Các ph Các ph
ươ ươ
ệ ệ
ng pháp ch n đoán b nh ẩ ng pháp ch n đoán b nh ẩ cúm gia c mầ cúm gia c mầ
Chẩn đoán huyết thanh học Chẩn đoán huyết thanh học •Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) •Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) Chẩn đoán virus học Chẩn đoán virus học •Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng Giám định virus bằng kỹ thuật PCR •Giám định virus bằng kỹ thuật PCR
Chẩn đoán virus học Chẩn đoán virus học
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm • Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong ống nhựa đã khử trùng chứa 12 ml dung dịch ống nhựa đã khử trùng chứa 12 ml dung dịch bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn . phát triển của vi khuẩn . Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập • Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu , virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu , nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì phải giữ ở nhiệt độ 700 C phải giữ ở nhiệt độ 700 C
Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
μ μ Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2) • Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2) thành huyễn dịch 10% thành huyễn dịch 10% Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi • Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm • Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong tủ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng sinh lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu không tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua màng được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua màng μ lọc 0,45 m hoặc 0,22 m. μ lọc 0,45 m hoặc 0,22 m.
Phân lập virus trên phôi gà Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm • Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm vào túi niệu phôi gà 911 ngày tuổi vào túi niệu phôi gà 911 ngày tuổi Tiêm truyền trên phôi gà • Tiêm truyền trên phôi gà Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên • Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi • Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ đã • Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ đã đục vào túi niệu lượng 0,10,2 ml huyễn đục vào túi niệu lượng 0,10,2 ml huyễn dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng. dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng. Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin • Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin
Phân lập virus trên phôi gà Phân lập virus trên phôi gà
Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày • Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày Thu hoạch nước trứng • Thu hoạch nước trứng Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ • Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ ấm 200 C trong 30 phút . ấm 200 C trong 30 phút . Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía • Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía buồng hơi buồng hơi Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm • Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm 10ml. 10ml. Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm • Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm 700 C 700 C Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu • Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 23 lần âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 23 lần
ả ứ ả ứ t tách RAN t t tách RAN t
B B c1: chi c1: chi
Ph n ng RT-PCR Ph n ng RT-PCR ế ế
ừ ệ ừ ệ b nh ph m b ng ẩ b nh ph m b ng ẩ ằ ằ ướ ướ
TRIZOL TRIZOL
l TRIZOL. l TRIZOL.
l chlorofrom, đậy nắp chặt. l chlorofrom, đậy nắp chặt.
μ Cho 750 l bệnh phẩm vào ống 1,5 ml • Cho 750 μ l bệnh phẩm vào ống 1,5 ml μ Thêm 250 • Thêm 250 μ Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng . • Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng . μ Thêm 250 • Thêm 250 μ Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây. • Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. • Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. • Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
t tách RNA t t tách RNA t B B c1: chi c1: chi
Phản ứng RTPCR Phản ứng RTPCR b nh ph m b ng ẩ b nh ph m b ng ẩ
ừ ệ ừ ệ ế ế ằ ằ ướ ướ
TRIZOL TRIZOL
l sang một ống mới. l sang một ống mới.
μ Hút 450500 • Hút 450500 μ μ l iso propanol, trộn bằng pipet rồi giữ Thêm 500 • Thêm 500 μ l iso propanol, trộn bằng pipet rồi giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời • Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. gian 5 phút. Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ • Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. 10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. Để khô ở nhiệt độ phòng . • Để khô ở nhiệt độ phòng . μ l nước. Cho thêm 20 60 • Cho thêm 20 60 μ l nước.
B B
c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b
ướ ướ
ế ế
ư ớ )) c c ư ớ
Nguyên liệu : : Nguyên liệu Kit QIAGen Onestep RTPCR (catalog • Kit QIAGen Onestep RTPCR (catalog #210212) gồm: #210212) gồm: Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT • Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT PCR (chứa Omn iscript TMRT, Sesicript PCR (chứa Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT và HotstarTaq TM DNA TMRT và HotstarTaq TM DNA polymerase) polymerase) Dung d ịch QIAGen Onestep RTPCR, 5X. • Dung d ịch QIAGen Onestep RTPCR, 5X. Dung d ịch Qsolution 5X. • Dung d ịch Qsolution 5X.
B B
c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b
ướ ướ
ế ế
ư ớ )) c c ư ớ
l).μ l).μ
Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại . • Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại . Nước RNAse Free. • Nước RNAse Free. Chất ức chế RNAse( 40U/ • Chất ức chế RNAse( 40U/ Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml. • Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml. l.μ Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 • Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 l.μ Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ • Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút phút
B B
c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b c 2:Ti n hành RT-PCR ( 1 b
ướ ướ
ế ế
ư ớ )) c c ư ớ
Máy lắc vortex. • Máy lắc vortex. Máy nhân gen . • Máy nhân gen . RNA của virus kiểm tra . • RNA của virus kiểm tra . RNA đối chứng dương tính . • RNA đối chứng dương tính . Primer forward và primer reverse . • Primer forward và primer reverse . Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R. • Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R.
Các b Các b
c ti n hành ph n ng PCR (1 b c ti n hành ph n ng PCR (1 b
c ) c )
ướ ế ướ ế
ả ứ ả ứ
ướ ướ
l.μ l.μ l.μ l.μ
đánh dấu c ác ống ly tâm nhỏ 0,5 ml A, B, C riêng rẽ. • đánh dấu c ác ống ly tâm nhỏ 0,5 ml A, B, C riêng rẽ. Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau : • Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau : l.μ • Dung dịch 5XRT PCR 10 Dung dịch 5XRT PCR 10 l.μ l.μ 10mM dNTPs 2 10mM dNTPs 2 • l.μ l.μ Enzym hỗn hợp 2 • Enzym hỗn hợp 2 l.μ Chất ức chế RNAse 0,25 • Chất ức chế RNAse 0,25 Nước RNAse free 31,75 • Nước RNAse free 31,75 μ • Nhỏ 46 l hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR Nhỏ 46 μ l hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR μ l. Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C. Th êm 1 • Th êm 1 μ l. Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C. μ l RAN ki ểm tra v ào c ác ống A Th êm 2 • Th êm 2 μ l RAN ki ểm tra v ào c ác ống A μ μ2 l RNA đối chứng H5N1 vào ống B 2 • l RNA đối chứng H5N1 vào ống B μ l nước RNAse – Free vào ống C μ2 2 • l nước RNAse – Free vào ống C • Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống . Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống .
Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước ) Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước )
Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để • Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để nhân gen . nhân gen . C trong 1 phút – 6060o o C trong 1 phút C trong 0,5 phút – 4242o o C trong 0,5 phút C trong 10 phút – 4242o o C trong 10 phút – 50500 0 C trong 30 phút C trong 30 phút C trong 15 phút – 95950 0 C trong 15 phút C trong 30 giây (tách sợi ) – 94940 0 C trong 30 giây (tách sợi ) C trong 30 giây (gắn primer) – 50500 0 C trong 30 giây (gắn primer) – 72720 0 C trong 1 phút C trong 1 phút Quay lại bước sáu 34 lần – Quay lại bước sáu 34 lần C trong 10 phút – 72720 0 C trong 10 phút
• 440 0 C C
Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR
l.μ l.μ
l.) l.)
Nguyên liệu.. Nguyên liệu Khay đổ khuôn thạch và buồng điện di • Khay đổ khuôn thạch và buồng điện di Nguồn điện và điện cực • Nguồn điện và điện cực • Đèn cực tím cầm tay(302 nm) hoặc hộp đèn cực tím Đèn cực tím cầm tay(302 nm) hoặc hộp đèn cực tím Máy ảnh và phim • Máy ảnh và phim Pipette và đầu tip 10 • Pipette và đầu tip 10 Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen) • Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen) Dung d ịch TBE 1X • Dung d ịch TBE 1X μ μ • Ethidium bromide ( 10 g/ Ethidium bromide ( 10 g/ μ μ Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25% XC) • Dung dịch nạp thạch (GLB: 30% glycogen; 0,25% BPB v à 0,25% XC) M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen) • M arker trọng lượng phân tử ( thang DNA 100bp) (invitrogen) Ống microtube chứa sản phẩm PCR • Ống microtube chứa sản phẩm PCR • DNA đối chứng dương tính DNA đối chứng dương tính
Các bước tiến hành Các bước tiến hành
l các sản phẩm PCR từ các ống phản l các sản phẩm PCR từ các ống phản
μ μ
Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào • Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp thạch thạch • Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5 ml a, b, c Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5 ml a, b, c μ Lấy 5 • Lấy 5 μ ứng vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với ứng vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với μ μ2 l dung dịch nạp(GLB) 2 l dung dịch nạp(GLB) • Cho 5 l marker trọng lượng phân tử vào giếng Cho 5 l marker trọng lượng phân tử vào giếng thứ nhất của miếng thạch 1,5% thứ nhất của miếng thạch 1,5%
Các bước tiến hành Các bước tiến hành
μ μ
Cho 7 l sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm • Cho 7 l sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch theo thứ tự từ a đến c theo thứ tự từ a đến c • Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy điện di ở điện thế 120V trong 30 40 phút điện di ở điện thế 120V trong 30 40 phút • Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực tím có bước sóng 302nm tím có bước sóng 302nm • Ghi lại hình bằng máy ảnh Ghi lại hình bằng máy ảnh
Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân tửtử
μ μ μ μ
μ μ
Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong • Thạch agarose 0,8% : 0,8 g thạch agarose trong 100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water 100ml dung dịch TBE 1X , đun nóng bằng water bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan bath hoặc lò vi sóng đến khi hoà tan • Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc Ethidium Bromide (EB): sử dụng dung dịch gốc l đổ vào thạch agarose để có hàm lượng 10 g/ l đổ vào thạch agarose để có hàm lượng 10 g/ cuối cùng là 0,5 g/ml cuối cùng là 0,5 g/ml • Bromophenol Blue(BPB): BPB là một thành Bromophenol Blue(BPB): BPB là một thành phần của dung dịch nạp (GLB), BPB được sử phần của dung dịch nạp (GLB), BPB được sử dụng rộng rãi như một chất thuốc nhuộm điện di dụng rộng rãi như một chất thuốc nhuộm điện di cho axit cho axit
