Chẩn đoán di truyền ở các bệnh nhân mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Và mục tiêu nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chẩn đoán di truyền ở các bệnh nhân mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH Ngô Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy*,**, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương*,** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2. Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA (Multiplex ligation‐ dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2. Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2. Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH. Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA. ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507 Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH)is a genetic disease caused by mutations in the CYP21A2gene which is located on chromosome 6. Detection of CYP21A2 gene mutations is important for diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of CYP21A2 gene mutations. Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene. Patients and Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients was extracted by Qiagen kit. After that we performedsequencing technique to identify point mutations and MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene. Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene. Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis of CYP21A2 mutations causing CAH disease. Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA . lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase ĐẶT VẤN ĐỀ 5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây Bệnh tăng sản tuyến thượng thận (CAH) là các thể bệnh: 3β-HSD, 17α‐hydroxylase và 20, bệnh di truyền trong đó thể thiếu enzym 21‐ 22‐desmolase ít gặp hơn. Sự khiếm khuyết của hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ enzyme 21‐hydroxylase dẫn đến mức độ khác * Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ môn Hóa sinh, ***Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, Email: suongnguyenmd@gmail.com 502 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 nhau của việc suy giảm tổng hợp cortisol và giảm/hoặc không giảm aldosterone đi kèm với tăng sinh tổng hợp nội tiết tố androgen. Những bất thường này dẫn đến nam hóa các thai nhi nữ, phát triển thể trạng nhanh hơn bình thường và giả dậy thì sớm ở trẻ nam. Trong đó thể mất muối là hình thức nghiêm trọng nhất của bệnh, do thiếu sinh tổng hợp aldosterone dẫn đến không có khả năng để giữ natri. Nếu không được điều trị kịp thời sẽ dễ nhanh chóng tử vong trong vài tuần(4). Tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới là 1/14.000‐ 15.000 trẻ em sơ sinh, trong đó thể thiếu enzym 21 – hydroxylase chiếm tỷ lệ 1/10.000 trẻ sinh ra(2,3). Ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có đề tài nghiên cứu về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ người lành mang gen bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Theo thống kê tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương, số lượng bệnh nhân hàng năm tăng lên, trung bình mỗi năm khoảng 40 – 70 bệnh nhân nhập viện và được điều trị tại khoa. Tính đến tháng 6 năm 2010 tổng số bệnh nhân lên đến 512 trẻ. Hiện nay, Việt Nam được coi là một trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc CAH cao trên thế giới(9). Nguyên nhân gây bệnh được khẳng định chủ yếu do đột biến gen CYP21A2. Gen CYP21A2 mã hóa enzyme 21‐hydroxylase, nằm trên cánh ngắn NST số 6 (6p21.3) có chiều dài khoảng 30 kb. Phần lớn các đột biến (95%) do sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫn đến trình tự ở vùng giả gen CYP21A1P sẽ chuyển sang gen CYP21A2 trong quá trình phân bào giảm nhiễm, 5% còn lại là do gen CYP21A2 tự đột biến(8, 10). Việc phân tích đột biến gen CYP21A2 có vai trò quan trọng xác định bệnh cũng như phân loại bệnh, giúp định hướng chỉ định điều trị bằng liệu pháp hormon thay thế suốt đời và là cơ sở của tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu:“Ứng dụng kỹ thuật giải trình Nhi Khoa Nghiên cứu Y học tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2”. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nhóm nghiên cứu: 2 bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Nhóm đối chứng: 2 người bình thường không mắc bệnh lý gì đặc biệt, mẫu đối chứng này được dùng để chuẩn kỹ thuật và chạy cùng với mẫu bệnh nhân. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số Bước 1: Thu 2 ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA của bệnh nhân. Bước 2: Sử dụng 200 μl máu tĩnh mạch chống đông EDTA để tách chiết DNA tổng số, sử dụng bộ tách chiết QIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen). Bước 3: Hòa mẫu DNA trong 200 μl TE 1X, bảo quản ở ‐200C. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng máy đo quang phổ Sử dụng 1‐5 μl DNA sau khi tách chiết, kiểm tra bằng hệ thống máy định lượng quang phổ DNA Nanodrop 2000c. Độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng tiếp theo. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến exon 9 của gen CYP21A2, phản ứng PCR được thực hiện trên máy khuyếch đại gen Eppendorft. Kỹ thuật điện di thường trên gel agarose Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose nồng độ 1%, đệm TBE 1X, kết quả được đọc trên máy geldoc. Mẫu bệnh nhân luôn được tiến hành cùng với mẫu người bình thường. 503 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Kỹ thuật MLPA (multiplex ligation – dependent probe amplification) Sử dụng kit MLPA P050 (MRC ‐ Holland) bao gồm 3 giai đoạn chính: ‐ Biến tính và lai DNA: 100 ng DNA (hòa trong 5μl) được biến tính và lai với 1,5μl hỗn hợp probe cùng 1,5μl buffer MLPA (chu trình nhiệt: 98oC – 5 phút, 25oC – tạm dừng, 95oC– 1 phút, 60oC ‐ 16 giờ). Nhận xét: Phản ứng PCR đã khuếch đại được hai đoạn: đoạn 1 từ exon 1 đến exon 3 (có kích thước 1157 bp) và đoạn 2 từ exon 3 đến exon 9 (có kích thước 2051 bp), sản phẩm PCR của bệnh nhân và người bình thường có kích thước như nhau, bờ đều sắc nét. Từ đó chúng tôi tiến hành giải trình tự sản phẩm khuếch đại của bệnh nhân. Kết quả giải trình tự gen ‐ Phản ứng nối: thực hiện bằng enzyme ligase (chu trình nhiệt: 54oC – 15 phút và 98oC – 5 phút). ‐ Phản ứng PCR: tiến hành thực hiện các quy trình nhiệt để khuếch đại các probe đã nối, thành phần phản ứng PCR gồm: primer, Taq polymerase, nước (chu trình nhiệt: 95oC – 1 phút, 30 chu kì với 95oC – 30 giây, 60oC – 30 giây, 72oC – 1 phút và kéo dài ở 72oC – 20 phút, 4oC dừng). Điện di và phân tích kết quả: điện di mao quản trên máy Beckman Coulter. Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.92 để phân tích kết quả. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bệnh nhân CAH 01 Kết quả PCR BN BT Exon 1- 3 - BN BT - Exon 3 - 9 Hình 1: Khuếch đại exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến exon 9 của gen CYP21A2. BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường, (‐): Mẫu nước 504 Hình 2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân CAH 01. Nhận xét: Tại vị trí c.1276 của bệnh nhân xuất hiện một đỉnh của nucleotid T, trong khi đó trình tự của genBank là C. Sự sai khác này làm thay đổi acid amin arginine tại vị trí codon 426 thành acid amin cysteine. Đột biến này đã được Grischuk công bố vào năm 2006 trên tạp chí J.Clin Endocrinol Metab(5). Như vậy chúng ta khẳng định bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử tại c.1276C>T. Hình 3. Kết quả giải trình tự exon 1 của gen CYP21A2. Nhận xét: Tại codon 10 của bệnh nhân có chèn thêm 3 nucleotid TGC, trong khi đó trình tự genBank NG_007941 không có codon này. Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nhận xét: Tại các đỉnh tương tứng với exon 1 và exon 3 của gen CYP21A2, mẫu người bình thường xuất hiện đỉnh nhưng mẫu bệnh nhân không xuất hiện đỉnh, chứng tỏ rằng bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2. Xét các đỉnh của exon 4, 6, 8, chiều cao đỉnh của bệnh nhân chỉ bằng ½ so với mẫu người bình thường, chứng tỏ rằng bệnh nhân bị đột biến mất đoạn dị hợp tử từ exon 4 đến exon 8. Bệnh nhân CAH 02 Kết quả PCR BN BT BN Nghiên cứu Y học BT BÀN LUẬN Exon 1- 3 Exon 3 - 9 Hình 4. Kết quả PCR khuếch đại gen CYP21A2 của bệnh nhân CAH 02 BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường Nhận xét: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy ở mẫu người bình thường xuất hiện hai vạch điện di tương ứng với 2 đoạn được khuếch đại có kích thướng 1157 bp và 2051 bp. Trong khi đó mẫu bệnh nhân không lên vạch, điều này chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến tại vùng gắn mồi, do vậy không khuếch đại được sản phẩm PCR. Kết quả MLPA Mẫu bệnh nhân được thực hiện phản ứng MLPA cùng mẫu đối chứng (người bình thường) để so sánh. Ex 3 Ex 1 Ex 4 Ex 6 Ex 8 Hình 5. Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân CAH 02 Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải): mẫu bệnh nhân CAH 02. Nhi Khoa Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh là bệnh di truyền liên quan đến rối loạn hormone của tuyến thượng thận, nguyên nhân chính gây bệnh là do đột biến gen CYP21A2. Tuy nhiên trong cơ thể chúng ta tồn tại gen CYP21A1P là gen giả (không có chức năng), có trình tự nucleotide tương đồng 98% so với gen CYP21A2. Như vậy vấn đề chỉ khuếch đại gen CYP21A2 để phân tích đột biến ở bệnh nhân CAH là vấn đề rất khó khăn. Dựa vào sự khác biệt 8 bp tại exon 3 của hai gen này chúng tôi đã chọn lựa hai cặp mồi được thiết kế để chỉ khuếch đại chọn lọc gen CYP21A2 mà không khuếch đại được gen CYP21A1P(7). Phản ứng PCR ở bệnh nhân CAH 01 khuếch đại được toàn bộ gen CYP21A2 gồm 2 đoạn: đoạn gen từ exon 1 đến exon 3 (có kích thước 1157 bp) và đoạn từ exon 3 đến exon 9 (kích thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải trình tự và kết quả phát hiện bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử ở vị trí c.1276 C>T, đột biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã được Grischuk công bố vào năm 2006 trên tạp chí J ClinEndocrinoMetab(5). Arginine là một trong 4 acid amin có liên kết hydro với chuỗi propionate của heme (cysteine‐169, glycine‐178, tryptophan‐302 và arginine‐426), điều này không chỉ giúp định hướng heme trong protein mà còn tham gia vào việc vận chuyển điện tử. Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí codon 426 thành acid amin cysteine sẽ phá vỡ các liên kết hydro với nhân tố heme, khiến 505 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 protein không có chức năng và gây thể mất muối CAH(6). Ở bệnh nhân này chúng tôi còn tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm 3 nucleotid TGC, kiểm tra kết quả SNP trên website NCBI chúng tôi phát hiện đây chỉ là SNP chứ không phải đột biến. Từ kết quả này cho thấy chúng tôi đã bước đầu hoàn thiện được các yếu tố thực hiện quy trình PCR để khuếch đại gen CYP21A2 như: lựa chọn trình tự mồi, chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt độ của chu kì luân nhiệt trong phản ứng PCR,…cũng như quá trình giải trình tự gen để xác định đột biến. Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp mồi đặc hiệu như đối với bệnh nhân CAH 01 nhưng kết quả PCR không khuếch đại được hai đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01, trong khi đó mẫu người bình thường vẫn xuất hiện 2 vạch tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR. Điều này cho thấy khả năng bệnh nhân bị đột biến tại vùng gắn mồi, vì vậy các mồi không gắn được vào phân tử DNA của bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐ 9 đều không lên vạch của sản phẩm PCR nên chúng tôi nghĩ bất thường có thể liên quan đến exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đoán này chúng tôi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả các đỉnh tương ứng với các exon của gen CYP21A2 đều xuất hiện, trong khi đó ở mẫu bệnh nhân, đỉnh của exon 1 và exon 3 không xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều cao chỉ bằng ½ so với người bình thường. Kết quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon 8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đoán rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh nhân sẽ mang kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử, trong đó 1 allele bình thường và allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố) còn lại cũng có kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử, mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8. 506 Muốn khẳng định suy đoán cần tiến hành phân tích kiểu gen của bố và mẹ bệnh nhân. Việc phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế tại Việt Nam nhưng đối với các nước trên thế giới vấn đề này được quan tâm từ lâu. Năm 2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn đồng hợp tử gen CYP21A2 gây thể nam hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp MLPA có thể sử dụng trong chẩn đoán mất đoạngen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh và chúng tôi đã thành công trong việc ứng dụng phương pháp này. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã bước đầu ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến điểm và kỹ thuật MLPA để phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ bị bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2. 3. 4. 5. Bahareh R, Akbari MT, Mahdieh N, Zaridust E, Ashtiani MT, Lee HH, Auchus R, Rabbani A (2011). Homozygous complete deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892. Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia. Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81. Concolino P, Mello E, Toscano V, Ameglio F, Zuppi C, Capoluongo E (2009). Multiplex ligation – dependent probe amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia: First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70. Day DJ, Speiser PW, Schulze E, Bettendorf M, Fitness J, Barany F, White PC (1996). Identification of Non‐Amplifying CYP21 Genes When Using PCR‐Based Diagnosis of 21‐Hydroxylase Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48. Grischuk Y, Rubtsov P, Riepe FG, Grötzinger J, Beljelarskaia S, Prassolov V, Kalintchenko N, Semitcheva T, Peterkova V, Tiulpakov A, Sippell WG, Krone N (2006). Four novel missense mutations in the CYP21A2 gene detected in Russian patients suffering from the classical form of congenital adrenal Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em