Luận án Tiến sĩ Dược học: Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHƯU MỸ LỆ

BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHƯU MỸ LỆ

KHƯU

BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG

DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế

Mã số: 62720402

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. HOÀNG MINH CHÂU

2. GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả

trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tác giả

Khưu Mỹ Lệ

MỤC LỤC

............................................................................................................................ Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt, bảng đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt

Danh mục các bảng, hình, biểu đồ và sơ đồ

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4

1.1. Tình hình nghiên cứu và thành tựu của công nghệ nano ..................................... 4

1.2. Khái niệm và phân loại tiểu phân nano trong ngành dược .................................. 7

1.3. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid ..................................................... 9

1.4. Phương pháp phân tích tính chất của hệ tiểu phân nano lipid ............................... 16

1.5. Các tá dược dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano ART .................................. 25

1.6. Artemisinin và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị sốt rét ................................ 27

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 37

2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 37

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 39

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 59

3.1. Kết quả đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol 888® ATO –

LabrafacTM PG) và ART ........................................................................................... 59

3.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ...... 65

3.3. Kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART ..................................... 92

3.4. Kết quả đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART

trên chuột gây nhiễm P. berghei ............................................................................. 122

Chương 4. BÀN LUẬN .........................................................................................127

4.1. Tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART

................................................................................................................................. 127

4.2. Công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ................................. 128

4.3. Tính chất của hệ tiểu phân nano ART .............................................................. 136

4.4. Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây

nhiễm Plasmodium berghei..................................................................................... 142

KẾT LUẬN ............................................................................................................144

KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................146

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Atomic force microscopy AFM

Artemisinin ART

Artemisinin – based combination therapies ACTs

Artemisinin and its derivatives ARTs

Công thức CT

Dược điển DĐ

Dihydroartemisinin DHA

Dung môi DM

Dầu/Nước D/N

Differential scanning calorimetry DSC

High pressure homogenization HPH

High performance liquid chromatography HPLC

Hiệu suất nang hóa HSNH

Kính hiển vi KHV

Kết tủa KT

Ký sinh trùng KST

Kích thước tiểu phân KTTP

Laser diffraction LD

Nước/Dầu N/D

N/D/N Nước/Dầu/Nước

Nanostructured lipid carriers NLC

Nhũ tương NT

Photon correlation spectroscopy PCS

Pha dầu PD

Poly dispersity index PdI

Polyethylen glycol PEG

Pha nước PN

PTHC Phóng thích hoạt chất

PTNH Phần trăm nang hóa

RESS Rapid expansion from supercritical solutions

RH Relative humidity

SAS Supercritical antisolvent

SEM Scanning electron microscopy

SLN Solid lipid nanoparticles

STH Siêu tới hạn

TB Trung bình

TEM Transmission electron microscope

TN Thí nghiệm

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Artemisinin and its derivatives Artemisinin và dẫn chất

Artemisinin – based combination therapies Các liệu pháp phối hợp dựa vào

artemisinin

Atomic force microscopy Phép đo kính hiển vi lực nguyên

tử

Differential scanning calorimetry Phép đo quét nhiệt vi sai

High pressure homogenization Đồng nhất hóa áp suất cao

High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Laser diffraction Nhiễu xạ laser

Nanostructured lipid carriers Giá mang lipid cấu trúc nano

Photon correlation spectroscopy Phổ tương quan photon

Poly dispersity index Chỉ số đa phân tán

Rapid expansion from supercritical solutions Khuếch trương nhanh từ dung

dịch siêu tới hạn

Relative humidity Độ ẩm tương đối

Scanning electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử quét

Solid lipid nanoparticles Tiểu phân nano lipid rắn

Supercritical antisolvent Đối kháng dung môi siêu tới hạn

Transmission electron microscopy Phép đo kính hiển vi điện tử

truyền qua

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Số lượng công bố về vật liệu nano ở một số nước ASEAN và Nhật .......... 5

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano đang lưu hành trên thị trường ....................... 6

Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn và dầu dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid ...... 10

Bảng 1.4 Ưu nhược điểm của các phương pháp bào chế tiểu phân nano ................. 15

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 37

Bảng 2.2 Hóa chất và dung môi nghiên cứu ............................................................. 37

Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................... 38

Bảng 2.4 Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano ART ................................ 42

Bảng 2.5 Các mức của yếu tố khảo sát ..................................................................... 46

Bảng 3.1 Thể chất của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG ................. 59

Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG

và lượng ART khác nhau .......................................................................................... 64

Bảng 3.3 Thành phần các công thức bào chế hệ tiểu phân nano .............................. 65

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát một số tính chất của hệ tiểu phân nano .......................... 65

Bảng 3.5 Thông số KTTP của CT 6 .......................................................................... 68

Bảng 3.6 Thành phần công thức với chất diện hoạt polysorbat 80 ........................... 69

Bảng 3.7 Thông số KTTP của mẫu 25, 26 và 27 ...................................................... 69

Bảng 3.8 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 –

Gelucire® 50/13 ......................................................................................................... 71

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá một số tính chất của mẫu 19, 20 và 21 .......................... 71

Bảng 3.10 Thông số KTTP của mẫu 19, 20 và 21 .................................................... 71

Bảng 3.11 Thành phần công thức với hỗn hợp polysorbat 80 - phosphatidylcholin

.................................................................................................................................. .73

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 22, 23 và 24 .......................... 73

Bảng 3.13 Thông số KTTP của CT 22, 23 và 24 ...................................................... 75

Bảng 3.14 Thành phần các công thức phối hợp phosphatidylcholin ........................ 75

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 16, 17 và 18 .......................... 76

Bảng 3.16 Thông số KTTP của CT 17 và 18 ............................................................ 77

Bảng 3.17 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 –

SimulsolTM 4000 P .................................................................................................... 78

Bảng 3.18 Thông số KTTP của CT 28, 29 và 30 ...................................................... 80

Bảng 3.19 Thông số KTTP của mẫu đồng nhất hóa bằng HPH ............................... 82

Bảng 3.20 Thông số KTTP của mẫu sau khi tăng áp suất đồng nhất hóa ................ 84

Bảng 3.21 Tính chất của các hệ tiểu phân có hàm lượng ART khác nhau ............... 85

Bảng 3.22 Các mức của yếu tố khảo sát ................................................................... 87

Bảng 3.23 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả ....................................................... 87

Bảng 3.24 KTTP của 6 TN ở điều kiện cơ bản ......................................................... 88

Bảng 3.25 Kích thước tiểu phân TB của thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng .......... 89

Bảng 3.26 Thông số KTTP của các lô kiểm chứng .................................................. 90

Bảng 3.27 Sự thay đổi KTTP trong quá trình khảo sát ............................................. 91

Bảng 3.28 Thông số kích thước của hệ tiểu phân nano ART ................................... 92

Bảng 3.29 Các thông số sắc ký của thẩm định tính tuyến tính ................................. 97

Bảng 3.30 Các thông số thẩm định độ lặp lại ........................................................... 98

Bảng 3.31 Các thông số sắc ký của ART .................................................................. 99

Bảng 3.32 Các thông số thẩm định độ đúng ............................................................. 99

Bảng 3.33 Hàm lượng % và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART ........ 100

Bảng 3.34 Dữ liệu lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART ........ 101

Bảng 3.35 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART ........................ 102

Bảng 3.36 Tiêu chuẩn nguyên liệu của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

................................................................................................................................. 103

Bảng 3.37 Chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano ART ................................... 103

Bảng 3.38 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano ART các lô nâng cấp .............. 109

Bảng 3.39 Hàm lượng %, PTNH và HSNH của lô nâng cấp.................................. 111

Bảng 3.40 Lượng hoạt chất phóng thích của lô nâng cấp ....................................... 112

Bảng 3.41 Tính chất của hệ tiểu phân lô nâng cấp ................................................. 113

Bảng 3.42 Bảng tóm tắt tính chất của tiểu phân lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp

................................................................................................................................. 113

Bảng 3.43 Kết quả tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano không chứa ART ... 114

Bảng 3.44 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART ở 6 ± 2 oC ... 115

Bảng 3.45 Giá trị p so sánh KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART theo thời

gian bảo quản với tháng 0 ....................................................................................... 115

Bảng 3.46 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC .................. 116

Bảng 3.47 Giá trị p so sánh KTTB của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC............ 116

Bảng 3.48 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC ....................... 117

Bảng 3.49 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH . 119

Bảng 3.50 Giá trị p so sánh kích thước của hệ tiểu phân nano ART theo thời gian

bảo quản với tháng 0 ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH..................................................... 119

Bảng 3.51 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

................................................................................................................................. 120

Bảng 3.52 Mật độ KST (KST/vi trường) của lô chứng âm và các lô điều trị ......... 122

Bảng 3.53 Giá trị p đánh giá mật độ KST giữa lô chứng âm và lô điều trị ............ 123

Bảng 3.54 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột giữa lô chứng âm và lô điều trị

................................................................................................................................. 124

Bảng 3.55 Thời gian sống sót của chuột lô chứng âm và các lô điều trị (ngày 35)

................................................................................................................................ .125

Bảng 3.56 Thời gian sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35) ........ 125

Bảng 3.57 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị

(ngày 35) ................................................................................................................. 126

Bảng 4.1 Kích thước của tiểu phân nano ART ở các áp suất và chu kỳ khác nhau

................................................................................................................................ .135

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Tỉ lệ bằng sáng chế trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe của một số quốc gia

trên thế giới (a) và tỉ lệ bằng sáng chế trong các lĩnh vực ứng dụng (b) .................... 5

Hình 1.2 Cấu tạo SLN (a), NLC dạng I (b), NLC dạng II (c) và NLC dạng III (d) ... 9

Hình 1.3 Hình minh họa cấu tạo (a) và cơ chế hoạt động (b) của máy HPH ........... 13

Hình 1.4 Các phương pháp đo kích thước và vùng kích thước phù hợp .................. 17

Hình 1.5 Vị trí định vị hoạt chất nang hóa ở tiểu phân ............................................. 22

Hình 1.6 Hình minh họa sự giải phóng hoạt chất qua túi thẩm tách ......................... 24

Hình 1.7 Hình minh họa tế bào Franz ....................................................................... 24

Hình 1.8 Công thức hóa học của artemisinin ............................................................ 27

Hình 3.1 Hình ảnh tiểu phân của CT 13 quan sát bằng KHV (x 100) ...................... 66

Hình 3.2 Hình ảnh tiểu phân của CT 12 quan sát bằng KHV (x 100) ...................... 66

Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân của CT 9 quan sát bằng KHV (x 100) ........................ 67

Hình 3.4 Hình ảnh tiểu phân của CT 6 quan sát bằng KHV (x 100) ........................ 67

Hình 3.5 Hình ảnh tiểu phân nano ART chụp bằng TEM (x 50.000) ....................... 94

Hình 3.6 Hình ảnh tiểu phân của lô nâng cấp chụp bằng TEM (x 30.000) ............ 110

Hình 3.7 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 3 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 50.000)

................................................................................................................................. 118

Hình 3.8 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 6 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 30.000)

................................................................................................................................. 118

Hình 3.9 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 4 tháng bảo quản ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5%

RH (x 30.000) .......................................................................................................... 121

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ nhiệt (a) Compritol® 888 ATO, (b) hỗn hợp Compritol® 888

ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) ................................................................................... 60

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ điểm chảy của Compritol® 888 ATO và các hỗn hợp lipid ..... 61

Biểu đồ 3.3 Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART 62

Biểu đồ 3.4 Biểu đồ nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau ................................................................. 63

Biểu đồ 3.5 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 6......................................... 68

Biểu đồ 3.6 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 25 (a), 27 (b) và 26 (c) ...... 70

Biểu đồ 3.7 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 20 (a), CT 21 (b) và 19 (c)....... 72

Biểu đồ 3.8 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 22 (a), 24 (b) và 23 (c) ............. 74

Biểu đồ 3.9 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 18 (a) và 17 (b) .................. 76

Biểu đồ 3.10 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 30 (a), 28 (b) và 29 (c) .... 79

Biểu đồ 3.11 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của mẫu HPH 500 bar 10 chu kỳ 81

Biểu đồ 3.12 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân sau HPH 800 bar 10 chu kỳ (a),

1.000 bar 10 chu kỳ (b) và 1.100 bar 5 chu kỳ (c) .................................................... 83

Biểu đồ 3.13 Biểu đồ hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân nano ART .............. 86

Biểu đồ 3.14 Biểu đồ so sánh các thông số KTTP của các mẫu khảo sát ................. 91

Biểu đồ 3.15 Biểu đồ phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART ......................... 93

Biểu đồ 3.16 Biểu đồ phân bố thế zêta của hệ tiểu phân nano ART ........................ 94

Biểu đồ 3.17 Sắc ký đồ HPLC của ART (a) mẫu chuẩn và (b) mẫu thử .................. 95

Biểu đồ 3.18 Sắc ký đồ (a) pha động (b) mẫu bào chế không chứa ART (c) mẫu

chứa ART và (d) mẫu không chứa ART thêm chuẩn ............................................... 96

Biểu đồ 3.19 Đồ thị biểu thị tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh ................. 97

Biểu đồ 3.20 Lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART ................ 101

Biểu đồ 3.21 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của lô nâng cấp .......................... 108

Biểu đồ 3.22 Biểu đồ phân bố thế zêta của lô nâng cấp ......................................... 110

Biểu đồ 3.23 Lượng hoạt chất phóng thích của tiểu phân nano ART lô nâng cấp . 112

Biểu đồ 3.24 Biểu đồ lượng hoạt chất phóng thích lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp .. 114

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano .................................. 11

Sơ đồ 1.2 Các phương pháp xác định kích thước tiểu phân ..................................... 16

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước bào chế hệ tiểu phân nano ART ...................................... 45

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART .................................... 106

MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỉ gần đây, công nghệ nano đã, đang phát triển mạnh mẽ và được

ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau. Công nghệ nano tạo nên các tiểu phân hoặc

cấu trúc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Tuy nhiên, trong dược phẩm, tiểu phân

nano bao gồm cả những tiểu phân có kích thước từ 1 nm đến 1 µm được ứng dụng

để chuyển giao hoạt chất đến nơi tác động [147]. Với cấu trúc được thiết kế đặc

biệt, tiểu phân nano có ưu điểm nổi trội như bảo vệ hoạt chất, tăng tính thấm thuốc

qua hàng rào sinh học, giải phóng hoạt chất có kiểm soát, phóng thích tại đích và

bảo vệ mô lành, tránh sự đa đề kháng thuốc.

Hoạt chất được nghiên cứu thuộc nhiều nhóm dược lý, gồm các chất có tác dụng

kháng ung thư, chống thải ghép, tiểu đường hay diệt ký sinh trùng,... Trong nhóm

diệt ký sinh trùng phải kể đến thuốc điều trị sốt rét – đặc biệt là artemisinin (ART)

và dẫn chất – vì chúng có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh. ART và dẫn

chất đã được WHO đưa vào phác đồ điều trị sốt rét từ năm 2001, cho đến nay vẫn

chưa có chất mới nào có thể thay thế được. Tu Youyou – nhà khoa học phát minh

ART – nhận giải Nobel năm 2015 cùng với Satoshi Omura và William Campbell đã

nói lên giá trị khoa học, giá trị thực tiễn và tính thời sự của ART. Hạn chế của ART

do tính chất rất kém tan (thực tế không tan) trong nước và cũng rất ít tan trong dầu

[2], [149] ảnh hưởng tới sinh khả dụng của thuốc.

Hiện nay, vẫn còn khoảng 3,2 tỉ dân số thế giới có nguy cơ mắc bệnh sốt rét. Năm

2015 có khoảng 214 triệu trường hợp mới mắc và 438.000 trường hợp tử vong do

sốt rét [153]. Ở nhiều khu vực, ký sinh trùng Plasmodium falciparum đề kháng lan

rộng với cloroquin, quinin dẫn đến thất bại điều trị và tăng tỉ lệ tử vong [150],

[152]. Một trong những nguyên nhân gây đề kháng là do tính chất của hoạt chất như

kém tan, kém bền nên sinh khả dụng thấp hay thời gian bán thải ngắn khiến nồng độ

thuốc không đạt yêu cầu điều trị. Trong khi đó, quá trình phát minh hoạt chất mới

có tác dụng trên ký sinh trùng cần rất nhiều thời gian và chi phí, đến nay các nghiên

cứu vẫn trong giai đoạn thử nghiệm. Vì những trở ngại này, trong kế hoạch ngăn

chặn sự đề kháng của ký sinh trùng sốt rét trên toàn cầu, WHO đã chọn cải tiến kỹ

thuật là giải pháp được ưu tiên hàng đầu nhằm bảo vệ hiệu quả điều trị của ART và

dẫn chất [151].

Giải pháp được quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ nano trong kỹ thuật bào

chế [118]. Khi đó, quá trình đến đích sinh học của hoạt chất không còn phụ thuộc

vào tính chất lý hóa của hoạt chất mà phụ thuộc phần lớn vào kích thước, hình dạng,

tính chất bề mặt,... của tiểu phân. Bào chế hệ tiểu phân nano lipid nhằm cải thiện độ

tan và khả năng phân tán của ART trong môi trường để có thể sử dụng bằng đường

uống hoặc tiêm tĩnh mạch, từ đó cải thiện sự hấp thu và sinh khả dụng cũng như

kiểm soát quá trình phóng thích hoạt chất, tăng thời gian tác dụng của thuốc nhằm

hạn chế sự đề kháng [34], [121]. Với mục đích đó, đề tài “Bào chế hệ tiểu phân

nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột”

được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

 Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG) và ART.

 Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART.

 Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART.

 Đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên

chuột gây nhiễm Plasmodium berghei.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1. Xác định được tỉ lệ của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART

nhằm thu được pha dầu đồng nhất cho công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

thông qua khảo sát, đánh giá sự thay đổi về nhiệt độ nóng chảy của Compritol®

888 ATO và sự hiện diện của ART trong biểu đồ DSC.

2. Xác định thành phần công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ở

quy mô phòng thí nghiệm (100 g), làm cơ sở để nâng cỡ mẫu bào chế lên 1.000 g

bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao nhiệt độ cao.

3. Xác định được kích thước, hình thể học, thế zêta, phần trăm nang hóa, hiệu suất

nang hóa và độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART, từ đó xây dựng tiêu chuẩn

cho sản phẩm nghiên cứu.

4. Đánh giá hiệu quả điều trị của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm

Plasmodium berghei thông qua các chỉ tiêu: Mật độ ký sinh trùng, tỉ lệ giảm mật

độ ký sinh trùng, thời gian sạch ký sinh trùng và thời gian duy trì tình trạng sạch

ký sinh trùng trong máu chuột bằng cách so sánh với nhóm chứng dương.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu và thành tựu của công nghệ nano

1.1.1 Thành tựu của công nghệ nano trên thế giới

Năm 2000, Mỹ là quốc gia đầu tiên thành lập hiệp hội chuyên trách về công nghệ

nano, đó là Hiệp hội Công nghệ nano quốc gia (National Nanotechnology Initiative,

NNI) [44], [117]. Theo NNI, công nghệ nano là kỹ thuật kiểm soát kích thước của

vật chất từ 1 nm đến 100 nm, khi đó, tính chất mới hình thành tạo nên ứng dụng

mới. Công nghệ nano kết hợp lý thuyết khoa học về nano, thiết bị và công nghệ để

thao tác, chế tạo và ứng dụng vật chất ở kích thước nm [83], [119].

Lux Research ước tính tổng ngân sách dành cho công nghệ nano trên toàn cầu

khoảng 18,5 tỉ USD, với doanh thu khoảng 731 tỉ USD trong năm 2012, con số này

có thể đạt 4,4 nghìn tỉ USD vào 2018. Công nghệ nano hướng đến các lĩnh vực:

Điều trị, phòng ngừa nhằm giảm tỉ lệ tử vong hay ngăn ngừa ung thư.

Cơ quan mới để thay thế bộ phận bị bệnh trong cơ thể.

Miếng dán qua da, bộ phận cảm biến và cảnh báo mức đường huyết.

Hệ thống lọc nước di động để nước sạch đến được khắp nơi trên toàn thế giới.

Cung cấp năng lượng, lưu trữ thông tin, cảnh báo ô nhiễm,...[86], [129].

Lượng công bố về công nghệ nano trong chăm sóc sức khỏe chiếm 4% với 6 lĩnh

vực chính. Đầu tiên là hệ phân phối thuốc (drug delivery) nhằm cải thiện sinh khả

dụng và dược động học của thuốc, gồm liposome, tiểu phân polyme, tinh thể

nano,... Hai là, thuốc và liệu pháp (drugs and therapy) với hoạt chất kích thước nano

như dendrimers. Tiếp đến là chế tạo tác nhân chẩn đoán hình ảnh in vivo và in vitro

(in vivo imaging, in vitro diagnostics) như oxid sắt từ, ống nano. Ngoài ra còn có

vật liệu sinh học kích thước nano dùng trong nha khoa hay cấy phóng xạ (active

implants) tiểu phân từ tính dùng cho MRI [43], [159]. Trong đó, hệ phân phối thuốc

chiếm trọng tâm nghiên cứu khi có 59% bằng sáng chế (Hình 1.1b). Mỹ có nhiều

nghiên cứu nhất với 32% lượng công bố và 54% bằng sáng chế (Hình 1.1a) [141].

Khác 23% Pháp 3%

Anh 3% Cấy phóng xạ 3% Thuốc và liệu pháp 3% Vật liệu sinh học 8%

Nhật 5%

Đức 12%

Mỹ 54%

Chẩn đoán in vivo 13% Chẩn đoán in vitro 3% Hệ phân phối thuốc 59%

(a) (b)

Hình 1.1 Tỉ lệ bằng sáng chế trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe của một số quốc gia

trên thế giới (a) và tỉ lệ bằng sáng chế trong các lĩnh vực ứng dụng (b)

"Nguồn: Wagner V, 2006" [141]

Tại Châu Á, số liệu liên quan đến lĩnh vực dược phẩm chưa được thống kê. Tuy

nhiên, ở lĩnh vực vật liệu nano, Nhật và các thành viên ASEAN đã có những đóng

góp đáng kể. Nhật có nhiều nghiên cứu được công bố nhất (Bảng 1.1).

Bảng 1.1 Số lượng công bố về vật liệu nano ở một số nước ASEAN và Nhật

Quốc gia Nhật Singapore Malaysia Thái Lan Việt Nam Indonesia

Lượng 4.672 1.045 384 318 86 26 công bố

"Nguồn: Tanthapanichakoon W, 2014" [133]

1.1.2 Thành tựu của công nghệ nano tại Việt Nam

Mặc dù chậm hơn so với thế giới nhưng Việt Nam cũng đã có những công bố về các

nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực vật liệu nano (Bảng 1.1) [133]. Ngoài các bài

báo được đăng tải trên các website nước ngoài, còn có các nghiên cứu được công bố

trong các hội nghị và tạp chí chuyên ngành trong nước. Tuy nhiên, vẫn chưa có

nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin được công bố.

1.1.3 Các chế phẩm thuốc của công nghệ nano đang có trên thị trường

Một số sản phẩm thuốc ứng dụng công nghệ nano trong bào chế đang lưu hành trên

thị trường được nêu trong Bảng 1.2 [41], [106].

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano đang lưu hành trên thị trường

Hoạt chất

Dạng bào chế

Chỉ định

Dạng tiểu phân nano Liên kết protein

Sản phẩm Abraxane Abelcet

Hỗn dịch tiêm truyền Ung thư di căn Hỗn dịch tiêm truyền Nhiễm nấm

Adagen

Gắn kết polyme PEG

Dung dịch tiêm bắp

Paclitaxel Amphotericin B Liposome Adenosin deaminase

Liệu pháp thay thế enzym

AmBisome

Amphotericin B Liposome

Nhiễm nấm

Đau mãn tính vừa - nặng

Cytarabin Morphin sulfat

Amphotericin B Liposome Amphotec Avinza Morphin sulfat DaunoXome Daunorubicin DepoCyt Depodur Doxil/CaelyX Doxorubicin Emend Estrasorb

Tinh thể nano Liposome Liposom PTKD Liposome Liposome Tinh thể nano Micell

Fosrenol

Bệnh thận giai đoạn cuối

Tiểu phân nano vô cơ

Genexol-PM

Ung thư

Micell polyme

Myocet

Ung thư

Liposome

Aprepitant Estradiol Lanthanum carbonat Paclitaxel Doxorubicin citrat Megestrol Naproxen

Megace ES Naprelan

Bột đông khô tiêm truyền tĩnh mạch Bột đông khô tiêm IV Nhiễm nấm Viên nang PTKD Hỗn dịch tiêm truyền Ung thư Ung thư Hỗn dịch tiêm Hỗn dịch tiêm Đau mãn tính vừa - nặng Hỗn dịch, tiêm truyền Ung thư Bột tiêm truyền Nôn, buồn nôn do hóa trị Nhũ tương, ngoài da Hội chứng tiền mãn kinh Viên nén (có thể nhai) Dung dịch, tiêm IV Bột đông khô, tiêm truyền Hỗn dịch uống Viên nén

Ung thư Viêm khớp mãn tính

Nanoxel

Paclitaxel

Dung dịch tiêm

Ung thư

Neulasta

Filgrastim

Giảm bạch cầu trung tính (neutropenia)

Oncospar

Ung thư

Pegasys

Viêm gan B, C

PegIntron

Viêm gan C mãn tính

Tinh thể nano Tinh thể nano Tiểu phân nano polyme Gắn kết với polyme PEG Gắn kết với polyme PEG Gắn kết với polyme PEG Gắn kết với polyme PEG Tinh thể nano

Dung dịch, tiêm dưới da Dung dịch, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch Dung dịch, tiêm dưới da Bột đông khô, tiêm dưới da Viên nén

Rapamune

Oncospar PEG- Lasparaginase Peginterferon alfa 2a Peginterferon alfa 2b Sirolimus

Somavert

Pegvisomant

Phức hợp protein polyme

Bột đông khô, tiêm dưới da

Tricor® Triglide®

Fenofibrat Fenofibrat

Tinh thể nano Tinh thể nano

Viên nén Viên nén

Megace ES® Megestrol

Hỗn dịch nano

Hỗn dịch uống

Ritonavir

Nhũ tương micro

Nhũ tương uống

Cyclosporin

Nhũ tương micro

Nhũ tương uống

Ức chế miễn dịch Hội chứng tăng tiết hormon tăng trưởng sau dậy thì Lipid máu cao Lipid máu cao Suy yếu, sụt cân trên bệnh nhân AIDS HIV Thải ghép khi cấy ghép cơ quan

Diazepam

Nhũ tương nano

Nhũ tương uống

Mất ngủ, lo âu

Norvir® Sandimmune Neoral® Diazepam- Lipuro

"Nguồn: Desai PP, 2012. Nijhara R, 2006. Wagner V, 2006" [41], [106], [141]

1.2. Khái niệm và phân loại tiểu phân nano trong ngành dược

1.2.1 Khái niệm tiểu phân nano trong ngành dược

Trong dược phẩm, tiểu phân nano được định nghĩa là tiểu phân phân tán (particulate

dispersion) có kích thước từ 1 nm đến 1 µm [39], [147].

Tiểu phân nano lipid là tiểu phân nano cấu tạo bởi lớp màng lipid bao quanh lõi

lipid ở trạng thái rắn, lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng; hoạt chất được hòa tan, phân

tán trong lipid hoặc gắn kết trên bề mặt tiểu phân [47].

1.2.2 Phân loại tiểu phân nano trong ngành dược

Theo thành phần cấu tạo, tiểu phân nano bao gồm: tiểu phân nano vô cơ, polyme và

tiểu phân nano lipid. Ngoài ra, còn có tinh thể nano, là dạng cấu trúc đặc biệt vì

không có chất mang [47], [134]. Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài chỉ tổng hợp các

thông tin về tiểu phân nano lipid. Đây là tiểu phân được ứng dụng nhiều trong phân

phối thuốc nhờ tính tương thích sinh học của tá dược [146], [160].

1.2.3 Một số tiểu phân nano lipid ứng dụng trong bào chế dược phẩm

1.2.3.1 Micelle

Micelle gồm lipid hoặc các phân tử thân nước khác như polyme hoặc polyamino

acid, được hình thành do sự tự sắp xếp của các phân tử có khối lượng phân tử thấp

với đầu kỵ nước hướng vào trong tạo thành lipid lớp đơn có lõi thân dầu, kích thước

từ 10 – 100 nm. Micelle đảo tạo thành từ sự tự sắp xếp của chất diện hoạt trong

dung môi hữu cơ (đầu kỵ nước hướng ra môi trường) [20], [48].

1.2.3.2 Liposome

Liposome tạo thành do sự sắp xếp của phospholipid theo trình tự đuôi thân nước

hướng vào trong đầu kỵ nước hướng ra ngoài. Vì vậy, lõi liposome chứa chất tan

trong nước, đặc biệt là protein và peptid. Màng phospholipid mang hoạt chất thân

dầu vì đó là lipid lớp kép. Phospholipid màng có một hoặc nhiều lớp kép của lipid

thân nước. Kích thước của liposome từ 20 nm đến vài µm [134], [138].

1.2.3.3 Nhũ tương micro (vi nhũ tương, microemulsion)

Nhũ tương micro có cấu tạo là nhũ tương D/N hoặc N/D, được bào chế từ việc phân

tán pha dầu vào pha nước có chất diện hoạt. Kích thước của giọt lỏng thường

khoảng 100 nm. Nhũ tương micro có thể chứa cả hoạt chất thân nước lẫn thân dầu.

Tuy nhiên, tỉ lệ chất diện hoạt cần thiết để ổn định nhũ tương micro thường khá cao.

Nhũ tương micro không bền khi pha loãng với nước [48], [118].

1.2.3.4 Nhũ tương nano (nanoemulsion)

Sự phối hợp hai pha dầu – nước bằng lực khuấy mạnh với sự hiện diện của chất

diện hoạt tạo thành nhũ tương nano với kích thước giọt dầu từ 20 – 200 nm. Nhũ

tương nano không bền do sự kết tụ tạo thành tiểu phân lớn hơn khi nồng độ chất tan

quá bão hòa trong môi trường (Oswald ripening) [101].

Nhũ tương micro và nhũ tương nano đều là hệ phân tán dầu trong nước với tiểu

phân phân tán có kích thước nm. Tuy nhiên, nhũ tương micro là hệ bền về nhiệt

động học (thermodynamically stable), trong khi đó, nhũ tương nano bền về động lực

học (kinetic stability). Trong quá trình bào chế, để thu được nhũ tương nano cần

năng lượng cao và lực phân tán mạnh còn nhũ tương micro được tạo thành tại điểm

cân bằng nhiệt động học nên cần dùng lượng chất diện hoạt cao [48], [137].

1.2.3.5 Tiểu phân nano lipid rắn (solid lipid nanoparticles, SLN)

SLN được bào chế bằng cách thay thế thành phần dầu lỏng của nhũ tương D/N bằng

một hoặc hỗn hợp lipid rắn. So với nhũ tương nano, SLN kiểm soát sự phóng thích

tốt hơn. Tuy nhiên, tỉ lệ chứa hoạt chất của SLN khá thấp do nhiều hoạt chất ít tan

trong lipid rắn. Sau khi bào chế, lipid rắn thường ở dạng có mức năng lượng cao (α,

β’). Trong quá trình bảo quản, chúng có xu hướng trở về mức năng lượng thấp hơn

(dạng β) ở trạng thái kết tinh nên dễ đẩy hoạt chất ra khỏi tiểu phân [104], [148].

1.2.3.6 Giá mang lipid cấu trúc nano (naonostructured lipid carriers, NLC)

Với NLC, pha dầu là hỗn hợp lipid rắn – lỏng với tỉ lệ khác nhau nhưng vẫn tạo nên

tiểu phân rắn ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ cơ thể. Có 3 dạng NLC. Dạng kết tinh

không hoàn toàn (imperfect lipid matrix) có lipid rắn chiếm tỉ lệ cao hơn lipid lỏng.

Khi về nhiệt độ phòng sẽ có sự xáo trộn trong cấu trúc, tạo thành các “khoảng

trống” chứa hoạt chất (dạng I, Hình 1.2 b). Dạng cấu trúc lipid lỏng/rắn/nước có tỉ

lệ lipid lỏng cao hơn lipid rắn. Sự tách pha trong quá trình làm nguội tạo nên các hạt

dầu li ti với cấu trúc lipid lỏng/rắn/nước (dạng II, Hình 1.2 c). Dạng vô định hình có

tỉ lệ lipid lỏng nhất định nhằm ngăn sự kết tinh hoàn toàn của lipid rắn và giúp

chúng tồn tại ở dạng vô định hình (dạng III, Hình 1.2 d) [99], [146].

Hoạt chất

d b C a Hình 1.2 Cấu tạo SLN (a), NLC dạng I (b), NLC dạng II (c) và NLC dạng III (d)

"Nguồn: Müller RH, 2002" [99]

Ngoài khả năng chứa hoạt chất, NLC còn hạn chế việc đẩy hoạt chất ra khỏi tiểu

phân trong quá trình bảo quản. Do pha dầu là hỗn hợp lipid rắn – lỏng nên sau khi

về nhiệt độ phòng, lõi của NLC vẫn có những “khoảng trống” nhờ lipid ở dạng vô

định hình, vì vậy, hoạt chất vẫn được bao trong lõi tiểu phân [113], [115].

1.3. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid

Thành phần lipid: Lipid có nguồn gốc từ tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, có

thể thoái biến sinh học [114], [161] gồm triglycerid, steroid, sáp và phospholipid

[46], [70]. Dựa vào sự tương tác với nước, có thể chia thành hai nhóm:

 Lipid lớp kép: Trong môi trường nước, các lipid tạo thành lớp lipid kép do sự

sắp xếp “đuôi nối đuôi” của các phân tử lipid lớp đơn, điển hình là

phospholipid. Phospholipid có nhóm chức (phosphatidylcholin) có thể thay

đổi tính chất của tiểu phân lipid như sự trương nở, liên kết và thoái hóa.

 Lipid không tạo lớp kép: Lipid trong vật thể sống chủ yếu là lipid lớp đơn.

Chúng được ứng dụng trong phân phối thuốc nhờ khả năng tạo thành mạng

matrix, gồm triglycerid và sáp. Chúng tác động đến tính chất của tiểu phân

nano do sự khác nhau về điểm chảy, tính chất kết tinh và dạng đa hình. Đặc

biệt, lipid còn làm tăng sự hấp thu các hoạt chất thân dầu [26], [90].

Acid béo dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid thường được chiết xuất từ một số

dầu lỏng dùng trong dược phẩm: Acid caprylic, acid capric, acid lauric, acid

palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic, acid behenic,…[46], [72]. Một số

lipid và dầu lỏng dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid được nêu ở Bảng 1.3.

Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn và dầu dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid

Lipid rắn Lipid rắn trong tự nhiên Hỗn hợp mono, di và triglycerid

Chất béo từ dê Dầu béo từ cacao Acid stearic Acid palmitic Acid behenic

Sáp

Sáp ong Cetyl palmitat Sáp carnauba Triglycerid Trimyristin Tripalmitin Tristearin Trilaurin Witepsol Glyceryl monostearat Glyceryl behenat Glyceryl palmitostearat Dầu lỏng Dầu dừa Dầu ô liu Dầu đậu nành Dầu lạc

"Nguồn: Katdare A, 2006" [72]

Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid: Phương pháp bào chế hệ tiểu phân

nano thường dựa vào hai nguyên lý cơ bản, đó là nguyên lý từ trên xuống (top

down) hoặc từ dưới lên (bottom up) [62], [135].

Nguyên lý “từ dưới lên”: Tiểu phân nano được tạo thành từ sự phát triển hoặc tự

sắp xếp của nguyên tử hoặc phân tử tạo thành khối do sự tương tác vật lý hoặc hóa

học trong điều kiện có hoặc không có sự hiện diện của chất mầm [26], [109].

Nguyên lý “từ trên xuống”: Nguyên liệu kích thước lớn được biến đổi thành kích

thước nhỏ bằng cách bẻ gãy hoặc cắt nhỏ nguyên liệu [26], [62].

Dựa vào hai nguyên lý này, có thể chia các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano

như trình bày trong Sơ đồ 1.1 [134], [147].

Bào chế hệ tiểu phân nano

Kỹ thuật kết tủa

Kỹ thuật cơ học

Kỹ thuật nhũ hóa

Nghiền

Pha loãng NT micro

Đồng nhất hóa

Kỹ thuật kháng DM

Kỹ thuật chất lỏng STH

HPH lạnh

HPH nóng

KT có kiểm soát

KT bay hơi trong nước

Nhũ hóa bay hơi DM

Kỹ thuật kháng DM STH

Khuếch trương nhanh từ dung dịch STH

Siêu âm

Thu hệ tiểu phân nano

Thu tiểu phân nano

Thu hệ tiểu phân nano

Để nguội (nhiệt độ phòng, ngăn mát tủ lạnh)

Sấy phun Đông khô Lọc

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano

1.3.1 Kỹ thuật cơ học

1.3.1.1 Đồng nhất hóa bằng áp suất cao hoặc siêu âm

Quy trình bào chế bằng phương pháp đồng nhất hóa thường gồm hai bước chính:

Bước 1. Tạo nhũ tương (D/N): Hòa tan hoạt chất vào pha dầu và phân tán hỗn hợp

này với pha nước chứa chất nhũ hóa. Khuấy tốc độ cao để tạo nhũ tương [31], [45].

Bước 2. Đồng nhất hóa kích thước giọt bằng siêu âm hoặc áp suất cao [27], [125].

 Kỹ thuật siêu âm

Áp lực từ những đợt sóng siêu âm tác động vào chất lỏng, kết hợp với điều kiện xác

định sẽ tạo bong bóng khí. Chúng lớn dần đến mức độ nhất định sẽ chuyển động dữ

dội và vỡ ra (hiện tượng sủi bong bóng, cavitation), tạo nên những đợt sóng có đủ

năng lượng bẻ gãy liên kết đồng hóa trị, làm giảm kích thước giọt lỏng [55], [137].

 Kỹ thuật đồng nhất hóa bằng áp suất cao

Hệ phân tán bị đẩy qua khe hẹp vào khe đồng nhất hóa có áp suất cao. Lực nén làm

dòng chất lỏng di chuyển dữ dội, áp suất động học tăng lên và được bù trừ bằng sự

giảm áp suất tĩnh xuống dưới áp suất hơi bão hòa của nước tạo thành bong bóng khí

(gas bubbles). Chúng vỡ ra đột ngột sau khi rời khỏi khe (hiện tượng sủi bong bóng,

cavitation) hình thành sóng có lực tác động rất mạnh. Năng lượng từ những đợt

sóng này, cộng với sự chuyễn động hỗn loạn của dòng chất lỏng và lực trượt làm

giọt lỏng bị chia nhỏ (Hình 1.3). Trong dòng chảy, giọt lỏng va chạm vào nhau và

có thể kết tụ lại nếu không được bao phủ bởi chất diện hoạt. Nếu tiến hành HPH

lạnh thì hiện tượng sủi bong bóng ít xảy ra [57], [89], [135].

Quá trình đồng nhất hóa có thể tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của

tá dược (HPH nóng), áp suất đồng nhất hóa thường từ 500 – 1.500 bar [75], [126]

hoặc dưới nhiệt độ phòng (HPH lạnh) [90]. So với HPH nóng, HPH lạnh có thể cho

kích thước tiểu phân lớn hơn nhưng phù hợp với hoạt chất nhạy cảm với nhiệt độ

[26], [158]. Quy trình bào chế ở nhiệt độ thấp thường qua các bước:

Phối hợp pha dầu ở nhiệt độ cao hơn điểm chảy của chất mang.

Làm rắn hỗn hợp bằng nước đá hoặc nitơ lỏng, nghiền mịn thành bột.

Phân tán bột vào pha nước có chứa chất diện hoạt.

Đồng nhất hóa ở nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng nhiệt độ phòng với HPH.

Thu hệ tiểu phân nano [90].

Máy HPH được thiết kế có một hoặc hai cấp đồng nhất hóa. Với cấu tạo một cấp

(Hình 1.3), sản phẩm đầu vào qua một buồng đồng nhất hóa và tiếp tục chu kỳ mới.

Ở máy hai cấp, sản phẩm được đồng nhất hóa ở buồng thứ nhất, sau đó, đến buồng

thứ hai (thường dùng áp suất bằng 1/10 áp suất của buồng thứ nhất). Tại đó các tiểu

phân gắn kết nhau sẽ được tách ra và phân tán riêng rẽ trở lại giúp kích thước của

tiểu phân đồng đều hơn. Trên thị trường, máy HPH dành cho nghiên cứu có dung

tích 40 ml, 500 ml và 2.000 ml. Máy có dung tích lớn hơn, có thể đồng nhất hóa 2

tấn sản phẩm trong một giờ, thường dùng cho quy mô công nghiệp [113], [123].

Hệ tiểu phân nano

Khe đồng nhất hóa

Hệ phân tán thô Piston

1. Vùng bong bóng vỡ 2. Vùng va chạm và sôi 3. Vùng lực trượt 4. Dòng chuyển động (b) (a) Hình 1.3 Hình minh họa cấu tạo (a) và cơ chế hoạt động (b) của máy HPH

"Nguồn: Thassu D, 2007" [135]

1.3.1.2 Kỹ thuật nghiền

Ứng dụng phương pháp nghiền khô cổ điển có thể thu được tiểu phân từ 1 – 10 µm

do nhiệt tạo thành trong quá trình nghiền và dạng bột khô thường có lực tĩnh điện

rất cao dễ gây kết tụ tiểu phân. Tuy nhiên, phương pháp nghiền ướt được cải tiến có

thể khắc phục nhược điểm này bằng cách nghiền tiểu phân (µm) đã được phân tán

trong nước có chất diện hoạt. Kết quả có thể thu tiểu phân dưới 200 nm [110], [147].

1.3.2 Kỹ thuật nhũ hóa

Kỹ thuật này được phát triển thành phương pháp pha loãng nhũ tương micro.

Phương pháp này gồm hai bước là bào chế nhũ tương D/N hoặc N/D từ acid béo có

oC) bằng cách khuấy để thu được tiểu phân nano. Tỉ lệ nhũ tương micro và nước

nhiệt độ nóng chảy thấp. Sau đó, phân tán dần nhũ tương nóng vào nước lạnh (2 – 3

thường khoảng 1 : 25 hoặc 1 : 50 [26], [90].

1.3.3 Kỹ thuật kết tủa

Kỹ thuật này cần có giai đoạn hòa tan hoạt chất vào dung môi, sau đó kết tủa lại

bằng một dung môi đối kháng (antisolvent) – hoạt chất kém tan trong dung môi này

– hoặc bay hơi dung môi. Chất diện hoạt hoặc chất ổn định cũng được dùng để ổn

định tiểu phân.

1.3.3.1 Kỹ thuật đối kháng dung môi

 Phương pháp kết tủa có kiểm soát

Hoạt chất và chất ổn định được hòa tan trong dung môi hỗn hòa nước (benzyl

alcohol, ethanol,...), sau đó phân tán hỗn hợp này vào pha nước. Quá trình khuếch

tán dung môi vào nước gây nên sự chuyển động giữa bề mặt hai pha, hạt mầm hình

thành và phát triển dần. Chất ổn định và chất ức chế có thể được phối hợp ở cả hai

pha để ức chế sự phát triển và thu được kích thước tiểu phân như mong muốn. Loại

dung môi hữu cơ bằng cách cô quay trong chân không [93], [134].

 Phương pháp bay hơi kết tủa trong dung dịch nước

Trong phương pháp này, hoạt chất kém tan bị kết tủa do sự bay hơi của dung môi

hữu cơ ở gần hoặc trên điểm sôi và tiếp xúc với môi trường nước. Trước hết, hoạt

chất được hòa tan trong dung môi hữu cơ. Hỗn hợp sau đó bị nén, đun nóng và phun

qua vòi bằng thép không gỉ để vào môi trường nước có chất ổn định đã được đun

nóng. Áp suất và sự đun nóng làm bay hơi dung môi hữu cơ và nhờ vậy, hạt mầm

tạo thành rồi kết tủa thành tiểu phân nano [147].

 Phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi

Hòa tan lipid và hoạt chất trong dung môi hữu cơ không hỗn hòa nước

(dicloromethan, ethyl acetat), phân tán hỗn hợp vào pha nước có chất diện hoạt. Bay

hơi dung môi dưới áp suất giảm, tiểu phân nano sẽ được tạo thành [71], [134].

1.3.3.2 Kỹ thuật chất lỏng siêu tới hạn

Chất lỏng siêu tới hạn thường dùng là CO2 với hai phương pháp cơ bản là kháng

dung môi siêu tới hạn (supercritical antisolvent, SAS) và khuếch trương nhanh từ

dung dịch siêu tới hạn (rapid expansion from supercritical solutions, RESS). SAS

dùng dung môi có thể hỗn hòa với CO2 tới hạn để hòa tan chất tan. Do không tan

trong CO2 tới hạn nên khi CO2 tới hạn ly trích (extract) vào dung môi, chất tan lập

tức kết tủa, hình thành tiểu phân. Trong RESS, hoạt chất được hòa tan vào CO2, sau

đó, hỗn hợp đi vào vùng có áp suất thấp hơn. Sự thay đổi áp suất đột ngột làm giảm

khả năng hòa tan của CO2 và lập tức chất tan bị kết tủa [93].

Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng (Bảng 1.4). Tuy nhiên, HPH được

dùng trong bào chế tiểu phân lipid phổ biến hơn cả, ngoài những ưu điểm đã tóm tắt

còn có một số ưu điểm nổi bật khác như:

Không dùng dung môi hữu cơ.

Có thể nâng cấp lên quy mô công nghiệp [123].

Có tính tiếp nối do quy trình đã được ứng dụng trong ngành công nghiệp sản

xuất thực phẩm và bơ sữa [124], [132].

Bảng 1.4 Ưu nhược điểm của các phương pháp bào chế tiểu phân nano

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Đồng nhất hóa bằng Phù hợp cho các loại hệ phân tán Nguy cơ nhiễm kim loại

siêu âm nano lipid Dãy phân bố kích cỡ rộng

Đồng nhất hóa bằng Kết quả có độ lặp lại cao, có thể Không phù hợp cho hoạt

HPH nhiệt độ cao nâng cấp quy mô công nghiệp chất nhạy cảm nhiệt độ

Đồng nhất hóa bằng Phù hợp cho hoạt chất nhạy cảm Nguy cơ phá hủy hoạt

HPH nhiệt độ thấp với nhiệt độ chất do áp suất

Kỹ thuật nghiền Phù hợp với hoạt chất kém tan cả Nhiễm tạp từ thiết bị

trong nước và dung môi hữu cơ nghiền

Nhũ hóa bay hơi Phù hợp cho hoạt chất thân dầu, Nguy cơ dung môi còn

dung môi nhạy cảm với nhiệt sót lại

Bay hơi kết tủa Phù hợp cho hoạt chất thân nước Dùng dung môi hữu cơ,

trong nước lẫn thân dầu, nhạy cảm với nhiệt nguy cơ dung môi sót lại

Kết tủa có kiểm soát Kích thước hạt nhỏ Lipid tan/DM phân cực

Không dùng dung môi hữu cơ Trang thiết bị đắt tiền CO2 siêu tới hạn

Pha loãng nhũ Phương pháp đơn giản Tỉ lệ lipid thấp

tương micro Tỉ lệ chất diện hoạt cao

1.4. Phương pháp phân tích tính chất của hệ tiểu phân nano lipid

1.4.1 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân

Các đặc điểm đánh giá là thể chất, màu sắc của hệ phân tán. Hệ phân tán nano lipid

có thể trong suốt, đục mờ hoặc đục như sữa tùy theo kích thước và nồng độ hạt

phân tán. Nếu nồng độ hạt cao thì hệ thường có màu đục như sữa nhưng mức độ

đục sẽ giảm dần khi pha loãng hệ tiểu phân.

Các hiện tượng cảm quan khác cần được đánh giá và theo dõi là sự kết bông, tạo

kem, tách pha... Hệ phân tán bền khi không có các hiện tượng này xảy ra.

1.4.2 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ tiểu phân

Kích thước là một trong những tính chất quan trọng của tiểu phân nano vì có ảnh

hưởng đến khả năng nang hóa, giải phóng hoạt chất và độ bền của hệ tiểu phân.

Ngoài ra, đó là tác nhân định vị tiểu phân trong tuần hoàn, quyết định sự phân bố in

vivo, độc tính và khả năng hướng mục tiêu của tiểu phân [80], [105].

Phân bố kích cỡ thể hiện độ đồng nhất về kích thước của tiểu phân. Dãy phân bố có

thể một hay nhiều đỉnh và được biễu diễn ở dạng đường cong phân bố tần số hay

đường cong phân bố tích lũy [30], [101]. Kích thước và dãy phân bố kích cỡ được

xác định bằng các kỹ thuật khác nhau (Sơ đồ 1.2) [103], [148].

Phương pháp xác định KTTP

Lọc Rây

Đo tốc độ lắng đọng Phân tích bằng PCS Phân tích bằng LD Quan sát với KHV điện tử

Quan sát với KHV quang học

Sơ đồ 1.2 Các phương pháp xác định kích thước tiểu phân

Mỗi phương pháp xác định kích thước hạt có ưu nhược điểm khác nhau, tuy nhiên,

thường dựa vào kích thước hạt của mẫu để chọn phương pháp phù hợp (Hình 1.4).

Trong các phương pháp đã nêu, phổ tương quan photon (photon correlation

spectroscopy, PCS) và nhiễu xạ laser (laser diffraction, LD) được dùng để phân tích

kích thước hạt nano nhiều nhất do khả năng phát hiện các hạt nhỏ, có thể là hạt vài

nm [90]. Các phương pháp còn lại mang tính chất kiểm tra và so sánh.

Rây

Quan sát với KHV QH

Đo tốc độ lắng

Quan sát với KHV điện tử

Khuếch tán ánh sáng

Nhiễu xạ laser

10 10 100 1 100 1000 1 0,1

nm µm

Hình 1.4 Các phương pháp đo kích thước và vùng kích thước phù hợp

1.4.2.1 Đánh giá phân bố cỡ tiểu phân dựa trên sự khuếch tán ánh sáng

PCS hay tán xạ ánh sáng (dynamic light scattering, DLS) là kỹ thuật đo kích thước

dựa vào sự khuếch tán ánh sáng của tiểu phân có kích thước dưới 6 µm [147] trong

hệ phân tán bằng nguồn sáng đơn sắc, ví dụ tia laser [67], [120]. PCS phân tích

cường độ dao động theo thời gian của tia sáng được tạo thành từ chuyển động

Brown của tiểu phân có kích thước nhỏ hơn bước sóng của tia tới ở góc tới xác

định. Cường độ khuếch tán phụ thuộc vào kích thước tiểu phân. Tiểu phân nhỏ di

chuyển nhanh do chúng có hệ số khuếch tán cao, trong khi tiểu phân lớn hơn di

chuyển chậm, cường độ dao động thấp hơn. Từ đường cong biểu diễn cường độ

khuếch tán theo thời gian sẽ cho các thông tin về kích thước và phân bố kích cỡ tiểu

phân, đại diện là hai thông số kích thước trung bình và hệ số phân tán PdI [104],

[137]. PCS dựa vào việc xác định hệ số khuếch tán của tiểu phân nên chỉ gián tiếp

xác định kích thước tiểu phân qua công thức Stokes – Einstein (1) [98], [101]:

D = kT/3d (1)

Trong đó:

D: Hệ số khuếch tán T: Nhiệt độ

d: Đường kính trung bình của tiểu phân k: Hằng số Boltzmann

: Độ nhớt môi trường phân tán

Dựa vào công thức, có thể thấy rằng nhiệt độ đo, độ nhớt của hệ phân tán ảnh

hưởng đến kết quả phân tích [101].

1.4.2.2 Đo kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser

Nhiễu xạ laser (laser diffraction, LD) là phương pháp thích hợp để xác định kích

thước tiểu phân từ 10 nm đến 1 mm và có dãy phân bố rộng [122], [147]. LD đo sự

phân bố kích thước tiểu phân bằng cách đo cường độ dao động của góc nhiễu xạ khi

tia laser đi qua hệ phân tán. Nếu kích thước tiểu phân lớn hơn độ dài sóng của chùm

tia sáng hoặc tỉ số chỉ số khúc xạ của pha phân tán và pha liên tục khác nhau thì LD

tuân theo nguyên tắc của nhiễu xạ Fraunhofer, ngược lại, sẽ tuân theo nguyên tắc

Lorenz – Mie [104], [137]. Phân tích sự phân bố cường độ góc nhiễu xạ sẽ thu được

thông tin về kích thước tiểu phân (trung bình, trung vị, mode, d10 hoặc d90) [67],

[134]. Mẫu được tuần hoàn qua tế bào đo nên kết quả có độ tin cậy cao [147].

1.4.3 Hình thể học của tiểu phân nano lipid

Tiểu phân là vật thể có cấu trúc ba chiều và có nhiều hình dạng khác nhau. Ngoài

kích thước, hình dạng cũng là tính chất quan trọng ảnh hưởng độ ổn định hóa lý, tỉ

lệ nang hóa, hiệu suất nang hóa của tiểu phân. Ngoài ra, khi vào cơ thể, hình dạng

của tiểu phân tác động không nhỏ đến khả năng hướng mục tiêu, phân phối hoạt

chất và sự thoái hóa [148]. Tuy nhiên, các phương pháp phân tích kích thước

thường không phản ánh chính xác hình dạng của chúng. Vì vậy, cần sử dụng các

phương pháp phân tích có thể quan sát trực tiếp hình dạng của tiểu phân.

Các phương pháp thường được dùng để khảo sát hình dạng của tiểu phân là kỹ thuật

quan sát hình ảnh với thiết bị là KHV như KHV quang học, TEM, SEM và AFM.

Chúng cung cấp thông tin về kích thước, cấu trúc bề mặt và sự kết tụ (nếu có) của

tiểu phân. KHV điện tử quan sát vật thể thông qua tia electron. Do có độ phóng đại

lớn và độ phân giải cao nên đây là thiết bị phù hợp để khảo sát cấu trúc và hình

dạng tiểu phân nano [30], [81].

1.4.3.1 Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học thường được dùng để khảo sát hình dạng các vật thể nhỏ.

Tuy nhiên, do sử dụng nguồn sáng khả kiến và thấu kính thủy tinh để phân tích mẫu

nên rất hạn chế khi phân tích tiểu phân có kích thước nano. Kính hiển vi quang học

chủ yếu được dùng để khảo sát sơ bộ kích thước hạt hoặc sự hiện diện của tinh thể

hoạt chất không nang hóa hoặc phát hiện các hạt to trong mẫu [101].

1.4.3.2 KHV điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, TEM)

TEM cung cấp thông tin về hình ảnh tiểu phân một cách trực tiếp với độ phân giải

tới mức độ kích thước phân tử (< 1 nm) [148]. TEM sử dụng chùm electron năng

lượng cao chiếu xuyên qua mẫu. Các thấu kính từ tạo ảnh với độ phóng đại cực lớn.

Độ phóng đại phụ thuộc vào tỉ lệ khoảng cách giữa mẫu và thấu kính mục tiêu cùng

với mặt phẳng ảnh. Đây là kỹ thuật thường dùng để kiểm tra kích thước và quan sát

cấu trúc tiểu phân [90], [161]. Có thể kết hợp với kỹ thuật cắt lớp (cryofracture)

trước khi quan sát cấu trúc bên trong tiểu phân. TEM có độ phân giải cao nhưng yêu

cầu mẫu khảo sát phải là một lớp thật mỏng để tia điện tử có thể chiếu xuyên qua,

có khi lớp mẫu này mỏng hơn 50 nm. Không giống như SEM, TEM quan sát hình

ảnh vật thể trong không gian hai chiều với độ phân giải cao hơn, độ phóng đại lớn

hơn và không cần bao phủ bề mặt mẫu bởi các kim loại dẫn điện [81], [82].

1.4.3.3 Kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopy, SEM)

SEM là loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao bằng cách sử

dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh được thực hiện

thông qua ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử

với bề mặt mẫu. Phương pháp này cho biết thông tin cơ bản về hình dạng và đặc

tính bề mặt tiểu phân. SEM thường dùng để phân tích hình thể học, kích thước, cấu

trúc bề mặt, sự phân tán và kết tụ của tiểu phân. Hình ảnh của mẫu khi khảo sát

bằng SEM sẽ được ghi nhận trong không gian ba chiều [75], [148]. Tương tự TEM,

SEM duy trì hoạt động trong chân không nên trước khi khảo sát, mẫu được làm khô

bằng cách loại bỏ toàn bộ nước, ngoài ra chúng còn được phủ bởi lớp kim loại có

thể dẫn điện, thường là vàng hoặc platin [95], [134].

1.4.3.4 Kính hiển vi lực nguyên tử (atomic force microscopy, AFM)

AFM quan sát cấu trúc vi mô bề mặt của vật rắn dựa trên nguyên tắc xác định lực

tương tác nguyên tử giữa một đầu mũi dò nhọn với bề mặt mẫu ở một khoảng cách

rất gần (0,2 – 10 nm) với độ phân giải khoảng 10 nm [90], [147].

Đầu dò nhọn, có dạng tháp cao vài µm và bán kính khoảng vài nm, thường được

làm bằng silicon, gồm hai phần: Đầu mũi dò và giá đỡ. Đầu dò quét trên bề mặt

mẫu tạo lực tương tác và thay đổi độ lệch của giá đỡ. Độ lệch này được xác định

bằng bộ phận phản chiếu laser ở trên đỉnh của giá đỡ và được chuyển thành các tín

hiệu hình ảnh. Đầu dò có thể quét và tạo ảnh với độ phân giải khoảng 0,5 nm. Kỹ

thuật này có thể xác định hình thể của tiểu phân trong không gian ba chiều [148].

Giống như TEM và SEM, AFM được dùng để khảo sát kích thước, hình dạng, cấu

trúc, sự phân tán và kết tụ của tiểu phân lipid. Điểm khác biệt giữa chúng chính là

AFM có thể hoạt động trong môi trường có không khí hoặc môi trường lỏng. Đây là

ưu điểm chỉ có ở AFM [63], [104].

1.4.4 Thế zêta của hệ tiểu phân nano lipid

Trong môi trường phân tán, bề mặt tiểu phân có thể tích điện tạo nên lực đẩy giữa

các tiểu phân và chống lại sự kết tụ, giúp chúng ổn định hơn. Lớp điện tích này hấp

dẫn các ion trái dấu tạo nên lớp Stern, là lớp khá dày bao bọc lấy tiểu phân. Lớp

ngoài cùng là lớp khuếch tán, gồm các ion tự do trong môi trường. Lực đẩy giữa các

tiểu phân thể hiện bởi thế năng zêta. Đây là thông số không phụ thuộc kích thước

mà phụ thuộc vào bề mặt tiểu phân, sự hiện diện của chất diện hoạt và ion trong môi

trường, có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH hoặc lực ion trong môi trường cũng

như hình thái bề mặt của tiểu phân [137], [154].

Để đo lường, hỗn dịch pha loãng của tiểu phân nano được cho vào một từ trường

yếu, sự chuyển động của tiểu phân được xác định bởi phép đo gió Doppler laser.

Kết quả thu được giá trị điện chuyển  (tốc độ tiểu phân / độ mạnh của điện trường)

và gián tiếp xác định thế zêta theo công thức Helmholtz- Smoluchowski (2) [101]:

(2) 𝜇 = 𝜀. /

Trong đó: : Điện chuyển

: Thế zêta

: Hằng số điện môi

: Độ nhớt của môi trường phân tán

Thế zêta giúp dự đoán độ ổn định vật lý của hệ tiểu phân nano lipid trong thời gian

bảo quản hoặc khi tương tác với dịch sinh lý. Tuy nhiên, việc đánh giá độ ổn định

của hệ tiểu phân không chỉ dựa vào thế zêta, nhất là khi có sự PEG hóa hoặc gắn kết

với các đại phân tử trên bề mặt tiểu phân, vì đây là một cơ chế khác tạo nên sự ổn

định cho tiểu phân: Hiệu ứng không gian [101].

1.4.5 Sự nang hóa hoạt chất của tiểu phân nano lipid

Nang hóa phản ánh khả năng hoạt chất bị bắt giữ hoặc hấp phụ trên bề mặt của tiểu

phân nano. Sự nang hóa hoạt chất liên quan trực tiếp đến độ bền của hoạt chất, độ

ổn định của hệ tiểu phân cũng như cơ chế và tốc độ giải phóng hoạt chất từ tiểu

phân. Vì vậy, đây là thông số rất quan trọng, phản ánh chất lượng của hệ tiểu phân

nano [134].

1.4.5.1 Sự định vị của hoạt chất đối với tiểu phân

Tùy theo bản chất của hoạt chất, khả năng chứa của lipid và phương pháp bào chế,

sự phân bố hoạt chất ở tiểu phân có thể xảy ra theo nhiều kiểu khác nhau (Hình 1.5).

Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và in vivo từ

tiểu phân nano [102], [155].

A: Hoạt chất hòa tan hoặc phân tán đồng nhất (cốt). B: Hoạt chất tập trung tại vỏ. C: Hoạt chất tập

trung tại lõi. D: Hoạt chất hấp phụ trên bề mặt. E: Khối kết tụ của hoạt chất

Hình 1.5 Vị trí định vị hoạt chất nang hóa ở tiểu phân

"Nguồn: Schäfer-Korting M, 2007" [122]

Kiểu phân tán đồng nhất với hoạt chất phân tán ở dạng vô định hình có thể thu được

khi bào chế bằng HPH nhiệt độ thấp hoặc phối hợp hoạt chất rất thân dầu vào lipid

bằng HPH nhiệt độ cao. Khi nguội dần, hoạt chất được phân tán trong lipid tạo nên

matrix đồng nhất giúp tiểu phân có thể giải phóng hoạt chất kéo dài [71], [99].

Kiểu tập trung tại vỏ tạo thành khi có hiện tượng tách pha trong quá trình nguội dần

từ giọt lipid trở thành tiểu phân lipid rắn. Lipid kết tủa trước nên lõi tiểu phân không

chứa hoạt chất. Song song đó, nồng độ hoạt chất trong lipid lỏng tăng dần, cuối

cùng chúng tập trung tại lớp vỏ của tiểu phân. Hoạt chất nang hóa tại vỏ được

phóng thích nhanh hơn khi tiếp xúc với môi trường [71], [99].

Ngược lại, kiểu định vị tại lõi hình thành khi hoạt chất kết tinh trước. Tỉ lệ hoạt chất

ở vỏ tiểu phân ít đi do rất nhiều hoạt chất tan tốt trong chất mang và được bắt giữa

trong lõi của chất mang. Khi đó, quá trình giải phóng hoạt chất sẽ được kiểm soát

tốt hơn và kéo dài hơn. Sự phóng thích hoạt chất phụ thuộc vào quá trình khuếch

tán hoạt chất từ lõi tiểu phân và tốc độ thoái biến của lipid [137], [155].

1.4.5.2 Các phương pháp tách hoạt chất không nang hóa trong tiểu phân

Kỹ thuật tách các hoạt chất tự do thường dựa vào kích thước tiểu phân, bao gồm:

 Thẩm tách (dialysis)

Thẩm tách là quá trình hoạt chất tự do khuếch tán qua màng có kích thước lỗ phù

hợp theo gradient nồng độ. Kích thước lỗ màng phải nhỏ hơn kích thước tiểu phân.

Hoạt chất có thể bị hấp phụ trên màng dẫn đến sai số [89], [147].

 Siêu ly tâm (ultracentrifugation)

Kỹ thuật này dùng lực ly tâm rất lớn (20.000 – 40.000 g) để tách hoạt chất tự do ra

khỏi hệ tiểu phân [61], [128]. Nếu tỉ trọng của tiểu phân nhỏ hơn môi trường, chúng

sẽ nổi trên bề mặt dịch lọc, hoạt chất tự do hòa tan trong môi trường hoặc lắng

xuống khi quá bão hòa. Ngược lại, nếu tỉ trọng cao hơn, tiểu phân sẽ sa lắng. Để

loại hết hoạt chất tự do, cần thực hiện lặp lại nhiều lần. Do lực ly tâm lớn nên có thể

tách được hoạt chất tự do và không cần pha loãng mẫu [22], [29].

 Siêu lọc (ultrafiltration)

Cho hệ tiểu phân nano đi qua màng lọc có kích thước lỗ lọc siêu nhỏ. Hoạt chất tự

do theo dịch lọc qua màng, tiểu phân bị giữ lại trên màng lọc. Phương pháp này

được áp dụng khi tỉ trọng của tiểu phân nhỏ hơn tỉ trọng môi trường phân tán [128].

1.4.6 Sự giải phóng hoạt chất

Quá trình giải phóng hoạt chất phụ thuộc vào độ tan và khả năng khuếch tán của

hoạt chất ra khỏi tiểu phân [54], [134]. Hiện tượng phóng thích ồ ạt xảy ra khi hệ có

tỉ lệ chất diện hoạt cao và bào chế ở nhiệt độ cao vì chúng làm tăng độ tan của hoạt

chất trong pha nước. Trong quá trình làm nguội, độ tan trong pha nước giảm dần,

hoạt chất có xu hướng tái phân bố vào pha dầu. Tuy nhiên, nếu lõi tiểu phân đã bão

hòa hoặc hóa rắn, hoạt chất sẽ kết tụ tại vỏ hoặc bề mặt tiểu phân [89], [97].

1.4.6.1 Phương pháp khuếch tán trực tiếp

Tiểu phân được đặt trực tiếp trong môi trường hòa tan, lấy mẫu phân tích trong

khoảng thời gian nhất định, ly tâm (hoặc lọc) và định lượng hoạt chất [63], [69].

1.4.6.2 Phương pháp khuếch tán qua màng

 Túi thẩm tách

Tiểu phân được phân tán trong môi trường hòa tan và cho vào túi thẩm tách. Kẹp

chặt miệng túi lại. Đặt túi vào môi trường hòa tan, sau đó lấy mẫu định lượng ở

từng thời điểm trong khoảng thời gian xác định (Hình 1.6) [30], [158].

Màng thẩm tích Dung môi Dung dịch nồng độ cao

Hình 1.6 Hình minh họa sự giải phóng hoạt chất qua túi thẩm tách

 Thẩm tách ngược

Trong kỹ thuật này, túi thẩm tách chứa khoảng 1 ml môi trường được đặt vào hệ

phân tán. Sau đó, hỗn hợp hệ phân tán này được cho vào môi trường hòa tan. Lấy

mẫu định lượng hoạt chất phóng thích theo thời gian [155].

 Tế bào Franz

Tế bào Franz gồm hai tế bào khuếch tán gắn kết với nhau và chia thành hai ngăn bởi

lớp màng mỏng. Ngăn cho chứa mẫu, ngăn nhận chứa đầy môi trường hòa tan

(Hình 1.7). Khuấy đều môi trường với tốc độ phù hợp, hoạt chất trong tiểu phân

được phóng thích và hòa tan vào môi trường ngăn nhận, lấy mẫu định lượng theo

từng thời điểm trong khoảng thời gian xác định [35], [103], [139].

Màng thường là cellulose acetat, cellulose nitrat, kích thước lỗ màng thường nhỏ

hơn kích thước tiểu phân, hoặc màng cấu tạo bằng mô người hay động vật [134].

Mẫu

Ngăn cho Chỗ tiếp xúc

Màng Nơi rút mẫu Sinh hàn

Ngăn nhận Vỏ chứa nước Cá từ

Hình 1.7 Hình minh họa tế bào Franz

1.5. Các tá dược dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano ART

1.5.1 Compritol® 888 ATO

Tên khoa học: Glycerol dibehenat (EP), tribehenin, glyceryl behenat (USP), là

diester của glycerin và acid behenic.

Tính chất: Bột mịn màu trắng, không mùi vị, trơ về hóa học, nóng chảy ở 69 – 74 oC.

Ứng dụng: Là một trong số ít tá dược lipid đa năng, Compritol® 888 ATO được

dùng làm tá dược tạo khung cho thuốc uống phóng thích kéo dài, làm tá dược trơn

cho viên nén, viên nang và tá dược dính trong dập thẳng. Ngoài ra, với 22 carbon

trong chuỗi acid béo, Compritol® 888 ATO được nghiên cứu với vai trò là chất tạo

khung mang hoạt chất trong SLN, NLC. Tá dược này còn giúp tiểu phân nano trở

về dạng rắn ở nhiệt độ cơ thể và kiểm soát tốc độ phóng thích hoạt chất [16], [52].

1.5.2 LabrafacTM PG

Tên khoa học: Propylen glycol dicaprylocaprat (EP).

Tính chất: Là dầu trung tính dạng lỏng, rất bền, trong suốt, không màu hoặc vàng

nhạt, không mùi vị.

Ứng dụng: Dùng làm pha dầu trong bào chế nhũ tương D/N hoặc N/D, làm dung

môi hòa tan cho các hoạt chất thân dầu hoặc là dầu lỏng trong bào chế tiểu phân

nano NLC. Phù hợp để đóng nang cứng hoặc mềm. Với số carbon trong chuỗi acid

béo từ 8 – 10 carbon, LabrafacTM PG có vai trò hòa tan và làm tăng độ tan của hoạt

chất trong Compritol® 888 ATO. Khi phối hợp với tỉ lệ nhất định, hỗn hợp lipid rắn

– lỏng có thể tạo tiểu phân dạng rắn ở nhiệt độ cơ thể. Ngoài ra, hỗn hợp lipid còn là

khung bảo vệ, giúp hoạt chất giảm thiểu sự tiếp xúc với môi trường bất lợi [72], [98].

1.5.3 Polysorbat 80

Tên khoa học: Polyoxyethylen 20 sorbitan monooleat, tween 80.

Tính chất: Là chất diện hoạt không ion hóa dạng lỏng, sánh, có màu vàng nhạt. Dễ

tan trong nước tạo dung dịch màu vàng.

Ứng dụng: Vì có tính an toàn cao nên polysorbat 80 được dùng ở tỉ lệ khá cao để

làm tác nhân trợ tan. Ngoài ra, polysorbat 80 còn là chất nhũ hóa tạo nhũ tương

D/N. Trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid, polysorbat 80 là chất diện hoạt giúp tạo

nhũ tương và ổn định hệ SLN, NLC trong thời gian bảo quản [29], [38], [42].

1.5.4 SimulsolTM 4000 P

Tên khoa học: Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil,

polyoxyethylenglyceroltrihydroxystearat, macrogol-glycerolhydroxystearat.

Tính chất: Là chất diện hoạt không ion hóa dạng lỏng, sánh, có màu trắng đến vàng

nhạt. Tan trong nước tạo dung dịch có mùi rất nhẹ và hầu như không vị.

Ứng dụng: Là chất đồng diện hoạt để bào chế nhũ tương D/N và là chất trợ tan cho

hoạt chất dùng cho đường uống và ngoài da. SimulsolTM 4000 P cũng là chất diện

hoạt để bào chế hệ SLN, NLC [38].

1.5.5 Gelucire® 50/13

Tên khoa học: Stearoyl macrogol-32 glycerid, steroyl polyoxylglycerid.

Tính chất: Là chất diện hoạt không ion hóa dạng hạt rắn như sáp, điểm chảy ở 50 oC.

Ứng dụng: Là tá dược làm tăng sinh khả dụng của những hoạt chất kém tan và là

chất nhũ hóa cho nhũ tương D/N. Dùng làm tá dược cho viên nén, viên nang, vi

nang với vai trò là chất trợ tan, tăng thấm cho hoạt chất. Gelucire® 50/13 được dùng

làm chất nhũ hóa trong bào chế hệ SLN, NLC [53].

1.5.6 Phosphatidylcholin

Tên khoa học: Phosphatidylcholin.

Tính chất: Phosphatidylcholin thuộc nhóm phospholipid, thành phần chính của

màng tế bào, có thể được chiết xuất từ lòng đỏ trứng hoặc màng tế bào, chứa 85%

acid stearic và 15% acid palmitic.

Ứng dụng: Là thành phần công thức của liposome và nhũ tương trong bào chế mỹ

phẩm và dược phẩm và là chất nhũ hóa cho nhũ tương D/N [17], [27], [128].

1.6. Artemisinin và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị sốt rét

1.6.1 Artemisinin (ART)

ART là một sesquiterpen lacton endoperoxid (Hình 1.8), hoạt chất chính của cây

Thanh hao. Thanh hao (còn gọi là Thanh cao hoa vàng) có tên khoa học là

Artemisia annua L., thuộc họ Cúc (Asteraceae). Quốc gia có nhiều Thanh hao mọc

hoang là Trung Quốc, Ấn Độ, Mông Cổ, Bắc Mỹ. Trung Quốc cũng là nơi gieo

trồng để chiết xuất ART cung cấp cho thị trường nhiều nhất hiện nay. Tại Việt

Nam, theo kết quả điều tra từ năm 1986 – 1990 (Viện Dược liệu), Thanh hao mọc tự

nhiên ở một số tỉnh phía Bắc. Ngoài ra, Thanh hao được trồng trọt thành công, sản

lượng không những đáp ứng nhu cầu ART trong nước mà còn có thể xuất khẩu [4], [6].

Bộ phận dùng là lá được thu hái ở cây sắp ra hoa, tốt nhất vào mùa hè, phơi nắng

nhẹ hoặc sấy 30 oC – 40 oC đến khô (độ ẩm không quá 13%). Hàm lượng ART thay

đổi tùy theo điều kiện thổ nhưỡng. Tính theo dược liệu khô, thanh hao Trung Quốc

có hàm lượng ART từ 0,01% – 0,5%, cây trồng tại Việt Nam có tỉ lệ ART từ 0,4% –

0,6% [4], [6].

ART được phân lập vào năm 1972, là hoạt chất có nhóm peroxid nội rất ít gặp trong

tự nhiên. Nguồn cung cấp ART hiện nay chủ yếu vẫn từ dược liệu. Phương pháp

tổng hợp, bán tổng hợp và sinh tổng hợp ART đã được nghiên cứu nhưng chưa

được ứng dụng vào sản xuất vì quy trình phức tạp và giá thành rất cao.

Hình 1.8 Công thức hóa học của artemisinin

Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-epoxy-

12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-on

Tên gọi khác: Artemisin; arteannuin; QHS; qinghaosu; thanh hao tố, quinghaosu

Công thức phân tử: C15H22O5, khối lượng phân tử: 282,3

Tính chất vật lý: ART có tinh thể hình kim không màu hoặc bột màu trắng óng ánh,

không mùi. Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol và ethanol, rất tan 20𝑜𝐶

trong dicloromethan, dễ tan trong aceton và ethylacetat. Năng suất quay cực [𝛼]𝐷 từ + 75o đến + 78o (dung dịch 1,0% trong ethanol). ART có nhiệt độ nóng chảy từ

151 oC – 154 oC, bền vững với nhiệt, không bị phân hủy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ

nóng chảy nên có thể tinh chế bằng phương pháp thăng hoa [4], [149].

Tính chất hóa học: ART là sesquiterpenlacton có nhóm peroxyd nội bị thủy phân

bởi acid hoặc kiềm mạnh làm mất hoạt tính kháng ký sinh trùng (KST) sốt rét.

Tác dụng dược lý: ART tác dụng trực tiếp lên KST sốt rét ở giai đoạn thể phân liệt

trong hồng cầu, có hiệu lực cao đối với P. falciparum kể cả chủng kháng cloroquin,

không bị đề kháng chéo với cloroquin [92], [108]. ART có thời gian sạch KST trong

máu nhanh, có thể loại trừ và cải thiện triệu chứng nhanh hơn cloroquin, kể cả với

chủng đã kháng cloroquin hoặc đa đề kháng. ART diệt giao bào P. falciparum, làm

ngăn chặn quá trình lây lan. Do không tác dụng đối với giai đoạn phát triển ở gan

của KST nên ART không được dùng dự phòng. Tỉ lệ tái phát trong vòng một tháng

khá cao do thời gian bán thải ngắn [2], [4], [6].

Cơ chế tác dụng: Cầu peroxyd nội trong cấu trúc của ART đóng vai trò quyết định

đối với tác dụng diệt KST sốt rét. Các nghiên cứu chứng minh rằng sự khử cầu

peroxyd xúc tác bởi hemin kích hoạt quá trình sản sinh gốc tự do từ cầu peroxyd.

Gốc tự do tạo thành phá hủy màng tế bào của KST thông qua quá trình akyl hóa.

Môi trường nội bào của KST trong hồng cầu vốn giàu hemin, do thu nhận được từ

sự phân giải protein của tế bào ký chủ. Điều này lý giải vì sao ART có tác dụng rất

chọn lọc trên KST [2], [92], [108].

Dược động học: ART hấp thu nhanh, nồng độ đỉnh trong huyết tương của đường

uống là 1 giờ, tiêm bắp là 2 giờ. ART được phân bố đều đến các cơ quan, vượt qua

hàng rào máu – não. ART liên kết mạnh với hồng cầu và protein huyết tương. Tỉ lệ

liên kết với protein huyết tương ở người là 64%. Gan là nơi chuyển hóa chính của

ART. Các chất chuyển hóa phân lập được trong nước tiểu là deoxyartemisinin,

deoxydihydroartemisinin, dihydrodeoxyartemisinin và crystal – 7. Chúng không

còn hoạt tính trên KST. ART thải trừ nhanh qua phân và một phần qua nước tiểu,

phần lớn ở dạng đã chuyển hóa. 80% liều dùng đường uống được thải qua phân và

nước tiểu trong 24 giờ. 68% liều tiêm tĩnh mạch được tìm thấy trong nước tiểu

trong 24 giờ đầu và 95% được tìm thấy trong 72 giờ. Thời gian bán thải của ART

rất ngắn, với đường uống là gần 4 giờ và tiêm bắp từ 3,85 – 5,38 giờ [2].

Chỉ định: ART được dùng trong điều trị sốt rét cấp tính, sốt rét không biến chứng

do P. falciparum, đặc biệt là sốt rét kháng cloroquin. Trước đây, ART có thể dùng

đơn độc hoặc phối hợp với một số thuốc điều trị sốt rét khác [4], [6]. Hiện nay,

WHO khuyến cáo dùng phối hợp với mefloquin, primaquin [152].

Độc tính: ART có độc tính cấp thấp. Trên chuột nhắt trắng, LD50 đường uống là 4,2

g/kg và tiêm bắp nhũ dịch dầu là 3,8 g/kg. Ở liều cao, thử nghiệm trên động vật,

ART và dẫn chất có độc tính trên thần kinh. Tuy nhiên, độc tính này hiếm khi xảy

ra trên người. Nghiên cứu chứng minh rằng ART an toàn và hiệu quả, tương đối an

toàn cho phụ nữ mang thai, trẻ em, người bệnh tim, gan, thận mãn tính [2], [92].

Tương tác thuốc: Phối hợp ART với mefloquin, tetracyclin, primaquin trên chủng

kháng thuốc sẽ có tác dụng cộng lực. Phối hợp với sulfamid, sulfon, các chất chống

oxi hóa sẽ làm giảm tác dụng của ART.

Bảo quản: Đựng trong lọ kín, để nơi mát, tránh ánh sáng.

Dạng bào chế: ART được bào chế dưới dạng viên nén (250 mg) và thuốc đạn (250

mg và 500 mg) [4].

1.6.2 Các nghiên cứu về bào chế và hiệu quả của ART trong điều trị sốt rét

Từ khi được chiết xuất và phân lập thành công vào những năm đầu của thập niên

70, các nghiên cứu về ART đã được cập nhật liên tục cho đến nay. Trên thế giới,

Chawira AN và cộng sự (1987) đánh giá hiệu quả của sự phối hợp ART trên chuột.

Kết quả cho thấy phối hợp ART và mefloquin, primaquin, tetracyclin hoặc

clindamycin đem lại hiệu quả điều trị cao hơn trên chủng đề kháng [36].

Titulaer HA và cộng sự (1990) đánh giá dược động học của ART trên người tình

nguyện. Kết quả sau khi uống, ART được hấp thu nhanh (45 phút) nhưng không

hoàn toàn (sinh khả dụng tương đối 32%). Thời gian thanh thải sau khi tiêm bắp

hỗn dịch dầu khoảng 10 giờ nhưng ở đường uống là 3 giờ [136].

Ashton M và cộng sự (1998) đánh giá dược động học của ART trên 8 người trưởng

thành khỏe mạnh (nam, người Việt Nam). Theo tác giả, có sự tương quan giữa nồng

độ ART trong huyết tương và diện tích dưới đường cong sau khi uống liều duy nhất

500 mg và 1000 mg. Thời gian bán thải của ART tăng theo liều [25].

De Donno A và cộng sự (2012) so sánh hoạt tính kháng KST in vitro của trà Thanh

hao và ART tinh khiết. Hàm lượng ART trong trà rất thấp so với hàm lượng có tác

dụng, chứng tỏ trong lá trà có những thành phần khác có tác dụng hiệp lực với ART [40].

Yu H và cộng sự (2012) điều chế ART nguyên liệu có kích thước khoảng 550 nm

bằng phương pháp khuếch trương nhanh dung dịch siêu tới hạn (RESS). Kết quả thu

được bột ART có điểm chảy thấp hơn. Tỉ trọng khối của bột cũng giảm, điều này có

thể làm tăng tính linh động của ART khi được phối hợp vào chế phẩm [157].

Moore KA và cộng sự (2016) nghiên cứu tính an toàn của ART trên phụ nữ mang

thai ở 3 tháng đầu thai kỳ. Kết quả cho thấy không có sự gia tăng nguy cơ sẩy thai ở

nhóm được điều trị bằng ART so với nhóm dùng quinin [96].

Bassi PU và cộng sự (2016) thực hiện nghiên cứu Cohort trên những bệnh nhân sốt

rét không biến chứng được điều trị bằng liệu pháp ACTs tại bệnh viện và cộng đồng

ở Nigeria. Báo cáo cho thấy liệu pháp ACTs an toàn và được dung nạp tốt [28].

Malwade C và cộng sự (2016) nghiên cứu vai trò của các tạp chất trong việc tinh

chế ART từ dịch chiết của Thanh cao hoa vàng [84].

Tại Việt Nam, Viện Dược liệu (1995) nghiên cứu nâng cao hiệu quả trồng cây

Thanh hao và công nghệ chiết xuất ART [15].

Nguyễn Duy Sỹ và cộng sự (1996) nghiên cứu dược động học của ART trên người

tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân bị sốt rét [11].

Ha Vinh và cộng sự (1997) đánh giá hiệu quả của ART (thuốc đạn), artemether (IM),

artesunat (IM và IV) trên người trưởng thành Việt Nam bị sốt rét nặng và biến chứng.

Kết quả cho thấy không có sự khác nhau về hiệu quả giữa 4 nhóm nghiên cứu [56].

Lê Minh Trí và cộng sự (2002) nghiên cứu sự tương quan giữa sinh khả dụng và tác

dụng diệt KST sốt rét của ART đường uống và qua da chuột nhắt trắng. Kết quả cho

thấy có sự khác nhau về tính chất dược động học giữa hai đường dùng thuốc [13].

Đỗ Hữu Nghị và cộng sự (2003) nghiên cứu chất xúc tác mới trong tổng hợp các

dẫn xuất fluoroalkylether của ART [9].

Triệu Nguyên Trung và cộng sự (2008) đánh giá hiệu quả của phác đồ ACTs đối

với sốt rét do P. falciparum chưa biến chứng tại vùng sốt rét lưu hành nặng, miền

Trung, Tây Nguyên. Kết quả cho thấy sự phối hợp này có hiệu quả cao [14].

Nguyễn Hải Nam và cộng sự (2008) tổng hợp và thử tác dụng của một số dẫn chất

ART có khả năng tác dụng kéo dài. Chất tổng hợp có hoạt tính kháng sốt rét in vitro

trên P. falciparum kháng cloroquin mạnh lên khi kéo dài thời gian nuôi cấy [8].

Trần Quang Bính (2011) đánh giá tình hình kháng ART và dẫn chất và giải pháp

phòng chống bệnh sốt rét [3]. Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2012) nuôi cấy rễ tơ

thanh hao thu nhận ART bằng công nghệ trong bioreactor [12].

Ngoài ra, còn có luận án "Nghiên cứu hệ phân tán rắn của artemisinin và ứng dụng

vào một số dạng thuốc" (Nguyễn Đăng Hòa, 2000), đề tài "Nghiên cứu so sánh một

số thông số dược động học và hiệu lực điều trị của artemisinin trên bệnh nhân sốt

rét P. falciparum chưa biến chứng người lớn và trẻ em" (Lê Đình Công, 2002),...

1.6.3 Tình hình đề kháng của ký sinh trùng sốt rét

ART và dẫn chất (ARTs) là thuốc cứu sống bệnh nhân sốt rét do P. falciparum đa

đề kháng. ARTs có hiệu lực vượt trội đối với P. falciparum, đặc biệt là thời gian

sạch KST trong máu nhanh và hiệu quả với cả chủng đa đề kháng. Cho đến nay,

chưa có hoạt chất mới nào có hiệu quả cao và an toàn như ARTs. Việc bảo tồn hiệu

lực của ARTs là trọng trách của ngành y tế bên cạnh nhiệm vụ đẩy lùi bệnh sốt rét

trên toàn cầu. Năm 2009, ngân sách dành cho sốt rét khoảng 3 tỉ USD, trong đó, 40

triệu USD dành cho quản lý, kiểm soát sự đề kháng ARTs [151].

Theo định nghĩa của WHO, đề kháng là “tình trạng KST có thể sống sót hoặc nhân

đôi dù đã có một lượng thuốc tương đương hoặc cao hơn liều thường dùng nhưng

trong giới hạn liều dùng được hấp thu” và thuốc cần phải “tiếp xúc với KST hoặc

đến được tế bào hồng cầu bị nhiễm trong khoảng thời gian cần thiết” [150].

Đề kháng ARTs là hiện tượng thời gian sạch KST trong máu chậm sau quá trình

điều trị với artesunat đơn trị hoặc phối hợp dựa vào ART và dẫn chất (ACTs). Điều

này có thể dẫn đến thất bại trong điều trị. Tại tiểu vùng sông Mê Kông, tỉ lệ thất bại

điều trị chỉ cao khi có sự đề kháng của KST đối với thuốc phối hợp với ARTs [152].

Báo cáo từ chương trình kiểm soát sốt rét của Campuchia và Thái Lan cho thấy có

sự tăng tỉ lệ bệnh nhân còn KST trong máu ở ngày điều trị thứ ba, chứng tỏ có thay

đổi độ nhạy cảm ARTs. Hiện tượng này cũng được ghi nhận tại biên giới Myanmar

– Thailand, Trung Quốc – Myanmar và tỉnh Bình Phước (Việt Nam) [150]. Dữ liệu

thống kê về hiệu quả của thuốc từ năm 2000 – 2010 của WHO cho thấy:

Artemether – lumefantrin vẫn có hiệu quả cao đối với KST, trừ Campuchia

đã ghi nhận một vài trường hợp đề kháng.

Đã có ít nhất một báo cáo cho thấy tỉ lệ thất bại điều trị cao (≥ 10%) với

artesunat – amodiaquin được ghi nhận từ 6 trong số 23 nước Châu Phi.

Khi mefloquin bị đề kháng thì hiệu quả của artesunat – mefloquin thấp (Mekong).

Một số nghiên cứu tiến hành ở Châu Phi và Mekong cho thấy sự phối hợp

dihydroartemisinin – piperaquin vẫn cho hiệu quả cao [150].

Báo cáo gần đây đề cập nguyên nhân tái phát ở bệnh nhân được điều trị bằng ARTs.

Câu hỏi đặt ra là hiện tượng này có phải do KST đề kháng với ARTs? Từ năm

2001, WHO đã khuyến cáo liệu pháp phối hợp dựa trên ARTs là lựa chọn hàng đầu

trong trường hợp sốt rét không biến chứng do P. falciparum [32]. Vì vậy, ACTs trở

thành phác đồ đầu tay trong chương trình kiểm soát và loại trừ sốt rét. Tuy nhiên,

qua dữ liệu thu thập được sau một thập kỷ sữ dụng, dù hiệu lực vượt trội của ARTs

trên P. falciparum vẫn đảm bảo nhưng tỉ lệ tái phát cao. Vì vậy, nghiên cứu tìm

nguyên nhân tái phát đã được tiến hành. Kết quả cho thấy KST phân lập từ những

trường hợp thất bại với ARTs đơn trị không kháng ARTs trên in vitro, khi tái điều

trị thì hiệu quả vẫn cao và giá trị IC50 in vitro không có nhiều thay đổi. Từ đó, giả

thuyết ART gây ra thể ngủ của KST được đặt ra. Năm 2011, giả thuyết được củng

cố khi kết quả in vitro tìm thấy thể ngủ của P. falciparum nhờ hình thái riêng biệt

của chúng và kết quả in vivo trên loài gặm nhấm cũng cho kết quả tương tự [77].

Theo báo cáo của WHO (2015), đã tìm được marker gây ra đề kháng ARTs. Đột

biến Kelch 13 propeller (K13) có liên quan đến việc thời gian sạch KST in vitro và

in vivo đến chậm hơn. Đây có thể là nguyên nhân gây kháng ARTs ở một số trường

hợp dọc biên giới Thái Lan – Campuchia và Thái Lan – Myanmar. Xác định kiểu

gen K13 kháng ARTs sẽ cung cấp thông tin rõ hơn về cơ chế của sự đề kháng và có

thể thiết lập chương trình ngăn chặn kháng ARTs ở vùng lãnh thổ này cũng như

ngăn chặn tình trạng đề kháng lan rộng sang các khu vực khác [152]. Dữ liệu gần

đây nhất (2015) của WHO cho thấy:

Artesunat – mefloquin là lựa chọn đầu tay tại Campuchia dù có tỉ lệ rất nhỏ

chủng falciparum có nhiều gen đa đề kháng Pfmdr1 (gây ra đề kháng

mefloquin) hiện diện tại khu vực này. DHA – piperaquin là lựa chọn đầu tay

khi điều trị sốt rét do P. falciparum tại Thái Lan.

Hiệu quả của sự phối hợp artemether – lumefantrin vẫn được đảm bảo tại Lào.

Hiệu lực của phác đồ ACTs vẫn rất cao tại Ấn Độ và Myanmar.

Tại Việt Nam, hiệu lực của thuốc phối hợp DHA – piperaquin vẫn trên 95%,

mặc dù có nơi tỉ lệ dương tính ở ngày thứ 3 là 36%.

Tại Châu Phi, hiệu quả của ACTs vẫn đang được theo dõi. Có một số trường

hợp chậm sạch KST trong máu nhưng chưa xác định được sự hiện diện của đột

biến K13 trong mẫu phân tích. Nhìn chung, ACTs vẫn là phác đồ hiệu quả cho

vùng lãnh thổ này [152].

Tóm lại, theo WHO (2015), mặc dù có hiện tượng chậm đáp ứng với ARTs ở một

số vùng Mêkông, ACTs vẫn là lựa chọn hiệu quả nhất cho sốt rét không biến chứng

do P. falciparum. Hầu hết bệnh nhân được điều trị khỏi khi thuốc phối hợp còn hiệu

quả. Do đó, tùy theo vùng địa lý, cần liên tục theo dõi để đảm bảo hiệu lực của

ACTs và có thể phát hiện sớm nhất khi có đề kháng xảy ra [152].

1.6.4 Ứng dụng công nghệ nano trong bào chế hệ tiểu phân nano ARTs

Đối với thuốc điều trị sốt rét, đích tác động là tế bào gan hoặc hồng cầu bị nhiễm.

Để cải thiện hiệu quả điều trị, trước hết, cần có đủ hàm lượng hoạt chất tại mục tiêu.

Tiểu phân nano lipid có thể tập trung hoạt chất tại đích một cách thụ động hay chủ

động nhờ cấu trúc bề mặt hoặc tăng sự hấp thu thuốc. Theo hướng thụ động, bề mặt

tiểu phân được gắn kết với PEG nhằm kéo dài thời gian lưu lại tuần hoàn hoặc gắn

ligand để nhận diện mô bệnh một cách đặc hiệu theo hướng chủ động [118], [151].

Trên thế giới, Joshi M và cs (2008) bào chế hệ tiểu phân NLC chứa artemether

(Nanoject) – hoạt chất kém tan trong nước – để tiêm IV. Kết quả thu được tiểu phân

có kích thước trung bình là 63 ± 28 nm, hiệu suất nang hóa 30 ± 2%. Nanoject có

hoạt tính kháng KST cao hơn (p < 0,005) và tỉ lệ chuột sống sót cao hơn (60%) sau

31 ngày so với chế phẩm thuốc tiêm đang lưu hành trên thị trường (0%) [68].

Santos-Magalhães NS và cs (2010) [118], Aditya NP và cộng sự (2013) [19] tập

hợp các nghiên cứu ứng dụng tiểu phân nano để bào chế thuốc điều trị sốt rét. Hầu

hết các hoạt chất điều trị sốt rét đều đã được nghiên cứu, từ quinin, cloroquin đến

primaquin, arteether,… Những năm 1980, liposome được dùng để bắt giữ

artemether và artesunat. Sau đó, nghiên cứu hướng đến bắt giữ hoạt chất trong nhũ

tương nano, SLN, NLC. Kết quả cho thấy có sự gia tăng tỉ lệ sống sót của chuột thử

nghiệm ở nhóm dùng tiểu phân nano so với nhóm dùng dạng bào chế cổ điển [118].

Anand R và cộng sự (2012) đánh giá sự gắn kết giữa các thành phần: doxorubicin,

ART và β – cyclodextrin với tiểu phân β – cyclodextrin. Kết quả cho thấy chúng có

sự gắn kết tạo nên sự thay đổi trong tính chất quang học của doxorubicin [23].

Memvanga PB và cs (2012) thành lập công thức và đánh giá hiệu lực diệt KST in

vivo của hệ tiểu phân lipid chứa β – arteether qua đường uống. Tiểu phân có kích

thước từ 80 – 250 nm và có hiệu lực diệt KST tương đương chế phẩm arteether

(dung dịch dầu, IM), cao hơn chế phẩm đường uống ở cùng liều lượng [91].

Yaméogo JB và cộng sự (2012) bào chế hệ phân phối thuốc nano tự nhũ hóa

(SNEDDS) cyclodextrins – ART. Tiểu phân thu được có kích thước khoảng 180 nm

và có tác dụng ức chế sự phát triển in vitro của P. falciparum nuôi cấy [156].

Isacchi B và cộng sự (2012) đánh giá hiệu lực của hệ phân tán liposome mang ART

và liposome mang hỗn hợp ART – curcumin trên chuột cái nhiễm P. berghei. Kết

quả có sự cải thiện rõ rệt về thời gian sạch KST trong máu của hệ phân tán liposome

mang ART và liposome mang hỗn hợp ART – curcumin so với ART đơn thuần [65].

Dwivedi P và cộng sự (2014) đã bào chế và đánh giá sinh khả dụng của hệ tiểu phân

SLN chứa arteether trên chuột. Kết quả % sinh khả dụng tương đối của hệ tiểu phân

so với hỗn dịch arteether và arteether trong dầu đậu phộng lần lượt là 169,99% và

7.461%, chứng tỏ hệ tiểu phân SLN cải thiện sinh khả dụng của arteether [42].

Nnamani PO và cộng sự (2014) bào chế hệ tiểu phân NLC chứa artemether dùng

ngoài da. Kết quả cho thấy artemether thấm qua da và phóng thích kéo dài [107].

Kumar GD và cộng sự (2014) bào chế hệ tiểu phân nano polyme chứa ART bằng

phương pháp bay hơi dung môi. Kết quả thu được tiểu phân polycaprolacton chứa

1% ART có kích thước khoảng 230 nm và hiệu suất nang hóa khoảng 99% [76].

Omwoyo WN và cộng sự (2016) bào chế và đánh giá hiệu quả của SLN chứa

dihydroartemisinin. Tiểu phân có kích thước khoảng 240,7 nm, phần trăm nang hóa

13,9% và hiệu suất nang hóa 62,3% [112].

Ngoài ra, Want MY và cộng sự (2014, 2015) bào chế và đánh giá hiệu quả của tiểu

phân polylactic co – glycolic chứa ART đối với bệnh Leishmania nội tạng. Tiểu

phân có kích thước khoảng 221 nm. Thế zêta, phần trăm và hiệu suất nang hóa lần

lượt là – 9,07 mV, 28,03%, 68,48%. Liều 10 và 20 mg/kg trọng lượng chuột cho

thấy tiểu phân có hiệu quả vượt trội so với ART đơn thuần [144], [145].

Wang D và cộng sự (2016) bào chế tiểu phân nano d-MOFs (T1-T2 dual-modal

magnetic resonance imaging (MRI) contrast and fluorescence optical imaging (FOI)

agent) chứa ART có thể phóng thích ART tại tế bào ung thư nhằm giảm tác dụng

không mong muốn trong quá trình điều trị [142].

Trong nước, nghiên cứu về ứng dụng công nghệ nano trong bào chế đối với nhóm

hoạt chất kháng sốt rét còn rất hạn chế. Tuy nhiên, nghiên cứu của nhóm hoạt chất

khác đã được công bố. Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự (2012) bào chế piroxicam

nano bằng phương pháp kết tinh. Tiểu phân thu được có kích thước 300 nm và thế

zêta là - 8,12 mV [1]. Trịnh Ngọc Dương và cộng sự (2015) tổng hợp tiểu phân

nano bạc clorid bằng phương pháp kết tủa, kích thước tiểu phân khoảng 80 nm [5].

Hồ Hoàng Nhân và cộng sự (2015) bào chế tiểu phân nano artesunat với chất mang

là PLGA và chitosan bằng phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi ứng dụng trong

điều trị ung thư. Tiểu phân thu được có kích thước 200 nm [10].

Lê Thị Hương Mai và cộng sự (2016) bào chế tiểu phân nano lipid rắn mafenid có

kích thước 200 nm và hiệu suất nang hóa khoảng 18% [7],...

Tóm lại, các nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano, đặc biệt là hệ tiểu phân nano

lipid cho thấy có sự cải thiện về sinh khả dụng, hiệu quả điều trị của thuốc. Tuy

nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu mang tính hệ thống được công bố. Ngoài ra, hầu

hết nghiên cứu được tiến hành với cỡ lô nhỏ, khoảng vài chục gam. Cho đến nay, cả

trên thế giới và trong nước, chưa có nghiên cứu về hệ tiểu phân nano SLN hay NLC

chứa ART được công bố. Vì vậy, đề tài được tiến hành nhằm góp phần xây dựng

phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa hoạt chất

điều trị sốt rét nói riêng và các hoạt chất khác nói chung.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nhà sản xuất Xuất xứ

Compritol® 888 ATO DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Gattefosse Pháp

LabrafacTM PG DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Gattefosse Pháp

Gelucire® 50/13 DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Gattefosse Pháp

Phosphatidylcholin DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Lipoid GmbH Đức

Polysorbat 80 DĐ Châu Âu 7.0 (2011) Seppic Pháp

SimulsolTM 4000 P DĐ Mỹ 34 (2011) Seppic Pháp

Artemisinin (Lô Sao Kim Việt DĐ Việt Nam IV (2010) 100309-1001IN) Pharma Nam

2.1.2 Hóa chất và dung môi nghiên cứu

Hóa chất và dung môi nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dược dụng và HPLC – đạt yêu cầu

phân tích được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Hóa chất và dung môi nghiên cứu

Hóa chất, dung môi Độ tinh khiết Nhà sản xuất Xuất xứ

Acetonitril HPLC Merck Đức

Methanol HPLC Merck Đức

Natri lauryl sulfat PA Guangdong Guanghua Trung Quốc

Sci–Tech Co., Ltd

2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

Trang thiết bị dùng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu

Tên thiết bị Nhà sản xuất Xuất xứ

Cân phân tích Libror AEL–40SM Shimadzu Nhật

Cân phân tích TE214S Sartorius Đức

VELP Scientifica Máy khuấy từ Ý

Bếp cách thủy Memmert WB14 Memmert Đức

China Shikang Medical Trung Máy ly tâm Centrifuge 80–1 Equipment Group Limited Quốc

Máy phân tích nhiệt vi sai Q200 TA Instruments Mỹ

Đức Máy khuấy IKA T25 digital Ultra–Turrax IKA Werke

Bể siêu âm RK 510 H Sonorex Đức

Máy đồng nhất hóa APV–2000 APV Đan Mạch

KHV quang học Nikon Nhật

KHV điện tử truyền qua JEM–1400 Jeol Nhật

Máy đo kích thước tiểu phân LA–920 Horiba Nhật

Máy đo thế zêta Zetasizer Nano ZS Malvern Anh

Máy ly tâm lạnh Z 36 HK Hermle Labortechnik Đức

Martin Christ

Máy đông khô Alpha 1-4 LD plus Gefriertrocknungsanlagen GmbH Đức

Shimadzu Máy HPLC LC–8A Nhật

Deawoo Tủ lạnh Hàn Quốc

2.1.4 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt trắng (đực và cái) chủng Swiss albino, được cung cấp bởi Viện Pasteur

TP. Hồ Chí Minh. Chuột được nuôi trong lồng 25 x 35 x 15 cm và được cung cấp

thức ăn và nước uống đầy đủ theo tiêu chuẩn trong suốt thời gian thử nghiệm.

2.1.5 Ký sinh trùng

Chủng Plasmodium berghei kháng cloroquin (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh) được

thuần chủng từ nguồn duy trì trong môi trường nitơ lỏng (Viện Sốt Rét – Ký Sinh

Trùng và Côn trùng TP. Hồ Chí Minh).

2.1.6 Nơi thực hiện đề tài

- Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Vi Ký Sinh, Ban NCKH – Thư Viện, Khoa

Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

- Bộ môn Hữu Cơ và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia – Vật liệu polyme

và Compozit, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh.

- Trung tâm kỹ thuật Chất dẻo và Cao su PRT, Sở Công Nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

- Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng và Côn Trùng TP. Hồ Chí Minh.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol 888 ATO –

LabrafacTM PG) và ART

2.2.1.1 Khảo sát thể chất và nhiệt độ tan chảy của hỗn hợp lipid

Khảo sát thể chất của hỗn hợp lipid với tỉ lệ khác nhau bằng cách quan sát hỗn hợp

trên cách thủy ở 37 oC bằng mắt thường, xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo

điểm chảy và DSC nhằm chọn tỉ lệ lipid có thể tạo hỗn hợp rắn ở nhiệt độ cơ thể.

Tiến hành: Cân hỗn hợp Compritol 888 ATO – LabrafacTM PG theo tỉ lệ từ (9 : 1)

đến (3 : 7). Làm nóng chảy hỗn hợp ở 80 oC trên cách thủy. Để nguội về 37 oC.

oC để khảo sát sự tương tác giữa các hỗn hợp bằng DSC.

Đánh giá thể chất của từng hỗn hợp. Lựa chọn hỗn hợp lipid có thể ở dạng rắn ở 37

2.2.1.2 Khảo sát sự tương tác của hỗn hợp lipid

Khảo sát sự tương tác giữa lipid rắn và lipid lỏng ở các tỉ lệ khác nhau nhằm chọn tỉ

lệ lipid phù hợp cho pha dầu bằng cách đánh giá sự thay đổi khoảng nóng chảy,

điểm chảy và enthalpy của hỗn hợp lipid khi phân tích DSC.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2 g lipid với các tỉ lệ khác nhau, đun cách thủy

hỗn hợp ở 80 oC, khuấy đều trong 10 phút. Để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chính

xác khoảng 5 mg mẫu vào đĩa nhôm và phân tích, khảo sát sự thay đổi trạng thái

của mẫu theo nhiệt độ từ -50 oC đến 250 oC với tốc độ gia nhiệt là 5 oC/phút [52].

2.2.1.3 Khảo sát sự tương tác giữa các hỗn hợp lipid và ART

Khảo sát sự tương tác giữa ART và hỗn hợp lipid ở các tỉ lệ khác nhau nhằm đánh

giá khả năng hòa tan của ART trong hỗn hợp lipid nóng chảy bằng cách đánh giá sự

thay đổi khoảng nóng chảy, điểm chảy và enthalpy của hỗn hợp khi phân tích DSC.

Các tỉ lệ khảo sát là hỗn hợp lipid có tỉ lệ phù hợp và lượng ART cố định.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng lượng ART xác định và từng loại lipid ứng với

các tỉ lệ khác nhau. Đun cách thủy Compritol 888 ATO ở 80 oC. Hòa tan hoàn toàn

ART vào LabrafacTM PG bằng cách khuấy đều trong 10 phút, cho hỗn hợp vào

Compritol 888 ATO nóng chảy và khuấy thêm 10 phút ở 80 oC để thu hỗn hợp

đồng nhất. Để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chính xác khoảng 5 mg mẫu vào đĩa

nhôm và cho vào máy phân tích, khảo sát sự thay đổi trạng thái của mẫu theo nhiệt

độ từ – 50 oC đến 250 oC với tốc độ gia nhiệt là 5 oC/phút [52], [58].

2.2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của lượng ART đến sự tương tác của hỗn hợp lipid

Thí nghiệm được tiến hành nhằm sơ bộ chọn lượng ART có thể phối hợp vào hỗn

hợp lipid bằng cách đánh giá sự thay đổi khoảng nóng chảy, điểm chảy và enthalpy

của hỗn hợp khi phân tích DSC. Tiến hành bằng cách khảo sát các thông số DSC

với mẫu có tỉ lệ lipid rắn – lỏng cố định và lượng ART tăng dần. Tỉ lệ lipid được

chọn dựa vào kết quả khảo sát sự tương tác giữa ART và tá dược.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng từng loại lipid với tỉ lệ Compritol 888 ATO –

LabrafacTM PG xác định và lượng ART khác nhau. Đun cách thủy Compritol 888

ATO ở 80 oC. Các bước còn lại tương tự quy trình khảo sát tương tác giữa ART và

tá dược.

2.2.2 Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

Quá trình thành lập công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART được

tiến hành qua các giai đoạn như sau:

Xây dựng công thức cơ bản (chưa nang hóa hoạt chất):

Dựa vào tài liệu tham khảo, chọn công thức cơ bản với thành phần pha dầu và tỉ lệ

chất diện hoạt phù hợp. Tiến hành điều chế theo công thức cơ bản với cỡ mẫu là

100 g, đồng thời đánh giá một số tính chất của sản phẩm.

Xây dựng kỹ thuật bào chế, thăm dò một số thông số của quy trình bào chế.

Thăm dò hàm lượng ART có thể phối hợp vào công thức bào chế.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân:

Mục đích của khảo sát là nhằm chọn thông số phù hợp cho quy trình bào chế. Tiến

hành xác định các biến (biến độc lập và phụ thuộc), đề nghị các mức của biến và

xây dựng mô hình thực nghiệm. Bào chế theo mô hình thực nghiệm và đánh giá

chất lượng sản phẩm nhằm chọn thông số phù hợp nhất cho quy trình bào chế.

Thực nghiệm kiểm chứng công thức tối ưu:

Tiến hành bào chế lặp lại ít nhất 2 lô và đánh giá giá trị của biến phụ thuộc. Giá trị

này và giá trị xác định được trong công thức tối ưu phải khác nhau không đạt ý

nghĩa thống kê nhằm xác định tính lặp lại của quy trình bào chế.

Nâng cỡ mẫu bào chế lên 1.000 g:

Tiến hành nâng cỡ mẫu bào chế (3 lô) nhằm đánh giá tính ổn định và lặp lại của

công thức và quy trình, tạo cơ sở cho việc nâng cấp lên quy mô lớn hơn.

Theo dõi độ ổn định của sản phẩm:

Theo dõi độ ổn định của 3 lô nâng cấp nhằm đánh giá độ ổn định dài hạn của sản

phẩm. Điều kiện bảo quản là ở 6 ± 2 oC (trong tủ lạnh) và 30 ± 2 oC, RH 75 ± 5%

(phòng đạt quy định vùng khí hậu IVb).

Các công thức đều được bào chế trên 3 lô và lấy giá trị trung bình.

2.2.2.1 Xây dựng công thức cơ bản của hệ tiểu phân nano ART

Pha dầu của công thức bào chế tiểu phân nano lipid thường gồm có hỗn hợp lipid,

có thể là hỗn hợp rắn – rắn hoặc hỗn hợp rắn – lỏng ở các tỉ lệ khác nhau. Ngoài ra,

còn có chất diện hoạt để ổn định nhũ tương và kích thước của tiểu phân [58], [104].

Đề tài tiến hành khảo sát hỗn hợp lipid rắn – lỏng với tỉ lệ cụ thể như Bảng 2.4.

Bảng 2.4 Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano ART

Thành phần Tỉ lệ (kl/kl)

a% Compritol 888 ATO

LabrafacTM PG b%

Chất diện hoạt c%

ART d%

Nước cất vừa đủ 100 g

 Khảo sát tỉ lệ lipid của công thức cơ bản

Khảo sát tỉ lệ lipid nhằm chọn tỉ lệ phù hợp nhất có thể chứa lượng lớn hoạt chất và

tạo được nhũ tương ổn định, thể chất lỏng phù hợp cho quá trình đồng nhất hóa.

Theo các thông tin thu thập, tỉ lệ lipid của công thức bào chế hệ tiểu phân nano

ART được lựa chọn khảo sát từ 5% – 30% [58].

Tiến hành bằng cách bào chế các nhũ tương có tỉ lệ lipid khác nhau, đánh giá thể

chất và khả năng ổn định của nhũ tương thu được thông qua việc theo dõi sự tách

lớp khi về nhiệt độ phòng.

Tỉ lệ lipid được chọn là tỉ lệ lipid cao nhất trong số các mẫu khảo sát, sau quá trình

bào chế thu được nhũ tương ở thể lỏng và không tách lớp khi về nhiệt độ phòng.

 Khảo sát chất diện hoạt của công thức cơ bản

Khảo sát nhằm chọn chất diện hoạt (hoặc hỗn hợp chất diện hoạt) có thể tạo nhũ

tương ổn định và thu được tiểu phân có kích thước nhỏ nhất phù hợp cho quá trình

đồng nhất hóa bằng áp suất cao.

Tiến hành bào chế các nhũ tương với các chất diện hoạt khác nhau và tỉ lệ khác

nhau. Chọn công thức bào chế có thể thu được nhũ tương ổn định và đánh giá kích

thước tiểu phân bằng cách quan sát với kính hiển vi quang học hoặc phân tích bằng

nhiễu xạ laser.

Loại và tỉ lệ chất diện hoạt (hoặc hỗn hợp chất diện hoạt) được chọn khi nhũ tương

tạo thành không tách lớp khi về nhiệt độ phòng và chứa các tiểu phân có kích thước

nhỏ nhất trong số các mẫu khảo sát với kích thước trung bình ≤ 500 nm, không có

tiểu phân > 2,5 µm.

2.2.2.2 Xây dựng kỹ thuật bào chế hệ tiểu phân nano ART

Ứng dụng kỹ thuật đồng nhất hóa để bào chế hệ tiểu phân nano ART. Kỹ thuật bào

chế gồm 3 bước chính:

Bước 1. Bào chế nhũ tương D/N

 Hòa tan lần lượt các chất diện hoạt thân nước (SimulsolTM 4000 P,

polysorbat 80 hoặc Gelucire® 50/13) vào nước bằng máy khuấy Ultra-

Turrax®, thu được pha nước chứa chất diện hoạt (hỗn hợp 1), nâng nhiệt độ

pha nước lên 80 oC trước khi phối hợp với pha dầu.

(Với Gelucire® 50/13, tiến hành đun cách thủy chất diện hoạt này ở 55 oC

cho nóng chảy hoàn toàn, tiếp tục cho nước nóng vào và khuấy đến khi

Gelucire® 50/13 tan hoàn toàn trong nước, nâng nhiệt độ pha nước lên 80 oC).

 Đun cách thủy Compritol® 888 ATO ở 80 oC, hòa tan LabrafacTM PG vào

Compritol® 888 ATO nóng chảy, tiếp tục hòa tan ART vào hỗn hợp, thu

được pha dầu đồng nhất (hỗn hợp 2).

(Với công thức có phosphatidylcholin, hòa tan phosphatidylcholin vào hỗn

hợp 2 để thu được pha dầu đồng nhất).

 Cho từ từ hỗn hợp (2) vào hỗn hợp (1) và khuấy bằng máy khuấy tốc độ cao

Ultra–Turrax®, tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 – 10 phút, giữ nhiệt độ ở 80

± 1,0 oC, thu được nhũ tương D/N.

 Tăng tốc độ khuấy lên 15.000 – 20.000 vòng/phút trong 5 phút, thu được nhũ

tương ART, giữ nhiệt độ ở 80 ± 1,0 oC.

Bước 2. Đồng nhất hóa kích thước tiểu phân nano ART

Rót nhũ tương thu được ở bước 1 vào phễu chứa của máy HPH. Tiến hành đồng

nhất hóa ở các mức áp suất và số chu kỳ khác nhau, từ 500 – 1.200 bar và 2 – 15

chu kỳ, chọn áp suất và số chu kỳ đồng nhất hóa có thể bào chế được hệ tiểu phân

có kích thước nm.

Các hệ tiểu phân được bào chế trong giai đoạn xây dựng công thức cơ bản (gồm

quá trình khảo sát tỉ lệ lipid và chất diện hoạt) không tiến hành bước 2 mà chỉ tiến

hành bước 1 và 3.

Bước 3. Thu hệ tiểu phân nano ART

Để nguội nhũ tương nano thu được ở bước 2 về nhiệt độ phòng, các giọt nano lipid

ở dạng lỏng hóa rắn và hình thành tiểu phân nano lipid, kết quả thu được tiểu phân

nano ART phân tán trong môi trường nước.

Hệ tiểu phân nano lipid không chứa ART được bào chế theo quy trình gồm 3 bước

như trên nhưng không phối hợp ART vào công thức bào chế và được bào chế với cỡ

mẫu 100 g hoặc 1.000 g tương tứng với hệ tiểu phân nano ART.

Thông số của các thiết bị bào chế

Hai thiết bị chính dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano là máy khuấy tốc độ cao

Ultra–Turrax® và máy đồng nhất hóa áp suất cao APV 2000. Máy Ultra–Turrax® có

tốc độ khuấy tối thiểu – tối đa lần lượt là 3.000 – 25.000 vòng/phút và thể tích tối

thiểu – tối đa lần lượt là 0,001 – 2 lít.

Máy APV 2000 có dung tích tối thiểu là 100 ml, áp suất tối đa là 2.000 bar, công

suất 11 lít/giờ và nhiệt độ làm việc tối đa là 100 oC.

Các bước bào chế hệ tiểu phân nano ART được trình bày theo Sơ đồ 2.1.

SimulsolTM 4000 P Compritol® 888 ATO

Polysorbat 80 hoặc LabrafacTM PG

Gelucire® 50/13 ART

- Đun cách thủy (80 oC)

- Hòa tan

phosphatidylcholin (nếu có)

Hòa tan vào nước (Gelucire® 50/13, 55 oC) Ultra-Turrax®

Pha nước Pha dầu

Khuấy tốc độ cao

Đun nóng (80 oC) Duy trì nhiệt độ (80 oC)

(15.000 – 20.000 v/p, 7 – 10 phút)

(80 oC)

Nhũ tương D/N (nóng)

HPH

(500 – 1.200 bar

2 – 15 chu kỳ)

Nhũ tương nano

Để nguội (nhiệt độ phòng)

Hệ tiểu phân nano ART

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước bào chế hệ tiểu phân nano ART

2.2.2.3 Khảo sát hàm lượng ART phối hợp vào công thức bào chế hệ tiểu phân

nano ART

Mục đích của việc khảo sát hàm lượng ART nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của tỉ lệ

hoạt chất đến kích thước và hiệu suất nang hóa của tiểu phân nano. Tiến hành bào

chế các hệ tiểu phân với hàm lượng ART khác nhau theo các bước như mục 2.2.2.2.

Chỉ tiêu đánh giá là kích thước tiểu phân trung bình, d10, d90 và hiệu suất nang hóa.

Hàm lượng ART ứng với mẫu bào chế có kích thước tiểu phân nhỏ nhất và hiệu

suất nang hóa cao nhất sẽ được chọn để phối hợp vào công thức bào chế.

2.2.2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân nano ART

Yếu tố khảo sát

Khảo sát các thông số của quá trình đồng nhất hóa bằng HPH nhằm chọn giá trị áp

suất và số chu kỳ thấp nhất nhưng vẫn phải đảm bảo kích thước tiểu phân thu được

là nhỏ nhất [140]. Các yếu tố được khảo sát:

Biến độc lập X1: Áp suất, đơn vị là bar.

Biến độc lập X2: Số chu kỳ đồng nhất hóa.

Biến phụ thuộc Ya: Kích thước trung bình của tiểu phân (đơn vị tính là nm).

Mỗi yếu tố có hai mức, mức tối đa (XiM) và tối thiểu (Xim), còn Xoi là mức cơ bản.

Các mức của yếu tố khảo sát được trình bày trong Bảng 2.5.

Bảng 2.5 Các mức của yếu tố khảo sát

N Yếu tố khảo sát Ký hiệu Xoi XiM Xim ∆𝑿𝒊

1 Áp suất X1 (bar) X1 Xoi1 XiM1 Xim1 ∆𝑋1

2 Số chu kỳ X2 X2 Xoi2 XiM2 Xim2 ∆𝑋2

Giá trị Xoi được tính theo công thức (3) và ∆Xi được tính theo công thức (4):

(3) (4) 𝑋o𝑖 = ∆𝑋𝑖 = 𝑋𝑖𝑀 + 𝑋𝑖𝑚 2 𝑋𝑖𝑀 − 𝑋𝑖𝑚 2

Mã hóa biến X1, X2 thành x1, x2.

Biến mã hóa có hai mức xiM= +1, xim= -1 và mức cơ bản xoi.

Biến thật Xi sẽ bằng (5):

𝑋𝑖 = 𝑋𝑜𝑖 + 𝑥𝑖∆𝑋𝑖 (5)

Ma trận bố trí thí nghiệm

Với cách bố trí thí nghiệm kiểu yếu tố đầy đủ thì số thí nghiệm bằng 22. Ma trận bố

trí thí nghiệm như Bảng 2.6.

Bảng 2.6 Ma trận bố trí thí nghiệm kiểu yếu tố đầy đủ

N x1 xo x2 ya

+ + + y1 1

– + + y2 2

+ + – y3 3

– + – y4 4

Thực nghiệm xác định phương trình hồi quy

Xác định các hệ số bi

Tiến hành bào chế mẫu với các mức của biến theo mô hình trên, xác định các giá trị

ya và tính toán giá trị của các hệ số bi theo công thức (6):

𝑁 ∑ 𝑥𝑖𝑢. 𝑦𝑖𝑢 𝑛=1

(6) 𝑏𝑖 = 1 𝑁

Trong đó, N là số thí nghiệm

Xác định phương trình hồi quy

Phương trình hồi quy bậc nhất biểu thị mối liên quan giữa các biến khảo sát và biến

phụ thuộc có dạng:

y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 +....+ bkxk

Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số hồi quy bi

Tiến hành bào chế 6 mẫu với các mức của biến độc lập ở điều kiện cơ bản. Xác định

các giá trị ya. Từ đó, tính toán và kiểm tra ý nghĩa của hệ số hồi quy bi bằng test

Student.

Tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box-Willson

Sau khi đánh giá ý nghĩa của các hệ số bi, tiến hành xác định bước nhảy của biến

trong các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với bước nhảy si (7):

(7) ±𝑠𝑖 = 𝐶. bi. ∆Xi

(8) 𝑋𝑖𝑚ớ𝑖 = 𝑋𝑜𝑖 ± 𝐶. 𝑏𝑖. ∆𝑋𝑖

Trong đó, C là hằng số thực nghiệm được chọn theo kinh nghiệm để mỗi bước nhảy

có ý nghĩa.

Tiến hành thí nghiệm đến khi ya xấu đi thì dừng và chọn mức của biến mà ở đó ya

thu được là tốt nhất.

2.2.2.5 Thực nghiệm kiểm chứng công thức tối ưu

Sau khi chọn được điều kiện tối ưu, lặp lại công thức và quy trình bào chế ở 2 mẫu

khác nhau nhằm kiểm chứng kết quả thu được từ mẫu tối ưu, làm nền tảng cho việc

nâng cấp cỡ mẫu bào chế.

Phân tích kích thước tiểu phân trung bình và dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân của

mẫu kiểm chứng (phương pháp tương tự mục 2.2.3.2) và so sánh với kết quả phân

tích của mẫu tối ưu. Yêu cầu của thí nghiệm này là tính chất của các hệ tiểu phân

thu được phải không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) so với tính chất của

mẫu tối ưu.

Từ đó, ứng dụng điều kiện tối ưu vào quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART và

hệ tiểu phân nano không chứa ART với cỡ lô 100 g và 1.000 g.

2.2.3 Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART

Đánh giá tính chất của các hệ tiểu phân nano ART được bào chế theo điều kiện tối

ưu, từ đó, tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm nghiên cứu.

2.2.3.1 Đánh giá cảm quan của hệ tiểu phân nano ART

Quan sát bằng mắt thường, hệ tiểu phân phân tán đồng nhất, không xuất hiện sự

chuyển đổi màu sắc, không kết bông hay nổi kem,…

2.2.3.2 Kích thước và phân bố kích cỡ tiểu phân của hệ tiểu phân nano ART

Xác định dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân bằng phương pháp nhiễu xạ laser [75].

Tiến hành phân tích ở nhiệt độ phòng, bao gồm các bước:

 Tráng tế bào đo bằng nước cất, dùng nước cất làm môi trường phân tán, khử

khí và đo đường nền.

 Tráng tế bào đo bằng mẫu phân tích, cho mẫu vào tế bào đo và khử khí.

 Đo mẫu, máy tự động tính kết quả theo phần mềm.

 Dựa vào kết quả, đánh giá dãy phân bố kích cỡ và các giá trị d10, d90 (là các

giá trị kích thước có đơn vị nm).

d10, d90 cho biết có 10%, 90% tiểu phân trong mẫu khảo sát có kích thước

nhỏ hơn kích thước này.

 Kích thước tiểu phân được trình bày dưới dạng kích thước trung bình ± SD.

2.2.3.3 Khảo sát hình thể học của tiểu phân nano ART

Khảo sát hình thể học của tiểu phân bằng TEM để đánh giá tính chất bề mặt và hình

dạng của tiểu phân [27]. Do TEM hoạt động trong môi trường chân không nên tất

cả mẫu khảo sát đều phải được làm khô trước khi cho vào máy phân tích. Bên trong

thiết bị có bộ phận kết nối với máy hút chân không để đảm bảo mẫu không hút ẩm

trong quá trình phân tích ở nhiệt độ 20 oC. Các bước tiến hành:

 Pha loãng mẫu bằng nước với tỉ lệ phù hợp (thường là 1 : 9).

 Phủ lưới đồng bằng màng carbon theo phương pháp bốc bay chân không.

 Trải mẫu đã pha loãng lên lưới đồng.

 Đặt lưới đồng chứa mẫu vào đĩa petri, hút ẩm trong 24 giờ để làm khô mẫu.

 Khảo sát mẫu với nguồn electron được tạo ra bởi súng phát điện tử làm bằng

tungsten có điện thế gia tốc electron là 100 kV. Hình ảnh tiểu phân được

phóng đại nhờ các thấu kính từ và được ghi nhận trên màng huỳnh quang,

hình ảnh được camera chuyển về máy tính.

2.2.3.4 Phân tích thế zêta của hệ tiểu phân nano ART

Đo thế zêta là một trong những phương pháp dự đoán độ ổn định của hệ tiểu phân

trong thời gian bảo quản. Pha loãng mẫu với tỉ lệ phù hợp, cho vào cốc đo, khử khí

và đo mẫu. Phần mềm điều khiển máy sẽ phân tích và ghi nhận kết quả [27], [75].

2.2.3.5 Định lượng ART bằng HPLC

Điều kiện định lượng ART bằng HPLC [149]

Cột thép không gỉ (250 mm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm) (Luna®,

Phenomenex). Nhiệt độ phân tích được duy trì ở nhiệt độ phòng.

Pha động: CH3CN – H2O (68 : 32).

Detector: UV–Vis, bước sóng phát hiện: 216 nm.

Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 2 mg ART chuẩn vào bình định mức 2 ml,

hòa tan bằng pha động, siêu âm và bổ sung pha động vừa đủ thể tích. Lấy 100 l

dung dịch, cho vào bình định mức 2 ml, bổ sung pha động vừa đủ thể tích. Lắc đều

và lọc qua giấy lọc 0,2 m, bỏ vài giọt đầu. Dung dịch chuẩn có nồng độ 50 g/ml.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 50 mg mẫu đông khô (phụ lục 3.22), đun

cách thủy 80 oC, hòa tan trong 6 ml methanol. Siêu âm 5 phút, ly tâm 3.500

vòng/phút (10 phút). Lọc, rửa tủa bằng 2 ml methanol (2 lần), thu dịch lọc vào bình

định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa đủ thể tích. Pha loãng 5 lần bằng pha động,

lắc đều, lọc qua giấy lọc 0,2 m, bỏ vài giọt đầu. Định lượng ART bằng HPLC [140].

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng ART bằng HPLC

Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng ART bằng HPLC với các chỉ tiêu [64]:

 Tính đặc hiệu

Đánh giá tính đặc hiệu bằng cách so sánh sắc ký đồ của các mẫu: Mẫu pha động

(mẫu trắng), mẫu của hệ tiểu phân nano không chứa ART, mẫu của hệ tiểu phân

nano chứa ART, mẫu của hệ tiểu phân nano không chứa ART thêm chuẩn. Mẫu

chứa ART và mẫu thêm chuẩn phải có đỉnh hấp thu có thời gian lưu tương đương

mẫu ART chuẩn ở bước sóng khảo sát. Mẫu pha động và mẫu không chứa ART

không có đỉnh hấp thu của ART ở bước sóng khảo sát.

 Tính tuyến tính

Tiến hành bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn bằng pha động để tạo thành các

dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau. Thiết lập phương trình hồi quy ŷ = Ax

+ B. Tính tương thích của phương trình hồi quy được đánh giá bằng trắc nghiệm F.

Ý nghĩa của các hệ số A và B được đánh giá bằng trắc nghiệm t.

 Độ lặp lại

Đánh giá độ lặp lại bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử của hệ tiểu phân nano ART. Mỗi

mẫu thử tiến hành sắc ký 1 lần. Xử lý thống kê và xác định độ lệch chuẩn tương đối.

Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại khi RSD ≤ 2%.

 Độ chính xác trung gian (liên ngày)

Đánh giá độ chính xác trung gian bằng cách chuẩn bị 6 mẫu thử của hệ tiểu phân

nano ART. Mỗi mẫu thử tiến hành sắc ký 1 lần và được thực hiện trong 3 ngày khác

nhau. Xử lý thống kê và xác định độ lệch chuẩn tương đối. Phương pháp đạt yêu

cầu về độ chính xác trung gian khi RSD ≤ 2%.

Phương pháp đạt độ chính xác khi phương sai hai nhóm ứng với độ lặp lại và độ

chính xác trung gian không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

 Độ đúng

Thêm lượng chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% hàm lượng ART có trong

mẫu thử. Xác định tỷ lệ phục hồi trung bình Y bằng công thức (9):

𝑋𝑟 𝑋𝑎

𝑌 = 𝑥 100 (9)

Trong đó:

Lượng chuẩn tìm thấy Xr

Lượng chuẩn thêm vào mẫu thử Xa

Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng khi giá trị phục hồi thực nghiệm nằm trong

giới hạn cho phép của tỉ lệ phục hồi lý thuyết (98% – 102%).

Công thức tính hàm lượng % (kl/kl) của ART (10):

(10) 𝑋 (%) = . 100 𝑆𝑡. 𝐶𝑐. 𝐻𝐿𝐶. 𝐹. 100 𝑆𝑐. 𝑚

Trong đó: Sc, St Lần lượt là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn và thử

Nồng độ (mg/ml) dung dịch chuẩn Cc

HLC Độ tinh khiết (%) của chuẩn

F Độ pha loãng của mẫu thử

m Khối lượng (g) của mẫu thử

Định lượng ART

Tiến hành theo điều kiện định lượng ART bằng HPLC đã nêu trên.

2.2.3.6 Phần trăm và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART

Để định lượng hoạt chất nang hóa trong tiểu phân, cần tách riêng hoạt chất không

nang hóa – chúng tồn tại tự do trong môi trường phân tán.

 Tách hoạt chất không nang hóa (hoạt chất tự do)

Phương pháp: Tách hoạt chất không nang hóa bằng kỹ thuật siêu lọc [162].

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 250 mg mẫu (hệ tiểu phân nano artemisinin)

vào ngăn trên của dụng cụ lọc (Amicon® Ultra 0,5, Millipore Co, Mỹ, MWCO

3.000 Da). Ly tâm mẫu với tốc độ 20.000 vòng/phút (tương đương 29.060 g)

trong 20 phút (2 lần). Tiểu phân và hoạt chất nang hóa được giữ lại trên màng

lọc, dịch lọc chứa hoạt chất tự do hòa tan trong môi trường sẽ đi qua màng. Thu

dịch lọc và định lượng ART tự do bằng HPLC.

 Tính phần trăm nang hóa (11) và hiệu suất nang hóa (12):

𝑛1 𝑛2

𝑃ℎầ𝑛 𝑡𝑟ă𝑚 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑥 100 (11)

𝑛1 𝑛3

𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑥 100 (12)

Trong đó: Lượng hoạt chất nang hóa n1

Lượng lipid n2

Lượng hoạt chất định lượng toàn phần n3

Lượng hoạt chất định lượng toàn phần là lượng hoạt chất định lượng được trong

tiểu phân và trong môi trường phân tán. Lượng hoạt chất nang hóa là hiệu số giữa

lượng hoạt chất định lượng toàn phần và hoạt chất trong môi trường phân tán – đây

là lượng hoạt chất tự do, không nang hóa trong tiểu phân.

2.2.3.7 Khảo sát sự phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân nano ART

Dùng phương pháp khuếch tán qua màng (túi thẩm tách) để khảo sát khả năng

phóng thích hoạt chất in vitro của hệ tiểu phân nano ART. Túi thẩm tách được tạo

thành bằng cách kẹp hai đầu của màng bán thấm (Spectra/Por® 1–3, MWCO 6.000–

8.000, Spectrum, Mỹ). Màng giữ tiểu phân trong túi, chỉ cho hoạt chất hòa tan đi

qua và khuếch tán vào môi trường thử nghiệm [162].

Màng bán thấm được ngâm trong nước cất hai lần (1 giờ), sau đó tiếp tục rửa bằng

nước cất hai lần (3 lần) trước khi sử dụng. Lần lượt kẹp hai đầu của màng bán thấm

bằng kẹp nổi và kẹp từ (Universal dialysis tubing closure, Spectrum, Mỹ) để tạo

thành túi thẩm tách có chiều dài 5 cm (diện tích là 3,2 cm2 tương ứng với 1 cm

chiều dài túi). Cân chính xác một lượng mẫu khảo sát (hệ tiểu phân nano ART) và

oC) và tiến hành thử nghiệm với các điều kiện xác định.

cho vào túi. Đặt ngay túi chứa mẫu vào cốc chứa sẵn môi trường hòa tan (37 ± 0,5

Điều kiện thử nghiệm như sau:

 Lượng mẫu: Cân chính xác lượng mẫu tương ứng với 25 mg ART.

 Môi trường thử nghiệm là 500 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8 và natri

laurylsulfat 0,5%. Nhiệt độ môi trường thử nghiệm là 37 ± 0,5 oC.

 Tốc độ quay: 100 vòng/phút.

 Thời điểm lấy mẫu: ¼ giờ, ½ giờ, ¾ giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3,5 giờ, 5 giờ và 8 giờ.

 Thể tích lấy mẫu: 5 ml, bù dịch bằng môi trường đệm với thể tích tương ứng.

Lọc mẫu qua giấy lọc 0,2 µm và phân tích HPLC.

Công thức tính lượng hoạt chất khuếch tán (mg/cm2) tại thời điểm i (13):

+ 𝑋𝑖 (mg/cm2) = 𝑋𝑖−1 (13) 1 100 𝑆𝑡. 𝐶𝑐. 𝐻𝐿𝐶. 𝑉. 100 𝑆𝑐. 𝑚1. d. 3,2

Trong đó: i Thời điểm lấy mẫu

Lần lượt là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn và thử Sc, St

Cc, HLC Lần lượt là nồng độ (mg/ml) và độ tinh khiết (%) của chuẩn

Lượng hoạt chất khuếch tán của mẫu thử tại thời điểm i Xi

V Thể tích (ml) của môi trường thử nghiệm

Khối lượng (g) mẫu thử nghiệm m1

d Chiều dài túi thẩm tách (cm)

3,2 Diện tích (cm2) ứng với 1 cm chiều dài túi

2.2.3.8 Xây dựng tiêu chuẩn của hệ tiểu phân nano ART

 Xây dựng quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART bằng phương pháp đồng

nhất hóa áp suất cao với cỡ mẫu 100 g.

 Xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm định hệ tiểu phân nano ART:

Cảm quan, kích thước và dãy phân bố kích thước, thế zêta, hình thể học, hiệu

suất nang hóa và khả năng phóng thích hoạt chất.

2.2.3.9 Nâng cỡ mẫu bào chế hệ tiểu phân nano ART lên 1.000 g

Nâng cấp cỡ mẫu nhằm đánh giá tính ổn định của thành phần công thức và quy

trình bào chế. Sau khi xác định được công thức và quy trình tối ưu, tiến hành bào

chế hệ tiểu phân có cỡ mẫu 1.000 g trên 3 lô bằng phương pháp đồng nhất hóa dưới

áp suất cao với thành phần công thức tương tự mẫu tối ưu. Sau đó, đánh giá các chỉ

tiêu chất lượng của hệ tiểu phân mẫu nâng cấp và so sánh với mẫu tối ưu. Chỉ tiêu

và phương pháp đánh giá được tiến hành như mục 2.2.3. Các thông số của quy trình

bào chế được khảo sát nhằm thu được hệ tiểu phân ứng với cỡ lô 1.000 g có chất

lượng không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê so với lô tối ưu (p < 0,05).

Phần trăm hoạt chất khuếch tán giữa mẫu tối ưu và mẫu nâng cấp được đánh giá

−0,5

𝑛

thông qua giá trị thống kê f2, tính theo công thức (14):

𝑖=1

] × 100} (14) 𝑓2 = 50 × 𝑙𝑔 {[1 + × ∑(𝑇𝑈𝑖 − 𝑁𝐶𝑖)2 1 𝑛

Trong đó: n: Số thời điểm lấy mẫu

TUi: TB lượng hoạt chất khuếch tán từ mẫu tối ưu ở thời điểm i

NCi: TB lượng hoạt chất khuếch tán từ mẫu nâng cấp ở thời điểm i

i: Thời điểm lấy mẫu

Khi f2 ≥ 50, lượng hoạt chất khuếch tán của hai mẫu tương tự nhau.

Sau đó, sản phẩm của lô nâng cấp được dùng để theo dõi độ ổn định và thử hiệu lực

diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột gây nhiễm P. berghei.

2.2.3.10 Theo dõi độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART

Độ ổn định của hệ tiểu phân được đánh giá sau thời gian bảo quản ở 6 ± 2 oC oC (trong

tủ lạnh) và 30 ± 2 oC / RH 75 ± 5% (phòng đạt quy định vùng khí hậu IVb).

 Thời điểm đánh giá: 0, 1, 2, 3, 6, 9 tháng sau khi bào chế.

 Các tính chất được đánh giá: Kích thước tiểu phân, hàm lượng hoạt chất và

hiệu suất nang hóa hoạt chất.

 Phương pháp tiến hành và đánh giá kết quả: Tương tự như cách đánh giá dãy

phân bố kích cỡ mục 2.2.3.2 và định lượng hoạt chất mục 2.2.3.5. Kích thước

và hiệu suất nang hóa ổn định chứng tỏ hệ tiểu phân ổn định.

2.2.4 Đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano

ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei

2.2.4.1 Chọn chuột nghiên cứu

Chuột nhắt trắng (đực và cái), chủng Swiss albino khỏe mạnh, không có biểu hiện

bất thường, khoảng 5 tuần tuổi, trọng lượng từ 18 – 20 g. Trong quá trình thử

nghiệm, chuột được nuôi trong cùng điều kiện môi trường thí nghiệm theo chế độ

ăn cân bằng với thức ăn có chất lượng chuẩn do Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng và

Côn trùng TP. Hồ Chí Minh cung cấp.

2.2.4.2 Chuẩn bị nguồn lây nhiễm P. berghei

Có nhiều mô hình gây nhiễm trên động vật được ứng dụng để nghiên cứu hiệu lực

của thuốc điều trị sốt rét. Tuy nhiên, mô hình nghiên cứu trên chuột nhiễm P.

berghei được dùng nhiều hơn cả. Đề tài ứng dụng quy trình gây nhiễm cho chuột

lành theo quy trình chuẩn của Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng và Côn Trùng TP. Hồ

Chí Minh.

Chủng P. berghei kháng cloroquin được thuần chủng từ nguồn duy trì trong môi

trường nitơ lỏng của Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng và Côn Trùng TP. Hồ Chí

Minh. KST được hoạt hóa ở 37 oC và thuần chủng bằng cách cấy truyền qua nhiều

thế hệ chuột lành. Máu có KST sẽ được truyền và gây nhiễm cho chuột lành.

Dùng bơm tiêm đã tráng heparin (1 ml máu cần 40 đơn vị heparin) để lấy máu từ

hốc mắt chuột, lắc đều để hòa loãng máu bằng dung dịch nước muối sinh lý (NaCl)

0,9%. Không để máu nhỏ ra ngoài và lấy đủ lượng máu truyền cho chuột lành trong

các lô thử nghiệm.

2.2.4.3 Gây nhiễm P. berghei cho chuột thí nghiệm

Quy trình truyền kháng nguyên từ chuột mang KST cho chuột lành như sau:

 Tiêm máu chứa kháng nguyên lấy từ chuột có KST sang chuột lành bằng kim

tiêm vô trùng qua đường tiêm phúc mô và thể tích tiêm là 0,2 ml máu pha

loãng chứa 1 x 107 KST.

 24 giờ sau khi truyền kháng nguyên, lấy lam giọt mỏng máu từ tĩnh mạch

đuôi chuột và để khô tự nhiên. Cố định lam bằng cồn tuyệt đối.

 Tiến hành nhuộm lam bằng dung dịch Giemsa 5% trong nước cất, để yên

trong khoảng 45 phút. Rửa sạch lam bằng nước cất, để khô tự nhiên.

 Soi lam với kính hiển vi (100 x) và xác định mật độ KST bằng cách đếm số

lượng KST trên 10.000 hồng cầu (khoảng 30 vi trường), chuột có mật độ

KST đạt 20 – 30% được chia ngẫu nhiên vào các lô thử nghiệm [65], [111].

2.2.4.4 Đường dùng thuốc và liều dùng

Chuột đã gây nhiễm được chia làm 9 lô, mỗi lô 10 con, trong đó:

 Lô 1 (lô chứng âm): Chuột có KST uống hệ tiểu phân nano không chứa ART.

 Lô 2 – 5 (lô chứng dương): Chuột có KST được uống ART liều 100 mg/kg

(lô 2), 150 mg/kg (lô 3), 170 mg/kg (lô 4) và 190 mg/kg cân nặng (lô 5) pha

trong dung dịch 1% polysorbat 80 và 1% SimulsolTM 4000 P.

 Lô 6 – 9 (lô nghiên cứu): Chuột có KST uống hệ tiểu phân nano ART liều

100 mg/kg (lô 6), 150 mg/kg (lô 7), 170 mg/kg (lô 8) và 190 mg/kg cân nặng

(lô 9).

Liều dùng: 100 mg/kg, 150 mg/kg, 170 mg/kg và 190 mg/kg cân nặng, tương ứng

với 2 mg, 3 mg, 3,4 mg và 3,8 mg chế phẩm.

2.2.4.5 Thời gian dùng thuốc

 Cho chuột uống vào buổi sáng, 1 lần/ngày x 7 ngày.

 Đánh giá mật độ KST theo quy trình 35 ngày: Ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 14,

21, 28 và 35 bằng cách lấy máu soi lam giọt mỏng máu từ đuôi chuột [111].

2.2.4.6 Đánh giá hiệu quả của thuốc

Đánh giá hiệu lực của thuốc dựa vào các chỉ tiêu:

 Mật độ KST: Đếm số lượng KST trong 10.000 hồng cầu (30 vi trường).

 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu giữa lô điều trị so với lô chứng âm ở các

thời điểm được tính theo công thức (1) [49], [65]:

X(%) = 𝑥 100 𝐴 − 𝐵 𝐴

(15) A là mật độ KST trung bình của lô chứng âm, B là mật độ KST trung bình

của lô điều trị. Điều trị có hiệu quả khi mật độ KST trong máu chuột giảm đi

≥ 30% [65].

 Thời gian sống sót của chuột: Là thời gian sống sót của chuột trong lô được

theo dõi đến ngày thứ 35 [21].

 Thời gian sạch KST trong máu: Là thời điểm bắt đầu có kết quả âm tính

(không phát hiện KST) khi soi lam giọt mỏng máu từ đuôi chuột.

 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu: Là khoảng thời gian có kết

quả âm tính khi soi lam giọt mỏng máu từ đuôi chuột, được theo dõi đến

ngày thứ 35.

2.2.5 Phân tích số liệu

Số liệu không có phân phối chuẩn được xử lý thống kê bằng phép kiểm Mann-

Whitney. Số liệu có phân phối chuẩn được xử lý thống kê bằng phân tích phương

sai một yếu tố ANOVA, phần mềm SPSS, phiên bản 22. Biểu diễn số liệu dưới

dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. p < 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid

(Compritol 888® ATO – LabrafacTM PG) và ART

3.1.1 Thể chất và nhiệt độ tan chảy của hỗn hợp lipid

Kết quả khảo sát thể chất và nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp lipid ở các tỉ lệ khác

nhau được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Thể chất của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG

Tỉ lệ lipid Nhiệt độ nóng chảy (oC)

Thể chất hỗn hợp (37 oC) (n = 3)

Rắn 71,50 ± 1,50

Rắn 70,30 ± 1,34

Rắn 66,65 ± 1,30

Rắn 68,46 ± 1,60

Rắn 64,06 ± 1,30

Mềm 59,50 ± 2,00

54,50 ± 2,50 Mềm Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (9 : 1) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (8 : 2) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (6 : 4) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (5 : 5) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (4 : 6) Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (3 : 7)

Bảng 3.1 cho thấy, với tỉ lệ từ (9 : 1) đến (5 : 5) thì hỗn hợp Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG ở dạng rắn và có nhiệt độ nóng chảy cao hơn 37 oC. Theo các tài

liệu tham khảo, tỉ lệ lipid rắn – lỏng trong bào chế tiểu phân nano thường là (7 : 3),

(6 : 4) hoặc (5 : 5). Do đó, tỉ lệ hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG từ

(8 : 2) đến (5 : 5) được chọn để đánh giá sự tương tác bằng DSC.

3.1.2 Sự tương tác của hỗn hợp lipid

Biểu đồ nhiệt của các mẫu khảo sát được trình bày như Biểu đồ 3.1 (phụ lục 1.1, 1.2).

(a)

(b) Biểu đồ 3.1 Biểu đồ nhiệt (a) Compritol® 888 ATO, (b) hỗn hợp Compritol® 888

ATO – LabrafacTM PG (7 : 3)

Theo biểu đồ nhiệt, Compritol® 888 ATO có nhiệt độ nóng chảy cao (72,35 oC) và

khoảng nóng chảy hẹp (Biểu đồ 3.1a). Khi phối hợp với LabrafacTM PG, mặc dù

hỗn hợp lipid vẫn ở thể rắn ở nhiệt độ phòng, nhưng chúng có những tính chất khác

với Compritol® 888 ATO.

Đầu tiên là nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp lipid giảm rõ rệt so với Compritol® 888

oC. Ngoài ra, khoảng nóng chảy rộng của hỗn hợp cũng rộng hơn, có thể do sự hòa

ATO. Cụ thể, điểm chảy của Compritol® 888 ATO giảm từ 72,35 oC xuống 61,11

tan vào nhau giữa hai lipid làm giảm nhiệt độ nóng chảy và mở rộng khoảng nóng

chảy của Compritol® 888 ATO (Biểu đồ 3.1 b). Tuy nhiên, với tỉ lệ cao hơn (6 : 4

hoặc 5 : 5), LabrafacTM PG có xu hướng tách ra khỏi hỗn hợp, vì vậy, xuất hiện

peak ở khoảng – 31 oC. Điểm chảy của hỗn hợp lipid được trình bày ở Biểu đồ 3.2.

)

C

o ( y ả h c g n ó n ộ đ t ệ i

h N

Compritol 888 ATO

Compritol 888 ATO - Labrafac PG (8:2)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG (6:4)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG (5:5)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG (7:3) Tỉ lệ hỗn hợp Compritol® 888 ATO - LabrafacTM PG

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ điểm chảy của Compritol® 888 ATO và các hỗn hợp lipid

Năng lượng chuyển pha của lipid cũng thay đổi theo tỉ lệ. Kết quả cho thấy năng

lượng nhiệt của tất cả các hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG khác

nhau so với Compritol® 888 ATO (p < 0,05). Lipid rắn Compritol® 888 ATO có

năng lượng nhiệt là 138,7 (J/g). Khi phối hợp lipid lỏng LabrafacTM PG, năng lượng

giảm đi rất rõ, tỉ lệ Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3), (6 : 4), (5 : 5) có

năng lượng nhiệt lần lượt là 126,4: 121,4: 136,6.

3.1.3 Sự tương tác giữa các hỗn hợp lipid và ART

Biểu đồ nhiệt của mẫu khảo sát sự tương tác giữa các hỗn hợp lipid và ART được

trình bày ở Biểu đồ 3.3. Ở khoảng nóng chảy của ART không có peak ART xuất

hiện. Nhiệt độ nóng chảy của các hỗn hợp này thấp hơn Compritol® 888 ATO (p <

0,05). Tỉ lệ lipid lỏng trong hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART

có ảnh hưởng đến năng lượng nhiệt của hỗn hợp. Tương tự kết quả khảo sát sự

tương tác giữa các hỗn hợp lipid, có peak của lipid lỏng xuất hiện ở tỉ lệ lipid (6 : 4)

và (5 : 5).

(Mẫu 13, 4, 14 và 15 lần lượt là hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART tỉ

lệ (8 : 2 : 0,8), (7 : 3 : 0,8), (6 : 4 : 0,8), (5 : 5 : 0,8))

Biểu đồ 3.3 Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART

Nhận xét: Kết quả khảo sát sự tương tác giữa các hỗn hợp Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG và Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART cho thấy:

 Hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) có nhiệt độ nóng chảy

và năng lượng nhiệt khác nhau so với Compritol® 888 ATO (p < 0,05) và sự

hỗn hòa Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG tốt nhất nên được chọn để

đánh giá sự ảnh hưởng của lượng ART đến trạng thái của hỗn hợp lipid.

 Không có sự hiện diện của peak ART khi phối hợp ART vào hỗn hợp lipid.

Vì vậy, tiến hành thí nghiệm đánh giá sự ảnh hưởng của lượng ART khác

nhau đến nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp lipid.

3.1.4 Ảnh hưởng của lượng ART đến sự tương tác của hỗn hợp lipid

Biểu đồ 3.4 cho biết nhiệt đô chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM

PG (7 : 3) và các hàm lượng ART khác nhau. Tỉ lệ lipid cố định nhưng lượng ART

tăng dần với lượng cao nhất là 100 mg ART trong 1 g lipid. Điểm chảy của hỗn hợp

Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) và ART không khác nhau so với

điểm chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) nhưng thấp

hơn điểm chảy của Compritol® 888 ATO (p < 0,05).

)

C

o ( y ả h c g n ó n ộ đ t ệ i

h N

Compritol 888 ATO

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 0,2)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 0,6)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 0,4)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 0,8)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 1)

Compritol 888 ATO - Labrafac PG - ART (7 : 3; 0,5) Tỉ lệ hỗn hợp Compritol®888 ATO - LabrafacTM PG - ART

Biểu đồ 3.4 Biểu đồ nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau

Cụ thể, theo Bảng 3.2, ART nguyên liệu có điểm chảy ở 153,12 oC. Khi phối hợp

vào hỗn hợp lipid, không có peak ART xuất hiện ở nhiệt độ này, chỉ có peak của

lipid ở khoảng 66 oC – 69 oC dù lượng ART tăng dần từ 20 mg lên đến 100 mg. Do

vậy, lượng ART phối hợp vào công thức có thể từ 20 mg đến hơn 100 mg/g hỗn

hợp lipid, phụ thuộc vào kết quả phân tích kích thước tiểu phân và hiệu suất nang

hóa hoạt chất (phụ lục 1.5 – 1.6).

Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG

và lượng ART khác nhau

Mẫu khảo sát Nhiệt độ bắt đầu nóng chảy Điểm chảy

(oC) (oC)

ART 152,00 ± 1,01 153,12 ± 1,22

Compritol® 888 ATO 70,88 ± 0,75 72,35 ± 0,68

63,36 ± 1,12 66,57 ± 1,10 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 0,2)

61,61 ± 2,03 68,30 ± 2,34 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 0,4)

64,61 ± 2,60 66,42 ± 2,58 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 0,5)

55,29 ± 1,87 66,89 ± 1,75 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 0,6)

66,74 ± 0,52 67,01 ± 0,40 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 0,8)

65,38 ± 1,46 66,91 ± 1,63 Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3 : 1,0)

Qua các kết quả phân tích nhiệt vi sai, có thể kết luận:

 Tỉ lệ Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) được chọn làm tỉ lệ pha

dầu của công thức khảo sát.

 Hàm lượng ART phối hợp vào công thức có thể từ 20 mg đến hơn 100 mg

(trong 1 g lipid).

3.2. Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu

phân nano ART

3.2.1 Công thức cơ bản của hệ tiểu phân nano ART

3.2.1.1 Tỉ lệ lipid của công thức cơ bản

Bào chế các công thức có tỉ lệ lipid từ 5% đến 30% (thành phần cụ thể như Bảng

3.3) với chất diện hoạt Gelucire® 50/13 (G) theo quy trình đề nghị ở mục 2.2.2.2.

Bảng 3.3 Thành phần các công thức bào chế hệ tiểu phân nano

Công thức 1 2 3 4 5 6 7

3,5 3,5 3,5 3,5 7 7 7

1,5 1,5 1,5 1,5 3 3 3

Compritol® 888 ATO (g) LabrafacTM PG (g) Gelucire® 50/13 (g) 0,5 0,6 0,7 0,8 1 1,5 2

Công thức 8 9 10 11 12 13 14 15

14 14 14 21 21 21 21 21

6 6 6 9 9 9 9 9

Compritol® 888 ATO (g) LabrafacTM PG (g) Gelucire® 50/13 (g) 2 2,5 3 2,5 3,3 4 4,5 5

Nước cất vđ (g) 100

Kết quả đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.4.

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát một số tính chất của hệ tiểu phân nano

Công thức 1 2 3 4 5 6 7

Cảm quan Hệ trắng đục và đồng nhất

Tách lớp Có Không Không Có Không Có Có

Công thức 8 9 10 11 13 14 15 12

Cảm quan Hệ mịn và đồng nhất

Tách lớp Có Không Có Có Không Không Có Có

Hệ phân tán tạo thành từ các công thức số 2, 3 (5% lipid), 6 (10% lipid), 9 (20%

lipid), 12 và 13 (30% lipid) không tách lớp khi để nguội về nhiệt độ phòng. Các CT

6, 9, 12 và 13 được chọn để tiếp tục khảo sát vì chúng có tiềm năng chứa nhiều hoạt

chất hơn CT chỉ có 5% lipid. Tiến hành quan sát bằng kính hiển vi quang học để

đánh giá kích thước tiểu phân của các hệ phân tán và chọn hệ có tiểu phân nhỏ nhất.

Kết quả thu được hình ảnh tiểu phân như Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3 và Hình 3.4.

Hình 3.1 Hình ảnh tiểu phân của CT 13 quan sát bằng KHV (x 100)

Hình 3.2 Hình ảnh tiểu phân của CT 12 quan sát bằng KHV (x 100)

Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân của CT 9 quan sát bằng KHV (x 100)

Hình 3.4 Hình ảnh tiểu phân của CT 6 quan sát bằng KHV (x 100)

Dựa vào hình ảnh thu được có thể thấy CT 6 và 9 có kích thước tiểu phân nhỏ hơn

các công thức còn lại. Tiểu phân hình tròn, dù kích thước to nhưng tách rời nhau và

khá đều. Tuy nhiên, CT 6 (10% lipid) có lợi thế hơn vì vẫn ở dạng lỏng khi về nhiệt

độ phòng nên được chọn để tiếp tục khảo sát kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser.

Như vậy, qua khảo sát đã chọn được tỉ lệ lipid là 10%. Tiến hành khảo sát chất diện

hoạt nhằm chọn chất diện hoạt và tỉ lệ phù hợp cho công thức bào chế.

3.2.1.2 Chất diện hoạt trong công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Dùng một chất diện hoạt trong công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

 Gelucire® 50/13 (G)

Kích thước tiểu phân của mẫu bào chế theo công thức 6 được đánh giá bằng nhiễu

xạ laser. Kết quả thu được biểu đồ phân bố và thông số kích thước như Biểu đồ 3.5

(phụ lục 2.1). Tiểu phân có kích thước khá to và dãy phân bố rộng.

Biểu đồ 3.5 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 6

Các thông số kích thước tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.5.

Bảng 3.5 Thông số KTTP của CT 6

Thông số

Kiểu phân bố Dãy phân bố (nm) KTTP TB (nm) TP ≤ 50 nm (%) TP ≤ 100 nm (%) TP ≤ 197 nm (%) TP ≤ 296 nm (%) TP ≤ 445 nm (%) TP ≤ 669 nm (%) TP ≤ 766 nm (%) Kết quả Một đỉnh 259 – 2.599 836,6 ± 22,85 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,9 ± 0,10 11,5 ± 0,60 39,8 ± 1,48 51,4 ± 2,27

 Polysorbat 80 (P)

Bào chế các mẫu có tỉ lệ polysorbat 80 là 1, 2 và 3%, cụ thể như Bảng 3.6.

Bảng 3.6 Thành phần công thức với chất diện hoạt polysorbat 80

25 Công thức 26 27

7 7 7

3 Compritol® 888 ATO (g) LabrafacTM PG (g) 3 3

1 Polysorbat 80 (g) 2 3

Nước cất vđ (g) 100

Tiến hành đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân. Về cảm quan, hệ tạo thành có

màu trắng đục, đồng nhất và bền. Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân bằng nhiễu

xạ laser cho thấy kích thước tiểu phân phân bố một đỉnh nhưng có phần đuôi kéo

dài, chứng tỏ còn một tỉ lệ hạt to trong các mẫu khảo sát (Biểu đồ 3.6, phụ lục 2.5).

Các thông số của dãy phân bố kích cỡ tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.7.

Bảng 3.7 Thông số KTTP của mẫu 25, 26 và 27

Thông số Kết quả

CT 27 CT 25 CT 26

Kiểu phân bố Một đỉnh Một đỉnh Một đỉnh

Dãy phân bố (nm) 226 – 5867 226 – 5122 226 – 5122

KTTP TB (nm) 728,8 ± 34,23 667,1 ± 23,72 600,7 ± 18,05

TP ≤ 50 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 100 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 197 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 296 nm (%) 2,3 ± 0,46 2,6 ± 0,67 3,6 ± 0,00

TP ≤ 445 nm (%) 33,4 ± 2,90 36,1 ± 3,99 42,3 ± 0,32

TP ≤ 669 nm (%) 82,0 ± 1,59 82,5 ± 4,94 87,1 ± 0,55

TP ≤ 766 nm (%) 88,1 ± 2,35 88,3 ± 3,35 91,6 ± 0,21

Kết quả so sánh cho thấy:

- Kích thước tiểu phân của CT 25, 26 và 27 nhỏ hơn CT 6 (p < 0,05) (phụ lục 2.12).

- Kích thước tiểu phân CT 26 nhỏ hơn CT 27 và 25 (p < 0,05) (phụ lục 2.12).

(a)

(b)

Phối hợp chất diện hoạt trong công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

 Hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 và Gelucire® 50/13 (G – P)

Tiến hành bào chế công thức có hỗn hợp chất nhũ hóa là polysorbat 80 – Gelucire®

50/13 với thành phần công thức như Bảng 3.8.

Bảng 3.8 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 –

Gelucire® 50/13

Công thức

19 7 3 1 0,5 21 7 3 0,75 0,75 Compritol® 888 ATO (g) LabrafacTM PG (g) Polysorbat 80 (g) Gelucire® 50/13 (g) Nước cất vđ (g) 20 7 3 0,5 1 100

Kết quả thu được các nhũ tương có tính chất như Bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá một số tính chất của mẫu 19, 20 và 21

Công thức 19 21

20 Hệ trắng đục và đồng nhất Không Không Không Cảm quan Tách lớp

Các thông số của dãy phân bố kích cỡ tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.10.

Bảng 3.10 Thông số KTTP của mẫu 19, 20 và 21

Thông số

Kiểu phân bố Dãy phân bố (nm) KTTP TB (nm) TP ≤ 50 nm (%) TP ≤ 100 nm (%) TP ≤ 197 nm (%) TP ≤ 296 nm (%) TP ≤ 445 nm (%) TP ≤ 669 nm (%) TP ≤ 766 nm (%) CT 20 Một đỉnh 259 – 2599 792,4 ± 14,80 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,10 13,8 ± 1,15 46,7 ± 1,15 58,0 ± 1,25 Kết quả CT 21 Một đỉnh 259 – 2599 777,7 ± 24,31 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,06 14,0 ± 0,56 47,7 ± 2,17 59,3 ± 2,29 CT 19 Một đỉnh 259 – 2976 747,2 ± 26,86 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 2,0 ± 0,15 21,6 ± 0,87 56,1 ± 1,94 65,7 ± 2,23

Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân như Biểu đồ 3.7 (phụ lục 2.3).

(a)

(b)

Biểu đồ cho thấy, kích thước tiểu phân của các công thức khảo sát đều phân bố một

đỉnh. Dù dãy phân bố vẫn rộng nhưng đã có sự cải thiện nhất định về kích thước

trung bình và tỉ lệ tiểu phân < 445 nm.

 Hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 và phosphatidylcholin (P – Ph)

Bào chế các hệ tiểu phân với thành phần công thức và tỉ lệ như Bảng 3.11.

Bảng 3.11 Thành phần công thức với hỗn hợp polysorbat 80 - phosphatidylcholin

Công thức 22 24 23

Compritol® 888 ATO (g) 7 7 7

LabrafacTM PG (g) 3 3 3

Polysorbat 80 (g) 0,5 0,75 1

Phosphatidylcholin (g) 1 0,75 0,5

Nước cất vđ (g) 100

Tính chất của các hệ tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.12.

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 22, 23 và 24

Công thức 22 23 24

Cảm quan Hệ trắng đục và đồng nhất

Tách lớp Không Không Không

Dãy phân bố kích thước tiểu phân được trình bày như Biểu đồ 3.8 (phụ lục 2.4) và

các thông số kích thước tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.13. Kết quả cho thấy

kích thước tiểu phân phân bố một đỉnh, dãy phân bố rộng nhưng tỉ lệ tiểu phân <

445 nm cao hơn gần 2 lần so với mẫu chỉ dùng Gelucire® 50/13.

(a)

(b)

Bảng 3.13 Thông số KTTP của CT 22, 23 và 24

Thông số Kết quả

CT 24 CT 22 CT 23

Kiểu phân bố Một đỉnh Một đỉnh Một đỉnh

Dãy phân bố (nm) 226 – 2269 226 – 2269 226 – 2269

KTTP TB (nm) 808,5 ± 36,17 770,8 ± 17,32 751,8 ± 10,41

TP ≤ 50 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 100 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 197 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 296 nm (%) 2,9 ± 0,32 3,7 ± 0,10 3,5 ± 0,53

TP ≤ 445 nm (%) 22,3 ± 1,40 27,0 ± 0,64 26,0 ± 2,51

TP ≤ 669 nm (%) 48,6 ± 2,12 53,5 ± 1,76 54,6 ± 2,56

TP ≤ 766 nm (%) 55,8 ± 2,43 60,2 ± 1,82 62,0 ± 2,14

Dữ liệu từ Bảng 3.13 chứng tỏ CT 23 có kích thước tiểu phân trung bình nhỏ hơn

CT 22 và CT 24.

 Hỗn hợp chất diện hoạt Gelucire® 50/13 và phosphatidylcholin (G – Ph)

Để tăng khả năng nhũ hóa và giảm kích thước tiểu phân, tiến hành phối hợp

Gelucire® 50/13 và phosphatidylcholin với tỉ lệ khác nhau, cụ thể như Bảng 3.14.

Bảng 3.14 Thành phần các công thức phối hợp phosphatidylcholin

Công thức 16 17 18

7 7 7

3 3 3

Compritol® 888 ATO (g) LabrafacTM PG (g) Gelucire® 50/13 (g) 0,5 1 0,75

Phosphatidylcholin (g) 1 0,5 0,75

Nước cất vđ (g) 100

Kết quả đánh giá một số tính chất của hệ tiểu phân được trình bày như Bảng 3.15.

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 16, 17 và 18

Công thức 16 17 18

Hệ trắng đục và đồng Hệ trắng đục và đồng Cảm quan Tách lớp nhất nhất

Tách lớp Có Không Không

Tiến hành đánh giá kích thước tiểu phân bằng phương pháp nhiễu xạ laser, kết quả

thu được biểu đồ phân bố như Biểu đồ 3.9 (phụ lục 2.2).

(a)

(b) Biểu đồ 3.9 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 18 (a) và 17 (b)

Các thông số của dãy phân bố kích cỡ tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.16.

Bảng 3.16 Thông số KTTP của CT 17 và 18

Thông số Kết quả

CT 18

Kiểu phân bố Dãy phân bố (nm) KTTP TB (nm) TP ≤ 50 nm (%) TP ≤ 100 nm (%) TP ≤ 197 nm (%) TP ≤ 296 nm (%) TP ≤ 445 nm (%) TP ≤ 669 nm (%) TP ≤ 766 nm (%) Một đỉnh 259 – 2976 831,7 ± 19,35 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,15 13,8 ± 1,05 45,1 ± 1,66 55,7 ± 2,00 CT 17 Một đỉnh 259 – 2599 766,3 ± 12,15 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,1 ± 0,17 15,0 ± 0,95 49,2 ± 0,80 60,6 ± 1,01

Từ biểu đồ có thể thấy, các mẫu khảo sát đều có kiểu phân bố một đỉnh, dãy phân

bố rộng và kích thước tiểu phân khá to. CT 17 có kích thước trung bình nhỏ hơn CT

18 (p < 0,05) (phụ lục 2.13).

Qua các kết quả khảo sát trên, có thể kết luận:

- Kích thước tiểu phân trung bình của các công thức tốt nhất (CT 17, 19 và 23)

không khác nhau (p > 0,05) (phụ lục 2.13). Tuy nhiên, các công thức phối hợp

polysorbat 80 (19 và 23) có tỉ lệ tiểu phân ≤ 445 nm cao hơn gần gấp hai lần

(khoảng 25% so với 15%) so với công thức không dùng polysorbat 80 (17). Điều

này gợi ý rằng sự phối hợp polysorbat 80 có triển vọng cải thiện các thông số kích

thước tiểu phân.

- Các thông số phân bố kích cỡ tiểu phân (Bảng 3.7) cũng cho thấy polysorbat 80

đơn chất ở các tỉ lệ khác nhau tạo tiểu phân có kích thước nhỏ hơn tất cả các

công thức khảo sát khác. Trong ba công thức CT 25, 26 và 27 thì CT 26 có kích

thước trung bình nhỏ hơn công thức còn lại (p < 0,05) (phụ lục 2.12). Như vậy,

công thức chứa 2% polysorbat 80 có kích thước tiểu phân nhỏ nhất trong số các

công thức đã khảo sát. Có thể chọn tỉ lệ này để phối hợp với SimulsolTM 4000 P.

 Hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 và SimulsolTM 4000 P (P – S)

Bào chế các hệ tiểu phân với với tỉ lệ chất diện hoạt SimulsolTM 4000 P được dùng

là 40%, 50% và 60% so với polysorbat 80. Thành phần công thức bào chế và tỉ lệ

của các thành phần đươc trình bày trong Bảng 3.17.

Bảng 3.17 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 –

SimulsolTM 4000 P

Công thức 28 29 30

Compritol® 888 ATO (g) 7 7 7

LabrafacTM PG (g) 3 3 3

Polysorbat 80 (g) 1,4 1 0,6

SimulsolTM 4000 P (g) 0,6 1 1,4

Nước cất vđ (g) 100

Kết quả cho thấy các hệ tiểu phân thu được đều đồng nhất và không tách lớp. Quan

sát bằng kính hiển vi quang học, thu được hình ảnh tiểu phân tròn, đặc biệt rất nhỏ

và có kích thước khá đồng đều.

Tiến hành phân tích kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser. Kết quả thu được

biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân của các mẫu khảo sát được trình bày như Biểu

đồ 3.10 (phụ lục 2.6).

Có thể thấy dãy phân bố chia làm hai vùng: Vùng kích thước nhỏ có phân bố rất đối

xứng và vùng kích thước to trải dài không đồng đều dù vùng này chiếm tỉ lệ nhỏ.

Nhìn chung, tiểu phân chủ yếu tập trung về vùng có kích thước nhỏ mặc dù vẫn còn

một phần đuôi kéo dài.

(a)

(b)

(c)

Biểu đồ 3.10 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 30 (a), 28 (b) và 29 (c)

Các thông số của dãy phân bố kích thước tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.18.

Bảng 3.18 Thông số KTTP của CT 28, 29 và 30

Thông số Kết quả

CT 30 CT 29 CT 28

Kiểu phân bố Một đỉnh Một đỉnh Một đỉnh

Dãy phân bố (nm) 172 – 2269 172 – 2599 172 – 2269

KTTP TB (nm) 529,0 ± 14,10 509,6 ± 26,93 446,6 ± 10,85

TP ≤ 50 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 100 nm (%) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

TP ≤ 197 nm (%) 0,7 ± 0,06 1,0 ± 0,17 1,2 ± 0,15

TP ≤ 296 nm (%) 19,0 ± 0,12 23,4 ± 3,39 27,3 ± 0,86

TP ≤ 445 nm (%) 64,1 ± 0,64 67,9 ± 4,34 75,6 ± 2,32

TP ≤ 669 nm (%) 81,3 ± 1,63 82,9 ± 2,75 89,0 ± 1,27

TP ≤ 766 nm (%) 83,6 ± 1,64 85,0 ± 2,45 90,5 ± 1,14

Dữ liệu cho thấy dãy kích thước tiểu phân phân bố khá đồng nhất và thu hẹp hơn so

với các mẫu trước đó. Theo các thông số kích thước thu được, kích thước tiểu phân

trung bình của các công thức khảo sát giảm đáng kể. Cả ba công thức đều có kích

thước trung bình nhỏ hơn CT 26 (p < 0,05), CT 29 có kích thước tiểu phân trung

bình nhỏ hơn CT 30 và CT 28 (p < 0,05) (phụ lục 2.15).

Qua các kết quả khảo sát chất diện hoạt, có thể kết luận:

- CT 29 có kích thước tiểu phân trung bình nhỏ nhất trong các mẫu đã khảo sát.

- CT 29 có sự tăng đáng kể tỉ lệ tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 445 nm với

gần 80% tiểu phân ≤ 445 nm, gấp 2 lần CT 26 (chỉ dùng polysorbat 80) và gấp

7 lần so với CT 6 (dùng Gelucire® 50/13).

- CT 29 có kích thước trung bình của tiểu phân < 500 nm và không có tiểu phân

> 2,5 µm. Đây là công thức có tiềm năng nhất so với tất cả các công thức đã

khảo sát.

- Tuy nhiên, kích thước tiểu phân trung bình của CT 29 vẫn to và dãy phân bố

cỡ còn rộng. Tiến hành đồng nhất hóa bằng áp suất cao ở nhiệt độ cao để chọn

quy trình bào chế phù hợp với công thức đã chọn.

3.2.2 Kỹ thuật bào chế hệ tiểu phân nano ART

Bào chế các hệ tiểu phân với thành phần công thức tương tự CT 29 và các bước bào

chế tương tự mục 2.2.2.2. Sau đó, nhũ tương được chuyển vào máy đồng nhất hóa

để làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân bằng phương pháp HPH ở nhiệt độ

cao. Sơ bộ khảo sát các thông số HPH nhằm chọn mức áp suất và số chu kỳ cho

phép thu được tiểu phân có kích thước trung bình từ 100 – 120 nm và dãy phân bố

một đỉnh.

 Đồng nhất hóa với áp suất 500 bar và 10 chu kỳ

Tiến hành đồng nhất hóa nhũ tương ở 500 bar và 10 chu kỳ. Kết quả thu được biểu

đồ phân bố kích cỡ như Biểu đồ 3.11 (phụ lục 2.7).

Biểu đồ 3.11 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân sau HPH 500 bar 10 chu kỳ

Các thông số của kích thước tiểu phân được trình bày cụ thể trong Bảng 3.19.

Bảng 3.19 Thông số KTTP của mẫu đồng nhất hóa bằng HPH

Thông số Kết quả

Kiểu phân bố Một đỉnh

Dãy phân bố (nm) 76 – 1.981

KTTP TB (nm) 158,7 ± 2,99

TP ≤ 50 nm (%) 0,0 ± 0,0

TP ≤ 100 nm (%) 17,6 ± 0,60

TP ≤ 197 nm (%) 89,1 ± 0,10

TP ≤ 296 nm (%) 96,7 ± 0,06

TP ≤ 445 nm (%) 97,9 ± 0,06

TP ≤ 669 nm (%) 97,9 ± 0,12

TP ≤ 766 nm (%) 97,9 ± 0,12

Biểu đồ phân bố kích cỡ cho thấy kích thước tiểu phân phân bố một đỉnh và tập

trung về vùng có kích thước nm với khoảng 96% tiểu phân có kích thước nhỏ hơn

296 nm. Kích thước tiểu phân trung bình nhỏ hơn CT 29 khoảng 3 lần. Tuy nhiên,

còn một đỉnh nhỏ ở vùng µm nên tiếp tục nâng áp suất đồng nhất hóa để kích thước

tiểu phân đồng đều hơn.

 Tăng áp suất đồng nhất hóa: Đồng nhất hóa hệ phân tán với các áp suất và

chu kỳ như sau:

800 bar 10 chu kỳ

1.000 bar 10 chu kỳ

1.100 bar 5 chu kỳ

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser như Biểu đồ 3.12 (phụ

lục 2.8 – 2.10).

(a)

(b)

(c)

Biểu đồ 3.12 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân sau HPH 800 bar 10 chu kỳ (a),

1.000 bar 10 chu kỳ (b) và 1.100 bar 5 chu kỳ (c)

Các thông số kích thước của mẫu được trình bày trong Bảng 3.20.

Bảng 3.20 Thông số KTTP của mẫu sau khi tăng áp suất đồng nhất hóa

Thông số Kết quả

800 bar 10 chu kỳ 1.000 bar 10 chu kỳ 1.100 bar 5 chu kỳ

Một đỉnh Kiểu phân bố Một đỉnh Một đỉnh

76 – 389 Dãy phân bố (nm) 58 – 339 58 – 339

KTTP TB (nm) 113,5 ± 3,69 113,3 ± 2,27 129,3 ± 1,38

31,4 ± 1,59 TP ≤ 100 nm (%) 39,4 ± 5,84 39,0 ± 3,25

93,0 ± 0,12 TP ≤ 197 nm (%) 97,1 ± 0,12 97,1 ± 0,17

99,5 ± 0,06 TP ≤ 296 nm (%) 99,9 ± 0,06 99,8 ± 0,06

99,8 ± 0,00 TP ≤ 339 nm (%) 100,0 ± 0,00 100,0 ± 0,00

89,2 ± 0,26 78,8 ± 1,25 79,0 ± 0,70 d10

160,2 ± 5,68 159,5 ± 3,97 184,7 ± 1,57 d90

Kết quả cho thấy, tăng áp suất thu hẹp đáng kể dãy phân bố và kích thước tiểu phân

trung bình. Kích thước của các mẫu khảo sát đều nhỏ hơn mẫu đồng nhất hóa ở 500

bar 10 chu kỳ (p < 0,05) (phụ lục 2.16). Tuy nhiên, nếu tăng lên 1.100 bar 5 chu kỳ

thì kích thước tiểu phân to hơn.

Từ các kết quả trên, có thể thấy áp suất đồng nhất hóa phù hợp nhất cho hệ tiểu

phân lipid có thể từ 1.000 bar 10 chu kỳ đến dưới 800 bar 10 chu kỳ (nhưng lớn hơn

500 bar 10 chu kỳ). Thông số cụ thể cần được xác định để chọn điều kiện tốt nhất

vừa có thể tiết kiệm thời gian và năng lượng, vừa đảm bảo kích thước tiểu phân

trung bình trong khoảng 110 nm.

3.2.3 Hàm lượng ART phối hợp vào công thức bào chế hệ tiểu phân nano

ART

Bào chế mẫu có thành phần công thức tương tự CT 29 với hàm lượng ART từ 0,3%

đến 1%. Với những mẫu đạt yêu cầu về cảm quan, tiếp tục đánh giá kích thước và

hiệu suất nang hóa của tiểu phân. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.21.

Bảng 3.21 Tính chất của các hệ tiểu phân có hàm lượng ART khác nhau

0,3% 58 – 339 114,6 ± 1,95 80,1 ± 1,18 164,5 ± 1,59 0,4% 58 – 339 116,4 ± 3,12 79,3 ± 0,57 170,7 ± 4,19 0,5% 58 – 339 114,6 ± 1,75 78,3 ± 0,55 165,4 ± 4,29

92,35 92,42 92,56 92,44 ± 0,105 0,114 0,6% 58 – 339 115,8 ± 2,84 78,0 ± 1,03 160,3 ± 3,32 94,56 94,68 94,52 94,59 ± 0,086 0,091 0,7% 58 – 339 115,9 ± 2,71 77,8 ± 1,01 162,4 ± 4,23 95,91 95,92 95,78 95,87 ± 0,078 0,082 0,8% 58 – 339 118,8 ± 1,96 79,5 ± 2,00 161,2 ± 6,37

97,45 97,46 97,48 97,46 ± 0,015 0,015

Hàm lượng Dãy phân bố KTTP TB (nm) d10 d90 Hiệu suất NH (%) M1 M2 M3 TB RSD Hàm lượng Dãy phân bố KTTP TB (nm) d10 d90 Hiệu suất NH (%) M1 M2 M3 TB RSD Hàm lượng Dãy phân bố KTTP TB (nm) d10 d90 Hiệu suất NH (%) M1 M2 M3 TB RSD 96,51 96,53 96,61 96,55 ± 0,053 0,055 0,9% 58 – 339 118,2 ± 1,39 79,1 ± 0,44 162,9 ± 0,62 96,98 96,95 96,88 96,94 ± 0,054 0,056 97,21 97,10 97,02 97,11 ± 0,097 0,100 1% 58 – 339 122,1 ± 2,48 80,1 ± 1,01 165,0 ± 3,12 96,61 96,54 96,48 96,55 ± 0,062 0,064

Kết quả so sánh kích thước tiểu phân trung bình của các mẫu có hàm lượng ART từ

0,3% đến 0,9% cho thấy kích thước tiểu phân của các mẫu khảo sát không khác

nhau đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05), nhưng mẫu có hàm lượng ART 1% có kích

thước tiểu phân trung bình khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với các

hàm lượng còn lại (phụ lục 2.17).

Biểu đồ 3.13 biểu diễn hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân có hàm lượng ART

tăng dần. Kết quả so sánh hiệu suất nang hóa của các mẫu có tỉ lệ ART từ 0,3% đến

1% cho thấy các hiệu suất nang hóa khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (phụ

lục 2.18) giữa các mẫu. Có thể nói hiệu suất nang hóa tăng dần theo hàm lượng của

ART. Tuy nhiên, hiệu suất nang hóa của mẫu có 0,9% ART bắt đầu giảm dần. Mẫu

bào chế có 0,8% ART có hiệu suất nang hóa cao nhất.

Dựa vào kết quả so sánh kích thước tiểu phân trung bình và hiệu suất nang hóa, có

thể thấy mẫu có tỉ lệ ART 0,8% là mẫu có kích thước tiểu phân trung bình nhỏ và

hiệu suất nang hóa cao nhất. Đây là hàm lượng được chọn để phối hợp vào công

thức bào chế hệ tiểu phân nano ART.

)

(

B T a ó h g n a n t ấ u s u ệ i H

0.3%

0.4%

0.5%

0.6%

0.7%

0.8%

0.9%

1.0%

Hàm lượng (%) ART

Biểu đồ 3.13 Biểu đồ hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân nano ART

3.2.4 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân

nano ART

3.2.4.1 Yếu tố khảo sát

Dựa vào các kết quả thu được, xác định các mức của yếu tố khảo sát như Bảng 3.22.

Bảng 3.22 Các mức của yếu tố khảo sát

Yếu tố khảo sát Ký hiệu Xoi XiM Xim ∆𝑿𝒊

850 150 1.000 700 Áp suất X1 (bar) X1

6 3 9 3 Số chu kỳ X2 X2

3.2.4.2 Ma trận bố trí thí nghiệm

Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả được trình bày trong Bảng 3.23.

Bảng 3.23 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả

N xo x1 x2 yuTB

1 1 1 1 112,60

2 1 -1 1 130,57

3 1 1 -1 122,00

4 1 -1 -1 142,70

127 -9,67 -5,38 bi

3.2.4.3 Phương trình hồi quy thực nghiệm

Từ kết quả kích thước trung bình, xác định được phương trình hồi quy thực nghiệm:

ŷ = 127 – 9,67 x1 – 5,38 x2 + 0,68 x1x2

Dựa vào phương trình hồi quy, hệ số bi mang dấu âm, như vậy, có khả năng hai yếu

tố này có ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân và tương quan theo chiều nghịch,

nghĩa là khi gia tăng áp suất và chu kỳ đồng nhất hóa thì kích thước tiểu phân sẽ

giảm và ngược lại.

3.2.4.4 Ý nghĩa của các hệ số hồi quy trong phương trình hồi quy thực nghiệm

► Tiến hành bào chế 6 lô theo điều kiện cơ bản, kết quả như Bảng 3.24.

Bảng 3.24 KTTP của 6 TN ở điều kiện cơ bản

Thông số KTTP KTTP TB

850 850 850 850 850 850 X1 (bar)

6 6 6 6 6 6 X2 (chu kỳ)

116,1 116,8 117,1 114,0 115,9 113,8 115,6 yu (nm)

Ta có, Tlt (0,05,5) = 2,57, Tlt (0,01,5) = 4,03. Ttn của các hệ số bi lần lượt là:

T b0 = 182,8 > Tlt Tb2 = 7,7 > Tlt

Tb1 = 13,9 > Tlt Tb12 = 1,0 < Tlt

Do đó, hệ số b0, b1 và b2 có ý nghĩa, hệ số b12 không có ý nghĩa. Như vậy, phương

trình hồi quy biểu thị mối liên quan giữa áp suất và số chu kỳ đồng nhất hóa đến

kích thước tiểu phân là:

ŷ = 127 – 9,67 x1 – 5,38 x2

3.2.4.5 Kết quả thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng bằng phương pháp Box –

Willson

Theo kết quả khảo sát, khi gia tăng áp suất và chu kỳ đồng nhất hóa thì kích thước

tiểu phân sẽ giảm và ngược lại. Vì vậy:

𝑋𝑖𝑚ớ𝑖 = 𝑋𝑖𝑚𝑖𝑛 − 𝑠

Chọn c = 0,04

Với b1 = – 9,67 Với b2 = – 5,38

∆𝑋1 = 150 ∆𝑋2 = 3

s1 = – 58 ≈ − 50 s1 = – 0,65 ≈ − 1

𝑋𝑖𝑚ớ𝑖 = 𝑋𝑖𝑚𝑖𝑛 + 50 𝑋𝑖𝑚ớ𝑖 = 𝑋𝑖𝑚𝑖𝑛 + 1

Kết quả của các TN tiến đến vùng gần dừng được trình bày trong Bảng 3.25.

Bảng 3.25 Kích thước tiểu phân TB của thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng

700

Ximin

750

117,1

58 – 389

800

118,7

58 – 339

850

115,6

58 – 339

900

116,2

58 – 339

950

113,9

58 – 339

1.000

112,6

58 – 339

N Dãy phân bố X1 yu X2

Dựa vào Bảng 3.25, có thể thấy điều kiện của thí nghiệm 10 cho kích thước tiểu

phân nhỏ nhất. Tuy nhiên, theo kết quả phân tích thống kê thì kích thước tiểu phân

từ thí nghiệm 6 đến thí nghiệm 10 không khác nhau (p > 0,05). Ngoài ra, dãy phân

bố kích cỡ của các thí nghiệm này cũng giống nhau. Hơn nữa, việc tăng áp suất và

số chu kỳ lên quá cao có thể ảnh hưởng đến chất lượng của nhũ tương nano. Vì vậy,

đề tài chọn điều kiện ở thí nghiệm 6 là điều kiện bào chế tối ưu ứng với áp suất 800

bar và 5 chu kỳ.

3.2.4.6 Thực nghiệm kiểm chứng công thức bào chế tối ưu

Điều kiện tối ưu được kiểm chứng bằng thực nghiệm qua hai lô bào chế dựa theo

công thức và quy trình bào chế đã nêu. Tiến hành đánh giá kích thước tiểu phân của

các lô thực nghiệm. Kết quả cho thấy kích thước tiểu phân của lô kiểm chứng phân

bố một đỉnh với dãy phân bố kích cỡ hẹp. Các thông số kích thước được trình bày

như Bảng 3.26 (phụ lục 2.11).

Bảng 3.26 Thông số KTTP của các lô kiểm chứng

Kiểu Dãy phân Lô Mẫu KTTP (nm) d10 (nm) d90 (nm) phân bố bố (nm)

Một đỉnh 58 – 339 117,1 80,6 165,3 1

Một đỉnh 58 – 339 114,7 81,2 158,7 2

Một đỉnh 58 – 339 113,9 81,1 156,9 3 1

115,2 81,0 160,3 TB

1,7 0,3 4,4 SD

Một đỉnh 58 – 339 118,5 81,1 167,1 1

Một đỉnh 58 – 339 115,2 81,1 160,2 2

Một đỉnh 58 – 339 114,1 81,1 157,4 3 2

115,9 81,1 161,6 TB

2,29 0,0 5,0 SD

Một đỉnh 58 – 339 115,6 ± 1,8 81,0 ± 0,2 160,9 ± 4,3 TB

Theo bảng kết quả, dãy phân bố kích thước tiểu phân của lô kiểm chứng từ 58 – 339

nm, tương đương với dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân trong lô tối ưu. Cụ thể, kích

thước trung bình của tiểu phân khoảng 115 nm, có 10% tiểu phân có kích thước

dưới 81 nm và 90% tiểu phân có kích thước dưới 161 nm. Phân tích thống kê cho

thấy giá trị kích thước tiểu phân trung bình giữa lô tối ưu và kiểm chứng không

khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) (phụ lục 2.19).

Kết quả phân tích chứng tỏ, phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano ART bằng

HPH có tính lặp lại.

Từ các kết quả khảo sát, có thể tóm tắt và so sánh sự thay đổi kích thước tiểu phân

trong quá trình thành lập công thức như Bảng 3.27 và Biểu đồ 3.14.

Bảng 3.27 Sự thay đổi KTTP trong quá trình khảo sát

Chất diện hoạt KTTP TB (nm) d10 (nm) d90 (nm)

836,6 ± 22,85 429,1 ± 6,05 1.363,5 ± 61,79 G

600,7 ± 18,05 336,7 ± 3,09 728,9 ± 6,64 P

747,2 ± 26,86 378,8 ± 4,11 1.326,6 ± 79,06 P – G

751,8 ± 10,41 350,9 ± 7,60 1.364,0 ± 49,20 P – Ph

766,3 ± 12,15 405,9 ± 6,47 1.265,0 ± 40,07 G – Ph

446,6 ± 10,85 245,9 ± 1,10 735,6 ± 84,54 P – S

P – S 500 bar 158,7 ± 2,99 94,3 ± 2,1 205,0 ± 2,8

1400

1200

P – S 800 bar 113,5 ± 3,7 78,8 ± 1,2 160,2 ± 5,7

)

1000

m n (

800

600

400

KTH TB (nm) d10 (nm) d90 (nm)

B T n â h p u ể i t c ớ ư h t h c í K

200

G - Ph

P - G

P - Ph

P - S

P - S - 500 bar

P - S - 800 bar

Công thức

Biểu đồ 3.14 Biểu đồ so sánh các thông số KTTP của các mẫu khảo sát

Theo Biểu đồ 3.14, kích thước tiểu phân đã có cải thiện đáng kể trong quá trình

khảo sát. Khởi đầu từ kích thước tiểu phân trung bình, d10 và d90 lần lượt là 836,6

nm, 429,1 nm và 1363,5 nm đã được giảm xuống đến 113,5 nm, 78,8 nm và 160,2

nm. Các thông số đều có sự giảm đáng kể từ 5 đến 8 lần.

Tiến hành đánh giá các tính chất khác của hệ tiểu phân nhằm thu thập dữ liệu làm

cơ sở xây dựng tiêu chuẩn kiểm định sản phẩm nghiên cứu.

3.3. Kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART

3.3.1 Cảm quan của hệ tiểu phân nano ART

Các hệ tiểu phân lỏng, đồng nhất và không tách lớp.

3.3.2 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART

Kích thước và dãy phân bố kích cỡ tiểu phân được trình bày trong Biểu đồ 3.15.

Biểu đồ cho thấy kích thước tiểu phân phân bố một đỉnh, dãy phân bố kích cỡ hẹp.

Các thông số kích thước của tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.28.

Bảng 3.28 Thông số kích thước của hệ tiểu phân nano ART

Thông số Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB

Kiểu phân bố Một đỉnh Một đỉnh Một đỉnh Một đỉnh

Dãy phân bố (nm) 58 – 339 58 – 339 58 – 339 58 – 339

KTTP (nm) 115,9 119,9 120,1 118,7 ± 2,64

81,3 81,2 81,2 81,2 ± 0,06 d10 (nm)

160,3 166,9 168,8 165,3 ± 4,46 d90 (nm)

Theo bảng kết quả, kích thước trung bình của tiểu phân nano ART bào chế theo

điều kiện tối ưu khoảng 118 nm. Có 10% tiểu phân có kích thước dưới 81,2 nm và

90% tiểu phân có kích thước dưới 165,3 nm.

(a)

(b)

(c)

Biểu đồ 3.15 Biểu đồ phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART

3.3.3 Hình thể học của tiểu phân nano ART

Hình ảnh tiểu phân được khảo sát bằng TEM, ảnh chụp như Hình 3.5 (phụ lục 3.4).

Hình 3.5 Hình ảnh tiểu phân nano ART chụp bằng TEM (x 50.000)

Kết quả từ TEM cho thấy tiểu phân có hình tròn, kích thước khá đều, phù hợp với

khoảng kích thước đo được bằng phương pháp nhiễu xạ laser (58 – 339 nm).

3.3.4 Thế zêta của hệ tiểu phân nano ART

Thế zêta của hệ tiểu phân được biểu diễn như Biểu đồ 3.16 với giá trị đo là |-15,1|

mV < |- 30| mV – là giá trị thường dùng để dự đoán độ ổn định của hệ tiểu phân bền

nhờ lực tĩnh điện – có thể bề mặt tiểu phân bị che phủ bởi lớp chất diện hoạt.

Biểu đồ 3.16 Biểu đồ phân bố thế zêta của hệ tiểu phân nano ART

3.3.5 Định lượng ART bằng HPLC

3.3.5.1 Sắc ký đồ của ART của mẫu chuẩn và mẫu thử

Tiến hành sắc ký theo điều kiện như mục 2.2.3.5, kết quả sắc ký đồ của mẫu ART

chuẩn và thử như Biểu đồ 3.17. Sắc ký đồ cho thấy đỉnh ART tách biệt với tạp chất,

thời gian lưu của ART mẫu thử tương tự thời gian lưu của ART trong mẫu chuẩn.

(a)

(b) Biểu đồ 3.17 Sắc ký đồ HPLC của ART (a) mẫu chuẩn và (b) mẫu thử

3.3.5.2 Thẩm định quy trình định lượng ART bằng HPLC

Tính đặc hiệu

Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp như Biểu đồ 3.18. Mẫu pha động

và mẫu không chứa ART không có đỉnh hấp thu ở 216 nm. Mẫu chứa ART và mẫu

không chứa ART thêm chuẩn cho đỉnh ART tách riêng biệt và có thời gian lưu

tương đương thời gian lưu của mẫu chuẩn. Như vậy, phương pháp định lượng đạt

yêu cầu về tính đặc hiệu.

(a)

(b)

(c)

(d) Biểu đồ 3.18 Sắc ký đồ (a) pha động (b) mẫu bào chế không chứa ART (c) mẫu

chứa ART và (d) mẫu không chứa ART thêm chuẩn

Tính tuyến tính

Đường chuẩn được xây dựng với 6 mẫu dung dịch chuẩn ART có nồng độ từ 5 –

250 µg/ml. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.29 và Biểu đồ 3.19.

Bảng 3.29 Các thông số sắc ký của thẩm định tính tuyến tính

Mẫu chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh (mAu.phút)

250 290.685 1

200 240.860 2

100 123.652 3

50 67.873 4

25 33.321 5

10 14.250 6

350000

300000

ŷ = 1161x + 4976 R² = 0.999

250000

5 7.481 7

h n

ỉ

200000

150000

đ h c í t n ệ i D

100000

50000

100

200

250

300

150 Nồng độ (mcg/ml)

Biểu đồ 3.19 Đồ thị biểu thị tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh

Phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

đỉnh của các mẫu chuẩn có dạng ŷ = 1161x + 4976.

Trắc nghiệm F và trắc nghiệm t cho thấy:

F0,05 = 7,71 < F = 4758: Phương trình hồi quy có tính tương thích.

t0,05 = 2,78 > to = 2,30: Hệ số Bo không có ý nghĩa.

t0,05 = 2,78 < t = 68,98: Hệ số B có ý nghĩa.

Do đó, phương trình hồi quy có dạng: ŷ = 1161 x

Như vậy, phương trình hồi quy biểu thị mối liên quan giữa nồng độ và diện tích

đỉnh có tính tương thích với R2 = 0,999 và khoảng nồng độ tuyến tính từ 5 – 250 µg/ml.

Độ lặp lại

Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.30.

Bảng 3.30 Các thông số thẩm định độ lặp lại

Thời gian lưu Diện tích đỉnh Lượng ART Hàm lượng Mẫu thử (phút) (mAu.phút) (mg) ART (%)

12,752 83.878 3,09 101,07 1

12,808 82.687 3,04 99,63 2

12,802 82.803 3,05 99,77 3

12,787 81.109 2,98 97,73 4

12,827 83.079 3,06 100,10 5

12,846 83.127 3,06 100,16 6

3,05 99,74 12,80 82.780,50 TB

0,03 918,35 0,03 1,11 SD

0,25 1,11 1,11 1,11 RSD (%)

Nhận xét: với RSD% < 2%, phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại.

Độ chính xác trung gian (liên ngày)

Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian được trình bày trong Bảng 3.31.

Bảng 3.31 Các thông số sắc ký của ART

Hàm lượng ART N1 (%) 99,29 100,26 98,84 100,08 97,95 99,99 99,40 Hàm lượng ART N3 (%) 98,66 97,61 97,03 100,68 99,70 100,37 99,01 Mẫu thử 1 2 3 4 5 6 TB TB2 RSD (%) Hàm lượng ART N2 (%) 97,74 97,28 100,14 99,50 99,91 98,22 98,80 99,07 1,19

Nhận xét: Với RSD < 2% nên phương pháp phân tích đạt yêu cầu độ chính xác

trung gian. So sánh thống kê cho thấy phương sai hai nhóm mẫu thử (độ lặp lại và

độ chính xác trung gian) không khác nhau (p > 0,05) nên phương pháp phân tích

ART bằng HPLC đạt yêu cầu về độ chính xác.

Độ đúng

Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày trong Bảng 3.32.

Bảng 3.32 Các thông số thẩm định độ đúng

Lượng sẵn có (mg) 3,05 3,05 3,05 3,05 3,05 3,05 3,05 3,05 3,05 Tỉ lệ chuẩn (%) 80% 100% 120% Lượng tìm thấy (mg) 2,42 2,49 2,44 3,02 3,07 3,00 3,65 3,69 3,64 Tỉ lệ phục hồi (%) 98,72 101,11 99,22 99,93 100,39 98,65 99,31 99,95 99,77 99,67 0,79

Mẫu thử 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TB RSD (%)

100

Nhận xét: Tỉ lệ phục hồi trung bình là 99,67 ± 0,79%, nằm trong khoảng 98% –

102%. Do đó, phương pháp định lượng ART bằng HPLC đạt yêu cầu về độ đúng.

Như vậy, dựa vào kết quả thẩm định, có thể kết luận phương pháp định lượng ART

bằng HPLC đạt yêu cầu phân tích (phụ lục 3.5).

3.3.5.3 Định lượng ART bằng HPLC

Hàm lượng % (kl/kl) ART được trình bày trong Bảng 3.33. Kết quả cho thấy hàm

lượng (%) trung bình của ART định lượng được trong mẫu bào chế theo điều kiện

tối ưu là khoảng 99,64%.

3.3.6 Phần trăm và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART

Kết quả xác định phần trăm nang hóa và hiệu suất nang hóa được trình bày trong

Bảng 3.33. Kết quả cho thấy tiểu phân có hiệu suất nang hoá cao, với hiệu suất nang

hóa trung bình khoảng 97,49% và phần trăm nang hóa khoảng 7,7%.

Bảng 3.33 Hàm lượng % và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART

Hàm lượng ART Phần trăm nang hóa Hiệu suất nang hóa Lô (%) (%) ART (%)

1 99,70 ± 0,3 7,773 ± 0,002 97,51 ± 0,02

2 99,66 ± 0,65 7,772 ± 0,003 97,51 ± 0,03

3 99,56 ± 0,37 7,769 ± 0,002 97,46 ± 0,03

TB (%) 99,64 ± 0,07 7,771 ± 0,002 97,49 ± 0,03

RSD (%) 0,07 0,07 0,03

3.3.7 Phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân nano ART

Kết quả khảo sát sự phóng thích hoạt chất của tiểu phân nano ART được trình bày

trong Bảng 3.34 và Biểu đồ 3.20.

101

Bảng 3.34 Dữ liệu lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART

Thời Lượng hoạt chất phóng thích (mg/cm2)

điểm Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB ± SD

0,00 0,00 0,00 ± 0,0 0,00 0

0,00 0,00 0,00 ± 0,0 0,00 15

0,00 0,00 0,00 ± 0,0 0,00 30

0,00 0,00 0,00 ± 0,0 0,00 45

5,41 ± 0,26 5,15 ± 0,81 5,42 ± 0,45 5,33 ± 0,52 1

7,72 ± 0,61 7,69 ± 0,89 7,64 ± 0,48 7,68 ± 0,62 2

9,85 ± 0,73 9,94 ± 0,65 9,53 ± 0,55 9,77 ± 0,61 3,5

11,77 ± 1,00 11,85 ± 0,71 11,14 ± 0,64 11,59 ± 0,79 5

13,70 ± 0,48 13,13 ± 1,14 13,45 ± 1,26 13,43 ± 0,95 8

18.0

Lượng hoạt chất phóng thích lũy tiến được biểu diễn như Biểu đồ 3.20.

) 2

15.0

m c / g m

( h c í

12.0

h t

Lô TU1

9.0

Lô TU2

6.0

Lô TU3

3.0

g n ó h p t ấ h c t ạ o h g n ợ ư L

0.0

Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.20 Lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART

102

Nhận xét: Ở thời điểm to cho đến 45 phút đầu tiên, hầu như không phát hiện ART. Ở

giờ đầu tiên, có khoảng 5,33 (mg/cm2) hoạt chất được phóng thích. Đến giờ thứ 8,

khoảng 13,43 (mg/cm2) ART được phóng thích ra khỏi tiểu phân và khuếch tán qua

màng thử nghiệm. Kết quả cho thấy lượng hoạt chất được phóng thích dần ra khỏi

tiểu phân và tăng lên theo thời gian thử nghiệm.

Như vậy, các hệ tiểu phân nano ART bào chế theo điều kiện tối ưu đã được đánh

giá về tính chất cảm quan, kích thước, hình thể học, thế zêta, hiệu suất nang hóa và

lượng hoạt chất được phóng thích sau 8 giờ. Kết quả thu được là cơ sở để xây dựng

tiêu chuẩn và phương pháp kiểm định chất lượng của hệ tiểu phân nano ART.

3.3.8 Tóm tắt tiêu chuẩn của hệ tiểu phân nano ART và quy trình bào

chế (phụ lục 5)

Từ các kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART, tiến hành xây dựng

tiêu chuẩn và quy trình bào chế cho sản phẩm nghiên cứu. Sau đây là phần tóm tắt

tiêu chuẩn của hệ tiểu phân nano ART.

3.3.8.1 Công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Bảng 3.35 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Thành phần Khối lượng (g)

Công thức 100 g Công thức 1.000 g

ART 0,8 8

Compritol® 888 ATO 7,0 70

LabrafacTM PG 3,0 30

Polysorbat 80 1,0 10

SimulsolTM 4000 P 1,0 10

Nước cất vđ 100,0 1.000

103

3.3.8.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Bảng 3.36 Tiêu chuẩn nguyên liệu của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn

Artemisinin Đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2010)

Compritol® 888 ATO Đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 7.0 (2011)

LabrafacTM PG Đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 7.0 (2011)

Polysorbat 80 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 7.0 (2011)

SimulsolTM 4000 P Đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ 34 (2011)

3.3.8.3 Chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano ART

Bảng 3.37 Chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano ART

Chỉ tiêu Yêu cầu

Hệ tiểu phân đồng nhất, không kết bông, Cảm quan

không nổi kem và không tách lớp

Kích thước

Dãy phân bố (nm) 58 – 339

KTTP TB (nm) 105 – 125

70 – 85 d10 (nm)

150 – 180 d90 (nm)

Hình cầu Hình thể học

Kích thước trong khoảng 58 – 339 nm

|–13,5| – |–16,5| Thế zêta (mV)

7,0 – 8,5 PTNH (%)

Không ít hơn 92% HSNH (%)

12 – 15 PTHC (mg/cm2) sau 8 giờ

104

3.3.8.4 Phương pháp thử

Các phương pháp kiểm nghiệm cho từng chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano

ART được tiến hành theo phụ lục 5.

3.3.8.5 Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

Từ các kết quả nghiên cứu với cỡ lô 100 g đã thu được quy trình bào chế hệ tiểu

phân nano ART qua các bước sau:

 Cân các thành phần với khối lượng theo công thức trong Bảng 3.35.

 Hòa tan lần lượt 1 g SimulsolTM 4000 P và 1 g polysorbat 80 vào nước cất

với lượng vừa đủ 100 g bằng máy khuấy tốc độ cao (Ultra-Turrax®) ở 5.000

vòng/phút đến khi tạo được dung dịch đồng nhất, thu được pha nước – hỗn

hợp (1).

 Đun cách thủy ở 80 oC (máy khuấy từ có gia nhiệt) trong 5 phút cho nóng

chảy hoàn toàn 7 g Compritol® 888 ATO, hòa tan 3 g LabrafacTM PG vào

oC, tiếp tục hòa tan 0,8 g ART vào hỗn hợp lipid này bằng khuấy từ trong 10

Compritol® 888 ATO đã nóng chảy bằng khuấy từ liên tục trong 5 phút ở 80

oC trên cách thủy (máy khuấy từ có gia nhiệt).

phút, thu được dung dịch dầu đồng nhất – hỗn hợp (2), duy trì nhiệt độ ở 80

oC trên cách thủy (máy khuấy từ có gia nhiệt), đồng thời khuấy tốc độ cao

 Cho từ từ hỗn hợp (2) vào hỗn hợp (1) đã được đun nóng và duy trì ở 80 ± 1

(Ultra-Turrax®) ở 10.000 vòng/phút trong 7 phút, thu được nhũ tương D/N,

tiếp tục duy trì nhiệt độ ở 80 ± 1 oC trên cách thủy (máy khuấy từ có gia

nhiệt).

 Tăng tốc độ khuấy lên 15.000 vòng/phút và khuấy liên tục trong 5 phút, duy

trì nhiệt độ ở 80 ± 1 oC trên cách thủy (máy khuấy từ có gia nhiệt), thu được

nhũ tương ART (3).

 Rót nhũ tương ART (3) đã được duy trì nhiệt độ ở 80 ± 1 oC trên cách thủy

(máy khuấy từ có gia nhiệt) vào phễu của máy HPH với điều kiện buồng

đồng nhất hóa đã đạt yêu cầu về nhiệt độ đầu vào, tiến hành đồng nhất hóa

105

kích thước tiểu phân nano với áp suất 800 bar và 5 chu kỳ, thu được nhũ

tương nano ART (4).

Thông số vận hành máy HPH: Nhiệt độ đầu vào của buồng đồng nhất hóa là

80 oC, nhiệt độ đầu ra của buồng đồng nhất hóa là 81 ± 1 oC, tốc độ đồng

nhất hóa: 196 ml/phút.

 Thu nhũ tương nano ART (4) và để nhũ tương nano nguội dần về nhiệt độ

phòng, thu được hệ tiểu phân nano ART (5).

 Bảo quản hệ tiểu phân nano ART (5) ở 6 ± 2 oC trong tủ lạnh.

Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano không chứa ART tương tự quy trình trên

nhưng không có giai đoạn hòa tan ART vào hỗn hợp lipid và được bào chế với cỡ

mẫu 100 g/lô hoặc 1.000 g/lô.

Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART được tóm tắt qua Sơ đồ 3.1.

106

Compritol® 888 ATO

LabrafacTM PG Polysorbat 80

ART SimulsolTM 4000 P

Hòa tan vào nước 5.000 vòng/phút Ultra-Turrax®

Pha nước Đun cách thủy Compritol® 888 ATO 80 oC, 5 phút Hòa tan LabrafacTM PG, ART Máy khuấy từ Pha dầu

Đun cách thủy Duy trì 80 oC Máy khuấy từ

Đun cách thủy, Duy trì 80 oC Máy khuấy từ

Cho từ từ pha dầu vào pha nước Khuấy 10.000 v/p (7 p) Tăng lên 15.000 v/p (5 p), duy trì 80 oC Ultra-Turrax®

Nhũ tương ART (D/N)

Nhũ tương nano ART

Đồng nhất hóa 800 bar 5 chu kỳ Nhiệt độ đầu vào: 80 oC Nhiệt độ đầu ra: 81 ± 1 oC Máy HPH

Để nguội về nhiệt độ phòng

Hệ tiểu phân nano ART

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

107

3.3.9 Kết quả bào chế hệ tiểu phân nano ART với cỡ mẫu 1.000 g – Lô

nâng cấp

3.3.9.1 Công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano cỡ mẫu 1.000 g

Công thức của lô 1.000 g được trình bày trong Bảng 3.35. Kết quả khảo sát cho thấy

quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART lô 100 g (trình bày ở mục 3.3.8.5) có thể

áp dụng cho lô nâng cấp 1.000 g. Tuy nhiên, trong giai đoạn phối hợp pha dầu và

pha nước, thời gian khuấy được tăng lên 10 phút để phân tán hoàn toàn pha dầu vào

pha nước và thu được nhũ tương đồng nhất. Khi thời gian khuấy ít hơn, trên bề mặt

nhũ tương còn những giọt dầu li ti; ngược lại, thời gian khuấy nhiều hơn, nhũ tương

không thay đổi về tính chất cảm quan và kích thước tiểu phân so với các mẫu khảo

sát ở 10 phút. Các thông số cụ thể của quy trình bào chế như sau:

 Phối hợp pha dầu (2) và pha nước (1) bằng máy khuấy tốc độ cao Ultra-

Turrax® ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút.

 Khuấy 15.000 vòng/phút trong 5 phút, duy trì nhiệt độ ở 80 ± 1 oC.

 Đồng nhất hóa kích thước tiểu phân với áp suất 800 bar và 5 chu kỳ.

Sau khi bào chế, tính chất của hệ tiểu phân nano ART lô 1.000 g được đánh giá và

so sánh với lô 100 g và đánh giá chất lượng theo tiêu chuẩn đã xây dựng.

3.3.9.2 Đánh giá chất lượng của hệ tiểu phân nano ART lô 1.000 g

Kết quả đánh giá chất lượng của hệ tiểu phân nano ART lô nâng cấp bằng phương

pháp thử đã nêu trong phụ lục 5 như sau:

Cảm quan của hệ tiểu phân nano ART lô nâng cấp

Các hệ tiểu phân đồng nhất, không kết bông, không nổi kem và không tách lớp.

Kích thước và dãy phân bố kích thước của hệ tiểu phân nano ART lô nâng cấp

Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân cho thấy kích thước tiểu phân nano ART của

các lô nâng cấp đều phân bố một đỉnh và có dãy phân bố kích cỡ hẹp.

Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân được trình bày như Biểu đồ 3.21 (phụ lục 3.7).

108

(a)

(b)

109

Các thông số kích thước của tiểu phân được trình bày trong Bảng 3.38.

Bảng 3.38 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano ART các lô nâng cấp

Kiểu Dãy phân Lô Mẫu KTTP (nm) d10 (nm) d90 (nm) phân bố bố (nm)

Một đỉnh 58 – 339 117,4 78,9 168,5 1

Một đỉnh 58 – 339 116,2 78,3 166,5 2

Một đỉnh 58 – 339 112,3 77,1 160,7 1 3

115,3 78,1 165,2 TB

2,67 0,92 4,05 SD

Một đỉnh 58 – 339 116,9 77,8 161,1 1

Một đỉnh 58 – 339 119,4 78,8 175,2 2

Một đỉnh 58 – 339 112,7 77,8 160,5 2 3

116,3 78,1 165,6 TB

3,39 0,58 8,32 SD

Một đỉnh 58 – 339 114,9 79,1 163,4 1

Một đỉnh 58 – 339 110,8 77,7 156,8 2

Một đỉnh 58 – 339 119,1 81,4 166,7 3 3

114,9 79,4 162,3 TB

4,15 1,87 5,04 SD

Một đỉnh 58 – 339 115,5 ± 0,73 78,5 ± 0,74 164,4 ± 1,81 TB

Theo bảng kết quả, kích thước trung bình của tiểu phân nano ART lô nâng cấp

khoảng 115 nm. Có 10% tiểu phân có kích thước dưới 78,5 nm và 90% tiểu phân có

kích thước dưới 164,4 nm.

Hình thể học của tiểu phân nano lô nâng cấp

Hình ảnh tiểu phân của lô nâng cấp được khảo sát bằng TEM, ảnh chụp như Hình

3.6. Kết quả cho thấy tiểu phân có hình tròn, kích thước khá đều, phù hợp với kích

thước đo được bằng nhiễu xạ laser (trong khoảng 58 – 339 nm, phụ lục 3.8).

110

Hình 3.6 Hình ảnh tiểu phân của lô nâng cấp chụp bằng TEM (x 30.000)

Thế zêta của hệ tiểu phân nano ART mẫu nâng cấp

Thế zêta đo được là -14,5 mV, được trình bày như Biểu đồ 3.22. Nếu xét theo cơ

chế ổn định hệ tiểu phân nhờ tĩnh điện học thì giá trị này thấp hơn mức cho phép,

thường được quy định là ± 30 mV.

Biểu đồ 3.22 Biểu đồ phân bố thế zêta của lô nâng cấp

111

Định lượng ART toàn phần

Hàm lượng % (kl/kl) ART của lô nâng cấp khoảng 99,6% (Bảng 3.39). Kết quả so

sánh cho thấy hàm lượng trung bình của 3 lô không khác nhau.

Phần trăm và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART mẫu nâng cấp

Kết quả xác định phần trăm nang hóa và hiệu suất nang hóa được trình bày trong

Bảng 3.39. Tiểu phân có hiệu suất nang hoá cao với tỉ lệ khoảng 97,4%. Kết quả so

sánh các giá trị trung bình cho thấy phần trăm nang hóa và hiệu suất nang hóa của 3

lô nâng cấp không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Bảng 3.39 Hàm lượng %, PTNH và HSNH của lô nâng cấp

Lô Mẫu

Hàm lượng ART (%) 99,05 99,30 100,16 99,50 ± 0,58 0,59 100,03 99,44 100,10 99,86 ± 0,36 0,37 98,91 99,24 100,31 99,48 ± 0,73 0,74 Phần trăm nang hóa (%) 7,770 7,762 7,767 7,766 ± 0,004 0,050 7,768 7,766 7,760 7,765 ± 0,004 0,052 7,765 7,768 7,771 7,768 ± 0,003 0,041 1 2 3 1 2 3 TB (%) RSD (%) 1 2 3 TB (%) RSD (%) 1 2 3 TB (%) RSD (%)

Hàm lượng TB (%)

Phần trăm nang hóa TB (%):

Hiệu suất nang hóa TB (%): Hiệu suất nang hóa (%) 97,50 97,40 97,46 97,45 ± 0,049 0,050 97,48 97,45 97,38 97,43 ± 0,051 0,052 97,43 97,48 97,51 97,48 ± 0,040 0,041 99,62 ± 0,53 RSD% = 0,54% 7,766 ± 0,004 RSD% = 0,05% 97,45 ± 0,04 RSD% = 0,05%

112

Sự phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân nano ART mẫu nâng cấp

Dữ liệu khảo sát sự phóng thích hoạt chất của tiểu phân được trình bày trong Bảng

3.40 và Biểu đồ 3.23. Tương tự mẫu tối ưu, ART được phóng thích dần ra khỏi tiểu

phân. Lượng phóng thích tăng dần đến khoảng 13,11 (mg/cm2) ở giờ thứ 8.

Bảng 3.40 Lượng hoạt chất phóng thích của lô nâng cấp

Lượng hoạt chất phóng thích (mg/cm2) Thời

Lô 1 Lô 2 Lô 3 TB ± SD điểm

0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,0 0

0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,0 15

0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,0 30

0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,0 45

5,42 5,11 4,67 5,07 ± 0,38 1

7,40 7,56 7,19 7,38 ± 0,19 2

9,72 9,45 9,77 9,64 ± 0,17 3,5

11,15 11,63 11,32 11,37 ± 0,24 5

18.0

12,98 13,26 13,09 13,11 ± 0,14 8

h c í

15.0

h t

12.0

) 2

NC_1

9.0

m c / g m

(

NC_2

6.0

NC_3

3.0

g n ó h p t ấ h c t ạ o h g n ợ ư L

0.0

Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.23 Lượng hoạt chất phóng thích của tiểu phân nano ART lô nâng cấp

Nhận xét: Sau khi được phóng thích ra khỏi tiểu phân, ART khuếch tán dần ra môi

trường thử nghiệm và lượng khuếch tán tăng dần theo thời gian.

113

3.3.9.3 Tóm tắt kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân lô nâng cấp

Bảng 3.41 Tính chất của hệ tiểu phân lô nâng cấp

Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả

Cảm quan

Hệ tiểu phân đồng nhất, không kết bông, không nổi kem và không tách lớp Hệ tiểu phân đồng nhất, không kết bông, không nổi kem và không tách lớp

58 – 339 105 – 125 70 – 85 150 – 180 Hình cầu 58 – 339 115,5 78,5 164,4 Hình cầu Kích thước Dãy phân bố (nm) KTTP TB (nm) d10 (nm) d90 (nm) Hình thể học

Kích thước trong khoảng 58 – 339 nm Kích thước trong khoảng 58 – 339 nm

|–13,5| – |–16,5| -14,5 Thế zêta (mV)

7,0 – 8,5 7,77 PTNH (%)

Không ít hơn 92% 97,45

12 – 15 13,11

HSNH (%) PTHC (mg/cm2) sau 8 giờ

3.3.9.4 So sánh tính chất của hệ tiểu phân nano ART lô tối ưu, kiểm chứng và

nâng cấp

Kết quả đánh giá tính chất của lô được tóm tắt trong Bảng 3.42. Đồ thị biễu diễn

phần trăm giải phóng hoạt chất được trình bày ở Biểu đồ 3.24.

Bảng 3.42 Bảng tóm tắt tính chất của tiểu phân lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp

Tính chất Kết quả

Lô kiểm chứng Lô nâng cấp

Lô tối ưu 58 – 339 Dãy phân bố KTTP (nm) 118,7 ± 2,64 KTTP TB (nm) 7,771 ± 0,002 Phần trăm nang hóa (%) Hiệu suất nang hóa (%) 97,49 ± 0,03 Lượng HC khuếch tán (mg/cm2) 13,43 ± 0,95 58 – 339 115,6 ± 1,8 7,773 ± 0,002 97,48 ± 0,04 13,80 ± 0,75 58 – 339 115,1 ± 0,20 7,766 ± 0,004 97,45 ± 0,04 13,11 ± 0,14

18.0

114

) 2

15.0

m c / g m

( h c í

12.0

h t

9.0

Mẫu nâng cấp

Mẫu tối ưu

6.0

Mẫu kiểm chứng

3.0

0.0

g n ó h p t ấ h c t ạ o h g n ợ ư L

4 Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.24 Biểu đồ lượng hoạt chất phóng thích của lô tối ưu, kiểm chứng và

nâng cấp

Hình thể học và thế zêta của tiểu phân lô nâng cấp đạt yêu cầu của tiêu chuẩn sản

phẩm. Dãy phân bố kích cỡ, phần trăm và hiệu suất nang hóa của tiểu phân lô tối

ưu, kiểm chứng và nâng cấp không khác nhau (p > 0,05). Giá trị f2 > 50 cho thấy sự

phóng thích hoạt chất giữa các lô này tương tự nhau.

Như vậy, phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano ART bằng HPH đã được nâng lên

cỡ mẫu 1.000 g. Sản phẩm nghiên cứu được dùng để theo dõi độ ổn định.

3.3.10 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART

3.3.10.1 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano không chứa ART

 Cảm quan của hệ tiểu phân nano không chứa ART

Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân không chứa ART không đổi sau 17 tháng khảo sát.

Bảng 3.43 Kết quả tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano không chứa ART

Lô 3T 6T 9T 12T 15T 16T 17T Yêu cầu

Hệ tiểu phân đồng nhất, không tách lớp Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt 1 2 3

115

 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ tiểu phân nano không chứa ART

Biểu đồ phân bố của các mẫu khảo sát theo thời gian đều có phân bố một đỉnh và

dãy phân bố kích cỡ hẹp. Các thông số kích thước tiểu phân được trình bày trong

Bảng 3.44 (phụ lục 3.12 – 3.17).

Bảng 3.44 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART ở 6 ± 2 oC

Lô

0

3

6

9

12

15

16

17

1 Thông số Dãy phân bố KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

2

Dãy phân bố KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

3

Dãy phân bố KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

58 – 339 113,8 ± 2,52 80,2 ± 0,80 156,3 ± 3,79 58 – 339 114,9 ± 2,94 80,3 ± 0,28 158,5 ± 6,03 58 – 339 119,7 ± 2,02 80,2 ± 1,89 166,1 ± 2,01

58 – 339 120,6 ± 3,12 81,5 ± 1,95 167,2 ± 3,61 58 – 339 116,3 ± 0,41 81,1 ± 1,17 160,5 ± 1,29 58 – 339 117,2 ± 1,20 81,2 ± 1,13 162,2 ± 3,25

58 – 339 119,5 ± 3,01 80,9 ± 1,21 170,0 ± 4,21 58 – 339 117,8 ± 2,17 81,4 ± 1,22 165,4 ± 5,34 58 – 339 116,0 ± 1,08 80,7 ± 0,46 162,3 ± 4,04

58 – 339 117,7 ± 1,49 78,9 ± 0,87 169,2 ± 4,02 58 – 339 116,0 ± 3,33 79,0 ± 0,95 164,9 ± 4,13 58 – 339 112,5 ± 1,13 77,2 ± 2,24 161,3 ± 3,03

58 – 339 118,6 ± 2,26 80,2 ± 0,48 167,9 ± 2,26 58 – 339 112,5 ± 1,89 79,3 ± 0,58 162,3 ± 2,60 58 – 339 114,7 ± 1,00 78,6 ± 1,37 162,6 ± 3,88

58 – 389 118 ± 3,01 80,1 ± 0,30 166,7 ± 3,25 58 – 389 115,0 ± 2,63 79,3 ± 0,74 161,8 ± 3,77 58 – 389 123,9 ± 1,40 78,2 ± 2,53 181,3 ± 3,14

58 – 389 121,1 ± 2,83 79,9 ± 0,56 176,1 ± 4,17 58 – 389 125,0 ± 3,08 80,1 ± 1,05 183,9 ± 3,19 58 – 389 130,9 ± 2,00 79,9 ± 2,12 195,8 ± 4,11

76 – 389 150,8 ± 4,64 103,7 ± 0,55 204,0 ± 3,51 76 – 389 147,2 ± 4,43 102,2 ± 1,09 200,8 ± 5,01 76 – 389 145,3 ± 3,07 101,4 ± 3,27 197,1 ± 5,31

Giá trị p so sánh sự giống hay khác nhau của các giá trị kích thước trung bình ở

tháng 0 đến tháng 17 được trình bày trong Bảng 3.45.

Bảng 3.45 Giá trị p so sánh KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART theo thời

gian bảo quản với tháng 0

Tháng 3 6 9 12 15 16 17

0,995 0,998 1,000 1,000 0,952 0,036 0,000 Giá trị p

116

Theo kết quả độ ổn định của hệ tiểu phân nano không chứa ART (Bảng 3.44):

Dãy phân bố kích cỡ tiểu phân bắt đầu mở rộng ở tháng 15 (58 – 389 nm).

Kích thước tiểu phân không khác nhau từ tháng 0 đến 15 (p > 0,05), khác

nhau ở tháng 16 và 17 (p < 0,05).

3.3.10.2 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

 Cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART không đổi sau 9 tháng khảo sát ở

nhiệt độ 6 ± 2 oC, trong ngăn mát tủ lạnh.

Bảng 3.46 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

Tháng Tính chất cảm quan Kết quả ở tháng 0

Lô NC1 Lô NC2 Lô NC3

Đạt Đạt Đạt 3 Hệ tiểu phân đồng Đạt Đạt Đạt 6 nhất, không tách lớp Đạt Đạt Đạt 9

 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

Kết quả so sánh kích thước tiểu phân trung bình, hàm lượng hoạt chất và hiệu suất

nang hóa giữa 3 lô ở mỗi thời điểm cho thấy các giá trị trung bình không khác nhau.

Giá trị p so sánh sự giống hay khác nhau của các giá trị kích thước trung bình ở các

thời điểm khảo sát so với tháng 0 trong điều kiện 6 ± 2 oC được trình bày trong

Bảng 3.47. Dựa vào các kết quả, nhận xét:

Dãy phân bố kích cỡ tiểu phân mở rộng ở tháng thứ 6 (phụ lục 3.18 – 3.19).

Kích thước tiểu phân không khác nhau từ tháng 0 đến tháng thứ 6 (p >

0,05) nhưng khác nhau ở tháng thứ 7 và thứ 9 (p < 0,05).

Bảng 3.47 Giá trị p so sánh KTTB của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

Tháng Giá trị p 3 1,000 6 0,993 7 0,005 9 0,000

117

Các thông số kích thước và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART được

trình bày cụ thể ở Bảng 3.48.

Bảng 3.48 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC

Tính chất Dãy phân bố

Lô NC1

KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

HLHC (%)

HSNH (%)

Dãy phân bố

NC2

KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

HLHC (%)

HSNH (%)

Dãy phân bố

NC3

KTTP TB (nm)

d10 (nm)

d90 (nm)

HLHC (%)

HSNH (%)

0 58 – 339 115,3 ± 2,67 78,1 ± 0,92 165,2 ± 4,05 99,50 ± 0,58 97,45 ± 0,05 58 – 339 116,3 ± 3,39 78,1 ± 0,58 165,6 ± 8,32 99,86 ± 0,36 97,43 ± 0,05 58 – 339 114,9 ± 4,15 79,4 ± 1,89 162,3 ± 5,04 99,48 ± 0,73 97,48 ± 0,04

Tháng 3 58 – 339 114,3 ± 3,60 78,8 ± 1,90 162,9 ± 3,33 99,12 ± 0,19 97,43 ± 0,04 58 – 339 116,5 ± 0,25 79,3 ± 1,12 165,9 ± 1,18 99,09 ± 0,17 97,39 ± 0,04 58 – 339 114,7 ± 1,70 79,4 ± 1,44 162,0 ± 1,37 98,94 ± 0,59 97,41 ± 0,03

6 58 – 389 118,6 ± 3,78 79,3 ± 1,44 171,7 ± 5,09 95,88 ± 0,96 96,22 ± 0,07 58 – 389 117,7 ± 2,22 78,9 ± 1,62 165,9 ± 7,98 95,68 ± 0,73 96,30 ± 0,07 58 – 389 113,1 ± 1,78 77,9 ± 0,40 162,5 ± 5,84 96,17 ± 1,18 96,36 ± 0,02

7 58 – 445 129,0 ± 1,68 82,1 ± 1,08 191,1 ± 4,02 92,67 ± 1,62 95,85 ± 0,07 58 – 389 126,7 ± 2,82 81,4 ± 0,98 186,5 ± 6,75 91,50 ± 1,67 95,71 ± 0,02 58 – 389 124,9 ± 1,61 80,0 ± 2,44 180,4 ± 3,73 93,40 ± 1,89 95,77 ± 0,06

9 76 – 500 139,8 ± 2,26 97,9 ± 0,25 200,0 ± 4,61 87,74 ± 0,66 94,66 ± 0,09 51 – 500 133,1 ± 9,78 83,2 ± 10,05 206,7 ± 23,67 88,13 ± 0,39 94,71 ± 0,04 51 – 500 129,5 ± 8,00 83,6 ± 12,53 200,2 ± 3,81 87,75 ± 0,87 94,68 ± 0,06

118

Hình ảnh chụp từ TEM cho thấy, ở tháng thứ 3 và thứ 6, tiểu phân nano ART có

hình cầu, kích thước nằm trong khoảng 58 – 339 nm tương tự tiểu phân ở tháng 0

(Hình 3.7 và Hình 3.8) (phụ lục 3. 9, 3.10).

Hình 3.7 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 3 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 50.000)

Hình 3.8 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 6 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 30.000)

119

Theo kết quả độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC (Bảng 3.48), nhận xét:

Dãy phân bố kích cỡ tiểu phân bắt đầu mở rộng ở tháng 6 (58 – 389 nm).

Kích thước tiểu phân nano ART không khác nhau từ tháng 0 đến 6 (p >

0,05), khác nhau ở tháng thứ 7 (p < 0,05).

Hình dạng tiểu phân nano ART ở tháng 3 và 6 tương tự tháng 0.

Hiệu suất nang hóa thay đổi không đáng kể từ tháng 0 đến tháng 6.

3.3.10.3 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

 Cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART không đổi sau 6 tháng khảo sát ở 30

± 2 oC / 75 ± 5% RH.

Bảng 3.49 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

Tháng Tính chất cảm quan Kết quả ở tháng 0

Lô NC1 Lô NC2 Lô NC3

Đạt Đạt Đạt 3 Hệ tiểu phân đồng Đạt Đạt Đạt 4 nhất, không tách lớp Đạt Đạt Đạt 5

Đạt Đạt Đạt 6

 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC

Kết quả so sánh kích thước tiểu phân trung bình, hàm lượng hoạt chất và hiệu suất

nang hóa giữa 3 lô ở mỗi thời điểm cho thấy các giá trị trung bình không khác nhau.

Giá trị p so sánh sự giống hay khác nhau của các giá trị kích thước trung bình ở

tháng 0 đến tháng thứ 6 được trình bày trong Bảng 3.50.

Bảng 3.50 Giá trị p so sánh kích thước của hệ tiểu phân nano ART theo thời gian

bảo quản với tháng 0 ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

3 0,730 4 0,529 5 0,000 6 0,000 Tháng Giá trị p

120

Các thông số kích thước và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART được

trình bày cụ thể trong Bảng 3.51.

Bảng 3.51 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH

Tính chất

0 58 - 339

Tháng 3 58 – 339

4 58 – 389

5 58 - 445

6 58 – 445

Lô NC1 Dãy phân bố

KTTP TB (nm)

115,3 ± 2,67

115,2 ± 1,77

118,9 2,62

126,2 ± 1,88

134,2 ± 6,95

d10 (nm)

78,1 0,92

79,1 1,21

80,1 0,36

79,0 0,69

79,6 0,55

d90 (nm)

165,2 ± 4,05

163,6 ± 1,87

169,8 6,17

185,6 ± 4,25

206,8 ± 15,90

HLHC (%)

99,50 ± 0,58

98,45 ± 0,65

95,41 1,30

93,30 ± 0,90

90,90 ± 0,58

HSNH (%)

97,45 ± 0,05

97,39 ± 0,04

96,69 0,04

95,79 ± 0,08

94,68 ± 0,10

58 – 339

58 – 389

58 – 445

NC2 Dãy phân bố

KTTP TB (nm)

116,3 ± 3,39

112,6 ± 3,50

115,6 2,84

123,6 ± 4,25

133,1 ± 3,80

d10 (nm)

78,1 0,58

78,0 2,28

78,4 2,33

78,1 1,41

79,8 0,76

d90 (nm)

165,6 ± 8,32

160,2 ± 3,54

166,2 1,76

185,0 ± 4,90

203,8 ± 8,14

HLHC (%)

HSNH (%)

99,86 ± 0,36 97,43 ± 0,05 58 - 339

98,40 ± 1,02 97,39 ± 0,03 58 – 339

95,98 0,88 96,83 0,06 58 – 389

94,18 ± 0,93 95,97 ± 0,03 58 – 445

89,27 ± 1,06 94,54 ± 0,08 58 – 445

NC3 Dãy phân bố

KTTP TB (nm)

114,9 ± 4,15

114,2 ± 2,93

117,8 1,07

125,6 ± 6,03

130,3 ± 2,10

d10 (nm)

79,4 1,89

78,7 1,65

78,0 0,06

79,7 0,58

79,9 0,50

d90 (nm)

162,3 ± 5,04

162,3 ± 4,51

172,0 2,98

186,7 ± 14,3

197,2 ± 4,43

HLHC (%)

HSNH (%)

99,48 ± 0,73 97,48 ± 0,04

98,51 ± 0,89 97,41 ± 0,04

95,87 1,57 96,78 0,06

93,43 ± 0,69 95,86 ± 0,08

89,62 ± 1,22 94,47 ± 0,08

121

Hình ảnh từ TEM cho thấy, ở tháng thứ 4, tiểu phân nano ART có hình cầu, kích

thước khá đồng đều và nằm trong khoảng 58 – 339 nm tương tự tiểu phân ở tháng 0

(Hình 3.9) (phụ lục 3.11).

Hình 3.9 Hình ảnh tiểu phân nano ART sau 4 tháng bảo quản ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5%

RH (x 30.000)

Dựa vào kết quả đánh giá độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ±

5% RH (Bảng 3.51), nhận xét:

Dãy phân bố kích cỡ tiểu phân bắt đầu mở rộng ở tháng thứ 4 (58 – 389

nm) (phụ lục 3.20 – 3.21).

Kích thước tiểu phân nano ART không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê từ

tháng 0 đến 4 (p > 0,05), khác nhau đạt ý nghĩa thống kê ở tháng thứ 5 và

6 (p < 0,05).

Như vậy, ở điều kiện 6 ± 2 oC, hệ tiểu phân nano ART ổn định hơn so với điều kiện

30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH. Khi được bảo quản ở 6 ± 2 oC, hệ tiểu phân nano ART vẫn

ổn định sau 6 tháng khảo sát.

122

3.4. Kết quả đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ

tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm P. berghei

3.4.1 Mật độ KST trong máu chuột gây nhiễm P. berghei

Kết quả đánh giá mật độ KST trên chuột nhiễm P.berghei được trình bày trong

Bảng 3.52.

Bảng 3.52 Mật độ KST (KST/vi trường) của lô chứng âm và các lô điều trị

Ngày Lô 1

Lô 3

Lô 4

Lô 5

Lô 6

Lô 7

Lô 8

Lô 9

Lô 2

1

2,2 ± 1,0

1,8 ± 0,8

2,1 ± 0,6

2,1 ± 1,0

2,5 ± 0,5

2,4 ± 0,5

2,0 ± 0,8

2,5 ± 0,7

2,8 ± 0,8

2

1,5 ± 0,7

2,2 ± 0,6

1,5 ± 1,3

1,8 ± 0,8

1,8 ± 0,5

1,4 ± 0,5*

1,3 ± 0,9*

0,9 ± 0,6*

0,2 ± 0,4*

3

0,6 ± 0,5*

2,9 ± 0,7

0,4 ± 0,5*

0,7 ± 0,7*

0,7 ± 0,5*

0,3 ± 0,5*

0,1 ± 0,3*

4

0,3 ± 0,5*

2,8 ± 0,6

0,1 ± 0,3*

0,2 ± 0,3*

0,1 ± 0,3*

0,1 ± 0,0*

0,0 ± 0,0*

5

0,0 ± 0,0*

3,1 ± 0,6

0,2 ± 0,4*

0,2 ± 0,0*

0,0 ± 0,0*

6

0,0 ± 0,0*

2,5 ± 0,5

0,2 ± 0,4*

0,2 ± 0,0*

0,0 ± 0,0*

7

0,0 ± 0,0*

3,5 ± 0,8

0,0 ± 0,0*

9

0,1 ± 0,3*

3,7 ± 0,8

0,1 ± 0,3*

0,0 ± 0,0*

14

0,9 ± 0,7*

4,0 ± 0,8

0,8 ± 0,9*

0,9 ± 0,9*

0,0 ± 0,0*

0,3 ± 0,5*

0,1 ± 0,3*

21

0,8 ± 0,9*

4,8 ± 0,4

0,8 ± 0,9*

1,3 ± 1,9*

0,5 ± 1,8*

1,9 ± 1,8*

0,8 ± 0,9*

1,2 ± 1,3*

0,7 ± 0,8*

28

1,3 ± 1,3*

5,0 ± 0,0

1,3 ± 1,4*

2,0 ± 2,2*

1,4 ± 2,2*

2,1 ± 2,2*

1,5 ± 2,1*

1,7 ± 2,3*

0,7 ± 0,9*

35

2,6 ± 2,5*

5,0 ± 0,0

1,9 ± 2,1*

1,6 ± 2,3*

1,8 ± 2,3*

2,9 ± 2,3*

2,4 ± 2,3*

2,1 ± 2,5*

1,9 ± 2,2*

*: Sự khác biệt giữa lô điều trị và lô chứng âm đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

123

Theo Bảng 3.52, mật độ KST trong máu giữa các lô điều trị bằng ART và lô chứng

âm có sự khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) ở hầu hết các ngày khảo sát, trừ

ngày 1 và 2 (phụ lục 4.10 – 4.11). Mật độ KST trong máu giữa lô điều trị bằng hệ

tiểu phân nano ART với liều 100 mg/kg (lô 6), 150 mg/kg (lô 7), 170 mg/kg (lô 8),

190 mg/kg (lô 9) và lô chứng âm có sự khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05),

trừ ngày 1 (phụ lục 4.10 – 4.11). Như vậy, bắt đầu từ ngày 2, các lô điều trị bằng hệ

tiểu phân nano ART có mật độ KST khác nhau so với lô chứng âm, chứng tỏ các lô

điều trị này có hiệu lực diệt KST sốt rét. Kết quả thống kê so sánh mật độ KST

trong máu chuột giữa các lô điều trị và lô chứng âm được trình bày trong Bảng 3.53.

Bảng 3.53 Giá trị p đánh giá mật độ KST giữa lô chứng âm và lô điều trị

Giá trị p

0,935

0,721

1,000

0,172

Ngày Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Lô 7 Lô 8 Lô 9

1

0,218

0,029

0,246

0,165 0,010**

2

3

4

5

6

7

9

14

17

21

28

0,033 0,100 0,687 0,035* 0,001*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,001*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,000*** 0,012*** 0,012*** 0,012*** 0,012*

0,012*** 0,012*** 0,012***

0,012*

35

*,**,***: Sự khác biệt giữa lô điều trị và lô chứng âm đạt ý nghĩa thống kê lần lượt

với p < 0,05, p <0,01 và p < 0,001.

3.4.2 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột gây nhiễm P. berghei

Kết quả đánh giá tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột giữa lô chứng âm và các

lô điều trị được trình bày trong Bảng 3.54.

124

Bảng 3.54 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột giữa lô chứng âm và lô điều trị

Ngày theo dõi

1

2

3

4

5

6

7

9

14

17

21

28

35 Lô 1 0,00 ± 43,82 0,00 ± 28,75 0,00 ± 25,44 0,00 ± 22,59 0,00 ± 18,31 0,00 ± 21,08 0,00 ± 24,28 0,00 ± 22,25 0,00 ± 20,41 0,00 ± 34,75 0,00 ± 8,78 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu giữa lô chứng âm và các lô điều trị (%) Lô 5 -38,89 ± 53,99 18,18 ± 35,86 75,86 ± 23,27* 92,86 ± 15,06* 93,55 ± 13,60* 92,00 ± 16,87* 100,00 ± 0,00* 97,30 ± 8,55* 80,00 ± 22,97* 90,70 ± 16,26* 89,58 ± 14,73* 72,00 ± 27,00* 64,00 ± 45,02*

Lô 4 -16,67 ± 55,25 18,18 ± 35,86 75,86 ± 23,27* 96,43 ± 11,29* 93,55 ± 13,60* 92,00 ± 16,87* 100,00 ± 0,00* 97,30 ± 8,55* 80,00 ± 22,97* 81,40 ± 24,02* 72,92 ± 40,55* 60,00 ± 43,20* 68,00 ± 47,33*

Lô 3 -16,67 ± 31,54 31,82 ± 57,70 86,21 ± 17,81* 96,43 ± 11,29* 93,55 ± 13,60* 92,00 ± 16,87* 100,00 ± 0,00* 97,30 ± 8,55* 80,00 ± 22,97* 90,70 ± 16,26* 83,33 ± 19,14* 74,00 ± 28,36* 62,00 ± 43,67*

Lô 6 -33,33 ± 28,69 36,36 ± 23,47* 89,66 ± 16,66* 96,43 ± 11,29* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 0,00* 97,30 ± 8,55* 77,50 ± 21,89* 65,12 ± 33,34* 60,42 ± 37,33* 58,00 ± 44,67* 42,00 ± 45,66*

Lô 7 -11,11 ± 45,36 40,91 ± 43,12* 96,55 ± 10,90* 96,43 ± 11,29* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 97,14 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 79,07 ± 17,16* 83,33 ± 19,14* 70,00 ± 41,37* 52,00 ± 45,41*

Lô 8 -38,89 ± 39,28 59,09 ± 25,80* 96,55 ± 10,90* 96,43 ± 11,29* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 92,50 ± 12,08* 88,37 ± 19,76* 75,00 ± 27,43* 66,00 ± 46,24* 58,00 ± 50,29*

Lô 2 -22,22 ± 57,38 31,82 ± 32,14 79,31 ± 17,81* 89,29 ± 17,25 * 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 97,30 ± 8,55* 77,50 ± 18,45* 86,05 ± 19,61* 83,33 ± 19,14* 74,00 ± 26,75* 48,00 ± 50,95*

Lô 9 -55,56 ± 43,82 90,91 ± 19,17* 96,55 ± 10,90* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 97,50 ± 7,91* 95,35 ± 14,71* 85,42 ± 17,15* 86,00 ± 18,97* 62,00 ± 44,67*

* Sự khác biệt giữa lô điều trị và lô chứng âm đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Theo Bảng 3.54, mật độ KST trong lô chứng âm tăng liên tục. Ngược lại, các lô

điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART với liều 100 mg/kg (lô 6), 150 mg/kg (lô 7),

170 mg/kg (lô 8) và 190 mg/kg (lô 9) bắt đầu giảm mật độ KST từ ngày 2, duy trì

đến ngày 35 và làm giảm mật độ KST trong máu chuột với tỉ lệ rất cao, từ 31% –

100%. Lô ART với liều tương tự (lô 2, 3, 4 và 5) bắt đầu giảm mật độ KST từ ngày

3 và duy trì đến ngày 35. Vào ngày 2 và ngày 3, hệ tiểu phân nano ART với liều

170 mg/kg (lô 8) và 190 mg/kg (lô 9) có tỉ lệ giảm mật độ KST cao hơn các lô ART

có liều tương tự (p < 0,05) (phụ lục 4.12). Điều này cho thấy việc điều trị sốt rét

bằng hệ tiểu phân nano ART là có hiệu quả.

125

3.4.3 Thời gian sống sót của chuột

Thời gian sống sót của chuột (ngày) trong lô chứng âm và các lô điều trị tính đến

ngày thứ 35 được trình bày trong Bảng 3.55.

Bảng 3.55 Thời gian sống sót của chuột lô chứng âm và các lô điều trị (ngày 35)

Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Lô 7 Lô 8 Lô 9

13,4 ± 5,1 31,5 ± 3,7* 32,9 ± 3,4* 30,4 ± 7,5* 32,9 ± 3,4* 28,3 ± 8,2* 30,8 ± 5,9* 30,1 ± 6,6* 32,9 ± 3,4* Thời gian sống sót (ngày)

* Sự khác biệt giữa lô điều trị và lô chứng âm đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Kết quả ở Bảng 3.55 cho thấy thời gian sống sót của chuột trong lô chứng âm chỉ

khoảng 13 ngày. Trong khi đó, lô điều trị bằng ART liều 100 mg/kg, 150 mg/kg,

170 mg/kg và 190 mg/kg có thời gian sống sót lần lượt là 31, 32, 30 và 32 ngày; lô

điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART liều 100 mg/kg, 150 mg/kg, 170 mg/kg và 190

mg/kg lần lượt là 28, 30, 30 và 32 ngày. Thời gian sống sót của các lô điều trị có sự

khác nhau đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm (p < 0,05).

3.4.4 Thời gian sạch KST trong máu chuột

Thời gian sạch KST trong máu chuột (ngày) của các lô thử nghiệm được trình bày

trong Bảng 3.56.

Bảng 3.56 Thời gian sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35)

Liều (mg/kg) Hệ tiểu phân nano ART (ngày) ART (ngày)

3,40 ± 0,70 3,90 ± 1,20 100

3,10 ± 0,88* 4,20 ± 1,48 150

2,80 ± 0,42** 4,60 ± 1,35 170

2,33 ± 0,71*** 4,60 ± 1,17 190

*, **, ***: Sự khác biệt giữa lô điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART và lô chứng

dương ART đạt ý nghĩa thống kê lần lượt với p < 0,05, p < 0,01 và p < 0,001.

126

Theo Bảng 3.56, thời gian sạch KST trong máu của lô điều trị bằng hệ tiểu phân

nano ART liều 100 mg/kg không khác nhau so với lô ART liều tương tự. Tuy nhiên,

liều 150 mg/kg, 170 mg/kg và 190 mg/kg khác nhau đạt ý nghĩa thống kê so với

ART (p < 0,05) (phụ lục 4.13) với số ngày lần lượt là 3,1 ngày (so với 4,2 ngày);

2,80 ngày (so với 4,60 ngày) và 2,33 ngày (so với 4,60 ngày). Điều đó chứng tỏ lô

điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART (lô 7, 8 và 9) có thời gian sạch KST trong máu

nhanh hơn lô ART (lô 3, 4 và 5).

3.4.5 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu chuột

Thời gian duy trì tình trạng sạch KST của các lô điều trị được trình bày ở Bảng 3.57.

Bảng 3.57 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu chuột của các lô điều

trị (ngày 35)

Liều (mg/kg) Hệ tiểu phân nano ART (ngày) ART (ngày)

8,20 ± 3,16 11,70 ± 10,04 100

16,70 ± 10,15 7,20 ± 5,01 150

21,20 ± 12,95* 7,40 ± 5,50 170

24,11 ± 10,12* 11,60 ± 11,82 190

*: Sự khác biệt giữa lô điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART và lô chứng dương

ART đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Theo Bảng 3.57, hệ tiểu phân nano ART liều 100 mg/kg (lô 6), 150 mg/kg (lô 7) có

thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu không khác nhau so với ART (p >

0,05). Tuy nhiên, với liều 170 mg/kg (lô 8) và 190 mg/kg (lô 9), hệ tiểu phân nano

ART có thời gian duy trì khác nhau so với lô ART (p < 0,05) (phụ lục 4.14) với số

ngày lần lượt là 21,20 ngày (so với 7,40 ngày) và 24,11 ngày (so với 11,60 ngày).

Như vậy, hệ tiểu phân nano ART có hiệu lực diệt KST sốt rét P. berghei ở các liều

thử nghiệm và có thời gian sạch KST nhanh hơn (liều 150 mg/kg – lô 7, 170 mg/kg

– lô 8 và 190 mg/kg – lô 9), thời gian duy trì tình trạng sạch KST lâu hơn ART (liều

170 mg/kg – lô 8 và 190 mg/kg – lô 9).

127

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. Tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG) và ART

4.1.1 Tương tác giữa Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG

DSC được ứng dụng để phân tích nhiệt độ nóng chảy và trạng thái kết tinh của lipid

[73]. Theo Zheng M (2013) [161], trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid, DSC có

thể được dùng để đánh giá sự tương tác giữa lipid rắn – lỏng và lipid – hoạt chất

thông qua sự thay đổi nhiệt độ nóng chảy và enthalpy của hỗn hợp so với đơn chất

[161]. Lipid rắn kiểm soát sự giải phóng hoạt chất tốt hơn lipid lỏng, tuy nhiên, đa

số hoạt chất lại dễ tan hơn trong lipid lỏng. Vì vậy, hỗn hợp lipid rắn – lỏng với tỉ lệ

phù hợp sẽ làm tăng phần trăm và hiệu suất nang hóa hoạt chất của hệ tiểu phân

nano. Đó là do sự hỗn hòa của lipid rắn – lỏng làm cấu trúc mạng lipid rắn thay đổi,

chúng liên kết ít chặt chẽ hơn và có nhiều khoảng "trống" để chứa hoạt chất. Dãy

nhiệt độ khảo sát DSC có thể từ – 60 oC đến 350 oC và tốc độ gia nhiệt từ 1 oC đến

10 oC trong một phút [33], [137]. Ngoài ra, nhiễu xạ tia X thường được phối hợp với

DSC trong việc xác định sự tương tác giữa lipid rắn – lipid lỏng và lipid – hoạt chất

thông qua khảo sát sự thay đổi trong cấu trúc mạng tinh thể của lipid rắn [26], [70].

Kết quả từ biểu đồ nhiệt cho thấy nhiệt độ nóng chảy của Compritol® 888 ATO ở

khoảng 72 oC với đỉnh nhọn và hẹp. Trong khi đó, hỗn hợp Compritol® 888 ATO –

LabrafacTM PG có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn và khoảng nóng chảy rộng hơn cũng

như nhiệt độ bắt đầu nóng chảy (onset temperature) thấp hơn. Có thể nói, sự hiện

diện của LabrafacTM PG trong hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG tạo

nên hỗn hợp lipid có cấu trúc linh động hơn, nhờ vậy, có thể giảm tình trạng đẩy

hoạt chất ra khỏi tiểu phân trong quá trình bảo quản [82].

Các tác giả đã đánh giá sự ảnh hưởng của lipid lỏng đến nhiệt độ nóng chảy của hỗn

hợp lipid. Theo Kovacevic A và cộng sự (2011), hiện tượng mở rộng peak hoặc

giảm chiều cao peak là do mẫu khảo sát là một hỗn hợp đồng nhất của lipid lỏng

128

trong lipid rắn làm giảm mức độ kết tinh của lipid rắn. Ngoài ra, sự hiện diện của

lipid lỏng làm cấu trúc của lipid rắn trở nên linh động hơn, vì thế, nhiệt độ nóng

chảy của hỗn hợp lipid thấp hơn so với lipid rắn [74]. Hu FQ và cộng sự (2005) đã

khảo sát tỉ lệ lipid rắn – lỏng trong công thức bào chế NLC và chứng minh sự phối

hợp lipid lỏng làm thay đổi đáng kể năng lượng chuyển pha và nhiệt độ nóng chảy

của lipid rắn [63]. Điều đó cho thấy lipid lỏng là nhân tố chính làm thay đổi năng

lượng chuyển pha và nhiệt độ nóng chảy của hỗn hợp lipid. Thông thường, tỉ lệ

lipid lỏng từ 5% đến 45% tổng lượng lipid là tỉ lệ phù hợp cho pha dầu [67], [127].

4.1.2 Tương tác giữa hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG và ART

Kết quả cho thấy ART có điểm chảy ở khoảng 153 oC với đỉnh rất nhọn và hẹp. Tuy

nhiên, khi được phối hợp vào hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 :

3) với hàm lượng lên đến 100 mg/g lipid cũng không có sự hiện diện của peak ART

trên biểu đồ DSC.

Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Das S và cộng sự (2012). Tác giả

nghiên cứu sự tương tác giữa clotrimazol – Compritol® 888 ATO và sự tương tác

giữa clotrimazol – Compritol® 888 ATO – LabrafacTM CC bằng DSC. Biểu đồ nhiệt

cho thấy không có peak clotrimazol xuất hiện trong các hỗn hợp khảo sát. Theo Das

S, có thể do clotrimazol được hòa tan hoàn toàn hoặc hiện diện ở dạng vô định hình

và được phân tán trong khối lipid [38].

4.2. Công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

4.2.1 Công thức cơ bản của hệ tiểu phân nano ART

4.2.1.1 Tỉ lệ lipid trong công thức cơ bản

Lipid được dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid thường là hỗn hợp rắn – lỏng.

Trong đó, lipid rắn đóng vai trò chính là tạo khung marix, lipid lỏng làm môi trường

hòa tan hoạt chất [26], [63]. Compritol® 888 ATO là lipid rắn có chuỗi carbon dài

được ứng dụng trong dược phẩm với nhiều vai trò khác nhau: Chống dính cho viên

nén, tạo khung kiểm soát sự giải phóng hoạt chất cho viên nén phóng thích kéo dài

129

và đặc biệt là tạo khung matrix trong bào chế tiểu phân nano lipid [16], [66], [70].

Nghiên cứu đã chứng minh rằng quy trình bào chế bằng HPH nhiệt độ cao không

làm thay đổi tính chất hóa học của Compritol® 888 ATO. Compritol® 888 ATO có

hiệu suất nang hóa cao vì có chuỗi hydrocarbon dài và là hỗn hợp của

diacylglycerols (40 – 60%) và các monoacylglycerol (13 – 21%) và triacylglycerol

(21 – 35%) [16].

LabrafacTM PG là lipid lỏng với khung carbon trung bình được dùng làm pha dầu

của hệ tự nhũ hóa nhằm tăng sinh khả dụng của hoạt chất kém tan (đường uống) và

tăng thấm (ngoài da). Trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid [67], [70], LabrafacTM

PG làm tăng độ tan của hoạt chất trong hỗn hợp lipid và giảm tình trạng đẩy hoạt

chất ra khỏi tiểu phân nhờ tăng tính linh động trong cấu trúc của lipid rắn.

Compritol® 888 ATO và LabrafacTM PG đều được chiết xuất từ thực vật đã được

kiểm soát chất lượng chặt chẽ và ứng dụng phổ biến trong bào chế dược phẩm. Hơn

nữa, cả hai lipid đều có thể bị thủy phân và chuyển hóa bởi các enzym trong cơ thể.

ART dễ tan trong LabrafacTM PG và hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM

PG (phụ lục 3.23). Với những ưu điểm này, Compritol® 888 ATO và LabrafacTM

PG được chọn làm tá dược lipid trong thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân

nano ART.

Tỉ lệ lipid trong công thức bào chế hệ tiểu phân nano thường từ 3% đến 20% [52],

[162]. Theo Aditya NP và cộng sự (2010) [18], tiểu phân nano artemether đã được

bào chế thành công bằng phương pháp hydrat hóa màng film biến đổi (modified

thin-film hydration). Trong nghiên cứu này, lipid chiếm 5% và dầu lỏng chiếm 45%

lipid. Sau khi đồng nhất hóa bằng siêu âm, kích thước tiểu phân nhỏ hơn 130 nm.

Ngoài ra, Dwivedi P và cộng sự (2014) đã bào chế tiểu phân SLN chứa arteether có

kích thước trung bình khoảng 110 nm, trong đó lipid chiếm 3% công thức [42]. Đề

tài đã chọn lipid 10% vì khi đó, nhũ tương đạt yêu cầu về thể chất và phù hợp với

điều kiện thiết bị nghiên cứu. Tỉ lệ này cao hơn so với các nghiên cứu trước đó. Như

vậy, với tỉ lệ lipid cao hơn, hệ tiểu phân nano có triển vọng chứa lượng hoạt chất

nhiều hơn. Điều này rất cần thiết để nâng cao phần trăm và hiệu suất nang hóa.

130

4.2.1.2 Chất diện hoạt của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Trong bào chế hệ tiểu phân nano, chất diện hoạt có vai trò hình thành nhũ tương và

ổn định hệ tiểu phân trong thời gian bảo quản [59]. Loại và lượng chất diện hoạt có

ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tạo nhũ tương và kích thước tiểu phân. Chất diện

hoạt không ion hóa thường được lựa chọn để ổn định hệ tiểu phân nano vì chúng ít

gây tương kỵ với hoạt chất và ít phụ thuộc pH [29], [37]. Qua khảo sát, các công

thức có 1,5% Gelucire® 50/13 tạo nhũ tương ổn định nhưng ở tỉ lệ thấp hoặc cao

hơn thì nhũ tương bị tách lớp. Do Gelucire® 50/13 có khả năng tự nhũ hóa, với tỉ lệ

nhất định, tác dụng này được phát huy tối đa kết hợp với acid béo trong lipid tạo

thành lớp màng kép giúp nhũ tương dễ hình thành và ổn định hơn.

Với 1,5% Gelucire® 50/13, tiểu phân thu được khá to. Khi phối hợp với

phosphatidylcholin thì tiểu phân nhỏ hơn, nhất là công thức có tỉ lệ Gelucire® –

phosphatidylcholin (2 : 1) (p < 0,05). Phối hợp polysorbat 80 với Gelucire® 50/13

hay phosphatidylcholin, dù kích thước của tiểu phân không khác nhau về mặt thống

kê (p > 0,05) nhưng tỉ lệ tiểu phân ≤ 445 nm tăng lên gấp (gần) 2 lần. Mẫu khảo sát

với đơn chất diện hoạt là polysorbat 80 làm giảm đáng kể kích thước tiểu phân (p <

0,05), tỉ lệ tiểu phân < 669 nm tăng lên khoảng 82% (gấp đôi các mẫu trước đó) dù

dãy phân bố còn rộng. Điều này gợi ý rằng polysorbat 80 là chất diện hoạt có triển

vọng cải thiện kích thước của tiểu phân nano ART.

Theo Attama AA và cộng sự (2007), polysorbat 80 1% có thể ổn định hệ tiểu phân

lipid bào chế từ dầu cacao và phospholipid sau 3 tháng bảo quản. Điều đó chứng tỏ

polysorbat 80 có hiệu quả nhũ hóa cao ngay cả khi được dùng với nồng độ thấp

[27]. Trong quá trình bào chế nhũ tương, các giọt lipid mới hình thành cần được che

phủ bởi chất nhũ hóa để tránh bị kết tụ trở lại. Kích thước giọt càng nhỏ, diện tích

bề mặt càng lớn thì lượng chất diện hoạt cần dùng càng nhiều. Đây là một trở ngại

vì với nồng độ cao, chất diện hoạt gây kích ứng đường tiêu hóa. Ngoài ra, việc dùng

chất diện hoạt thân nước với tỉ lệ cao kết hợp bào chế ở nhiệt độ cao có thể tăng tạm

thời độ tan của hoạt chất trong pha nước. Khi nhiệt độ giảm dần, hiện tượng tái

131

phân bố hoạt chất giữa pha nước và pha dầu xảy ra. Nếu lõi lipid đã bão hòa, hoạt

chất ở lại pha nước hoặc bám dính trên bề mặt tiểu phân, tăng nguy cơ bám dính và

kết tụ tiểu phân. Vì vậy, chất diện hoạt cần được dùng ở nồng độ thấp nhất có thể

nhưng vẫn đủ hiệu quả để ổn định tiểu phân mới hình thành.

Có thể dùng một hoặc hỗn hợp chất diện hoạt. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chứng

minh rằng, hỗn hợp chất diện hoạt có tác dụng nhũ hóa tốt hơn đơn chất [26], [58].

Mẫu bào chế dùng hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – SimulsolTM 4000 P có cải

thiện đáng kể, thể hiện qua các mẫu 28, 29 và 30:

 Thu hẹp dãy phân bố và giảm kích thước tiểu phân trung bình còn 500 nm.

 Tăng tỉ lệ tiểu phân có kích thước ≤ 445 nm lên khoảng 75%, gần gấp 2 lần

mẫu chỉ dùng polysorbat 80 và gấp 7 lần so với mẫu dùng Gelucire® 50/13.

Như vậy, sự phối hợp chất diện hoạt đem lại hiệu quả nhũ hóa cao hơn, chứng tỏ

polysorbat 80 – SimulsolTM 4000 P là hỗn hợp chất diện hoạt phù hợp cho pha dầu

chứa hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG. Han F và cộng sự (2007)

nghiên cứu độ ổn định của hệ NLC tạo thành từ các chất diện hoạt khác nhau. Tác

giả đã kết luận rằng hệ tiểu phân NLC tạo thành từ hỗn hợp tween 80 – poloxamer

188 ổn định gần 3 tháng. Trong khi đó, các mẫu bào chế dùng đơn chất diện hoạt

chỉ có thể ổn định tối đa là 1 tuần dù tất cả các công thức có cùng lượng chất diện

hoạt (5%) [58]. So với nghiên cứu của Han F và cộng sự, hệ tiểu phân nano ART có

tỉ lệ hỗn hợp chất diện hoạt thấp hơn nhưng hệ vẫn ổn định đến 6 tháng.

4.2.2 Kỹ thuật bào chế hệ tiểu phân nano ART

Trong các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid, đồng nhất hóa bằng HPH

là phương pháp được áp dụng phổ biến nhất [134], [143]. Tỉ lệ lipid thường từ 5% –

10%, thậm chí 60% cũng có thể đồng nhất hóa bằng HPH [27], [104]. Theo Müller

RH và cộng sự (2002) [99], HPH là giải pháp tăng tỉ lệ lipid trong công thức bào

chế lên đến 80%. Đây là ưu điểm nếu cần chế phẩm dạng cream hoặc đông khô vì

tiêu tốn ít năng lượng cho quá trình loại nước. Thông thường, áp suất từ 500 bar đến

1.500 bar là đủ hiệu quả để thu được tiểu phân có kích thước nm [50], [104].

132

Đề tài đã ứng dụng phương pháp đồng nhất hóa bằng HPH nhiệt độ cao để bào chế

hệ tiểu phân nano ART. Kết quả cho thấy HPH làm giảm và đồng nhất hóa kích

thước tiểu phân rất hiệu quả. Điều đó được chứng minh qua kết quả thu được sau

khi đồng nhất nhất hóa bằng HPH ở 500 bar 10 chu kỳ:

 Kích thước tiểu phân trung bình của mẫu khảo sát khoảng 158 nm, nhỏ

hơn gần 3 lần kích thước của mẫu chưa đồng nhất hóa bằng HPH.

 Có 98% tiểu phân ≤ 445 nm, nhiều hơn 20% so với mẫu chưa qua HPH.

 Dãy phân bố kích thước hẹp hơn.

Dù chỉ đồng nhất hóa ở 500 bar 10 chu kỳ nhưng kích thước tiểu phân đã được cải

thiện đáng kể. Dù vậy, vẫn còn khoảng 2% tiểu phân có kích thước lớn hơn 445 nm.

Như vậy, áp suất 500 bar 10 chu kỳ chưa đủ để thu được tiểu phân có kích thước

nhỏ và đồng đều. Để giảm kích thước, có thể áp dụng một số phương pháp như tăng

áp suất đồng nhất hóa, tăng số chu kỳ đồng nhất hóa hoặc tăng nhiệt độ đồng nhất

hóa. Borgia SL và cộng sự (2005) đã bào chế hệ tiểu phân SLN và NLC từ

Compritol® 888 ATO và Miglyol® bằng phương pháp đồng nhất hóa HPH ở 500 bar

và 85 oC. Kích thước tiểu phân thu được khoảng 200 nm. Quá trình đồng nhất hóa

diễn ra ở áp suất thấp, tuy nhiên, nhiệt độ sử dụng lại rất cao. Tác giả đã kết hợp

giữa lực nén do áp suất và lực va chạm do nhiệt độ cao để giảm kích thước tiểu

phân. Tuy nhiên, nhiệt độ cao có thể là một điều bất lợi nếu máy HPH không có bộ

phận ổn định nhiệt. Quá trình đồng nhất hóa thường có hiệu quả sau ít nhất 3 chu

kỳ. Với lượng mẫu lớn, nếu qua nhiều chu kỳ thì thời gian tiếp xúc với nhiệt sẽ kéo

dài làm giảm chất lượng sản phẩm. Do đó, giải pháp tăng áp suất được lựa chọn để

giảm kích thước tiểu phân ART. Khi tăng áp suất lên 800 bar, một lần nữa kích

thước tiểu phân có cải thiện rõ rệt. Tất cả các thông số kích thước thu được đều có

giá trị nhỏ hơn so với mẫu đồng nhất hóa ở 500 bar:

 Kích thước tiểu phân trung bình khoảng 113 nm, có 99,9% tiểu phân ≤ 296

nm.

 Dãy phân bố kích thước từ 58 – 339 nm.

133

Như vậy, áp suất 800 bar đủ hiệu quả để đồng nhất hóa kích thước tiểu phân nano

ART. Áp suất 1.000 bar cũng có hiệu quả tương tự. Tuy nhiên, ở 1.100 bar, kích

thước tiểu phân có xu hướng tăng lên trở lại. Khi áp suất tăng, tốc độ vận chuyển

của dòng chất lỏng tăng, nhiệt độ của khe đồng nhất hóa sẽ tăng và độ nhớt của mẫu

giảm dẫn đến kích thước tiểu phân giảm. Khi hệ cân bằng, nếu tiếp tục tăng áp suất

hoặc số chu kỳ thì kích thước tiểu phân có thể tăng vì chúng bị kết tụ [50], [113].

Sự kết tụ xảy ra do quá trình va chạm giữa các giọt nano mới tạo thành. Khi áp suất

và số chu kỳ tăng, lực tác động vào tiểu phân tăng theo, kích thước của chúng giảm

đi nhanh chóng. Tuy nhiên, nếu những bề mặt mới tạo thành này va chạm vào nhau

trước khi chất diện hoạt kịp hấp phụ lên bề mặt của chúng thì sự kết tụ sẽ nhanh

chóng diễn ra. Việc bao phủ kém hiệu quả của chất diện hoạt cũng là lý do khiến

kích thước tiểu phân không giảm khi áp suất và chu kỳ đồng nhất hóa cao. Trường

hợp này xảy ra khi lượng chất nhũ hóa không đủ so với diện tích bề mặt quá lớn của

các giọt lipid (vì kích thước càng nhỏ diện tích bề mặt càng lớn).

Do đó, cần xác định áp suất và số chu kỳ đồng nhất hóa thấp nhất nhưng vẫn thu

được tiểu phân có kích thước nm giúp giảm thời gian bào chế, giảm nhu cầu năng

lượng và tránh hoạt chất tiếp xúc quá lâu với nhiệt.

4.2.3 Hàm lượng ART trong công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART

Kết quả khảo sát hàm lượng ART cho thấy tiểu phân thu được có một số tính chất

giống nhau và khác nhau. Trong đó, đáng lưu ý nhất là sự khác nhau về kích thước

tiểu phân và hiệu suất nang hóa. Tiểu phân chứa 10% ART có kích thước lớn hơn

so với mẫu không chứa ART và các mẫu còn lại (p < 0,05). Kết quả cho thấy, hiệu

suất nang hóa tăng theo hàm lượng ART. Tuy nhiên, hiệu suất giảm đi rõ rệt ở mẫu

chứa 9% và tiếp tục giảm ở mẫu chứa 10% ART.

Nghiên cứu đã chứng minh rằng hiệu suất nang hóa có liên quan chặt chẽ đến tỉ lệ

hoạt chất – lipid. Hiệu suất tăng theo tỉ lệ hoạt chất – lipid đến một giá trị cân bằng.

Nếu tiếp tục tăng lượng hoạt chất, hiệu suất có thể không tăng được nữa, thậm chí

giảm đi [143]. Vì lipid chỉ có thể chứa một lượng hoạt chất xác định, khi vượt quá

134

khả năng chứa, hoạt chất dễ bị đẩy ra tiểu phân và bám trên bề mặt tiểu phân hoặc

khuếch tán ra môi trường. Hiệu suất nang hóa giảm, tỉ lệ hoạt chất tự do trong môi

trường tăng. Lúc này, hoạt chất có thể hòa tan trong dung dịch hoặc ở dạng tinh thể

nano hoặc là đám kết dính trên bề mặt tiểu phân. Do không được bảo vệ bởi lớp áo

lipid, hoặc do tác động từ điều kiện môi trường, chúng có thể bị sát nhập với nhau,

kích thước tăng dần lên dẫn đến kích thước của tiểu phân cũng tăng theo và mất dần

sự ổn định của hệ tiểu phân. Điều này có thể lý giải cho sự gia tăng kích thước của

mẫu chứa 10% ART so với các mẫu còn lại. Vì vậy, chọn tỉ lệ ART 8% để phối hợp

vào tiểu phân nhằm tối ưu hiệu suất nang hóa đồng thời thu được tiểu phân có kích

thước nanomet. Phân tích HPLC đã cho thấy hiệu suất nang hóa của tiểu phân nano

ART (97,45%) cao hơn rất nhiều so với hiệu suất nang hóa arteether (69%) trong

nghiên cứu của Dwivedi và cộng sự (2014) [42].

4.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước của tiểu phân nano ART

Kết quả khảo sát cho thấy lipid, chất diện hoạt và quá trình đồng nhất hóa đều có

ảnh hưởng đến kích thước và các tính chất khác của tiểu phân nano ART. Để thu

được tiểu phân có kích thước đạt yêu cầu và ổn định thì trước hết, nhũ tương đầu

vào cần có kích thước giọt dầu phù hợp. Điều này cũng đã được các tác giả khác

công bố [79], [116]. Ngoài việc chọn nhũ tương đầu vào có kích thước tiểu phân

nhỏ nhất (thông qua khảo sát tỉ lệ lipid và chất diện hoạt), cần tiến hành xác định áp

suất và số chu kỳ tốt nhất cho quá trình bào chế hệ tiểu phân nano ART. Tiểu phân

nano thường được bào chế ở áp suất từ 500 bar đến 1.500 bar với 3 đến 20 chu kỳ

đồng nhất hóa [52], [137]. Kết quả thu được từ quá trình khảo sát phương pháp

HPH trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART cũng đã chứng minh điều đó.

Dựa vào kết quả thực nghiệm theo mô hình yếu tố đầy đủ, giá trị b1 và b2 lần lượt là

– 9,67 và – 5,38, cả hai hệ số đều mang dấu âm, chứng tỏ áp suất và số chu kỳ đồng

nhất hóa có sự tương quan nghịch với kích thước tiểu phân. Tăng áp suất và chu kỳ

làm giảm kích thước và ngược lại. Điều này có thể thấy rõ qua thí nghiệm ở áp suất

500 bar, 700 bar so với 800 bar và 1.000 bar. Ở 800 bar và 1.000 bar tiểu phân đều

135

có kích thước nhỏ và đồng nhất hơn so với 500 bar và 700 bar. Tuy nhiên, khi đã

đạt trạng thái cân bằng, nếu tiếp tục tăng áp suất và chu kỳ thì quá trình đồng nhất

hóa không hiệu quả [74], [87]. Cụ thể, khi tăng áp suất lên 1.100 bar thì kích thước

tiểu phân tăng, có thể áp suất quá cao và thời gian tiếp xúc với nhiệt dài làm tăng

năng lượng động học của các tiểu phân kích thước nhỏ [130], chúng va chạm vào

nhau khi bề mặt chưa được bao phủ hiệu quả nên kết tụ trở lại. Trong khi đó, áp

suất từ 800 bar (5, 10 chu kỳ) đến 1.000 bar (3 đến 10 chu kỳ) đều cho kích thước

tiểu phân khoảng 115 nm với dãy phân bố từ 58 – 339 nm, cụ thể (Bảng 4.1):

Bảng 4.1 Kích thước của tiểu phân nano ART ở các áp suất và chu kỳ khác nhau

1.000 1.000

118,7 113,5 115,6 116,2

800 5 800 10 850 6 900 7

950 8 113,9 9 112,6 10 113,3 Áp suất Chu kỳ KTTPTB (nm)

Điều kiện thí nghiệm có áp suất và số chu kỳ nhỏ nhất sẽ được chọn vì ngoài yếu tố

chất lượng, hiệu quả của quá trình đồng nhất hóa thì vấn đề tiết kiệm thời gian và

năng lượng cũng cần được ưu tiên. Vì vậy, 800 bar 5 chu kỳ là điều kiện phù hợp

nhất cho quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART.

Kết quả này phù hợp với công bố của Sun và cộng sự (2013). Tác giả bào chế tiểu

phân SLN chứa curcumin với thông số HPH tối ưu là 800 bar và 6 chu kỳ, kích

thước tiểu phân khoảng 153 nm [130]. Kích thước này lớn hơn so với tiểu phân

nano ART. Ngoài ra, Vivek K và cộng sự (2007) đã xác định được điều kiện tối ưu

nhất để đồng nhất hóa tiểu phân SLN chứa olanzapin là ở 10.000 psi (khoảng 700

bar) và 3 chu kỳ. Với áp suất cao hơn, kích thước không giảm đi và tăng số chu kỳ

lên thì dãy phân bố kích thước mở rộng. Ở điều kiện này tiểu phân olanzapin có

kích thước lớn hơn (190 nm) tiểu phân nano ART (115 nm) [140].

Một số yếu tố khác cũng cần được lưu ý trong quá trình bào chế. Trước hết là giai

đoạn khuấy tốc độ cao để tạo nhũ tương và sơ bộ giảm kích thước giọt dầu. Quá

trình này được thực hiện ngay trước khi tiến hành HPH. Lực cắt trong quá trình

khuấy không chỉ có vai trò phân tán pha dầu vào pha nước mà còn làm giảm kích

136

thước tiểu phân đáng kể [130]. Nếu sản phẩm đầu vào có kích thước không phù hợp

(do thành phần công thức không phù hợp hoặc khuấy tốc độ cao không hiệu quả) thì

kích thước của sản phẩm đầu ra của HPH sẽ ít có khả năng đạt yêu cầu. Sự khác

nhau quá lớn về kích thước sẽ dẫn đến chênh lệch về nồng độ chất nhũ hóa cần thiết

để duy trì độ ổn định của hệ. Kích thước tiểu phân giảm đi nhưng trạng thái này chỉ

có thể được duy trì khi bề mặt tiểu phân được bao phủ hiệu quả bởi chất nhũ hóa.

Ngược lại, sự kết tụ sẽ xảy ra và hệ bị mất ổn định [50], [74].

Kiểm soát nhiệt độ trong quá trình bào chế cũng là vấn đề quan trọng. Nhiệt độ cần

đủ cao để hỗn hợp lipid luôn ở trạng thái lỏng và pha dầu đồng nhất nhằm đảm bảo

hiệu quả đồng nhất hóa. Nếu nhiệt độ thấp hơn điểm chảy của lipid, lipid rắn có

nguy cơ hóa rắn trở lại trong khi quá trình bào chế vẫn chưa hoàn tất. Ngược lại,

nhũ tương sẽ được cung cấp năng lượng không cần thiết. Cả hai trường hợp đều làm

giảm chất lượng của hệ tiểu phân, có thể là tăng kích thước, giảm hiệu suất nang

hóa hoặc giảm độ ổn định của hệ trong quá trình bảo quản. Chính vì vậy, trong

nghiên cứu bào chế SLN, NLC với pha dầu là lipid rắn có điểm chảy cao, vẫn có thể

tiến hành đồng nhất hóa ở áp suất rất thấp và qua rất ít chu kỳ (500 bar, 3 chu kỳ)

nhưng nhiệt độ đồng nhất hóa phải từ 75 oC – 90 oC hoặc cao hơn điểm chảy của

lipid rắn từ 5 oC – 10 oC [52], [66].

4.3. Tính chất của hệ tiểu phân nano ART

4.3.1 Kích thước và dãy phân bố kích thước tiểu phân nano ART

Kết quả từ nhiễu xạ laser cho biết thông tin về kích thước tiểu phân trong mẫu khảo

sát. Vì vậy, kết quả này mang tính tổng thể, chứa các thông tin về dãy phân bố kích

cỡ, tỉ lệ phần trăm của từng nhóm kích thước và kích thước trung bình của tiểu

phân. Tuy nhiên, phương pháp này không cung cấp thông tin về hình ảnh của tiểu

phân. Vì vậy, bên cạnh đánh giá kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser, đề tài đã

phối hợp khảo sát hình ảnh tiểu phân bằng TEM. TEM cho biết thông tin về hình

dạng, mức độ đồng đều và kích thước của tiểu phân. Ngoài ra, TEM cũng phát hiện

sự hiện diện của một dạng cấu trúc khác (liposome, hoạt chất tự do,...) trong hệ

137

phân tán nano. Ngoài nhiệm vụ cung cấp thông tin về hình ảnh tiểu phân quan tâm

và các dạng tiểu phân khác, TEM chính là công cụ hỗ trợ xác định kích thước [90],

[160]. Kết quả thu được từ nhiễu xạ laser cho thấy kích thước trung bình của tiểu

phân nano ART khoảng 115 nm với dãy phân bố từ 58 – 339 nm. Giá trị thu được

từ TEM cho biết kích thước tiểu phân nằm trong vùng 100 nm. Như vậy, kết quả

của hai phương pháp có sự tương đồng và đáng tin cậy. Ngoài ra, hình ảnh từ TEM

chứng tỏ các tiểu phân có hình dạng đồng nhất và không có sự hiện diện của các

cấu trúc khác trong mẫu khảo sát.

Để có thông tin đầy đủ hơn về cấu trúc của hệ phân tán và hình dạng tiểu phân, kỹ

thuật chụp ảnh tiểu phân bằng KHV điện tử thường kết hợp với kỹ thuật đông khô

(freeze fracturing). Mẫu sẽ được làm lạnh đột ngột để đảm bảo tất cả chất lỏng, kể

cả môi trường phân tán đều hóa rắn ở dạng vô định hình [120]. Đây là phương pháp

quan sát hình ảnh tiểu phân trung thực nhất vì chúng không bị tách khỏi hệ phân tán

do quá trình làm khô mẫu. Hình ảnh thu được không chỉ cho biết các thông tin về

kích thước, hình dạng mà còn có thông tin về cấu trúc bên trong của tiểu phân. Ví

dụ, bằng cryoTEM các tác giả đã chứng minh tiểu phân lipid rắn triglycerid thường

có cạnh sắc nhọn với lớp bên trong rất rõ nét, do sự hóa rắn của lipid rắn. Ngược lại,

giọt nhũ tương hình tròn, lõi trong suốt, phản ánh matrix lỏng [67], [101].

4.3.2 Thế zêta của hệ tiểu phân nano ART

Thế zêta phản ánh lực đẩy giữa các tiểu phân cùng dấu trong hệ phân tán. Lực đẩy

này ngăn cản sự kết tụ giữa chúng. Đối với hệ tiểu phân ổn định nhờ lực đẩy tĩnh

điện, giá trị thế zêta < |30| mV, tối ưu là > |60| mV cho dự đoán hệ tiểu phân có thể

ổn định về phương diện vật lý trong thời gian bảo quản. Thế zêta giữa |5| mV và |15|

mV, hệ bị kết bông giới hạn; giữa |5| mV và |3| mV hệ kết bông tối đa. Tuy nhiên,

nguyên tắc này không phù hợp đối với hệ tiểu phân ổn định nhờ hiệu ứng không

gian vì khi đó các nhóm tạo hiệu ứng sẽ làm giảm thế zêta của hệ [60], [132].

Thế zêta của hệ tiểu phân nano ART khoảng – 15 mV nhưng hệ vẫn ổn định trong

khoảng thời gian dài. Sự che phủ bởi lớp chất diện hoạt đã làm giảm thế zêta của hệ

138

tiểu phân. Vì vậy, trong trường hợp này, dù trị tuyệt đối của thế zêta thấp hơn 30

mV nhưng hệ tiểu phân vẫn ổn định [38], [154]. Có thể bề mặt tiểu phân được che

phủ bởi các nhóm PEG (polyethylen glycol), hiện diện trong chất diện hoạt tạo nên

sự ngăn cách không gian giữa các tiểu phân và ngăn chúng kết tụ trở lại, nhờ vậy,

hệ ổn định hơn. Das S và cộng sự (2012) [38] đã bào chế hệ tiểu phân SLN và NLC

từ các lipid và chất diện hoạt không ion hóa khác nhau. Kết quả thu được các hệ

phân tán có trị tuyệt đối của thế zêta thấp hơn 20 mV và bền trong thời gian khảo

sát là 3 tháng. Kết quả này khá tương đồng với kết quả của đề tài nghiên cứu. Tuy

nhiên, hệ tiểu phân nano ART có độ ổn định dài hơn (6 tháng).

4.3.3 Hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART

Ngoài kích thước, hiệu suất nang hóa là tiêu chí quan trọng nhằm đánh giá tiềm

năng ứng dụng của hệ tiểu phân nano. Yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất

nang hóa là độ tan của hoạt chất trong lipid nóng chảy và tính chất của lipid. Hoạt

chất cần phải tan tốt trong lipid nóng chảy. Nếu pha dầu là hỗn hợp lipid rắn – lỏng

thì mức độ liên kết trong cấu trúc của lipid rắn sẽ lỏng lẻo, tiểu phân có nhiều

“không gian” để chứa hoạt chất hơn [122]. Vì vậy, chọn hỗn hợp lipid rắn – lỏng

(Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) có khả năng hòa tan ART là biện pháp

nâng cao hiệu suất nang hóa. Hiệu suất nang hóa cao (khoảng 97%) có nhiều ưu

điểm: Hoạt chất được bảo vệ, hệ tiểu phân ổn định hơn do hạn chế sự hiện diện của

hoạt chất tự do trong môi trường.

Dwivedi P và cộng sự (2014) dùng phương pháp sắc ký cột (Sephadex G50) để đánh

giá hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân SLN chứa arteether. Kết quả cho thấy tiểu

phân có hiệu suất nang hóa khoảng 69% [42]. Đề tài xác định hiệu suất nang hóa

ART bằng phương pháp siêu lọc. Đây là phương pháp được ứng dụng phổ biến

trong nghiên cứu đánh giá hiệu suất nang hóa của tiểu phân nano vì kết quả chính

xác và có độ lặp lại cao [18], [162]. Kết quả thu được hiệu suất nang hóa ART

khoảng 97% do ART dễ tan trong LabracTM PG và hỗn hợp lipid nóng chảy, thực tế

không tan trong nước.

139

4.3.4 Sự phóng thích hoạt chất của hệ tiểu phân nano ART

Trong mô hình túi thẩm tách, hoạt chất được khuếch tán qua màng bán thấm để vào

môi trường thử nghiệm. Nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt chất tan trong lipid

nóng chảy thường được chứa trong tiểu phân. Vì vậy, trước khi khuếch tán qua

màng, hoạt chất cần được phóng thích ra khỏi tiểu phân [42], [143].

Kết quả cho thấy ART khuếch tán chậm và lượng khuếch tán tăng dần sau thời gian

khảo sát, có thể ART được chứa trong tiểu phân. Vì vậy, lượng nhỏ ART hòa tan

trong môi trường phân tán sẽ nhanh chóng khuếch tán qua màng, sau đó, ART

khuếch tán dần từ trong tiểu phân và đi qua màng bán thấm để vào môi trường thử

nghiệm. Trong khi đó, ART nguyên liệu khuếch tán rất nhanh vào môi trường trong

giờ đầu tiên. Ở những giờ tiếp theo, lượng khuếch tán tiếp tục tăng lên cao. Hiện

tượng này không xảy ra với tiểu phân nano ART. Có thể ART nguyên liệu ở dạng

tự do nên nhanh chóng khuếch tán qua màng vào môi trường thử nghiệm. Ngược

lại, khi được phân tán trong lipid, ART cần có thời gian khuếch tán ra khỏi tiểu

phân. Ngoài ra, vì được chứa trong tiểu phân nên ART được bảo vệ, hạn chế tiếp xúc

với môi trường bảo quản và dịch sinh lý, nhất là dịch tiêu hóa. Điều này rất có ý

nghĩa đối với hoạt chất kém bền như ART.

Trong một nghiên cứu của Aditya NP và cộng sự (2010), sự khuếch tán hoạt chất

được khảo sát trong 25 giờ với tổng lượng hoạt chất khuếch tán khoảng 275 mg

(tương đương 55% hàm lượng công thức) [18]. Như vậy, tương tự hệ tiểu phân

nano ART, các tác giả này đã chứng minh quá trình phóng thích hoạt chất của hệ

tiểu phân nano diễn ra chậm và tăng dần theo thời gian.

4.3.5 Tính chất của hệ tiểu phân nano ART với cỡ lô bào chế là 1.000 g

Theo kết quả phân tích, tính chất tiểu phân của lô tối ưu, kiểm chứng và nâng cấp

không khác nhau (p > 0,05). Điều đó cho thấy quy trình bào chế có tính lặp lại và ổn

định. Cỡ lô bào chế hệ tiểu phân nano ART đã được nâng lên 1.000 g với tỉ lệ lipid

là 10% và tỉ lệ chất diện hoạt là 2%. Khả năng nâng cỡ lô là yếu tố rất có ý nghĩa

trong quá trình nghiên cứu, vì đó là cơ sở để tiến hành đánh giá hiệu quả điều trị và

140

tiềm năng ứng dụng của sản phẩm. Trong nghiên cứu của Shegokar R và cộng sự

(2011), quy trình bào chế hệ tiểu phân lipid chứa stavudin đã được nâng cấp từ cỡ lô

phòng thí nghiệm (40 g) lên lô trung bình (10 kg) và lô lớn (60 kg). Thông số HPH

tối ưu của cỡ lô 40 g và 10 kg là 800 bar 1 chu kỳ, cỡ lô 60 kg là 800 bar 5 chu kỳ.

Kết quả thu được hệ tiểu phân có kích thước ổn định trong một năm. Tuy nhiên, pha

dầu của các mẫu này chỉ 2% (1,85% lipid + 0,15% hoạt chất) và tỉ lệ chất diện hoạt

– lipid là 35 : 10. Dù tỉ lệ pha dầu thấp hơn hệ tiểu phân nano ART 5 lần nhưng tỉ lệ

chất diện hoạt – pha dầu cao hơn 19 lần. Lượng lipid quá thấp và tỉ lệ chất diện hoạt

quá cao có thể hạn chế khả năng ứng dụng của sản phẩm. Theo các tác giả, cỡ lô lớn

hơn vẫn có thể được tiến hành trên máy HPH có công suất lớn. Sự hiện diện của các

thiết bị này trên thị trường là cơ sở để thúc đẩy việc ứng dụng HPH trong quá trình

nghiên cứu bào chế tiểu phân nano lipid [123].

4.3.6 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART

4.3.6.1 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano không chứa ART

Hệ tiểu phân nano không chứa ART ổn định đến 15 tháng. Tính chất cảm quan và

kích thước trung bình của tiểu phân không khác nhau về mặt thống kê. Tuy nhiên, ở

tháng thứ 16, có sự mở rộng dãy phân bố kích thước từ 339 nm đến 389 nm và kích

thước tiểu phân trung bình khoảng 126 nm. Kết quả này cho thấy hệ tiểu phân nano

nghiên cứu có thời gian ổn định dài hơn so với nghiên cứu khác. Ví dụ, Han F và

cộng sự (2007) bào chế hệ tiểu phân nano lipid ổn định trong một năm [58].

Độ ổn định có liên quan đến tính chất bề mặt của tiểu phân. Có thể giải thích độ ổn

định vật lý của tiểu phân nano trong môi trường nước qua một số cơ chế. Cơ chế

thứ nhất, tiểu phân ổn định nhờ lực đẩy tĩnh điện hình thành từ sự tích điện trên bề

mặt tiểu phân [85]. Lực đẩy tĩnh điện của hệ phân tán được mô tả bởi thuyết

Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO). Theo thuyết DLVO, có hai loại lực

tác động vào tiểu phân bao gồm lực đẩy tĩnh điện và lực hấp dẫn (Van der Waals).

Lực đẩy xuất phát từ sự chồng chéo của các lớp điện kép (electrical double layer,

EDL) bao quanh tiểu phân trong môi trường nên có thể ngăn chặn tiểu phân kết tụ

141

với nhau [58], [154]. Cơ chế thứ hai dựa vào sự cản trở không gian trên bề mặt tiểu

phân [78], [100], [131]. Độ ổn định không gian (steric stabilization) [85] là hiệu ứng

tạo nên từ sự ngăn cách không gian giữa các tiểu phân. Sự ngăn cách hình thành từ

đuôi thân nước của chất diện hoạt. Các chất diện hoạt không ion hóa, đặc biệt là

chất có chứa nhóm ethylen oxid, có thể giúp tiểu phân ổn định bằng cách hấp phụ

đầu kỵ nước lên phần thân dầu trên bề mặt của tiểu phân, còn đuôi thân nước của

chất diện hoạt hướng vào môi trường. Chính đuôi thân nước này tạo nên không gian

ngăn cách các tiểu phân, ngăn chặn sự tiếp xúc và sát nhập giữa chúng [85], [94].

Các chất diện hoạt thường dùng là poloxamer, tween, ... [24], [60].

4.3.6.2 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART

Ở 6 ± 2 oC, kích thước tiểu phân nano ART ổn định 6 tháng. Đến tháng thứ 9, kích

thước tiểu phân trung bình tăng lên khoảng 138 nm và dãy phân bố mở rộng đến

600 nm. Kết quả cho thấy từ tháng 0 đến tháng thứ 5, hàm lượng % của ART và

hiệu suất nang hóa giảm không đáng kể. Đến tháng thứ 6, tỉ lệ giảm nhiều hơn. Điều

này gợi ý rằng hiệu suất nang hóa giảm là một trong những dấu hiệu của sự gia tăng

kích thước. Có thể lượng ART tự do tăng lên đến một mức nào đó sẽ tụ lại hoặc

bám dính lên bề mặt tiểu phân, khả năng kết tụ giữa các tiểu phân tăng lên. Nếu quá

trình này tiếp diễn, sự gia tăng kích thước sẽ càng tiến triển.

Ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH, kích thước tiểu phân ổn định trong 4 tháng và bắt đầu

tăng ở tháng thứ 5. Sự gia tăng kích thước đi kèm với sự mở rộng dãy phân bố kích

cỡ. Tháng thứ 6 và tháng thứ 9, tình trạng gia tăng kích thước tiếp tục xảy ra. Có thể

nhiệt độ cung cấp thêm năng lượng khiến lipid thay đổi trạng thái kết tinh và thay

đổi sự sắp xếp phân tử của lipid trên bề mặt tiểu phân khiến chúng dễ kết tụ hơn

[51]. Như vậy, thời gian ổn định của hệ tiểu phân kéo dài hơn ở 6 ± 2 oC, nên chọn

điều kiện này để bảo quản hệ tiểu phân nano ART.

Kết quả so sánh cho thấy hệ tiểu phân không chứa ART có thời gian ổn định dài

hơn hệ tiểu phân nano ART. Có thể mẫu không chứa ART không có hiện tượng

bám dính hoặc kết tụ hoạt chất trong môi trường. Các mẫu chứa ART đều có một tỉ

142

lệ nhất định hoạt chất tự do trong môi trường. Theo thời gian có sự chuyển dịch

hoạt chất từ pha dầu ra pha nước làm tăng tỉ lệ hoạt chất tự do. Hoạt chất có thể kết

tụ với nhau hoặc bám trên bề mặt tiểu phân, cả hai hiện tượng này đều làm tăng khả

năng kết dính giữa các tiểu phân dẫn đến sự mất ổn định của hệ tiểu phân.

Theo Das S và cộng sự (2012), trong 3 tháng khảo sát, hệ tiểu phân SLN và NLC ổn

định hơn khi bảo quản ở 2 – 8 oC so với 25 oC. Ngoài ra, kích thước tiểu phân tăng

nhiều hơn ở mẫu có phần trăm nang hóa cao [38]. Ohshima H và cộng sự (2009) đã

chứng minh kích thước tiểu phân của hệ phân tán nifedipin ổn định trong 120 ngày

ở nhiệt độ mát, nhưng bị kết tụ trong 90 ngày ở nhiệt độ phòng [110]. Như vậy, hệ

tiểu phân nano ART có thời gian ổn định dài hơn so với các nghiên cứu đã nêu.

4.4. Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano

ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei

Lô chứng âm có mật độ KST tăng cao dần đến khi chuột trong lô bắt đầu chết vào

ngày 7. Các lô điều trị có mật độ KST giảm dần qua các ngày theo dõi. Mặc dù mật

độ KST tăng dần trở lại vào ngày 21 nhưng phần trăm KST của tất cả các lô điều trị

bằng hệ tiểu phân nano ART vẫn thấp hơn ngày 1 từ 50% – 70%. Hệ tiểu phân nano

ART liều 170 mg/kg và 190 mg/kg có tỉ lệ giảm mật độ KST > 30% bắt đầu từ ngày

2 và giảm mật độ KST cao hơn lô ART (p < 0,05) vào ngày 2 và 3, chứng tỏ hệ tiểu

phân nano ART có tác động diệt KST sốt rét và tác động này đến sớm hơn lô ART.

Các lô chuột điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART liều 150 mg/kg, 170 mg/kg và

190 mg/kg có thời gian sạch KST trong máu nhanh hơn lô ART có liều tương tự (p

< 0,05). Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá tỉ lệ giảm mật độ KST trong

máu. Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu của lô điều trị bằng hệ tiểu

phân nano ART (liều 170 mg/kg và 190 mg/kg) kéo dài hơn lô ART có liều tương

tự (p < 0,05). Ngoài ra, các lô ART còn có hiện tượng dao động mật độ KST trong

máu nhưng hiện tượng này không xảy ra đối với các lô hệ tiểu phân nano ART.

Thực tế, ART có thời gian bán thải ngắn, khoảng 4 giờ theo đường uống [6]. Sự dao

động mật độ KST phản ánh nồng độ và hiệu quả điều trị của thuốc. Với đường

143

uống, tiểu phân từ 20 – 500 nm được hấp thu xuyên bào qua đường tiêu hóa. Nếu

kích thước lớn hơn, tiểu phân có nguy cơ bị lớp màng nhày giữ lại và không được

hấp thu. Tiểu phân nano ART có kích thước khoảng 115 nm nên chúng nhanh

chóng vượt qua rào cản của đường tiêu hóa và được hấp thu nhanh hơn. Ngoài ra,

ART được tiểu phân bảo vệ nên có thể hấp thu và tập trung đến đích nhanh hơn

[88]. Hiệu suất nang hóa cao chứng tỏ ART được chứa trong lipid và được phóng

thích dần ra khỏi tiểu phân, có thể điều này làm kéo dài thời gian duy trì tình trạng

sạch KST trong máu và thời gian sống sót của chuột. Tất cả những điều này góp

phần tăng hiệu lực diệt KST của hệ tiểu phân nano ART so với ART. Nghiên cứu

tiếp theo nên tiến hành đánh giá sinh khả dụng của ART với định hướng bào chế

sản phẩm chứa hệ tiểu phân nano ART có tác động nhanh và kéo dài nhằm nâng cao

hiệu quả điều trị bệnh sốt rét.

Những kết quả thử nghiệm này khá tương đồng với công bố của các tác giả khác.

Kết quả đánh giá hiệu lực diệt KST sốt rét của liposome chứa ART của Isacchi B và

cộng sự (2012) đã chứng minh liposome ART có thời gian sạch KST trong máu

nhanh hơn và kéo dài hơn so với lô chứng dương [65]. Aditya NP và cộng sự (2012)

đánh giá hiệu quả diệt KST sốt rét của liposome chứa curcumin so với curcumin.

Tác giả kết luận liposome curcumin có thời gian tác dụng kéo dài hơn curcumin.

Ngoài ra, phối hợp liposome chứa curcumin và α/β arteether điều trị sốt rét trên

chuột gây nhiễm P. berghei cũng làm giảm tỉ lệ tái phát [17].

144

KẾT LUẬN

Theo nội dung đề ra, đề tài đã thu được kết quả như sau:

1. Đã thu được kết quả đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid

(Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART.

Hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART có nhiệt độ nóng chảy

khoảng 67 oC (nhiệt độ nóng chảy của Compritol® 888 ATO là 72,35 oC) và peak

ART không xuất hiện ở khoảng 153 oC.

2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART.

Thành phần công thức của hệ tiểu phân nano ART gồm 10% Compritol® 888 ATO

– LabrafacTM PG (7 : 3), 2% polysorbat 80 – SimulsolTM 4000P (1 : 1), 0,8% ART

và nước cất được bào chế bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao (800 bar) ở

80 oC 5 chu kỳ với quy mô 1.000 g/mẻ.

3. Đã xác định được tính chất của hệ tiểu phân nano ART và từ đó xây dựng

tiêu chuẩn kiểm định hệ tiểu phân nano ART.

3.1. Đã đánh giá được các tính chất của hệ tiểu phân nano ART.

 Tiểu phân nano ART có kích thước trung bình khoảng 115 nm với dãy phân

bố kích cỡ từ 58 – 339 nm. Hình ảnh chụp từ TEM cho thấy tiểu phân có

hình cầu, kích thước trong khoảng 58 – 339 nm, phù hợp với kích thước đo

được bằng phương pháp nhiễu xạ laser.

 Quy trình định lượng ART bằng HPLC đạt yêu cầu phân tích. Hàm lượng

ART khoảng 8% so với lipid và hiệu suất nang hóa hoạt chất của tiểu phân

khoảng 97%. ART được phóng thích ra khỏi tiểu phân và khuếch tán qua

màng thử nghiệm với lượng phóng thích tăng dần theo thời gian.

3.2. Đã xây dựng được tiêu chuẩn kiểm định hệ tiểu phân nano ART.

3.3. Đã nâng cỡ mẫu bào chế lên 1.000 g. Kết quả phân tích cho thấy tính chất

của lô tối ưu và nâng cấp không khác nhau đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

145

3.4. Đã xác định được độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC trong tủ

lạnh và 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH. Ở 6 ± 2 oC, hệ tiểu phân ổn định tới tháng

thứ 6. Ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH, hệ tiểu phân ổn định đến tháng thứ 4. Hệ

tiểu phân không chứa ART ổn định đến tháng thứ 15.

4. Đã đánh giá tác động diệt KST sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên

chuột gây nhiễm Plasmodium berghei.

Trong thử nghiệm in vivo, hệ tiểu phân nano ART có hiệu quả diệt KST sốt rét P.

berghei trên chuột, với tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu > 30% từ ngày 2 đến ngày

35 so với lô chứng âm. Ngoài ra, các lô điều trị bằng hệ tiểu phân nano ART (liều

150 mg/kg, 170 mg/kg và 190 mg/kg) có thời gian sạch KST trong máu nhanh hơn

các lô ART có liều tương tự (p < 0,05) với số ngày lần lượt là 3,1 ngày (so với 4,2

ngày); 2,80 ngày (so với 4,60 ngày) và 2,33 ngày (so với 4,60 ngày). Liều 170

mg/kg và 190 mg/kg có thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu kéo dài hơn

các lô ART có liều tương tự (p < 0,05) với số ngày lần lượt là 21,20 ngày (so với

7,40 ngày) và 24,11 ngày (so với 11,60 ngày).

146

KIẾN NGHỊ

Đề tài đã thu được một số kết quả là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng công nghệ

nano trong bào chế thuốc. Để hoàn thiện hơn và nâng cao triển vọng ứng dụng trong

nghiên cứu sản xuất, cần khảo sát tiếp theo:

 Nghiên cứu hoàn thiện dạng bào chế (thuốc tiêm hoặc uống) cho sản phẩm.

 Thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn của sản phẩm trên mô hình

động vật.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

1. Khưu Mỹ Lệ, Trương Công Trị, Nguyễn Minh Cang, Hoàng Minh Châu,

Nguyễn Minh Đức (2013), “Khảo sát thành phần công thức và thông số điều chế

hệ phân tán nano artemisinin bằng phương pháp đồng nhất hóa dưới áp suất

cao”, Y học TP. Hồ Chí Minh tập 17 phụ bản của số 4, tr. 295 – 302.

2. Khuu My Le, Truong Cong Tri, Lam Hoang Vu, Hoang Minh Chau, Nguyen

Minh Duc (2013), “Physicochemical characterization of artemisinin-loaded lipid

nanoparticles”, Pharma Indochina VIII, pp. 371 – 375.

3. Khưu Mỹ Lệ, Trương Công Trị, Nguyễn Minh Cang, Hoàng Minh Châu,

Nguyễn Minh Đức (2015), “Khảo sát độ tan và đánh giá sự tương tác của

artemisinin với một số tá dược ứng dụng điều chế tiểu phân nano artemisinin”, Y

học TP. Hồ Chí Minh phụ bản tập 19 của số 3, tr. 729 – 736.

4. Khưu Mỹ Lệ, Trịnh Ngọc Hải, Trương Công Trị, Lê Thành Đồng, Hoàng Minh

Châu, Nguyễn Minh Đức (2016), “Đánh giá tác dụng của hệ tiểu phân nano

artemisinin trên chuột nhiễm Plasmodium berghei”, Tạp chí Dược Liệu, tập 21,

số 6, tr. 412 – 416.

5. Khưu Mỹ Lệ, Trương Công Trị, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Minh Đức (2017),

“Khảo sát sự ảnh hưởng của áp suất và chu kỳ đồng nhất hóa lên kích thước tiểu

phân nano artemisinin điều chế bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao”, Y

học TP. Hồ Chí Minh phụ bản tập 21 của số 1, tr. 368 – 373.

6. Khưu Mỹ Lệ, Trương Công Trị, Hoàng Minh Châu, Nguyễn Minh Đức (2017),

“Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa artemisinin cỡ lô 1.000 g

bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao”, TP. Hồ Chí Minh phụ bản tập 21

của số 1, tr. 374 – 380.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Thị Mai Anh, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trường Sơn (2012), “Nghiên

cứu bào chế piroxicam nano bằng phương pháp kết tinh”, Tạp chí Dược

học 436, tr. 05 – 09.

2. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb khoa

học và kỹ thuật, Hà Nội, tập II, tr. 820 – 825.

3. Trần Quang Bính (2011), “Tình hình kháng thuốc sốt rét artemisinin và dẫn

chất và các giải pháp hiện nay trong chiến lược phòng chống sốt rét ở Việt

Nam”, Y học TPHCM tập 15, phụ bản của số 4, tr. 15 – 18.

4. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr. 63 – 64.

5. Trịnh Ngọc Dương, Chữ Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Thanh Bình, Phạm

Thanh Phúc, Vũ Đức Lợi, Nguyễn Thanh Hải (2015), “Nghiên cứu tổng

hợp tiểu phân nano bạc clorid”, Tạp chí Dược học 472, tr. 60 – 64.

6. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr. 640 – 642.

7. Lê Thị Hương Mai, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Ngọc Chiến (2016), “Nghiên

cứu bào chế tiểu phân nano lipid rắn mafenid”, Tạp chí Dược học 479, tr.

77 – 80.

8. Nguyễn Hải Nam, Ngô Anh Ngọc, Bùi Ngọc Sơn (2008), “Tổng hợp và thử

tác dụng sinh học một số dẫn chất của artemisinin có khả năng tác dụng

kéo dài”, Tạp chí Dược học 384, tr. 26 – 28, 31.

9. Đỗ Hữu Nghị, Trần Mạnh Bình, Nguyễn Văn Hân (2003), “Một chất xúc tác

mới trong tổng hợp các dẫn xuất fluoroalkylether của artemisinin”, Tạp chí

Dược học 329, tr. 31 – 34.

10. Hồ Hoàng Nhân, Trần Trọng Biên, Nguyễn Ngọc Chiến (2015), “Nghiên cứu

bào chế tiểu phân nano artesunat với chất mang là PLGA và chitosan”, Tạp

chí Dược học 476, tr. 8 – 12.

11. Nguyễn Duy Sỹ (1996), Nghiên cứu dược động học của thuốc điều trị sốt rét

artemisinin, Đề tài cấp Bộ.

12. Bùi Thị Tường Thu, Phạm Thế Anh, Trần Văn Minh (2012), “Nuôi cấy rễ tơ

thanh hao thu nhận artemisinin bằng công nghệ trong bioreactor”, Tạp chí

Dược Liệu tập 17 (1), tr. 57 – 62.

13. Lê Minh Trí, Hoàng Ân, Phan Xuân Thiện, Trần Thị Thái Thanh (2002),

“Nghiên cứu sự tương quan giữa sinh khả dụng và tác dụng diệt ký sinh

trùng sốt rét của ART dùng đường uống và qua da qua xét nghiệm máu của

bệnh nhân đang điều trị sốt rét và chuột nhắt nhiễm P. berghei”, Y học

TPHCM tập 16, phụ bản của số 1, tr. 181 – 186.

14. Triệu Nguyên Trung, Huỳnh Hồng Quang, Li Guoqiao và cộng sự (2008),

“Đánh giá hiệu quả phác đồ thuốc phối hợp có gốc artemisinin (ACTs)

trong điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum chưa biến chứng tại vùng

sốt rét lưu hành nặng, khu vực miền Trung Tây Nguyên, 2004 – 2008”, Y

học TPHCM tập 12, phụ bản của số 4, tr. 28 – 34.

15. Viện Dược liệu (1995), Nghiên cứu nâng cao hiệu quả trồng cây Thanh cao

(Artemisinin annua L.) và công nghệ chiết xuất artemisinin, Đề tài Nhà nước.

TIẾNG ANH

16. Aburahma MH, Badr-Eldin SM (2014), “Compritol 888 ATO: A

multifunctional lipid excipient in drug delivery systems and

nanopharmaceuticals”, Drug delivery 11 (12), pp. 1.865 – 1.883.

17. Aditya NP, Chimote G, Gunalan K, Banerjee R, Patankar S, Madhusudhan B

(2012), “Curcuminoids-loaded liposomes in combination with arteether

protects against Plasmodium berghei infection in mice”, Experimental

Parasitology 131, pp. 292 – 299.

18. Aditya NP, Patankar S, Madhusudhan B, Murthy RS, Souto EB (2010),

“Arthemeter-loaded lipid nanoparticles produced by modified thin-film

hydration: Pharmacokinetics, toxicological and in vivo anti-malarial

activity”, European Journal of Pharmaceutical Sciences 40, pp. 448 – 455.

19. Aditya NP, Vathsala PG, Vieira V, Murthy RS, Souto EB (2013), “Advances

in nanomedicines for malaria treatment”, Advances in Colloid and

Interface Science 201 – 202, pp. 1 – 17.

20. Alexis F, Pridgen EM, Langer R and Farokhzad OC (2010), “Nanoparticle

technologies for cancer therapy”, Handbook of Experimental Pharmacology

197, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, pp. 56 – 77.

21. Alli LA, Adesokan AA, Salawu OA, Akanji MA, Tijani AY (2011), Anti-

plasmodial activity of aqueous root extract of Acacia nilotica, African

Journal of Biochemistry Research Vol.5 (7), pp. 214 – 219.

22. Almeida JS, Lima F, Ros SD, Bulhões LO, de Carvalho LM, Beck RC (2010),

“Nanostructured systems containing rutin: In vitro antioxidant activity and

photostability studies”, Nanoscale Res Lett 5, pp. 1.603 – 1.610.

23. Anand R, Manoli F, Manet I, Daoud – Mahammed S, Agostoni V, Gref R,

Monti S (2012), “β – cyclodextrin polymer nanoparticles as carriers for

doxorubicin and artemisinin: a spectroscopic and photophysical study”,

Photochemistry and Photobiology, 11 (8), pp. 1.285 – 1.292.

24. Anarjan N, Tan CP (2013), “Effects of selected polysorbate and sucrose ester

emulsifiers on the physicochemical properties of astaxanthin

nanodispersions”, Molecules 18, pp. 768 – 777.

25. Ashton M, Gordi T, Trinh NH, Nguyen VH, Nguyen DS, nguyen TN, Dinh

XH, Johansson M, Le DC (1998), “Artemisinin pharmacokinetics in

healthy adults after 250, 500 and 1000 mg single oral doses”,

Biopharmaceutics and Drug Disposition 19 (4), pp. 245 – 250.

26. Attama AA, Momoh MA and Builders PF (2012), “Chapter 5 – Lipid

nanoparticulate drug delivery systems: A revolution in dosage form design and

development”, Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems, pp. 107 – 132.

27. Attama AA, Schicke BC, Paepenmüller T, Müller-Goymann CC (2007),

“Solid lipid nanodispersions containing mixed lipid core and a polar

heterolipid: Characterization”, European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics 67 (4), pp. 48 – 57.

28. Bassi PU, Osakwe AI, Suku C, Kalat M, Elagbaje C, Isah A, Ayinbuomwan

S, Wammanda RD, Bob-Okon II, Ambe J, Mava Y, Adesina

AO, Ugochukwu CG, Nyong EE, Ogunleye OO, Onuoha F, Jalo

I, Adegoke VO, Balogun ST, Ntadom G, Ejiekpe FN, Tahir R, Dabit

K, Amodu AA, Nwaosu S, Habib AT (2016), “Cohort event monitoring of

patient treated for uncomplicated malaria with artemisinin-based

combination therapies in selected hospitals and community pharmacies in

Nigeria”, Nigerian Postgraduate Medical Journal 23 (4), pp. 172 – 181.

29. Beloqui A, Solinís MA, Delgado A, Évora C, del Pozo-Rodríguez A,

Rodríguez-Gascón A (2013), “Biodistribution of Nanostructured Lipid

Carriers (NLC) after intravenous administration to rats: Influence of

technological factors”, European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics 84 (2), pp. 309 – 314.

30. Bhushan B (2004), Springer Handbook of Nanotechnology, Springer-Verlag

Berlin Heidelberg, Germany, pp. 1 – 5.

31. Blasi P, Schoubben A, Traina G, Manfroni G, Barberini L, Alberti PF, Cirotto

C, Ricci M (2013), “Lipid nanoparticles for brain targeting III. Long-term

stability and in vivo toxicity”, International Journal of Pharmaceutics 454,

pp. 316 – 323.

32. Bloland PB (2001), Drug resistance in malaria, WHO Press, Switzerland, pp.

12 – 18.

33. Bunjes H, Unruh T (2007), “Characterization of lipid nanoparticles by

differential scanning calorimetry, X-ray and neutron scattering”, Advanced

drug delivery reviews, pp. 379 – 402.

34. Chakraborty S, Shukla D, Mishra B, Singh S (2009), “Lipid – An emerging

platform for oral delivery of drugs with poor bioavailability”, European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 73, pp. 1 – 15.

35. Chattopadhyay P, Shekunov BY, Yim D, Cipolla D, Boyd B, Farr S (2007),

“Production of solid lipid nanoparticle suspension using supercritical fluid

extraction of emulsion (SFEE) for pulmonary delivery using the AERx

system”, Advanced Drug Delivery Reviews 59, pp. 444 – 453.

36. Chawira AN, Warhurst DC, Robinson BL, Peters W (1987), “The effect of

combinations of qinghaosu (artemisinin) with standard antimalarial drugs

in the suppressive treatment of malaria in mice”, Transactions of the Royal

Society of Tropical Medicine and Hygiene 81 (4), pp. 554 – 558.

37. Chen YC, Liu DZ, Liu JJ, Chang TW, Ho HO, Sheu MT (2012),

“Development of terbinafine solid lipid nanoparticles as a topical delivery

system”, International Journal of Nanomedicine 7, pp. 4409 – 4418.

38. Das S, Ng WK, Tan RB (2012), “Are nanostructured lipid carriers (NLCs)

better than solid lipid nanoparticles (SLNs): Development, characterizations

and comparative evaluations of clotrimazole-loaded SLNs and NLCs?”,

European Journal of Pharmaceutical Sciences 47”, pp. 139 – 152.

39. Date AA, Joshi MD, Patravale VB (2007), “Parasitic diseases: Liposomes and

polymeric nanoparticles versus lipid nanoparticles”, Advanced Drug

Delivery Reviews 59, pp. 505 – 521.

40. De Donno A, Grassi T, Idolo A, Guido M, Papadia P, Caccioppola A,

Villanova L, Merendino A, Bagordo F, Fanizzi FP (2012), “First-time

comparison of the in vitro antimalarial activity of Artemisia annua herbal

tea and artemisinin”, Transactions of the Royal Society of Tropical

Medicine and Hygiene 106 (11), pp. 696 – 700.

41. Desai PP, Date AA, Patravale VB (2012), “Overcoming poor oral bioavailability

using nanoparticle formulations – opportunities and limitations”, Drug

Discovery Today: Technologies, Vol. 9, No.2, pp. e87 – e95.

42. Dwivedi P, Khatik R, Khandelwal K, Taneja I, Raju KS, Wahajuddin, Paliwal

SK, Dwivedi AK, Mishra PR (2014), “Pharmacokinetics study of arteether

loaded solid lipid nanoparticles: An improved oral bioavailability in rats”,

International Journal of Pharmaceutics 466, pp. 321 – 327.

43. Emerich DF, Thanos CG (2006), “The pinpoint promise of nanoparticle-based drug

delivery and molecular diagnosis”, Biomolecular Engineering 23, pp. 171 – 184.

44. ETC Group (2008), Downsizing development: An introduction to nano-scale

technologies and the implications for the global south, UN Non-

Governmental Liaison Service, New York and Geneva, pp. 11 – 60.

45. Ezzati Nazhad Dolatabadi J, Hamishehkar H, Eskandani M, Valizadeh H

(2014), “Formulation, characterization and cytotoxicity studies of

alendronate sodium-loaded solid lipid nanoparticles”, Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces 117, pp. 21 – 28.

46. Fahy E, Cotter D, Sud M, Subramaniam S (2011), “Lipid classification,

structures and tools”, Biochimica et Biophysica Acta 1811, pp. 637 – 647.

47. Faraji AH, Wipf P (2009), “Nanoparticles in cellular drug delivery”,

Bioorganic & Medicinal Chemistry 17, pp. 2.950 – 2.962.

48. Feng L, Mumper RJ (2012), “A critical review of lipid – based nanoparticles

for taxane delivery”, Cancer Letters 334 (2), pp. 157 – 175.

49. Fidock DA, Rosenthal PJ, Croft SL, Brun R and Nwaka S (2004),

“Antimalarial drug discovery: Efficacy models for compoud screening”,

Nature Reviews Drug Discovery 3 (6), pp. 509 – 520.

50. Floury J, Desrumaux A, Lardières J (2000), “Effect of high-pressure

homogenization on droplet size distributions and rheological properties of

model oil-in-water emulsions”, Innovative Food Science & Emerging

Technologies 1, pp. 127 – 134.

51. Freitas C, Müller RH (1998), “Effect of light and temperature on zeta potential

and physical stability in solid lipid nanoparticle (SLNTM) dispersions”,

International Journal of Pharmaceutics 168, pp. 221 – 229.

52. Freitas C, Müller RH (1999), “Correlation between long-term stability of solid

lipid nanoparticles (SLN™) and crystallinity of the lipid phase”, European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 47, pp. 125 – 132.

53. Garg NK, Singh B, Jain A, Nirbhavane P, Sharma R, Tyagi RK, Kushwah V,

Jain S, Katare OP (2016), “Fucose decorated solid lipid nanocarriers

mediate efficient delivery of methotrexate in breast cancer therapeutics”,

Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 146, pp. 1.114 – 1.126.

54. Gogotsi Y (2006), “Nanoparticles for drug delivery”, Nanomaterials

handbook, CRC Press, chapter 23.

55. Gong C, Hart DP (1998), “Ultrasound induced cavitation and sonochemical

yields”, Journal of the Acoustical Society of America, Vol. 104, pp. 2 – 16.

56. Ha V, Nguyen NH, Tran BH, Bui MC, Nguyen HP, Tran HC, Phan TQ,

Arnold K and Tran TH (1997), “Severe complicated malaria treated with

artemisinin, artesunate or artemether in Vietnam”, Transactions of the

Royal society of tropical medicine and hygiene 91 (4), pp. 465 – 467.

57. Håkansson A, Fuchs L, Innings F, Revstedt J, Bergenståhl B, Trägårdh C

(2010), “Visual observations and acoustic measurements of cavitation in an

experimental model of a high-pressure homogenizer”, Journal of Food

Engineering 100, pp. 504 – 513.

58. Han F, Li S, Yin R, Liu H, Xu L (2007), “Effect of surfactants on the

formulation and characterization of a new type of colloidal drug delivery

system: Nanostructured lipid carriers”, Colloids and Surfaces A:

Physicochem. Eng. Aspects, pp. 210 – 216.

59. Helgason T, Awad TS, Kristbergsson K, McClements DJ, Weiss J (2009), “Effect

of surfactant surface coverage on formation of solid lipid nanoparticles

(SLN)”, Journal of Colloid and Interface Science 334, pp. 75 – 81.

60. Heurtault B, Saulnier P, Pech B, Proust JE, Benoit JP (2003), “Physico – chemical

stability of colloidal lipid particles”, Biomaterials 24, pp. 4.283 – 4.300.

61. Hong M, Zhu S, Jiang Y, Tang G, Sun C, Fang C, Shi B, Pei Y (2010), “Novel

anti-tumor strategy: PEG–hydroxycamptothecin conjugate loaded transferrin-

PEG-nanoparticles”, Journal of Controlled Release 141, pp. 22 – 29.

62. Horton MA, Khan A (2006), “Medical nanotechnology in the UK: A

perspective from the London centre for nanotechnology”, Nanomedicine:

Nanotechnology, Biology and Medicine 2, pp. 42 – 48.

63. Hu FQ, Jiang SP, Du YZ, Yuan H, Ye YQ, Zeng S (2005), “Preparation and

characteristics of stearic acid nanostructured lipid carriers by solvent

diffusion method in an aqueous system”, Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces 45, pp. 167 – 173.

64. ICH harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical

procedures: Text and methodology Q2(R1) current Step 4 version.

65. Isacchi B, Bergonzi MC, Grazioso M, Righeschi C, Pietretti A, Severini C, Bilia

AR (2012), “Artemisinin and artemisinin plus curcumin liposomal

formulation: Enhanced antimalarial efficacy against Plasmodium berghei-

infected mice”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics

80, pp. 528 – 534.

66. Jores K, Haberland A, Wartewig S, Mäder K and Mehnert W (2005), “Solid

lipid nanoparticles (SLN) and oil–loaded SLN studied by

spectrofluorometry and raman spectroscopy”, Pharmaceutical Research 22

(11), pp. 1.887 – 1.896.

67. Jores K, Mehnert W, Drechsler M, Bunjes H, Johann C, Mäder K (2004),

“Investigations on the structure of solid lipid nanoparticles (SLN) and oil –

loaded solid lipid nanoparticles by photon correlation spectroscopy, field –

low fractionation and transmission electron microscophy”, Journal of

Controlled Release 95, pp. 217 – 227.

68. Joshi M, Pathak S, Sharma S, Patravale V (2008), “Design and in vivo

pharmacodynamic evaluation of nanostructured lipid carriers for parenteral

delivery of artemether: Nanoject”, International Journal of Pharmaceutics

364, pp. 119 – 126.

69. Joshi M, Patravale V (2007), “Nanostructured lipid carrier based gel of

celecoxid”, International Journal of Pharmaceutics, pp. 2 – 4.

70. Kalepu S, Manthina M, Padavala V (2013), “Oral lipid-based drug delivery

systems – an overview”, Acta Pharmaceutica Sinica B 3 (6), pp. 361 – 372.

71. Kamble MS, Vaidya KK, Bhosale AV and Chaudhari PD (2012), “Solid lipid

nanoparticles and nanostructured lipid carriers – An overview”,

International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological

Sciences, 2 (4), pp. 681 – 691.

72. Katdare A, Chaubal MV (2006), Excipient Development for Pharmaceutical,

Biotechnology, and Drug Delivery Systems, Taylor & Francis Group, LLC,

New York, pp. 156 – 168.

73. Klancnik G, Medved J, Mrvar P (2010), “Differential thermal analysis (DTA) and

differential scanning calorimetry (DSC) as a method of material investigation”,

RMZ - Materials and Geoenvironment, Vol. 57, No.1, pp. 127 – 142.

74. Kovacevic A, Savic S, Vuleta G, Müller RH, Keck CM (2011), “Polyhydroxy

surfactants for the formulation of lipid nanoparticles (SLN and NLC):

Effects on size, physical stability and particle matrix structure”,

International Journal of Pharmaceutics 406, pp. 163 – 172.

75. Kovačević AB, Müller RH, Savić SD, Vuleta GM (2014), “Solid lipid

nanoparticles (SLN) stabilized with polyhydroxy surfactants: Preparation,

characterization and physical stability investigation”, Colloids and Surfaces

A: Physicochemical and Engineering Aspects 444, pp. 15 – 25.

76. Kumar GD, Razdan BK, Meenakshi B (2014), “Formulation and evaluation of

nanoparticles containing artemisinin HCl”, International Journal of Research

and Development in Pharmacy and Life Sciences 3 (2), pp. 925 – 934.

77. LaCrue AN, Scheel M, Kennedy K, Kumar N, Kyle DE (2011), “Effect of

artesunat on parasite recrudescence and dormancy in the rodent malaria

model Plasmodium vinckei”, PLoS One 6 (10), e26689.

78. Lazaridis N, Alexopoulos AH, Chatzi EG, Kiparissides C (1999), “Steric

stabilization in emulsion polymerization using oligomeric nonionic

surfactants”, Chemical Engineering Science 54, pp. 3.251 – 3.261.

79. Lee L, Hancocks R, Noble I, Norton IT (2014), “Production of water-in-oil

nanoemulsions using high pressure homogenisation: A study on droplet

break-up”, Journal of Food Engineering 131, pp. 33 – 37.

80. Lim SB, Banerjee A, Onyüksel H (2012), “Improvement of drug safety by the use

of lipid – based nanocarriers”, Journal of Controlled Release 163, pp. 34 – 45.

81. Lin PC, Lin S, Wang PC, Sridhar R (2013), “Techniques for physicochemical

characterization of nanomaterials”, Biotechnology Advances 32(4), pp. 711

– 726.

82. Lin X, Li X, Zheng L, Yu L, Zhang Q, Liu W (2007), “Preparation and

characterization of monocaprate nanostructured lipid carriers”, Colloids

and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, pp. 1 – 6.

83. Logothetidis S (2012), “Nanotechnology: Principles and Applications”,

Nanostructured Materials and Their Applications, pp. 1 – 22.

84. Malwade C, Qu H, Rong BG, Christensen LP (2016), “Role of impurities in

purication of artemisinin from Artemisia annua L. extracts”, Planta Medica

81 (S 01), S1 – S381.

85. Mark HF (2007), “Latex technology”, Encyclopedia of Polymer Science and

Technology, third edition, John Wiley & Sons, Inc, New York City, United

States, pp. 614 – 615.

86. Markman JL, Rekechenetskiy A, Holler E, Ljubimova JY (2013),

“Nanomedicine therapeutic approaches to overcome cancer drug

resistance”, Advanced Drug Delivery Reviews 65, pp. 1.866 – 1.879.

87. Martins S, Tho I, Souto E, Ferreira D, Brandl M (2012), “Multivariate design

for the evaluation of lipid and surfactant composition effect for

optimisation of lipid nanoparticles”, European Journal of Pharmaceutical

Sciences 45, pp. 613 – 623.

88. McClements DJ (2013), “Edible lipid nanoparticles: Digestion, absorption, and

potential toxicity”, Progress in Lipid Research 52, pp. 409 – 423.

89. Mehnert W, Mäder K (2001), “Solid lipid nanoparticles: Production,

characterization and application”, Advanced Drug Delivery Review 47, pp.

165 – 196.

90. Mehnert W, Mäder K (2012), “Solid lipid nanoparticles: Production,

characterization and applications”, Advanced Drug Delivery Reviews 64,

pp. 83 – 101.

91. Memvanga PB, Préat V (2012), “Formulation design and in vivo antimalarial

evaluation of lipid – based drug delivery systems for oral delivery of β-

arteether”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 82,

pp. 112 – 119.

92. Meshnick SR (2002), “Artemisinin: mechanisisms of action, resistance and

toxicity, International Journal for Parasitology 32, pp. 1.655 – 1.660.

93. Mishra B, Patel BB, Tiwari S (2010), “Colloidal nanocarriers: a review on

formulation technology, types and applications toward target drug delivery”,

Nanomedicine: nanotechnology, Biology, and medicine 6, pp. 9 – 24.

94. Moghimi SM, Szebeni J (2003), “Stealth liposomes and long circulating

nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-

binding properties”, Progress in Lipid Research 42, pp. 463 – 478.

95. Mohanraj VJ, Chen Y (2006), “Nanoparticles – A review”, Tropical Journal of

Pharmaceutical Research 5 (1), pp. 561 – 573.

96. Moore KA, Simpson JA, Paw MK, Pimanpanarak M, Wiladphaingern J,

Rijken MJ, Jittamala P, White NJ, Fowkes FJ, Nosten F, McGready R

(2016), “Safety of artemisinin in first trimester of prospectively followed

pregnancies: an observational study”, The Lancet Infectious Diseases 15,

pp. 547 – 552.

97. Müller RH, Mäder K, Gohla S (2000), “Solid lipid nanoparticles (SLN) for

controlled drug delivery – a review of the state of the art”, European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 50, pp. 161 – 177.

98. Müller RH, Petersen RD, Hommoss A, Pardeike J (2007), “Nano structured

lipid carriers (NLC) in cosmetic dermal products”, Advanced Drug

Delivery Reviews 59, pp. 522 – 530.

99. Müller RH, Radtke M, Wissing SA (2002), “Solid lipid nanoparticals and nano

structured lipid carriers in cosmetic and dermatological preparations”,

Advanced Drug Delivery Reviews 54, pp. 133 – 141.

100. Napper DH (1977), “Steric stabilization”, Journal of Colloid and Interface

Science 58 (2), pp. 390 – 407.

101. Nastruzzi C (2005), “Characteration of solid lipid nano - and micropartical”,

Lipospheres in drug targets and delivery, CRC Press LLC, Boca Raton, pp.

42 – 58.

102. Nastruzzi C (2005), “Delivery of Lipophilic Compounds with Lipid

Nanoparticles - Applications in Dermatics and for Transdermal Therapy”,

Lipospheres in drug targets and delivery, CRC Press LLC, Boca Raton, pp.

128 – 136.

103. Nastruzzi C (2005), “Production of lipospheres for bioactive compound

delivery”, Lipospheres in drug targets and delivery, CRC Press LLC, Boca

Raton, pp. 24 – 35.

104. Nastruzzi C (2005), “Solid lipid nanoparticles - Concepts, Procedures, and

Physicochemical Aspects”, Lipospheres in drug targets and delivery, CRC

Press LLC, Boca Raton, pp. 2 – 17.

105. Nastruzzi C (2005), “Solid lipid nanoparticles: Interaction with cells, cytokine

production, and enzymatic degradation”, Lipospheres in drug targets and

delivery, CRC Press LLC, Boca Raton, pp. 102 – 120.

106. Nijhara R, Balakrishnan K (2006), “Bringing nanomedicines to market:

regulatory challenges, opportunities and uncertainties”, Nanomedicine:

Nanotechnology, Biology, and Medicine 2, pp. 127 – 136.

107. Nnamani PO, Hansen S, Windbergs M, Lehr CM (2014), “Development of

artemether-loaded nanostructured lipid carrier (NLC) formulation for topical

application”, International Journal of Pharmaceutics 477 (1- 2), pp. 208 – 217.

108. O΄Neill PM, Barton VE, Ward SA (2010), “The molecular mechanism of action

of artemisinin – The debate continues”, Molecules 15, pp. 1.705 – 1.721.

109. Ochekpe NA, Olorunfemi PO, Ngwuluka NC (2009), “Nanotechnology and

Drug Delivery, Part 1: Background and Applications”, Tropical Journal of

Pharmaceutical Research 8 (3), pp. 265 – 274.

110. Ohshima H, Miyagishima A, Kurita T, Makino Y, Iwao Y, Sonobe T, Itai

S (2009), “Freeze-dried nifedipine-lipid nanoparticles with long-term

nano-dispersion stability after reconstitution”, International Journal of

Pharmaceutics 377, pp. 180 – 184.

111. Okokon JE, Ofodum KC, Ajibesin KK, Danladi B, Gamaniel KS (2005),

“Pharmacological screening and evaluation of antiplasmodial activity of

Croton zambesicus against Plasmodium berghei infection in mice”, Indian

Journal of Pharmacology 37 (4), pp. 243 – 246.

112. Omwoyo WN, Melariri P, Gathirwa JW, Oloo F, Mahanga GM, Kalombo

L, Ogutu B, Swai H (2016), “Development, characterization and

antimalarial efficacy of dihydroartemisinin loaded solid

lipid nanoparticles”, Nanomedicine 12 (3), pp. 801 – 809.

113. Pardeike J, Hommoss A, Müller RH (2009), “Lipid nanoparticles (SLN, NLC)

in cosmetic and pharmaceutical dermal products”, International Journal of

Pharmaceutics 366, pp. 170 – 184.

114. Pardeike J, Weber S, Haber T, Wagner J, Zarfl HP, Plank H, Zimmer A

(2011), “Development of an itraconazole-loaded nanostructured lipid

carrier (NLC) formulation for pulmonary application”, International

Journal of Pharmaceutics 419 (1 – 2), pp. 329 – 338.

115. Radtke M, Müller RH, “Nanostructured lipid drug carriers”, Nanotechnology,

pp. 48 – 52.

116. Ravi PR, Aditya N, Kathuria H, Malekar S, Vats R (2014), “Lipid

nanoparticles for oral delivery of raloxifene: Optimization, stability, in vivo

evaluation and uptake mechanism”, European Journal of Pharmaceutics

and Biopharmaceutics 87 (1), pp. 114 – 124.

117. Roco MC (2011), “The long view of nanotechnology development: the

National Nanotechnology Initiative at 10 years”, Journal of Nanoparticles

Research 13, pp. 427 – 445.

118. Santos-Magalhães NS, Mosqueira VC (2010),“Nanotechnology applied to the

treatment of malaria”, Advanced Drug Delivery Reviews 62, pp. 560 – 575.

119. Sargent JF (2014), The National Nanotechnology Initiative: Overview,

Reauthorization, and Appropriations Issues, Congressional Research

Service, pp. 8 – 43.

120. Saupe A, Gordon KC, Rades T (2006), “Structural investigations on

nanoemulsions, solid lipid nanoparticals and nanostructured lipid carriers

by cryo- field emission scanning electron microscopy and Raman

spectroscopy”, International Journal of Pharmaceutics 314, pp. 56 – 62.

121. Savjani KT, Gajjar AK and Savjani JK (2012), “Drug solubility: Importance and

enhancement techniques”, ISRN Pharmaceutics 2012, pp. 5.402 – 5.412.

122. Schäfer-Korting M and Mehnert W, Korting HC (2007), “Lipid nanoparticles

for improved topical application of drugs for skin diseases”, Advanced

Drug Delivery Reviews 59, pp. 427 – 443.

123. Shegokar R, Singh KK, Müller RH (2011), “Production and stability of

stavudine solid lipid nanoparticles – From lab to industrial scale”,

International Journal of Pharmaceutics 416, pp. 461 – 470.

124. Silva AC, González-Mira E, García ML, Egea MA, Fonseca J, Silva R, Santos

D, Souto EB, Ferreira D (2011), “Preparation, characterization and

biocompatibility studies on risperidone-loaded solid lipid nanoparticles

(SLN): High pressure homogenization versus ultrasound”, Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces 86, pp. 158 – 165.

125. Souto EB, Doktorovová S (2009), “Chapter 6 – Solid lipid nanoparticle

formulation: Pharmacokinetic and biopharmaceutical aspects in drug

delivery”, Methods in Enzymology 464, pp. 105 – 129.

126. Souto EB, Wissing SA, Barbosa CM, Müller RH (2004), “Development of a

controlled release formulation based on SLN and NLC for topical clotrimazole

delivery”, International Journal of pharmaceutics 278, pp. 71 – 77.

127. Souto EB, Wissing SA, Barbosa CM, Müller RH (2004), “Evaluation of the

physical stability of SLN and NLC before and after incorporation into

hydrogel formulations”, European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics 58, pp. 83 – 90.

128. Stancampiano AH, Puglisi G, Pignatello R (2008), “Effect of lipophilicity of

dispersed drugs on the physicochemical and technological properties of

solid lipid nanoparticles”, The Open Drug Delivery Journal 2, pp. 26 – 32.

129. Suh WH, Suslick KS, Stucky GD, Suh Y (2009), “Nanotechnology,

nanotoxicology, and neuroscience”, Progress in neurobiology 87, pp. 133 – 170.

130. Sun J, Bi C, Chan HM, Sun S, Zhang Q, Zheng Y (2013), “Curcumin-loaded

solid lipid nanoparticles have prolonged in vitro antitumour activity,

cellular uptake and improved in vivo bioavailability”, Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces 111, pp. 367 – 375.

131. Tadros T (2013), “Steric stabilization”, Encyclopedia of colloid and interface

science 58 (2), pp. 1.048 – 1.049.

132. Tamjidi F, Shahedi M, Varshosaz J, Nasirpour (2013), “Nanostructured lipid

carriers (NLC): A potential delivery system for bioactive food molecules”,

Innovative Food Science and Emerging Technologies 19, pp. 29 – 43.

133. Tanthapanichakoon W, Chaichanawong J, Ratchahat S (2014), “Review of

nanomaterials R & D in 21st century in Thailand with highlight on

nanoparticle technology”, Advanced Powder Technology 25, pp. 189 – 194.

134. Teeranachaideekul V, Souto EB, Junyaprasert VB, Müller RH (2007), “Cetyl

palmitata-based NLC for topical delivery of Coenzyme Q10 –

Development, physicochemical characterization and in vitro release

studies”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 67,

pp. 141 – 148.

135. Thassu D, Deleers M, Pathak Y (2007),“Nanoparticulate drug delivery

systems”, Drugs and the pharmaceutical sciences, Vol 166, pp. 76 – 95.

136. Titulaer HA, Zuidema J, Kager PA, Wetsteyn JC, Lugt CB, Merkus FW

(1990), “The pharmacokinetics of artemisinin after oral, intramuscular and

rectal administration to volunteers”, Journal of Pharmacy and

Pharmacology 42 (11), pp. 810 – 813.

137. Torchilin VP (2006), Nanoparticulates as drug carriers, Imperial College

Press, London, pp. 18 – 19, 196 – 232.

138. Ulrich AS (2002), “Biophysical Aspects of using liposomes as delivery

vehicles”, Bioscience Reports, Vol. 22, No. 2, pp. 129 – 147.

139. Vaghasiya H, Kumar A, Sawant (2013), “Development of solid lipid

nanoparticles based controlled release system for topical delivery of

terbinafine hydrochloride”, International Journal of Pharmaceutical Sciences

49, pp. 311 – 322.

140. Vivek K, Reddy H, Murthy RS (2007), “Investigations of the effect of the lipid

matrix on drug entrapment, in vitro release, and physical stability of

olanzapine-loaded solid lipid nanoparticles”, AAPS PharmSciTech 8 (4),

Article 83.

141. Wagner V, Dullaart A, Bock AK & Zweck A (2006), “The emerging

nanomedicine landscape”, Nature Biotechnology, Vol 24, No.10, pp. 1.211

– 1.217.

142. Wang D, Zhou J, Chen R, Shi R, Zhao G, Xia G, Li R, Liu Z, Tian J, Wang

H, Guo Z, Wang H, Chen Q (2016), “Controllable synthesis of dual-MOFs

nanostructures for pH-responsive artemisinin delivery, magnetic resonance

and optical dual-model imaging-guided chemo/photothermal combinational

cancer therapy”, Biomaterials100, pp. 27 – 40.

143. Wang S, Chen T, Chen R, Hu Y, Chen M, Wang Y (2012), “Emodin loaded solid

lipid nanoparticles: Preparation, characterization and antitumor activity

studies”, International Journal of Pharmaceutics 430, pp. 238 – 246.

144. Want MY, Islamuddin M, Chouhan G, Dasgupta AK, Chattopadhyay AP,

Afrin F (2014), “A new approach for the delivery of artemisinin:

formulation, characterization, and ex-vivo antileishmanial studies”, Journal

of Colloid and Interface Science, 432, pp. 258 – 269.

145. Want MY, Islamuddin M, Chouhan G, Ozbak HA, Hemeg HA, Dasgupta AK,

Chattopadhyay AP, Afrin F (2015), “Therapeutic efficacy of artemisinin –

loaded nanoparticles in experimental visceral leishmaniasis”, Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces, 130, pp. 215 – 221.

146. Weber S, Zimmer A, Pardeike J (2013), “Solid lipid nanoparticles (SLN) and

nanostructured lipid carriers (NLC) for pulmonary application: A review of

the state of the art”, European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics 86 (1), pp. 7 – 22.

147. Williams III RO, Vaughn JM (2007), “Nanoparticle engineering”,

Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Informa Healthcare USA,

Inc, pp. 2.384 – 2.397.

148. Wissing SA, Kayser O, Müller RH (2004), “Solid lipid nanoparticals for parenteral

drug delivery”, Advanced Drug Delivery Reviews 56, pp. 1.257 – 1.272.

149. World Health Organization (2006), WHO monograph on good agricultural

and collection practices (GACP) for Artemisia annua L., WHO Press,

Switzerland, pp. 37 – 47.

150. World Health Organization (2010), Global report on antimalaria drug efficacy

and drug resisttance: 2000 – 2010, WHO Press, Switzerland, pp. 9 – 65.

151. World Health Organization (2011), Global plan for artemisinin resistance

containment, WHO Press, Switzerland, pp. 7 – 58.

152. World Health Organization (2015), Status report on artemisinin and ACT

resistance, WHO Press, Switzerland, pp. 1 – 8.

153. World Health Organization (2015), World malaria report 2015, WHO Press,

Switzerland, pp. 2 – 20.

154. Wu L, Zhang J, Watanabe W (2011), “Physical and chemical stability of drug

nanoparticles”, Advanced Drug Delivery Reviews 63, pp. 456 – 469.

155. Yadav N, Khatak S, Sara UV (2013), “Solid lipid nanoparticles – A review”,

International Journal of Applied Pharmaceutics, Vol 5, Issue 2, pp. 8 – 18.

156. Yaméogo JB, Gèze A, Choisnard L, Putaux JL, Gansané A, Sirima SB, Semdé

R, Wouessidjewe D (2012), “Self-assembled biotransesterified

cyclodextrins as artemisinin nanocarriers – I: Formulation, lyoavailability

and in vitro antimalarial activity assessment”, European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics 80, pp. 508 – 517.

157. Yu H, Zhao X, Zu Y, Zhang X, Zu B, Zhang X (2012), “Preparation and

characterization of micronized artemisinin via a rapid expansion of

supercritical solution (RESS) method”, International Journal of Molecular

Sciences 13 (4), pp. 5.060 – 5.073.

158. Yuan H, Wang LL, Doo YZ, You J, Hu FQ, Zeng S (2007), “Preparation and

characteristics of nanostructured lipid carriers for control - releasing

progesterone by melt emulsification”, Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces, pp. 2 – 3.

159. Zhang XQ, Xu X, Bertrand N, Pridgen E, Swami A, Farokhzad OC (2012),

“Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to

personalized nanomedicine”, Advanced Drug Delivery Reviews 64, pp.

1.363 – 1.384.

160. Zhang ZH, Zhang YL, Zhou JP, Lv HX (2012), “Solid lipid nanoparticles

modified with stearic acid-octaarginine for oral administration of insulin”,

International Journal of Nanomedicine 7, pp. 3.333 – 3.339.

161. Zheng M, Falkeborg M, Zheng Y, Yang T, Xu X (2013), “Formulation and

characterization of nanostructured lipid carriers containing a mixed lipids

core”, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects

430, pp. 76 – 84.

162. Zhuang CY, Li N, Wang M, Zhang XN, Pan WS (2010), “Preparation and

characterization of vinpocetine loaded nanostructured lipid carriers (NLC)

for improved oral bioavailability”, International Journal of Pharmaceutics

394, pp. 179 – 185.

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid rắn – lỏng (Compritol® 888

ATO – LabrafacTM PG) và ART

Gồm phụ lục 1.1 – 1.6

Phụ lục 2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

Gồm phụ lục 2.1 – 2.19

Phụ lục 3. Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART

Gồm phụ lục 3.1 – 3.26

Phụ lục 4. Đánh giá hiệu lực diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART

trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei

Gồm phụ lục 4.1 – 4.14

Phụ lục 5. Tiêu chuẩn của hệ tiểu phân nano ART

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid rắn – lỏng (Compritol®

888 ATO – LabrafacTM PG) và ART

Phụ lục 1.1. Biểu đồ nhiệt của Compritol® 888 ATO

Phụ lục 1.2. Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Comprtol® 888 ATO – LabrafacTM PG (7 : 3)

Phụ lục 1.3. Biểu đồ nhiệt của ART

Phụ lục 1.4. Biểu đồ nhiệt của Compritol 888® ATO – LabrafacTM PG – ART (7 : 3 : 0,8)

Phụ lục 1.5. Biểu đồ nhiệt của Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART (7 : 3:

0,2)

Phụ lục 1.6. Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG –

ART (7 : 3 : 1,0)

Phụ lục 2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

Phụ lục 2.1. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 6

Phụ lục 2.2. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 17

Phụ lục 2.3. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 19

Phụ lục 2.4. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 23

Phụ lục 2.5. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 26

Phụ lục 2.6. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 29

Phụ lục 2.7. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 31 (500 bar)

Phụ lục 2.8. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân CT 32 (800 bar)

Phụ lục 2.9. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước tiểu phân CT 33 (1.000 bar)

Phụ lục 2.10. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước tiểu phân CT 34 (1.100 bar)

Phụ lục 2.11. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước tiểu phân lô kiểm chứng

Phụ lục 2.12. So sánh KTTP TB của hệ tiểu phân CT 6 và CT 25, 26 và 27

Phụ lục 2.13. So sánh KTTP TB của hệ tiểu phân CT 17 – 24

Phụ lục 2.14. So sánh tỉ lệ tiểu phân < 445 nm của hệ tiểu phân CT 17, 18, 19 và 23

Phụ lục 2.15. So sánh KTTP TB của hệ tiểu phân CT 26, 28, 29 và 30

Phụ lục 2.16. So sánh KTTP TB của hệ tiểu phân đồng nhất hóa ở 500 bar, 800 bar, 1.000 bar và 1.100 bar

Phụ lục 2.17. So sánh KTTP TB của các hệ tiểu phân nano chứa hàm lượng ART khác nhau

Phụ lục 2.18. So sánh hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân nano chứa hàm lượng ART khác nhau

Phụ lục 2.19. So sánh KTTP TB của hệ tiểu phân nano ART lô tối ưu và kiểm chứng

Phụ lục 3. Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART

Phụ lục 3.1. Bảng phân tích ANOVA khảo sát tính tuyến tính

Phụ lục 3.2 Khảo sát khả năng khuếch tán qua màng của ART (theo mục 2.2.3.7)

Lượng hoạt chất phóng thích lũy tiến (mg/cm2)

Thời điểm

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 mẫu 7 Mẫu 8 Mẫu 9 Mẫu 10 Mẫu 11 Mẫu 12 TB SD

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,25 16,57 15,54 16,25 13,75 14,85 14,40 15,79 16,50 14,33 12,69 12,55 15,75 14,92 1,3949

0,5 22,09 19,51 22,06 19,33 22,93 20,42 22,12 21,44 22,52 18,40 20,02 22,36 21,1 1,4934

0,75 28,75 23,76 26,40 24,89 23,15 27,71 28,94 24,74 28,33 23,92 25,04 29,65 26,28 2,3017

1 32,07 29,84 32,96 29,48 30,93 33,42 32,23 31,77 34,90 29,47 32,87 35,36 32,11 1,95

2 38,05 39,30 35,61 38,18 37,69 38,02 37,86 40,19 37,38 39,93 39,45 39,78 38,45 1,32

3,5 42,21 40,89 40,50 40,83 41,34 41,96 42,42 42,64 42,35 41,72 42,49 41,10 41,70 0,75

5 47,69 44,98 45,51 44,68 44,92 46,56 47,70 46,68 47,56 46,37 47,46 46,56 46,39 1,12

8 49,26 47,68 49,24 47,09 49,64 48,15 50,06 49,30 49,34 48,71 49,66 48,95 48,92 0,87

) 2 m c / g m

( h c í

h t

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

t ấ h c t ạ o h g n ợ ư L

g n ó h p

Thời gian (giờ)

Phụ lục 3.3. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước tiểu phân của hệ tiểu phân

nano ART lô tối ưu (TU)

Phụ lục 3.4. Hình ảnh tiểu phân nano ART lô tối ưu chụp bằng TEM

Phụ lục 3.5. Các thông số sắc ký đánh giá tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn

Lần tiêm

1 2 3 4 5 6 TB SD RSD % Thời gian lưu (phút) 12,775 12,781 12,767 12,751 12,729 12,774 12,760 0,02 0,15 Diện tích đỉnh (mAu.phút) 67.637 66.570 68.774 66.748 66.054 67.841 67.270,67 996,38 1,48 Hệ số bất đối 1,179 1,183 1,152 1,147 1,153 1,155 1,162 0,015 1,325 Số đĩa lý thuyết 5.932 5.972 5.692 5.743 5.846 5.747 5.822,00 113,09 1,94

Phụ lục 3.6. Các thông số sắc ký đánh giá tính tương thích hệ thống của mẫu thử

Lần tiêm

1 2 3 4 5 6 TB SD RSD % Thời gian lưu (phút) 12,707 12,675 12,927 12,956 12,983 12,982 12,87 0,14 1,10 Diện tích đỉnh (mAu.phút) 81.879 83.193 83.008 82.404 82.941 81.118 82.423,83 800,35 0,97 Hệ số bất đối 1,186 1,173 1,165 1,174 1,193 1,189 1,180 0,011 0,925 Số đĩa lý thuyết 7.586 7.513 7.623 7.609 7.440 7.599 7.561,67 70,94 0,94

Phụ lục 3.7. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước tiểu phân nano ART lô nâng

cấp 1 (NC1)

Phụ lục 3.8. Hình ảnh tiểu phân nano ART lô nâng cấp chụp bằng TEM

Phụ lục 3.9. Hình ảnh tiểu phân sau 3 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC chụp bằng TEM

Phụ lục 3.10. Hình ảnh tiểu phân sau 6 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC chụp bằng TEM

Phụ lục 3.11. Hình ảnh tiểu phân sau 4 tháng bảo quản 30 ± 2 oC chụp bằng TEM

Phụ lục 3.12. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 0 (MTr 0T)

Phụ lục 3.13. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 3 (MTr 3T)

Phụ lục 3.14. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 6 (MTr 6T)

Phụ lục 3.15. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 9 (MTr 9T)

Phụ lục 3.16 Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 12 (MTr 12T)

Phụ lục 3.17. Biểu đồ phân bố và thông số kích thước hệ tiểu phân không chứa ART

tháng thứ 15 (MTr 15T)

Phụ lục 3.18. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước hệ tiểu phân nano ART

tháng thứ 3 ở 6 ± 2 oC (MT – 3TM)

Phụ lục 3.19. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước hệ tiểu phân nano ART

tháng thứ 6 ở 6 ± 2 oC (MT 6TM)

Phụ lục 3.20. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước hệ tiểu phân nano ART

tháng thứ 3 ở 30 ± 2 oC (MT 3TP)

Phụ lục 3.21. Biểu đồ phân bố và các thông số kích thước của hệ tiểu phân nano

ART tháng thứ 4 ở 30 ± 2 oC (MT 4TP)

Phụ lục 3.22. Điều kiện đông khô mẫu trong quy đình định lượng ART bằng HPLC:

 Máy đông khô: Alpha 1–4 LD plus.

 Đông lạnh ở -20 oC trong 12 giờ và đông khô ở -52 oC trong 48 giờ.

 Cho mẫu đông khô vào bình hút ẩm trong 3 giờ.

 Bảo vệ mẫu đông khô bằng túi polymer có khóa, trong ngăn mát tủ lạnh.

Phụ lục 3.23. Khảo sát độ tan của ART trong các tá dược lipid

Phương pháp: Cho một lượng thừa ART vào 2 g lipid lỏng. Khuấy liên tục (máy

khuấy Stuart® CB 162) hỗn hợp này với tốc độ 3 ở 30 oC ± 0,5 oC trong 8 giờ. Lấy

mẫu, lọc và định lượng ART bằng HPLC. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.

Chuẩn bị mẫu HPLC: Cân chính xác khoảng 20 mg mẫu vào bình định mức 10 ml,

hòa tan trong 6 ml methanol. Siêu âm 5 phút và bổ sung methanol vừa đủ thể tích. Pha

loãng với tỉ lệ phù hợp. Lọc qua màng lọc 0,45 m và định lượng ART bằng HPLC.

Kết quả: Kết quả khảo sát độ tan của ART được trình bày trong bảng 1.

Bảng 1. Kết quả khảo sát độ tan của ART trong lipid lỏng

Nhiệt độ 30 oC ± 0,5 oC

Lượng ART tan trong LabrafacTM PG (mg/g) (n = 3) 34,54 ± 1,19

Lượng ART tan trong LabrafacTM CC (mg/g) (n = 3) 29,36 ± 2,33

Kết luận: ART dễ tan trong LabrafacTM PG và LabrafacTM CC. Lượng ART hòa tan

trong lipid LabrafacTM PG nhiều hơn LabrafacTM CC. Do đó, chọn LabrafacTM PG

là thành phần lipid lỏng để hòa tan ART.

Phụ lục 3.24. Sắc ký đồ HPLC định lượng toàn phần và ART không nang hóa lô tối ưu.

Hình 1. Sắc ký đồ ART định lượng toàn phần lô tối ưu

Hình 2. Sắc ký đồ ART không nang hóa của lô tối ưu

Phụ lục 3.25. Sắc ký đồ HPLC định lượng toàn phần và ART không nang hóa lô

kiểm chứng.

Hình 3. Sắc ký đồ ART định lượng toàn phần lô kiểm chứng

Hình 4. Sắc ký đồ ART không nang hóa của lô kiểm chứng

Phụ lục 3.26. Sắc ký đồ HPLC định lượng toàn phần và ART không nang hóa lô

nâng cấp.

Hình 5. Sắc ký đồ ART định lượng toàn phần lô nâng cấp

Hình 6. Sắc ký đồ ART không nang hóa lô nâng cấp

Phụ lục 4. Đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano

ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei

Ngày theo dõi / chuột 1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35

Mật độ KST trong máu chuột (lô 1) 3 2 3 4 3 4 2 3 3 4 5 5 5 5

2 2 2 2 3 3 2 5 5 5 5 5 5 5

1 3 2 2 2 3 3 3 4 5 5 5 5 5

4 2 2 4 3 3 2 4 3 3 5 5 5 5

5 1 2 3 3 4 3 4 4 4 5 5 5 5

6 1 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 5 5

7 3 3 2 2 3 3 3 3 3 2 4 5 5

8 1 3 3 4 3 3 3 3 3 1 4 5 5

9 1 1 3 3 3 2 4 5 5 5 5 5 5

10 2 2 3 2 2 2 2 3 4 5 5 5 5

TB 1,8 2,2 2,9 2,8 3,1 2,5 3,5 3,7 4,0 4,3 4,8 5,0 5,0

Phụ lục 4.1. Mật độ KST (lô 1)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 6) 3 2 1 0 0 0 0 0 0 1 2 2 2 5

5 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2

4 3 2 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1

6 2 1 0 0 0 0 0 0 1 2 1 5 5

1 2 2 0 0 0 0 0 1 3 5 5 5 5

2 3 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 5

7 3 2 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0

8 3 2 1 0 0 0 0 0 1 1 2 1 1

9 10 2 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 0 5 0 5 0 5 0

TB 2,4 1,4 0,3 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,9 1,5 1,9 2,1 2,9

1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35 Phụ lục 4.3. Mật độ KST (lô 7)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 7) 3 1 0 0 1 0 0 0 0 0 2 2 1 5

4 2 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1

5 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 3 2 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 5

2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1

1 2 2 1 0 0 0 0 0 0 1 2 5 5

1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35

7 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1

9 3 2 0 0 0 0 1 0 0 2 0 5 5

10 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

TB 2,0 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,9 0,8 1,5 2,4

Phụ lục 4.2. Mật độ KST (lô 6)

Mật độ KST trong máu chuột (lô 8)

Ngày theo dõi / chuột

2 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 3 1 0 0 0 0 0 0 1 2 2 5 5

4 3 1 0 0 0 0 0 0 1 1 2 1 1

5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 2 1 0 0 0 0 0 0 0 2 3 5 5

7 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 2 0 1 1 0 0 0 0 1 0 3 5 5

9 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

10 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 5

TB 2,5 0,9 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 0,5 1,2 1,7 2,1

1 3 1 2 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 9 0 14 0 17 0 21 0 28 0 35 Phụ lục 4.5. Mật độ KST (lô 9)

Mật độ KST trong máu chuột (lô 8)

Ngày theo dõi / chuột

2 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 5

4 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 5

5 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2

7 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

9 2 0 0 0 0 0 0 0 1 2 2 1 5

10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

TB 2,8 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,7 0,7 1,9

1 2 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 9 0 14 0 17 1 21 1 28 1 35 Phụ lục 4.6. Mật độ KST (lô 2)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 2) 3 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5

5 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0

4 1 2 1 0 0 0 0 0 2 2 2 2 5

1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1

6 2 2 1 1 0 0 0 0 1 2 2 3 5

2 3 2 1 0 0 0 0 1 1 0 2 3 5

7 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 4 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

9 10 TB 2 2,2 3 1 1,5 2 1 0,6 0 1 0,3 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0 0,1 0 1 0,9 1 0 0,6 1 1 0,8 1 3 1,3 1 5 2,6 0

1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35

Phụ lục 4.4. Mật độ KST (lô 8)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 3) 6 3 2 3 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 1 5 1

4 2 0 1 0 1 0 0 0 3 2 2 2 1

5 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 2 4 5

2 3 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

1 1 3 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 1

7 2 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

8 2 3 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1

9 2 2 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0

10 2 3 0 1 0 0 0 0 1 0 1 2 5

TB 2,1 1,5 0,4 0,1 0,2 0,2 0,0 0,1 0,8 0,4 0,8 1,3 1,9

1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35 Phụ lục 4.8. Mật độ KST (lô 4)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 4) 3 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1

6 2 3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

2 2 3 1 0 0 0 0 0 1 3 5 5 5

4 1 1 1 0 1 0 0 0 3 2 4 5 5

5 3 2 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

7 2 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2 0

8 4 2 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

9 3 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0

10 1 2 1 0 0 0 0 0 1 1 3 5 5

TB 2,1 1,8 0,7 0,1 0,2 0,2 0,0 0,1 0,8 0,8 1,3 2,0 1,6

1 2 1 1 2 2 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 9 0 14 0 17 0 21 1 28 0 35 Phụ lục 4.9. Mật độ KST (lô 5)

Ngày theo dõi / chuột

Mật độ KST trong máu chuột (lô 5) 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

1 2 3 4 5 6 7 9 14 17 21 28 35

1 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 3 3 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1

4 2 2 1 0 1 0 0 0 3 2 2 2 1

5 4 2 2 0 0 0 0 0 1 1 0 4 5

7 3 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

8 3 2 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

9 3 2 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0

10 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 2 5

TB 2,5 1,8 0,7 0,2 0,2 0,2 0,0 0,1 0,8 0,4 0,5 1,4 1,8

6 3 2 0 1 0 0 0 0 1 0 0 3 5 Chuột chết do mật độ ký sinh trùng cao, ghi chú ̎5 ̎.

Phụ lục 4.7. Mật độ KST (lô 3)

Phụ lục 4.10. So sánh mật độ KST trong máu chuột ngày theo dõi thứ 2 của lô 1 – 9

Phụ lục 4.11. So sánh mật độ KST trong máu chuột ngày thứ 35 của lô 1 – 9

Phụ lục 4.12. Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột

Phụ lục 4.13. So sánh ngày bắt đầu sạch KST trong máu

Phụ lục 4.14. So sánh số ngày duy trì tình trạng sạch KST trong máu của lô 2 – 9

Phụ lục 5. Tiêu chuẩn của hệ tiểu phân nano ART

Khoa Dược TIÊU CHUẨN Số TC:

Đại học Y Dược TPHCM HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ Có hiệu lực từ:

Quyết định ban hành số: , ngày tháng năm 2017

I. TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT

1.1. CÔNG THỨC BÀO CHẾ CHO LÔ 1.000 G

Artemisinin 8 g

Compritol® 888 ATO 70 g

LabrafacTM PG 30 g

Polysorbat 80 10 g

SimulsolTM 4000 P 10 g

Nước cất vđ 1.000 g

1.2. TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU

Artemisinin (Lô 100309-1001IN) Đạt tiêu chuẩn DĐ Việt Nam IV (2010)

Compritol® 888 ATO Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011)

LabrafacTM PG Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011)

Polysorbat 80 Đạt tiêu chuẩn DĐ Châu Âu 7.0 (2011)

SimulsolTM 4000 P Đạt tiêu chuẩn DĐ Mỹ 34 (2011)

1.3. CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM

1.3.1. Cảm quan: Hệ tiểu phân nano artemisinin đồng nhất, không kết bông, không

nổi kem và không tách lớp.

1.3.2. Kích thước

Tiểu phân nano artemisinin có kích thước trung bình trong khoảng 105 – 125 nm,

dãy phân bố kích thước từ 58 – 339 nm, d10 trong khoảng 70 – 85 nm, d90 trong

khoảng 150 – 180 nm.

1.3.3. Hình thể học

Tiểu phân nano artemisinin có hình cầu, kích thước trong khoảng 58 – 339 nm.

1.3.4. Thế zêta

Trị tuyệt đối của thế zêta trong khoảng |–13,5| – |–16,5| mV.

1.3.5. Phần trăm nang hóa

Hệ tiểu phân nano artemisinin phải có phần trăm nang hóa trong khoảng 7,0 – 8,5%.

1.3.6. Hiệu suất nang hóa

Hệ tiểu phân nano artemisinin phải có hiệu suất nang hóa không ít hơn 92%.

1.3.7. Phóng thích hoạt chất

Lượng artemisinin phóng thích phải nằm trong khoảng 12 – 15 mg/cm2.

II. PHƯƠNG PHÁP THỬ

2.1. CẢM QUAN

Quan sát bằng mắt thường, hệ tiểu phân phân tán đồng nhất, không xuất hiện sự

chuyển đổi màu sắc, không kết bông hay nổi kem,…

2.2. KÍCH THƯỚC VÀ DÃY PHÂN BỐ KÍCH THƯỚC

2.2.1. Thiết bị thử nghiệm

Máy phân tích kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser.

2.2.2. Cách tiến hành

Phân tích trên máy phân tích kích thước tiểu phân. Tráng tế bào đo bằng nước cất,

cho nước cất vào tế bào đo, khử khí và đo đường nền. Tráng tế bào đo bằng mẫu

phân tích, cho mẫu vào tế bào đo, khử khí và phân tích mẫu.

2.3. HÌNH THỂ HỌC

2.3.1. Thiết bị thử nghiệm

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

2.3.2. Cách tiến hành

Phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Pha loãng mẫu bằng nước

cất với tỉ lệ phù hợp (thường là 1 : 9), trải mẫu pha loãng lên lưới đồng đã được phủ

bởi màng carbon theo phương pháp bốc bay chân không. Đặt lưới đồng chứa mẫu

vào đĩa petri, hút ẩm trong khoảng 24 giờ để làm khô mẫu. Khảo sát mẫu với nguồn

electron có điện thế gia tốc là 100 kV.

2.4. THẾ ZÊTA

2.4.1. Thiết bị thử nghiệm

Máy phân tích kích thước tiểu phân có chức năng đo thế zêta.

2.4.2. Cách tiến hành

Đo thế zêta bằng máy phân tích kích thước tiểu phân. Pha loãng mẫu bằng nước cất

với tỉ lệ phù hợp (thường là 1 : 9), cho vào cốc đo, khử khí và đo mẫu.

2.5. ĐỊNH LƯỢNG ARTEMISININ: SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

2.5.1. Điều kiện sắc ký

Pha động: Hỗn hợp acetonitril – nước (68 : 32).

Cột thép không gỉ (250 mm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm). Nhiệt độ phân

tích được duy trì ở nhiệt độ phòng.

Detector quang phổ tử ngoại đặt tại bước sóng 216 nm.

Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

2.5.2. Dung dịch chuẩn

Cân chính xác khoảng 2 mg ART chuẩn vào bình định mức 2 ml, hòa tan bằng pha

động, siêu âm và bổ sung pha động vừa đủ thể tích. Lấy 100 l dung dịch, cho vào

bình định mức 2 ml, bổ sung pha động vừa đủ thể tích. Lắc đều và lọc qua màng lọc

0,2 m, bỏ vài giọt đầu. Dung dịch chuẩn có nồng độ 50 g/ml.

2.5.3. Dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 50 mg mẫu đông khô, đun cách thủy (80 oC), hòa tan trong 6

ml methanol. Siêu âm 5 phút, ly tâm 3.500 vòng/phút (10 phút). Lọc, rửa tủa bằng 2

ml methanol (2 lần), thu dịch lọc vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol vừa

đủ thể tích. Pha loãng 5 lần bằng pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,2 m, bỏ

vài giọt đầu. Định lượng ART bằng HPLC.

2.5.4. Cách tiến hành

Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn, phép thử có giá trị khi độ lệch chuẩn tương

đối của diện tích đỉnh và thời gian lưu của artemisinin nhỏ hơn 2%.

Tiêm dung dịch thử. Tính hàm lượng (%) của artemisinin từ diện tích đỉnh của dung

dịch thử và dung dịch chuẩn.

2.5.5. Cách tính hàm luợng (%) artemisinin

𝑋 (%) = . 100 𝑆𝑡. 𝐶𝑐. 𝐻𝐿𝐶. 𝐹. 100 𝑆𝑐. 𝑚

Sc, St Lần lượt là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn và thử

Nồng độ (mg/ml) dung dịch chuẩn Cc

HLC Độ tinh khiết (%) của chuẩn

F Độ pha loãng của mẫu thử

m Khối lượng (g) của mẫu thử

2.6. PHẦN TRĂM NANG HÓA VÀ HIỆU SUẤT NANG HÓA: PHƯƠNG

PHÁP SIÊU LỌC

2.6.1. Thiết bị thử nghiệm

Dụng cụ lọc với màng có kích thước lỗ lọc là 3.000 Da.

2.6.2. Cách tiến hành

Cân chính xác khoảng 250 mg mẫu vào ngăn trên của dụng cụ lọc. Ly tâm 20.000

vòng/phút (tương đương 29.060 g) trong 20 phút (2 lần). Thu dịch lọc và định lượng

artemisinin tự do bằng HPLC.

2.6.3. Tính phần trăm nang hóa và hiệu suất nang hóa

𝑃ℎầ𝑛 𝑡𝑟ă𝑚 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑥 100 𝑛1 𝑛2

𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) = 𝑥 100 𝑛1 𝑛3

Lượng hoạt chất nang hóa n1

Lượng lipid n2

Lượng hoạt chất định lượng toàn phần n3

Lượng hoạt chất định lượng toàn phần là lượng hoạt chất trong tiểu phân và trong

môi trường phân tán. Lượng hoạt chất nang hóa là hiệu số giữa lượng hoạt chất

định lượng toàn phần và hoạt chất trong môi trường phân tán tán – đây là lượng

hoạt chất tự do, không nang hóa trong tiểu phân.

2.7. PHÓNG THÍCH HOẠT CHẤT: PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN QUA

MÀNG

2.7.1. Thiết bị thử nghiệm

Túi thẩm tách có chiều dài 5 cm (diện tích 3,2 cm2 tương ứng với 1 cm chiều dài

túi) được tạo thành bằng cách kẹp kín hai đầu của màng bán thấm có MWCO

6.000–8.000 bằng kẹp nổi và kẹp từ. Màng bán thấm được ngâm trong nước cất hai

lần (1 giờ), rửa bằng nước cất hai lần (3 lần) trước khi sử dụng.

2.7.2. Điều kiện thử nghiệm

Môi trường thử nghiệm là 500 ml đệm phosphat pH 6,8 có natri laurylsulfat 0,5%.

Nhiệt độ môi trường thử nghiệm: 37 ± 0,5 oC. Tốc độ quay: 100 vòng/phút. Thời

điểm lấy mẫu: ¼ giờ, ½ giờ, ¾ giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3,5 giờ, 5 giờ và 8 giờ. Thể tích lấy

mẫu: 5 ml, bù dịch bằng môi trường đệm với thể tích tương ứng. Lọc mẫu qua màng

lọc 0,2 µm và định lượng bằng HPLC.

2.7.3. Cách tính lượng hoạt chất khuếch tán (mg/cm2) tại thời điểm i

+ 𝑋𝑖 (mg/cm2) = 𝑋𝑖−1 1 100 𝑆𝑡. 𝐶𝑐. 𝐻𝐿𝐶. 𝑉. 100 𝑆𝑐. 𝑚1. d. 3,2

i Thời điểm lấy mẫu

Lần lượt là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn và thử Sc, St

Cc, HLC Lần lượt là nồng độ (mg/ml) và độ tinh khiết (%) của chuẩn

Lượng hoạt chất khuếch tán của mẫu thử tại thời điểm i Xi

Thể tích (ml) của môi trường thử nghiệm V

Khối lượng (g) mẫu thử nghiệm m1

d Chiều dài túi thẩm tách (cm)

3,2 Diện tích (cm2) ứng với 1 cm chiều dài túi

III. BẢO QUẢN

Bảo quản: Trong tủ lạnh, nhiệt độ 6 ± 2 oC.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 05 năm 2017

Người soạn tiêu chuẩn

DS KHƯU MỸ LỆ