít nƣớc/60 phút, lọc lấy nƣớc trong.

* MT có chất tăng trưởng (MT6) :

Glucose - 20g ; Pepton - 10g ; Chất tăng trƣởng (Vitamin nhóm B : gồm B2, B3, B6) ;

(NH4)2SO- lg ; KH2PO4 - l,5g ; K2HPO4 - 4g ; Nƣớc cất - l000ml; pH =7; Hấp 1atm/ 20 phút.

* MT không có chất tăng trưởng (MT7) :

Glucose - 20g ; Pepton - 10g ; (NH4)2SO4 - lg ; KH2PO4 - l,5g ; K2HPO4 - 4g ;

Nƣớc cất - l000ml; pH = 7 ; Hấp 1 atm/ 20 phút.

iii

* MT thử hoạt tính protease (MT8) :

Glucose - 0,05g; Nƣớc chiết thịt - 5ml; Gelatin - l0g; Pepton - 0,lg; KH2PO4 - l,5g;

K2HP04 - l,5g; NaCl - 3g; Agar - 20g; Nƣớc cất - 1000ml. Hấp 1 atm/ 20 phút.

* MT thử khả năng di động của VK lactic (MT9) :

Cao thịt - 5g ; Pepton - 5g ; Glucose - 5g ; Dịch tự phân nấm men - 5% thể tích ;

Tween 80 - 0,5ml ; MnS04.4H20 - 0,lg ; Kali citrat - lg ; Bromocresol tía 1,6% - 2,8ml ; Agar

- 15g ; Nƣớc cất - l000ml ; pH - 6,5 Thanh trùng ở 1210 C/20 phút.

2. Các loại môi trƣờng nghiên cứu nấm men

* Môi trƣờng 1: Môi trƣờng cao malt (môi trƣờng hoạt hóa):

Cao malt 20g

Pepton 5g

Nƣớc cất 1000ml

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trƣờng 2: Môi trƣờng Hansen agar và dịch thể :

Glucose, đƣờng kính 50g

Pepton 10g

3g KH2PO4

3g MgSO4

Agar 16g

Nƣớc cất 1000ml

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trường 3: Môi trƣờng cao nấm men :

1g Cao nấm men

50g Glucose

10g Pepton

3g KH2PO4

1000ml Nƣớc cất

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trường 4: Môi trƣờng dịch chiết nấm men :

Pepton 10g

Dịch chiết nấm men 50g

Glucose 20g

Nƣớc cất 1000ml

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trường 5: Môi trƣờng khoai tây - đƣờng - cám :

Khoai tây 300g

Cám 100g

Đƣờng kính 50g

Nƣớc l000ml

Khoai tây 0 5 kg cắt vỏ, thái nhƣ hạt lựu, lọc, đun cùng 500ml nƣớc cất.

Cám 200g cho vào 500ml nƣớc đun nhỏ lửa, lọc.

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trường 6: Môi trƣờng cao malt:

Cao malt 3g

Cao nấm men 3g

Pepton 5g

Glucose 10g

Nƣớc 1000ml

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút.

* Môi trưởng 7: Môi trƣờng bảo vệ nấm men khi đông khô :

Sữa gầy 10%

Natri Glutamat 1%

Nƣớc cất 1000ml

results of BLAST

Strain Sb

Chủng Sb

GCATATCAATTAAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACG

GCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGA

GTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGA

ACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTG

TAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAG TGGGTGG

TAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAAC AAGTACA

GTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAA

TTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCC

TTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAG

GATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAAT

ACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATG

GTTATATGCCGCCCGCT

BLASTN 2.2.10 [Oct-19-2004]

Altschul, stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb

Miller, and David J. Lipman (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein đatabasp

search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

RID: 1099371195-1171-1330817 4 32.BLASTQ4

Reference:

Query=

(603 letters)

samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences) 2,671,199 sequences; 12,095,686,587 total letters

If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQS

Database: All GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences (but no EST, STS, GSS, environmental

Taxonomy reports

Mouse-over to show defline and scores. Click to show alignments

Distribution of 101 Blast Hits on the Query Sequencc

Sequences producing significant alignments:

gi |1360587|emb|z73326.1| SCYLR154C s.cerevisiae chromosome X... gi |1262303 |gb|053879.1 | YSCL9634 Saccharomyces cerevisiae ch... gi |48596767|emb|AJ746340.1| Saccharomyces cerevisiae 26S rR... gi |46242015 |gb| Ay529515.1| Saccharomyces cerevisiae isolate... gi |172409|qb|J01355.1|YSCRGIH5 Saccharomyces cerevisiae 25S.. gi |31746929|qb|AY048154.1| Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-.. gi |31747002|gb|AY130346.1| Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-. gi |31747001|qb|AY130345.1| Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-.. gi |31747000|gb|ÁY130344.1| Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-.. gi |31746999|qb|AY130343.1| Saccharomyces cerevisiae NRRL Y- gi |14150788|gb|AF374615_.1| Saccharomyces cerevisiae 26S rib.. gi |32127530|emb|AJ508593.1| SCA508593 Saccharomyces Dastoria.. gi |32127528|emb|AJ508591.1|SEA508591 Saccharomyces sp. CBS .. gi |32127518|emb|AJ508581.1|CRO508581 Saccharomyces cerevisi . . gi |33327422|gb|AF528077.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327420|gb|AF528075.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327419|gb|AF528074.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327418|gb|AF528073.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327417|gb|AF528072.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327416|gb|AF528071.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33327415|gb|AF528070.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |33318414|gb|AF528067.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |10717178|gb|AY007889.1| Saccharomyces cerevisiae 26S rib gi |3327421|gb|AF528076.1| Saccharomyces cerevisiae strain .. gi |46242017|gb|AY529517.1| Saccharomyces cerevisiae isolate.. gi |42661532|emb|AJ544259.1| Saccharomyces cerevisiae.. Score (bits) 1170 1170 1170 1160 1146 1140 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1134 1126 1114 E Value 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Saccharomyces cariocanus

Saccharomyces cerevisiae

Zygosaccharomyces microellipso

Saccharomyces servazzii

Saccharomyces kluyveri

Saccharomyces kunashirensis

Saccharomyces mikatae

Saccharomyces uvarum

Saccharomyces pastorianus

Saccharomyces bayanus

Saccharomyces kudriavzevii

XÁC NHẬN CỦA THỦ TRƢỞNG CƠ QUAN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Trần Thanh Thúy

TS. Dƣơng Thị Bạch Tuyết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Mẫu 01

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỠ

Mtd.doc

Mẫu 01

9. ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị trong và ngoài nƣớc

10. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ SẢN PHẨM TRONG, NGOÀI NƢỚC LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN ĐỂ TÀI

(Ghi cụ thể một số bài báo, tài liệu, nghiên cứu triển khai....trong 5 năm gần đây)

Mtd.doc

Nội dung phối hợp Họ và tên ngƣời đại diện

13. TÓM TẮT NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI VÃ TIẾN ĐỘ THỤC HIỆN (ghi cụ thể)

12. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Nội dung Thời gian thực hiện Dự kiến kết quả

14. DỰ KIẾN SẢN PHẨM VÀ ĐỊA CHÍ ỨNG DỤNG

• Loại sản phẩm:

• Tên sản phẩm (ghi cụ thể):

Mtd.doc

• Đìa chỉ có thế ứng dụng (ghi cụ thể)

15. KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Tổng kinh phí:

Trong đó:

Kinh phí sự nghiệp khoa học công nghệ: Các nguồn kinh phí khác:

Nhu cầu kinh phí từng năm:

- Năm

Mtd.doc

Dự trù kinh phí treo các mục :

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

-----------------------

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỂ TÀI:

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC

PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

MÃ SỐ CS. 2005.23.92

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Trần Thanh Thủy

TP. HỒ CHÍ MINH - 2006

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực

phẩm lên men, đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con ngƣời. Những năm gần đây, nhóm vsv

này đƣợc biết đến nhiều hơn với chức năng "VKprobiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế mầm

bệnh tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, cải thiện sự cân bằng hệ vsv tự nhiên nơi đƣờng ruột

của ngƣời và vật nuôi.

Trong chăn nuôi heo, tiêu chảy là căn bệnh khá phổ biến, gây thiệt hại không nhỏ đến

năng suất và chất lƣợng sản phẩm nuôi.

Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh này thuờng dẫn đến hiện tƣợng loạn khuẩn khiến

tiêu chầy kéo dài, gây hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng sinh thái.

Phƣơng pháp hữu hiệu nhất khắc phục tình trạng này là tái lập cân bằng hệ vi khuẩn

đƣờng ruột bằng cách bổ sung một hệ vi khuẩn cố lợi mới dƣới dạng các chế phẩm probiotic.

Đó cũng chính là lý do khiến chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu :

"Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật tạo chế phẩm Probiotic phòng và trị bệnh

đường ruột cho heo"

Mục tiêu của đề tài:

Sử dụng một số chủng vsv có ích (VK lactic, nấm men) tạo chế phẩm có khả năng

phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo có hiệu quả. Nhiệm vụ của đề tài:

1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có các hoạt tính cần thiết

của một chủng probiotic.

2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân loại các chủng vsv đã

tuyển chọn.

3. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.

4. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống và tạo chế phẩm probiotic.

5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản.

6. Bƣớc đầu thử nghiêm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.

7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mô phòng thí nghiệm.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về probiotic

1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic

1.1.2. Thành phần và đặc điểm VSVđược dùng trong probiotic

1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic

1.1.4. Vai trò của probiotic

1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN

1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic

A. Vi khuẩn lactic

1.2.1. Đặc điểm hình thái

1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic

1.2.3. Quá trình lên men lactic

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của VK lactic

1.2.4.1. Nguồn cacbon

1.2.4.2. Nguồn nitơ

1.2.4.3. Các muối vô cơ

1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng

1.2.4.5. Oxy

1.2.4.6. Nhiệt độ

1.2.4.7. pH

1.2.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ

đời sống

B. Sơ lược về nấm men

1.3. Tổng quan về heo

1.3.1. Vị trí phân loại của heo

1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hoá ở heo con

1.3.3. Các bệnh đường ruột ở heo con

1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli

1.3.3.2. Tiêu chảy do Salmonella (Phó thƣơng hàn)

1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị

1.3.4.1. Phòng bệnh

1.3.4.2. Điều trị

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Nguồn phân lập từ các loại thực phẩm lên men lactic, các chế phẩm men tiêu hoá.

Các chủng VK kiểm định do Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐHQG Hà Nội và Viện

Pasteur Tp.HCM cung cấp.

Enzym -amylase và protease do Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM cung cấp. Đĩa

giấy kháng sinh chuẩn do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch

2.2.2. Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm

2.2.3. Định lƣợng axit lactic bằng phƣơng pháp chuẩn độ Therner

2.2.4. Xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ

thạch

2.2.5. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic

2.2.6. Bảo quản giống VSV bằng phƣơng pháp đông khô

2.2.7. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc mọc

trên môi trƣờng thạch

2.2.8. Khảo sát sự sinh trƣởng của vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đo mật độ

quang

2.2.9. Xác định các dạng đồng phân của axit lactic bằng phƣơng pháp sắc ký bản

mỏng

1.2.10. Phân loại nấm men bằng phƣơng pháp xác định trịnh tự rADN 16S

2.2.11. Xác định sinh khối nấm men bằng phƣơng pháp cân sinh khối tƣơi

2.2.12. Phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa

(Tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ tái phát, tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn)

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vsv có các đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo

chế phẩm probiotic

* Tiêu chí tuyển chọn VK lactic nhƣ sau:

- Là VK hiện diện bình thƣờng trong đƣờng ruột của heo.

- Tạo axit lactic cao, chịu pH thấp của MT.

- Có khả năng ức chế phát triển của các VK gây bệnh, VK gây thối.

- Đề kháng đƣợc các chất kháng sinh đƣờng ruột.

- Làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu các chất dinh dƣỡng.

Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L2 và chủng B sau 48h

Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng E. coli và s. typhimurium của chủng B, N4 và L2

Hình 3.3. Hoạt tính kháng neomicin, kanamicin, gentamicin của chủng B, N4 và L2

Hình 3.4. Khả năng đối kháng với các

Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc và tế

VK kiểm định của Saccharomyces sp.02

bào của chủng Saccharomyces sp.02

* Kết quả: Phân lập đƣợc 34 chủng VK lactic và chọn đƣợc 3 chủng vi khuẩn

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn lactic

Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc (a) và hình thái tế bào của chủng B, N4 và L2 chụp trên kính hiển vi điện tử quét

(x 15 000 - 20 000)

Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng VK lactic

tuyển chọn

Ký hiệu chủng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Lên men Khả năng sinh khí Sinh trƣởng ở: 150C 500C pH = 3,5 pH = 9,5 NaCl = 6,5% B Đồng hình Không + + + + + N4 Đồng hình Không + + + + + L2 Đồng hình Không + + + + +

Mezo- ĐAP L-LDH Mezo- ĐAP L-LDH

+ + - +/- + + + + Dạng peptidoglucal Dạng đồng phân của axit lactic Lên men đƣờng Glucose L-arabinose Raffinose D-ribose Maltose Manitol Saccharose Lactose D-Galactose Mezo- ĐAP L-LDH; D-LDH + - - - + - - - + - - + + + + +

Sorbilol Starch Cellobioza Fmctoza D- gluconat L- rbanuioza L-sorboza TrehaIoza D-xyloza Salỉcin Gelatin Melezitoza + - + - - - - + - - - - - - - - - - - - - + - +

+ - - - +/- - - - - - - - Ghi chú: -: Âm tính; + : Dƣơng tính +/-: Mọc yếu Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi kết hợp với kết quả định danh đến loài của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội. Dựa vào khoá phân loại của Bergey's (1986) và Okada (1992), phân loại 3 chủng nhƣ sau:

+ Chủng Lactobacillus sp. B là lactobacillus agilis. + Chủng Lactobacillus sp. N4 là Lactobacillus salivarius. + Chủng Lactobacillus sp. L2 là Lactobacillus acidophilus. 33. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men Bảng 3.2. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men

Các đặc điểm Chủng Saccitaromyces sp.02 Đặc điểm của chi Sacchoromyces (theo Lodder 1971)

Hình thái khuẩn lạc Tròn, bóng

Hình thái tế bào Dạng nẩy chồi Khuẩn lạc dạng bột nhão, hơi bóng Tròn, elip Đa cực hay đơn cực

Tròn, elip Đơn cực Giả Khuẩn ly Có hoặc không có khuẩn ty giả

Nang bào tử Trong nang bào tử có 1-4 bào tử, bào tử hình cẩu, elip

Trong nang bào tử có 1-4 bào tử, bào tử hình cầu Không Khả năng sử dụng nitrat Không

Không Khả năng phân giải urê Không rõ

Khả năng lên men các loại đƣờng Có khả năng lên men các loại đƣờng tƣơng tự

Lên men đƣợc 6 trong 7 loại dƣờng kháo sát: glucose,mallose,fructose, saccarose, d- galactose, dextin không lên men dƣờng laciose

Khả năng đề kháng với các kháng sinh

Khả năng đối khắng vđỉ các vi khuẩn kiểm dinh typhymurium,

subtilis, Streptococcus Đề kháng rất mạnh với các kháng sinh (Neomycin, Axit atidixic,Kanamycin, Gentamycin. Ampicillin, Ctoramphenicol, Noefloxacin, Tetracylin) , Đề kháng rất mạnh với E. coli, Samonella Samonelia choieraesuis Đề kháng khá mạnh với Bacillus sp., Sacrina lutea

So sánh các đặc điểm chủng nấm men Saccharomyces sp.02 với đặc điểm chung của

chi Saccharomyces theo khoá phân loại của Lodder (1971), của Cletus p. Kurtzman (1998)

chúng đều có các đặc điểm tƣơng đồng. Do vậy, chủng nấm men Saccharomyces sp.02 thuộc

chi Saccharomyces.

Kết quả xác định và so sánh bình tự gen rADN 16S chủng Saccharomyces sp.02 với

bình tự gen rADN 16S đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản cho thấy

chủng này có độ tƣơng đồng cao tới 99% so với loài Saccharomyces cerevisiae (phòng Thí

nghiệm SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG Hà Nội). Từ đó có thể kết luận

chủng này thuộc loài Saccharomyces cerevisiae.

3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối các chủng

nghiên cứu

A. VI KHUẨN LACTIC

Thời gian( giờ)

Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của chủng B

3.4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy

Thời gian ( giờ)

Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của MT nuối cấy đến sự tạo thành sinh khối của

Thời gian ( giờ)

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

Thời gian ( giờ)

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy

Thời gian ( giờ)

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH ban díu đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

3.4.3. Ảnh hƣởng của pH ban đầu

Thời gian ( giờ)

Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo (hành sinh khối của chủng B

3.4.4. Ảnh hƣởng của nguồn thức ăn nitơ

Thời gian ( giờ)

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

3.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men

Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2

3.4.6. Ảnh hƣởng của nguồn thức ăn cacbon

Thời gian ( giờ)

3.4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ saccharose

Biểu đồ 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của chủng

3.4.8. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong

Bảng 3.3. Động thái quá trình tạo sinh khối, sinh axit lactic vặ độ pH của 3 chủng VK lactic

điều kiện tối ƣu

B Các giá trị N4 L2

Thời gian (giờ) pH pH pH OD600 OD600 OD600 H. lƣợng a. lactic (g/l) H.lƣựng a. lactic (g/l)

0,149 1,517 2,214 2.370 2,422 2,466 2,482 2,482 2,515 6,019 0,198 4,332 0,441 3,577 1,062 3,490 1,224 3,431 1,341 3,426 1,395 3,401 1,431 3,390 1,449 3,386 1,467 0 6 12 18 24 30 36 42 48 H. lƣợng a. lactic (g/l) 0,157 6,011 0,207 1,635 4.252 0,459 2,157 3,539 1,053 2,242 3.463 1,260 2.346 3.413 1,314 2,395 3,411 1,359 2.395 3,406 1,404 2,395 3.401 1,422 2,482 3,389 1,440 0,131 0,586 1,005 1,430 1,827 1,974 2,016 2,054 2,121 5,360 4,568 3,685 3,606 3,585 3,563 3,517 3,502 3,476 0,288 0,414 0,981 1,134 1,179 1,224 1,242 1,278 1,332

Bảng 3.4. Tổng hợp các điều kiện để thu sinh khối của 3 chủng VK lactic

Chủng L2 Chủng N4

6-6,5 5,5 -6,0

Điền kiện tối ƣu MT thay thế pH ban đầu Nguồn N Tỷ lệ cao NM (%) Nguồn C Tỷ lệ saccarose (%) Nhiệt độ MT(0C) Thời gian thu sinh khối (h) Chủng B Nƣớc cà chua Nƣớc cà chua Nƣớc cà chua 6-6.5 Cao nấm men Cao nấm men Cao nấm men 1 -1,5 Saccarose 1-1.5 30-350C 18-30h 1 -2 Saccarose 1 -2 35 - 400c 24-3 6h 1 -1.5 Saccarose 1-1,5 30-350C 18-30h

B. NẤM MEN

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của MT đến sự tạo thành sinh khối chủng Sac. cerevisiae,

chúng tôi đã xác định đƣợc các điều kiện tối nhƣ sau:

- Môi trƣờng cao nấm men.

- Tỷ lệ giống cấy ban đầu 10%. - Nhiệt độ là 350C. - pH ban đầu là 6,0.

- Chế độ lắc thông khí là 170 vòng/phút.

- Nồng độ cao nấm men là 0,3%.

- Nồng độ saccharose thích hợp là 3,5%.

Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối nấm men

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của cường độ thông khí đến sự tạo sinh khối nấm men

- Thời gian thu sinh khối tốt nhất là 18 giờ.

Đồ thị 3.7. Đồ thị tăng trưởng cùa

Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo

chủng nấm men trên các loại môi

thảnh sinh khối của chúng nấm men

trường

3.5. Tạo chế phẩm probiotic

3.5.1. Đông khô các chủng VSV

Mục đích việc đông khô các chủng VSV nghiên cứu ngoài nhiệm vụ bảo quản giếng

mà còn đƣợc dùng làm nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic.

Các chủng B, N4 và L2, đƣợc nuôi trên MT nƣớc chiết cà chua với những điều kiện

tối ƣu tới pha ổn định (24 đến 36 giờ), ly tâm (3500 vòng/15 phút) thu sinh khối. Chủng nấm

men đƣợc nuôi trên MT cao nấm men trong các điều kiện tối ƣu tới pha ổn định (18 - 21h), ly

tâm thu sinh khối. Thực hiện đông khô các chủng. Mẫu VK Iactic đông khô có dạng bột mịn,

Hình 3.7. Đông khô 3 chủng VK lactic (a)và chủng Sac. cerevisiae (b)

màu trắng sữa và mùi đặc trƣng. Mẫu nấm men đông khô có dạng bột mịn, màu ƣấng ngà. Cố thể bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ phòng (300C) hoặc trong tủ lạnh (40C).

3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm

Bảng 3.5. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định (D - d, mm)

3.5.2.1. Chế phẩm P-SP-01

Tỷ lệ phối trộn Khả năng đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với VK kiểm định (D - d, mm)

1:1:1 2:1:1 1:2:1 1:1:2

15 14 25 11 26 25 15 14 20 12 28 25 19 15 29 17 31 28 14 13 19 15 29 24 VK Kiểm định E. coli S. typhimurium S. choleraesuis Serratia sp. Streptococcus sp. Bacttlus subtilis

Bảng 3.6. Khả năng đối kháng VK kiểm định của các tỷ lệ phối trộn

3.5.2.2. Chế phẩm P-SP-02

Khả năng đối kháng VKKD của các tỷ lệ phối trộn (D - d, mm)

1 : 1 1 :1,5 1,5 : 1 1 :2 Vi khuẩn kiểm định

Hình 3.8. Khả năng đối kháng với vsv kiểm định của tổ hợp giống (VK lactic/nấm men) 1 : 1,5

23 21 30 27 26 25 24 22 E. coli s. choleraesuis

3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic

Trộn sinh khối Lac. agilis : Lac. acidophilus : Lac. salivarius theo tỷ lệ 1:2: 1. Enzim

a amylase và protease do viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp đã đƣợc kiểm tra hoạt tính trƣớc

khi sử dụng. Phối trộn 2 loại enzim trên theo tỷ lệ 1: 1. Hoạt tính của enzym α-amylase đƣợc

kiểm tra bằng phƣơng pháp Smith & Roe, kết quả đạt 1453,963 UI (mg tinh bột/g/phút). Hoạt

tính của enzym protease đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Anson cải tiến, kết quả đạt 21.867

Anson (μmol Tyrosin/g/phút).

Sinh khối 3 chủng VK lactic trộn với sinh khối nấm men theo tỷ lệ 1:1,5. Các nguyên

liệu đƣợc đƣa vào máy ƣộn siêu tốc và tự động đóng gói chế phẩm trong bao nhôm với trong

lƣợng 25g/gói.

* Chế phẩm probiotic P-SP-01 gồm :

- Sinh khối 3 chủng VK Iactic : 10g

- Enzim α amylase và protease(tỷ lệ 1:1): 15g

* Chế phẩm probiotic P-SP- 02 gồm :

- Sinh khối 3 chủng VK lactic và nấm men : 10g

Hình 3.9. Chế phẩm probiotic P-SP-02

- Enzim protease, amylase (tỷ lệ 1:1) là : 15g Bảo quản chế phẩm ỏ nhiệt độ phòng hay trong tủ lạnh (40C).

3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm

3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau quá trình đông khô Chất lƣợng và

hiệu quả sử dụng chế phẩm phụ thuộc rất nhiều vào khả năng sống sốt của các chủng VSV

đƣợc sử dụng trong các chế phẩm sau thời gian bảo quản.

Bảng 3.7. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau quá trình đông khô

Mật độ tế bào(CFU/R) Ký hiệu

Sau 30 ngày San 60 ngày Sau 90 ngày chủng

Chủng B Chủng N4 Chủng L2 Trƣớc đông khô 2,76 x 1010 3,34 x 1010 3,37 x 109 2,26 x 1010 2.91 x 1010 2,66 x 109 9,28 x 109 9,70 x 109 9,44 x 109 6,22 x 109 7 85 x 109 6,81 x 109

Sau 30 ngày sế lƣợng tế bào của các chủng B, N4 và L2 thay đổi không đáng kể. Sau

60 ngày, đặc biệt sau 90 ngày đông khô, số lƣợng tế bào của các chủng tuy có giảm song vẫn đạt trên 109 tế bào/1g chế phẩm. Đây cũng chính là mức yêu cầu về mật độ tế bào của các

chủng VSV trong chế phẩm probiotic và cho hiệu quả cao khi sử dụng.

3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chăng trong chế phẩm

Bảng 3.8. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm Khỉ năng ức chế (D-d, mm) Chủng VSV ức chế vi khuẩn kiếm định Gây bệnh

Trước đông khô Sau đông khô Sac. cerevisiae với E.coli Viêm một, liêu cháy 25 23

Sac. cerevisiae với Sal choleraesuis Chủng B với E.coli Tiêu chảy ở heo Viêm một, tiêu chảy 25 14 22 13

Chủng B với Sal. choleraesuis Tiêu chảy ở heo 27 26

Chủng N4 với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 12 11

Chủng N4 với Sai choleraesuis Chủng 12 với E.coli Chủng 12 với Sai choleraesuis Tiêu chảy ở heo Viêm ruột, tiêu cháy Tiêu chảy ở heo 25 13 22 24 13 22

Kiểm tra khả năng đề kháng với VK kiểm định và đề kháng với kháng sinh của Sac.

cerevisiae cho thấy kết quả tƣơng tự.

Với các đặc tính trên, cố thể bƣớc đầu yên tâm khi sử dụng thử nghiệm các chế phẩm

probiotic của mình trên heo con sau cai sữa.

Hình 3.10. So đồ quy bình công nghệ tạo chế phẩm probiotic

3.7. Xây dựng quy trình công nghệ

3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa

Mục đích thí nghiệm là nghiên cứu tác dụng của chế phẩm P-SP-01 đến việc phòng,

trị bệnh tiêu chảy, hệ số chuyển hoá thức ăn và khả năng tăng trọng của heo con sau cai sữa

(giai đoạn từ 28 ngày đến Số ngày tuổi). So sánh hiệu quả của chế phẩm P-SP-01 so với hiệu

quả của chế phẩm BioI (đối chứng) do Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM sản xuất và hiện

đang lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng.

3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa

Bổ sung và trộn đều lg chế phẩm P-SP-01/kg thức ăn cho heo con sau cai sữa 28 ngày

tuổi.

Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con đƣợc tính bằng sế ngày heo con tiêu chảy tái phát trên tổng

Bảng 3.9. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%)

số ngày nuôi trong các lô thí nghiệm.

Lô Lô ĐC 1 Lô ĐC 2 Lô TN3 Lô TN 4 Lô TN 5 Chỉ tiêu

Tổng số ngày heo con bị tiêu chảy 35 27 13 19 20

224 224 224 224 224 Tổng số ngày nuôi của các lô thí nghiệm

Tỷ lệ tiêu chảy (%) 15,63 12,05 5,80 8,48 8,93

Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm

Giảm so với ĐC (%) - 22,90 62,89 45,75 42,87

* Nhận xét

Kết quả khảo sát cho thấy, ở các lô thí nghiệm có bổ sung chế phẩm P-SP-01 có tỷ lệ

tiêu chảy thíp hơn so với lô ĐC2 - bổ sung Biol và lô ĐC1 - không bổ sung chế phẩm. Việc

sử dụng chế phẩm cho heo con có tác dụng làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 42,87% - 62,89% so

với lô

ĐC1. Điều này chứng tỏ, P-SP-01 ngoài tác dụng cạnh tranh và dối kháng để loại trừ VK gây

bệnh, còn cung cấp thêm một lƣợng VSV có lợi, giúp duy trì sự cân bằng hệ VSV dƣờng

ruột, từ dó làm giảm tình trạng tiêu chảy ở heo con. Đặc biệt, ở các lô thí nghiêm 3, 4, 5,

không cố tỷ lệ tái phát bệnh, còn ở lô không dùng chế phẩm tỷ lệ tái phát bệnh tiêu chảy khá

cao (66,66%).

3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa

Kết quả khảo sát trọng lƣợng và sự tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56

ngày tuổi đƣợc bình bày qua bảng 3.16.

Bảng 3.10. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi

Lô Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô TN3 Lô TN4 Lô TN5

28 6,2 15,3 9,1 325 28 7,1 17,9 10,8 385,7 28 9,0 21,9 12,9 460,1 28 5,8 15,3 9,5 339,3 28 5,9 15,8 9,9 353,6

Biểu đồ 3.7. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các là thí nghiệm

* Nhận xét :Kết quả khảo sát cho thấy, tăng trọng bình quân ở các lô có bổ sung chế

phẩm (lô 3, 4, 5, ĐC2) đều cao hơn so với lô ĐC1. Tuy nhiên, tăng trọng bình quân giữa các

lô 3, 4, 5 không đều nhau. Vì thế mà ở lô 3, tăng trọng bình quân rất cao so với các lô 4, 5 và

lô ĐC2 (12,9kg/con so với 9,lkg/con ở lô ĐC1).

3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn

Bảng 3.11. Hệ số tiêu tấn thức ăn trong thời gian thí nghiệm

Lô Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô 3 Lô 4 Lô 5

Biểu đồ 3.8. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm

Chỉ tiêu Số kg thức ăn tiêu thụ (kg/lô) Tăng trọng (kg/Iô) Hệ số tiêu tốn thức ăn 121,5 72,7 1,67 100 86,1 1,16 135 103 1,31 94,2 76,2 1,24 102 79 1,29

* Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, hệ số tiêu tốn thức ăn ở các lô có bổ sung chế

phẩm P-SP-01 (lô 3 : 1,31; lô 4 : 1,24; lô 5 : 1,29) và Biol (lô ĐC2 : 1,16), đều thấp hơn rất

nhiều so với lô ĐC1 (1,67). Hệ số này gần xấp xỉ với 1,4 là giá trị của hệ số tiêu tấn thức ăn

cho hiệu quả kinh tế nhất theo kinh nghiệm của các nhà chăn nuôi.

Nhƣ vậy, khi bổ sung probiotic vào trong khẩu phần ăn, các VSV có lợi sẽ nhanh

chống phát triển, chúng kết hợp với các enzym hỗ trợ cho việc tiêu hóa thức ăn làm cho heo

con ăn nhiều hơn, hấp thu dƣỡng chất tết hơn dẫn đến tăng trọng mau hơn và làm giảm hệ số

tiêu tốn thức ăn.

Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa (28 ngày tuổi) cho thấy khả

năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo của chế phẩm P-SP-01 cho kết quả khá tốt. Hiệu

quả này tƣờng đƣơng với hiệu quả sử dụng chế phẩm BioI của Viện sinh học nhiệt đới

TP.HCM hiện đang đƣợc lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng.

Tuy nhiên, các số liệu ghi nhận đƣợc mới chỉ là bƣớc đầu vì số lƣợng heo con thử

nghiệm hạn chế do những khó khăn khi chúng tôi triển khai thực nghiệm trong thời kỳ dịch

cúm HSN1 đang bùng phát ở Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những thực nghiệm trên, chúng tôi đã cố những kết luận sau :

1. Đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 3 chủng VK lactic, 1 chủng nấm men có những

đặc tính cần thiết của một chủng probiotic :

- Có khả năng sinh các chất kháng khuẩn cao.

- Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với các VSV kiểm định

(chuyên gây bệnh tiêu chảy cho heo) nhƣ E. coli, Salmonella choleraesuis.

- Có khả năng đề kháng tết với các chất kháng sinh (trị dƣờng ruột) nhƣ neomicin

(Ne), nalidixic axit (Ng), kanamicin (Kn), gentamicin (Ge).

- Có khả năng duy trì hoạt tính sinh học và sống sốt cao sau quá bình đông khô.

2. Đã nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân loại các chủng trên

đến loài là :

Chủng B là Lactobacillus agilis.

Chủng N4 là Lactobacillus salivarius.

Chủng L2 là Lactobacillus acidophilus.

Chủng nấm men Sac. sp. 02 là Sác. Cerevisiae.

3. Đã xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu cho sự tạo thành sinh khối của 3 chủng VK

lactic và 1 chủng nấm men.

4. Đã khảo sát và xác định đƣợc công thức tạo 2 loại chế phẩm probiotic P-SP-01 và

P-SP-02.

5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau quá trình bảo quản từ1 đến 2 vả 3 tháng cho thấy khả năng sống sốt của các chủng khá cao, sau 3 tháng mật độ tế bào ở mức cho phép (109

CFU/g). Chất lƣợng này tƣơng đƣơng với chế phẩm BioI đang lƣu hành rộng rãi trên thị

trƣờng.

6. Đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm P-SP-01 và P-SP-02 ở quy mô

phòng thí nghiệm.

7. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa, giai đoạn 28 đến

56 ngày tuổi. Kết quả thu đƣợc : Tỷ lệ tiêu chảy 7,74% ; Tỷ lệ tái phát 0%; Tăng trọng trung

bình là 384,3g/ngày ; Hệ

số tiêu tấn thức ăn 1,28%. So với lô sử dụng Biol, đạt chất lƣợng tốt hơn hay tƣơng

đƣờng.

ĐỀ NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu đạt đƣợc, để sớm đƣa chế phẩm vào ứng dụng thực tiễn,

chúng tôi xin đề nghị một số vấn đề sau :

- Tiếp tục hoàn thiện quy trình công nghệ tạo các chế phẩm Probiotic trên.

- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-02 ƣơng phòng và bị tiêu chảy cho heo con

sau cai sữa làm cơ sở cho việc sản xuất và sử dụng 2 chế phẩm nghiên cứu đƣợc ra quy mô

đại trà.

SẢN PHẨM THU ĐƢỢC SAU ĐỀ TÀI

1. Bài báo : "Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nám men Saccharomyces sp.02", Tạp chí

Khoa học, Trƣờng ĐHSP TP. Hồ Chí Minh, Năm 2006.

2. Bài báo : "Đặc điểm các chủng vi khuẩn lactic dùng trong chế phẩm probiotic phòng và trị

bệnh tiêu chảy cho heo", Hội nghị Khoa học lần thứ 20 kỷ niệm 50 năm thành lập

Trƣờng ĐHBK Hà Nội, Năm 2006.

3. Hai chế phẩm Probiotic P-SP-0I và P-SP-02.

Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở: Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ

BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ

BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về probiotic

A. Vi khuẩn lactic

B. Nấm men

1.3. Tổng quan về heo

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với yêu

cầu tạo chế phẩm probiotic.

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi

khuẩn lactic tuyển chọn

3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men

Bảng 3.6. Khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của chủng Saccharomyces sp.02 Kết quả Nồng độ +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 10 g/đĩa +++ 30 g/đĩa +++ 5 g/đĩa +++ 30 g/đĩa

Bảng 3.7. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của chủng Sac. cerevisiae Gây bệnh Viêm ruột, tiêu chảy Sốt thƣơng hàn ở ngƣời và tiêu chảy ở động vật

3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối

các chủng nghiên cứu

A. Vi khuẩn lactic

Thời gian (giờ)

Thời gian (giờ)

Thời gian ( giờ)

Bảng 3.9. Động thái quá trình tạo sinh khôi, sinh axit lactic và độ pH của 3 chủng VK lactic Các giá trị N4

3.5. Tạo chế phẩm probiotic

3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm

3.7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic

Hình 3.14. Chế phẩm P-SP-01 trước và sau khi đóng gói 3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa

Bảng 3.15. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Lô TN3 13 224 5,80 62,89

Bảng 3.16. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi Lô

Bảng 3.17. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm Lô ĐC1 121,5 72,7 1,67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

PHỤ LỤC

results of BLAST

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỂ TÀI:

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC

PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng