Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO TÊM NGUYÊN
BÀO SỢI NGƯỜI
Trần Công Toại*; Tô Minh Quân**
TÓM TẮT
Các tác giả sử dụng fibrin từ huyết thanh người
làm scaffold để phát triển vật liệu thay thế trung bì.
Nguyên bào sợi người nuôi cấy tới lần cấy chuyền
thứ 2. Để hình thành tấm nguyên bào sợi, nguyên
bào sợi người huyền phù trong keo fibrin, thêm
CaCl2 để tạo thành tấm nguyên bào sợi. Kiểm tra mô
học HE tấm nguyên bào sợi ở các ngày 8, 13, 15, 18.
Ngoài ra, còn nuôi nguyên bào sợi trên bề mặt tấm
fibrin để chứng minh khả năng làm giá thế nuôi cấy
tế bào.
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
59
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
* Từ khóa: Nguyên bào sợi; Keo fibrin; Tấm trung
bì.
Creation of human fibroblasts
Tran Cong Toai; To
Minh Quan
SUMMARY
The aim of this study was to develop a new method
to create dermal graft composite for the treatment of
various skin defects. We utilized human plasma
derived fibrin as the scaffold for the development of
a living human dermal equivalent: fibrin - fibroblast
(B - FF). Skin cells were cultured to passage 2. For
B - FF formation, human fibroblasts were suspensed
in human fibrin matrix and add CaCl2 to solution for
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
60
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
making dermal sheet. Dermal sheet were tested with HE staining on 8th, 13th, 15th, 18th day. Another hand,
we seeded a layer of fibroblast on the surface of
fibrin sheet to prove the ability of sacffold for cell
culture.
* Key words: Fibroblast; Fibrin glue; Dermal
sheet.
nhân (BN) mất da [6]. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tuy nhiên sự tồn tại của - Công nghệ mô da rất
lớp feeder nguyên bào hiệu quả trong chữa trị
sợi chuột và protein động vết bỏng. Rheinwald và
vật từ huyết thanh phôi Green nuôi cấy tế bào
bò trong nuôi cấy có thể sừng và phát triển tấm tế
tạo ra phản ứng thải loại bào sừng làm vật liệu
chậm. Sử dụng tấm tế thay thế cho những bệnh
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
61
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
bào sừng còn hạn chế lành vết thương nhanh
trong ứng dụng lâm sàng hơn và tốt hơn về mặt
do nó mỏng manh, tỉ lệ thẩm mỹ [1, 7].
chấp nhận mảnh ghép - Nhiều vật liệu đã
thấp [1, 6]. Vì vậy, phát được thử nghiệm tạo cấu
triển mảnh ghép da bằng trúc 3D cho nguyên bào
cách kết hợp một tấm sợi như collagen,
nguyên bào sợi nuôi trên collagen/chitosan, keo
vật liệu sinh học khắc fibrin thương mại, huyết
phục tốt hơn, làm làm thanh… [3]. Trong
tăng tỉ lệ chấp nhận nghiên cứu này,
mảnh ghép, quá trình
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
64
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
* Tr êng §¹i häc Y khoa Ph¹m Ngäc Th¹ch; ** §¹i
häc Quèc gia Thµnh phè Hå ChÝ Minh
Ph¶n biÖn khoa häc: GS. TS. Lª Gia Vinh
sử dụng fibrin như vật nguyên bào sợi trong
liệu sinh học vì nó được khuôn nền fibrin.
thu nhận từ huyết thanh
người. Vì vậy, có thể thu VẬT LIỆU, PHƯƠNG
nhận từ chính người PHÁP
bệnh, có thể tạo thành NGHIÊN CỨU
tấm trung bì tự thân từ
1. Vật liệu nghiên
fibrin và nguyên bào sợi
cứu.
tự thân [1, 4].
- Lấy da sản phụ mổ đẻ
- Mục đích của nghiên
trong cả hai lần sinh. Sau
cứu này là tạo cấu trúc
lần mổ đẻ đầu tiên, vết
3D fibrin - nguyên bào
cắt cổ tử cung hình thành
sợi bằng cách kết hợp
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
64
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
vết sẹo. Ở lần sinh thứ 2. Phương pháp
nghiên cứu.
hai, cắt bỏ vết sẹo giữ vết sẹo ở 4oC trong PBS • Tách nguyên bào sợi.
kháng sinh cho đến khi [2]:
sử dụng. - Thu da từ vết sẹo của
- Máu cuống rốn thu từ thai phụ hay vết da bòng,
trẻ sinh theo phương lưu giữ trong PBS vô
pháp tự nhiên, thai đủ trùng.
tháng. - Dùng dao phẫu thuật
- Da người và huyết cắt bỏ lớp tế bào mỡ trên
tương xét nghiệm âm tấm thớt đĩa petri.
tính với HIV, HCV, - Da người được ủ
HBV. Cả hai được sử
dụng càng nhanh càng trong trypsin - EDTA ở 4oC trong 18 giờ.
tốt.
- Tách lớp tế bào sừng,
dùng kéo cắt lớp trung bì
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
61
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
thành những mảnh mô 80% diện tích môi
nhỏ, sau đó chuyển mảnh trường).
mô vào trong bình Roux - Tiến hành cấy chuyền
ủ trong 1 giờ. đến lần thứ ba.
- Sau 1 giờ thêm 2 ml • Thu nhận huyết thanh
môi trường vào trong máu cuống rốn:
bình Roux. - Máu cuống rốn thu
- Sau 1 ngày, thay môi nhận từ thai nhi mổ
trường cũ bằng môi đẻ.
trường mới. - Sau khi sinh, thu nhận
- Cứ 3 ngày một lần máu cuống rốn trong ống
tiến hành thay môi ly tâm 15 ml có chứa
trường cho đến khi tế bào 1,25 ml natri citrate.
đạt đến mật độ cấy - Ly tâm 3000
chuyền (khoảng 70 - vòng/phút/5 phút. Hút
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
62
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
huyết thanh, lọc vào ống - Hút 5 ml dung dịch tế
ly tâm. bào đem ly tâm 3000
vòng/phút/5 phút. • Tạo tấm nguyên bào
sợi trong keo fibrin [1]: - Thêm 1 ml huyết
tương vào ống ly tâm có - Tiến hành cấy chuyền
tế bào, huyền phù, đếm nguyên bào sợi F2.
- Rửa bình nuôi bằng
tế bào, chỉnh về mật độ 5.105 tế bào/ml. PBS vô trùng hai lần.
- Cho 1 ml huyết tương - Ủ 2,5 ml trypsin -
có tế bào vào trong mỗi EDTA 2,5% trong 5
giếng trong đĩa 6 giếng. phút.
- Thêm 25 µl CaCl2 vào - Thêm 2,5 ml môi
trong mỗi giếng. trường để bất hoạt
- Ngày kế tiếp, hút bỏ trypsin - EDTA.
huyết tương dư, thay
bằng 1,5 ml môi trường
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
63
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
nuôi nguyên bào sợi, - Hai ngày thay môi
thay môi trường 3 trường một lần cho đến
ngày/lần. ngày thứ 8 đem đi
nhuộm HE. - Đem tấm nguyên bào
sợi ngày 4, 8, 13, 15, 18 3. Những phương
đi xét nghiệm mô học. pháp xác định trong
nghiên cứu. • Nuôi một lớp nguyên
bào sợi trên keo fibrin - Xác định nguyên bào
[6]: sợi: sử dụng nhuộm
vimentin để xác định - Cho 1 ml huyết thanh
nguyên bào sợi. cuống rốn vào 1 đĩa
trong đĩa 6 giếng. - Xác định tấm nguyên
bào sợi: sử dụng phương
pháp nhuộm HE để xác - Cấy 1 ml dịch tế bào mật độ 5.105 tế bào/ml
định cấu trúc lớp nguyên lên bề mặt đĩa.
bào sợi.
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
64
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
- Thời gian hình thành 4. Các chỉ tiêu cần
tấm nguyên bào sợi. khảo sát.
- Sự hình thành tấm - Tách rời tấm nguyên
nguyên bào sợi. bào sợi bằng tay.
KẾT QUẢ VÀ bµn LUẬN
1. Kết quả nuôi trung bì sơ cấp.
Ngày 3
Ngày 0
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
65
Ngày 7
Ngày 15
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
Hình 1: Nguyên bào sợi Po lan ra từ mảnh mô (x
10).
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
64
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
- Sau ba ngày nuôi cấy, * Kết quả nhuộm
tế bào bắt đầu lan ra vimentin: sau khi nhuộm,
mảnh mô, ngày thứ 3 có tế bào bắt màu dương
những tế bào đơn trải dài tính với vimentin. Tế bào
thành hình thoi. có màu nâu đậm.
- Ngày thứ 7, nguyên 2. Kết quả tạo keo
bào sợi ngày càng nhiều, fibrin.
trong giai đoạn này - Huyết thanh nhận từ
nguyên bào sợi tăng máu cuống rốn sau khi
trưởng mạnh, xung thêm CaCl2 vào, khoảng
quanh mảnh mô có nhiều 5 phút sau dịch fibrin
tế bào. đông đặc lại tạo thành
- Ngày thứ 15, tế bào tấm fibrin. Tấm fibrin có
hợp dòng, tạo thành một màu vàng, hơi xốp, dễ
lớp đơn trên bề mặt nuôi dàng tách ra khỏi vật
chứa và có hình dạng của cấy.
vật chứa.
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
65
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
không quan 3D, nó phải
len lỏi giữa những
khoảng trống của tấm
fibrin.
Nguyên bào sợi
Hình 2: Nguyên bào
sợi nhuộm vimentin.
3. Kết quả tạo tấm
nguyên bào sợi. Hình 3: Nguyên bào
sợi trong keo fibrin ngày - Một ngày sau khi tạo
8 (x 10). thành tấm fibrin, nguyên
bào sợi trong tấm fibrin
trải dài và có hình dạng - Tấm nguyên bào sợi
cong, uốn khúc. Điều cắt ngang cho thấy
này khác với nguyên bào nguyên bào sợi phân bố
sợi trên đĩa Roux, có thể đều trong tấm fibrin. Dựa
là do tế bào trải dài trong
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
66
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
vào hình ảnh nhuộm HE thấy 1 lớp nguyên bào
cắt ngang của tấm sợi mọc trên bề mặt tấm
nguyên bào sợi các ngày fibrin. Ngoài ra một số tế
4, 8, 13, 15, 18, lượng bào len lỏi vào bên trong
nguyên bào sợi trong các tuy nhiên đâm không sâu
ngày 4, 8, 13 nhiều hơn so và số lượng tế bào không
với các ngày 15, 18, đã nhiều.
xác định sinh trưởng tốt
trong 13 ngày đầu, giảm
dần ở các ngày sau.
KẾT LUẬN
4. Nguyên bào sợi
Qua nghiên cứu, chúng
trên màng fibrin.
tôi rút ra một số nhận
Sau khi cấy lên bề mặt xét:
tấm fibrin, một ngày sau
- Tạo được tấm nguyên
nguyên bào sợi bắt đầu
bào sợi người trong
bám, trải dài. Hình cắt
fibrin.
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
ngang tấm fibrin đã cho 67
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
- Tấm nguyên bào sợi Reconstruction of living
bóc bằng tay dễ dàng. bilayer human skin
equivalent utilizing - Thời gian sử dụng
human fibrin as a tấm nguyên bào sợi
scaffold. Burns, 2007, khoảng 2 tuần sau khi
33, pp. 355 - 363. tạo.
2. Akira Takashima. - Fibrin có khả năng
Current Protocols in cell làm giá thể nuôi tế bào.
biology, 1998, pp. 211 - TÀI LIỆU THAM
212. KHẢO
3. B. L. Seal, T. C. 1. A. L. Mazlyzam, B.
Otero, A. Panich. S. Aminuddin, N. H.
Polymer material for Fuzina, M. M. Norhayati,
tisse and organ O. Fauziah, M. R. Isa, L.
regeneration, Material Saimh, B. H. I.
science and Engineering Ruszymah.
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
68
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
R. 2001, 34, pp. 147 - keratinocytes and
230. autologous fibrin sealant
in a porcine wound 4. Béatrice Mis, Eric
model. British Journal of Rolland, Vincent
Plastic Surgery, 2002, Ronfard. Combined use
55, pp. 219 - 227. of a collagen - based
dermal substitute and a 6. L. P. Kamolza, M.
fibrin - based cultured Luegmair, N. Wickb, B.
epithelium: a step toward Eisenbocka, S. Burjaka,
a total skin replacement R. Koller, G. Meissl, M.
for acute wounds. Burns, Frey. The Viennese
2004, 30, pp. 713 - 719. culture method: cultured
human epithelium 5. Grant, K. Warwick,
obtained on a dermal J. Marshall, C. Green và
matrix based on R. Martin. The co -
fibroblast containing application of sprayed
autologous
t¹p chÝ y - d îc häc qu©n sù sè 1-2009
cultured 69
Sè chuyªn ®Ò hinh th¸I häc chµo mõng 60 n¨m ngµy truyÒn thèng häc viÖn qu©n y
fibrin glue gels. Burns,
2005, 31, pp. 25 - 29.
7. R. E. Horch, H.
Banasch, G. B. Stark.
Translation of cultured
autologous keratinocytes
in fibrin sealant
biomatrix to resurface
chronic wounds.
Transplantation
Proceedings, 2001, 33,
pp. 642 - 644.
