Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP.HCM NGUYEÃN TRÖÔNG BAÛO TRAÂN CHOÏN GIOÁNG VI KHUAÅN VAØ KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑIEÀU KIEÄN LEÂN MEN ACETIC ÑEÅ LAØM GIAÁM TRAÙI CAÂY

Chuyeân ngaønh : Vi sinh vaät hoïc Maõ Soá

: 60 42 40

LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC

NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: TS. TRÒNH THÒ HOÀNG

Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2007

LÔØI CAÛM ÔN

Em xin chaân thaønh caûm ôn COÂ- TIEÁN SÓ TRÒNH THÒ HOÀNG- ñaõ

taïo ñieàu kieän vaø taän tình chæ baûo ñeå em hoaøn thaønh luaän vaên naøy.

Em voâ cuøng caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ KHOA SINH HOÏC

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM ñaõ truyeàn nhöõng kieán thöùc quyù baùu

trong suoát quaù trình em hoïc taïi tröôøng.

Em xin chaân thaønh caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ VAØ CAÙC BAÏN

PHOØNG THÍ NGHIEÄM BOÄ MOÂN VI SINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC

KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN ñaõ giuùp ñôõ vaø taïo ñieàu kieän toát cho em trong

suoát thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi.

Toâi xin caûm ôn CAÙC BAÏN HOÏC VIEÂN CAO HOÏC KHOAÙ 15

cuøng ÑOÀNG NGHIEÄP BAÏN BEØ ñaõ ôû beân caïnh giuùp toâi hoaøn thaønh

Con voâ cuøng bieát ôn BA MEÏ vaø MOÏI NGÖÔØI TRONG GIA

luaän vaên naøy.

ÑÌNH maõi maõi laø choã döïa vöõng chaéc vaø aám aùp cho con.

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm

phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong

che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực

phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn

nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng.

Ở Việt Nam, quá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân

thông qua việc nuôi giấm trong gia đình. Giấm được tạo ra bằng phương pháp

lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc,

rượu trái cây. Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái

cây này để làm giấm.

Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên

men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống.

2. Mục đích của đề tài nghiên cứu

(cid:31) Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh.

(cid:31) Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian

ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh

dưỡng cao.

3. Phương pháp nghiên cứu

(cid:31) Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm xây dựng tổng luận nghiên cứu:

Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về

những nội dung có liên quan đến đề tài.

(cid:31) Phương pháp thực nghiệm, chứng minh.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Các loại giấm thông dụng và một số vấn đề về giấm trái cây

1.1.1. Sơ lược lịch sử lên men acetic. [12], [31], [32]

Từ đầu thế kỷ XIV ở Pháp đã có những cơ sở công nghiệp sản xuất giấm.

Đến năm 1786 người ta đã bắt đầu để ý đến vai trò cua oxy và nhấn mạnh

độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tạo thành giấm .

Năm 1822 Person đã chú ý đến 1 lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt

giấm và ông đặt tên Mycoderma (là 1 loài vi khuẩn hiếu khí ).

Từ năm 1837 đến 1838 Turpin và Kiizing đã nhấn mạnh quá trình lên men

acetic là do vi sinh vật và đặt tên vi sinh vật đó là Ulviva acetic.

Năm 1862 đến 1868, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur khám phá ra

được bản chất của quá trình lên men này. Ông miêu tả được vi khuẩn sinh

acid acetic hiện diện trong màng mỏng của giấm, và chứng minh được quá

trình lên men giấm thực chất là quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic

trong điều kiện có oxy và ông đặt tên vi khuẩn này là Mycoderma aceti.

Năm 1901 M.W Bejerinck phân lập thuần khiết được vi khuẩn lên men

acetic và gọi là vi khuẩn Acetobacter.

Ngày nay ứng dụng của quá trình lên men acetic, người ta đã sản xuất

nhiều loại giấm khác nhau, thường là giấm ăn chứa khoảng 3% acid acetic.

1.1.2. Các loại giấm thông dụng [28], [42].

- Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua,

dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và

chất dinh dưỡng.

- Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua

dịch rượu vang nho.

- Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch

bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu.

- Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua

dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt.

- Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép

thơm, nước ép trái điều, nước dừa. Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang

sơri, vang mít…

1.1.3. Thành phần của giấm ăn [28], [42].

Bên cạnh acetic acid và ethanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp,

có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn

gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn

Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành. Trong giấm còn

có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc.

Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid),

nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phân của vi khuẩn

Acetic.

Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác

nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate…

1.1.4. Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24]

Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic. Ngòai ra còn

dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có

chứa đường (nho, lê, đào, táo, chuối,mận,dứa…) hay tinh bột đã qua quá trình

đường phân.

(cid:31) Nguyên liệu có bột  Đường  Rượu  acid acetic.

(cid:31) Nguyên liệu có đường  Rượu  acid acetic.

(cid:31) Nguyên liệu có rượu  acid acetic.

Các muối khoáng, nguồn Nitơ dễ đồng hóa (muối Amon) hết một lượng

ít acid acetic để tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn họat động lên men.

Nồng độ rượu thích hợp là 6-15%. Khi hết rượu vi khuẩn có thể oxy hóa

acid acetic thành CO2 và H2O theo phương trình:

CH3COOH + 2O2  CO2 + H2O

Vì thế trong quá trình lên men bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng

ethanol tối thiểu là 0,3-0,5% .

1.1.5. Đặc điểm 1 số loại trái cây sử dụng để làm giấm

I.1.5.1. Đặc điểm của dứa. [9] ,[29]

Dứa có tên khoa học là Ananas Comonus thuộc họ Bromeliace (lớp

thứ Một lá mầm ), là cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới

Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao.

Dứa là loại cây không kén đất vì chúng có thể sinh trưởng trên các vùng gò

đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng

Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc. Sau 1-2 năm

trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha.

Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt

và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng

saccaroz và 34% dưới dạng fructoz và glucoz ).

Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric).

Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie

và canxi).

Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g.

Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt.

Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho

400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo.

Hàm lượng

Thành phần

Nước (%)

54,3

Protein(%)

0,5

Acid hữu cơ (g%)

0,6

Glucid (g%)

3,9

Tro (g% )

0,2

Muối khoáng (mg%)

9,0

10,2

0,3

Vitamin (mg%)

0,05

0,01

0,1

B1 B2 PP

Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa

1.1.5. Đặc điểm của nho. [9], [29]

Nho là loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được nhập

vào Việt Nam vào đầu của thập niên 70 thế kỉ trước và ngày càng được trồng

phổ biến ở một số vùng của nước ta.

Thành phần dinh dưỡng của nho được trình bày ở bảng sau

Thành phần

Hàm lượng

Nước (%)

85%

Đường tổng số g/100g trái cây

16,8

Acid malic g/100g trái cây

1,0

Protein g/100g trái cây

0,5

Chất tro g/100 g trái cây

0,4

160-450

Thiamin (B1) g

3-60

Riboflavin (B2) g

Acid panthothenic

0,5-1,4

Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nho

0,16-0,5

Pyridoxin (B6) mg

Nicotinamit (PP) mg

0,68-2,6

15-92

Acid p-amiobenzoic g

1.1.6. Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28].

Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân

(cid:31) Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO2 và

H2O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục.

(cid:31) Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida.

(cid:31) Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm…

(cid:31) Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong

sản xuất giấm. Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy

bằng kính lúp. Chúng xúât hiện trong thùng lên men giấm và

trong dung dịch rượu trước khi lên acid hóa. Con đực trưởng

thành dài 1mm, con cái dài 1-2mm. Lươn giấm sinh sản và

phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp, ở nồng độ acid cao từ

9-10% chúng bị ưc chế nhưng không hoàn toàn ngưng sinh

sản, với nồng độ cao hơn chúng mới chết. Lươn giấm sống

bằng cách ăn vi khuẩn acetic, một phần rượu, acid acetic,

đạm, các khoáng hòa tan làm giảm độ chua của giấm. Lươn

giấm không độc đối với nguời, nhưng với số lượng lớn, chúng

làm vỡ màng giấm, làm vẩn đục giấm và giấm không ngon.

Lươn giấm có trong giấm là do không vệ sinh sạch sẽ trong

quá trình lên men.

(cid:31) Ruồi giấm : làm giảm acid, sinh ấu trùng, có thể ăn vi khuẩn

Acetic.

(cid:31) Vi khuẩn Lactic:Vi khuẩn Lactic tạo mùi khó chịu và làm mất

màu giấm, giảm độ chua. Có 3 cách chống vi khuẩn lactic:

o Lọc và tiệt trùng rượu đã lên men.

o Bổ sung giấm ngon vào dịch trước khi lên men

tạo độ chua ban đầu để hạn chế vi khuẩn lactic.

o Bổ sung SO2 vào giấm.

(cid:31) Giấm chuyển thành màu đen: do 3 nhân tố là tannin,sắt và

các men oxy hóa. Khắc phục tannin và sắt bằng cách thông

khí và lọc. Một số men oxy hóa cũng làm thay đổi màu

giấm, khắc phục bằng cách thanh trùng Pasteur.

1.1.7. Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn. [26], [28], [42]

Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi

sinh vật gây bệnh. Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:

(cid:31) Trạng thái cảm quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu

nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước

dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ

đường, trái cây…). Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên

liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của

nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng.

(cid:31) Không có lươn giấm.

(cid:31) Không chứa acid vô cơ tự do.

(cid:31) Không có kim loại nặng.

(cid:31) Không chứa phẩm màu.

(cid:31) Không chứa chất sát trùng.

(cid:31) Không chứa hơn 2% ethanol.

1.1.8. Bảo quản giấm ăn. [28], [42]

Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều

vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu

nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ.

(cid:31) Phương pháp thanh trùng Pasteur

Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy chai sau 1 thời gian bảo quản. Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75o- 80oC trong 30-40 giây,nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến mùi

vị và giấm bị đục.

(cid:31) Sử dụng chất chống oxy hóa (Sulfit).

SO2 là tác nhân chống oxy hóa được phép sử dụng trong bảo quản thực

phẩm với hàm lượng thấp hơn 10mg/l SO2 được thêm vào dạng khí hoặc

K2SO3 ngay trước khi đóng chai. SO2 có tác dụng làm giảmvận tốc oxy hóa

các chất có gốc aldehyt, aceton tự do trong giấm.

(cid:31) Màu và sự khử màu

Các chất màu có trong giấm có nguồn gốc từ nguyên liệu sử dụng ban đầu

hoặc các chất tạo ra trong quá trình lên men. Ví dụ: màu vàng do caramen

hoặc những chất màu khác cho phep sử dụng trong thực phẩm. Giấm làm từ

nguyên liệu tự nhiên đôi khi cần có màu như màu đỏ của giấm làm từ vang

đỏ có ý nghĩa cảm quan. Ở một số nước giấm được bán sau khi đã qua khử

màu bằng than hoạt tính.

(cid:31) Đóng chai và bảo quản sản phẩm

Giấm thành phẩm dùng trong gia đình được chứa trong chai nhựa hoặc chai

thủy tinh và bảo quản bằng cách gắn xi trên nắp chai.

Giấm sử dụng trong chế biến bảo quản thực phẩm được chứa trong những

thùng có dung tích lớn và kín.

Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép

tỏi hoặc 1 ít muối ăn.

Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ

cao. Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn.

1.2. Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic.

1.2.1. Đặc điểm chung. [13], [30], [37], [42], [47],[50]

Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt

buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng sử dụng oxygen làm

chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Vi khuẩn sinh acetic acid

thường hiện diện trong những môi trường có đường, alcohol hay các môi

trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu

Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được

xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid. Vi khuẩn Acetic di động

nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động. Không hình thành

nội bào tử.

Đặc điểm hình thái [13]

Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng

khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào.

Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong việc

định danh vi khuẩn sinh acid acetic.

Đặc điểm sinh thái . [13], [39]

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với

nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu

và ở các nơi sản xuất giấm.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48],

[49]

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân

biệt bởi các điểm sinh lý, sinh hoá sau:

- Oxy hoá acetate và lactate tạo CO2 và H2O.

- Phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau.

- Phát triển sinh khối khi nuôi cấy trong các môi trường chứa: D-glucose

30%; acid acetic 0.35%; KNO3 1.0%; methanol; glutamate; mannitol.

- Sinh acetic acid từ nguồn cơ chất ethanol.

- Tạo sắc tố hoà tan trong nước.

- Tạo các polysaccharide có cấu trúc giống levan.

- Đồng hoá ammonia trong môi trường chứa D-glucose, D-mannitol hay

ethanol.

- Tạo dihydroxyaceton từ glycerol.

- Phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon

duy nhất là: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-

xylose, D-arabinose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol, meso-

ribitol, dulcitol, meso-erythritol, myo-inositol, glycerol, maltose, lactose,

melibiose, sucrose, sucrose, raffinose và ethanol.

1.2.2. Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13]

Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic acid

- Sản xuất giấm.

- Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không

hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc

biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ:

G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành

L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được

sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá

glycerol.

- Sản xuất một số loại nước giải khát lên men truyền thống. Ví dụ: sản

xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa

thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình

lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống

Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter .

-Sản xuất cellulose vi khuẩn.

1.2.3. Phân loại. [13]

Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae

thuộc phân lớp -Proteobacteria. Theo International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và

Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm:

Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas

Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998,

Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002,

Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair

2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và

cộng sự 2006

1.2.3.1. Giống Acetobacter Beijerinck 1898

Beijerinck (1898) dùng thuật ngữ “ Acetobacter” để chỉ các vi khuẩn

hiếu khí hình que, Gram âm, có khả năng sinh acetic acid từ ethanol. Các

chủng Acetobacter có thể dễ dàng phân biệt với các loài thuộc những giống

khác trong họ Acetobacteraceae bởi các đặc điểm kiểu hình sau: Q-9 là thành

phần ubiquinone chính trong màng tế bào và oxy hoá 2 nguồn cơ chất acetate

và lactate cho sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O.

Hiện nay, giống Acetobacter gồm 16 loài gồm: A. aceti,

A.pasteurianus, A.pomorum, A.indonesiensis, A.tropicalis, A.orientalis,

A.syzygii, A.cibinogensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.cibinogensis,

A.estunensis, A.orleanensis, A.peroxydans, A.cerevisiae, A.malorum, A.oeni

và A.nitrogenifigens; A.aceti là loài điển hình của giống.

1.2.3.2. Giống Gluconobacter Asai 1935

Giống thứ hai trong họ Acetobacteraceae, Gluconobacter được đề

nghị bởi Asai vào năm 1935. Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có

khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã

đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng

oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên

giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành

acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter.

1.2.3.3. Giống Acidomonas Urakami và cộng sự-1989

Tên giống Acidomonas được đề nghị bởi Urakami và cộng sự (1989)

với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica. Giống này được công nhận với các

đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh

dưỡng methyl tùy ý.

1.2.3.4. Gluconacetobacter Yamada và cộng sự- 1998

Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ

phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984)

nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh

acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính

được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành

phần ubiquinone chính trong màng tế bào Acetobacter. Sau đó, giống phụ

Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ

Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần

trình tự mã hoá 16S rRNA.

1.2.3.5. Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000

Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ

Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000). Các loài Asaia có những

đặc điểm khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc

tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát

triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35%. Hầu như tất cả

các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển

tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường.

1.2.3.6. Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002

Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1

cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với

các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia.

1.2.3.7 Giống Swaminathania Loganathan và Nair 2004

Các chủng Swaminathania phân lập từ cây lúa hoang mọc ở khu vực

sinh thái ngập mặn. Loganathan và Nair (2004) xác định giống

Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân

loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào

trình tự 16S rDNA.

1.2.3.8. Giống Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004

Đặc điểm nổi bật của Saccharibacter là tính ưa áp suất thẩm thấu, chỉ

có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao từ 5-40%.

Ngoài ra, Saccharibacter không sinh acid acetic từ ethanol và không thể phát

triển trong môi trường có 0,35% c acid acetic.

1.2.3.9. Giống Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006

Neoasaia, giống thứ chín trong họ Acetobacteraceae, được Yukphan

và cộng sự phát hiện và chỉ có 1 loài là Ne. chiangmaiensis. Giống này được

phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng

16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình

của các chủng đã biết.

1.2.3.10. Giống Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006

Granulibacter là giống thứ 10 trong họ Acetobacteraceae được công

bố trên tạp chí IJSEM vào cuối năm 2006. Đây là giống đầu tiên thuộc họ

Acetobacteraceae được biết đến như chủng gây bệnh cho người khi được

phân lập từ bệnh nhân bị u hạch mãn tính.

1.3. Cơ chế của quá trình lên men “Acetic” và 1 số phương pháp lên men

1.3.1. Cơ chế của quá trình lên men acetic [2], [12]

Acid acetic thu nhận từ nhiều phương pháp: Chưng cất gỗ, tổng hợp hóa

học hay sinh học lên men. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa

không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn.

Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic

vào năm 1802.

Phương trình tổng quát:

CH3CH2OH + O2  CH3COOH +H2O + 117kcal

Thực chất trải qua các giai đọan sau:

2CH3CH2OH + O2  CH3CHO +2H2O

ethanol Acetaldehyt

CH3CHO + H2O  CH3CH(OH)2

Hydrat của acetaldehyt

CH3CH(OH)2 +1/2 O2 CH3COOH + H2O

Acid acetic

Ngoài ra vi khuẩn Acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác

nhau như:

Propanol  acid propionic.

Lactic acid  acetoin.

Glycerine  dyhiroxyacetol.

D-sorbitol  L-sorbose.

D-Ribit  L-ribulose.

D-Manit  D-Fructose.

D-Glucose  acid gluconic  D-5-ketogluconic.

Lactic acid  pyruvic acid.

1.3.2 . Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12]

1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid.

Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan

trọng đến sự lên men.

Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và

nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn.

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu.

Nồng độ rượu trong môi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 9-

14% đối với lọai vi khuẩn khác. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi

khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự

sống. Vì thế đây là 1 quá trình có hại.

Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và

acid acetic bị mất đi theo phản ứng:

CH3COOH + 2O2 =2CO2 +2H2O

Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là

0,3-0,5%.

Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường. Đối với những

lòai vi khuẩn khác nhau tồn tại một giá trị pH giới hạn làm ngừng sự quá oxy

hóa. Giá trị pH đối với sự quá oxy hóa luôn cao hơn giá trị pH giới hạn đối

với sự oxy hóa rượu 1 ít. Do đó khi có rượu thì sẽ kìm hãm sự quá oxy hóa.

Đầu tiên rượu có mặt bị oxy hóa và chỉ khi độ acid chuyển sang giá trị giới

hạn thì sự quá oxy hóa bắt đầu.

1.3.2.3.Nhiệt độ

Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với chúng là từ 25-32oC. Ở nhiệt độ thấp thì quá trình lên men xảy ra chậm.Ở

nhiệt độ cao sẽ ức chế họat động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh

sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất của quá trình

lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic và rượu etylic.

Tùy theo từng lòai mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay

đổi. Nhưng trong sản xuất người ta dùng những lòai vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-400C.

1.3.2.4. Độ thoáng khí

Oxy là 1 yếu tố quan trọng và là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men.

Theo cơ chế của quá trình oxy hóa, lượng không khí cung cấp cho quá

trình lên men là tương đối lớn.

Trong thực tế càng thóang khí năng suất càng cao( có giới hạn do năng

suất của chủng vi khuẩn).

1.3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn C.N. P và các nguyên tố vi lượng

Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngòai acid

acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần đượcc bổ sung 1 số muối khóang

(NH4)2SO4, (NH4)2PO4, KH2PO4, MgSO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu

cụ thể của từng loài. Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung

thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt,

sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch

còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid …

1.3.3. Các phương pháp lên men [12], [20]

1.3.3.1. Phương pháp chậm

Nguyên lý

Phương pháp chậm còn được gọi là phương Pháp – Orleans, được biết

đến từ năm 1670, khời đầu là vùng nho nổi tiếng cuả Pháp. Người ta thấy dịch

vang nho để trong thùng gỗ bị hở nắp dần dần đục hơn, có màng phủ trên bề

mặt và trở nên chua.

Để sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta dùng những thùng

gỗ đứng có vòi tiếp nguyên liệu và rót giấm (thường bằng thủy tinh, nhựa…).

Vật liệu cấy là dấm tươi lấy từ thùng lên men khác, cho vào 1/5 thể tích thùng

là dấm tươi, sau đó đổ dịch lên men vào đến khoảng ½ thùng. Tiếp đó cứ theo

1 chu kỳ( 1tuần) đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy thùng. Thường

dịch lên men là hỗn hợp của rượu vang và acid tạo nên dung dịch có nồng độ

từ 1-2% acid, 2-4% rượu. Vi khuẩn Acetobacter phát triển trên bề mặt chất

lỏng và “cái giấm” hình thành chứa chứa 1 lượng lớn vi khuẩn Acetobacter.

Sở dĩ ngươi ta cho acetic acid trước là để tạo điều kiện cho vi khuẩn

phát triển, mặt khác là để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị

nhiễm.

Quá trình lên men diễn ra chậm chạp do sự thâm nhập hạn chế của oxy

qua bề mặt dung dịch bị che phủ một lớp cái dấm. Thường quá trình kết thúc

sau 5 tuần nuôi cấy. Lúc đó nồng độ dịch lên men vào để lên men tiếp. Trong

quá trình lên men do bị chấn động( va chạm )” cái dấm” chìm xuống và tiêu

thụ 1 lượng cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Đây là nguyên nhân

giảm độ acid trong giấm thành phẩm. Sau đó trên bề mặt thóang khí lại hình

thành 1 lớp màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men như trên.

Giấm lấy ra được lọc trong và thanh trùng Pasteur để bảo quản được lâu.

Ưu điểm

-Cho chất lượng giấm thơm ngon.

-Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở

các địa phương.

Nhược điểm

- Thời gian lên men dài.

- Năng suất thấp.

- Nồng độ acid thấp.

- Mặt bằng sản xuất phải lớn.

- Khó cơ khí hóa, tự động hóa.

- Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện

pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam.

1.3.3.2. Phương pháp nhanh

Nguyên lý

Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức. Phương pháp

này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men

giảm xuống đáng kể.

Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa

vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu. Bề mặt lớn được tạo ra

khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng

thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có

chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m. Vi khuẩn acetic được bám

trên vat liệu xốp (vật liệu mang). Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng

lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ

kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó,

dịch lên men cho phương pháp nhanh thường là hỗn hợp acid 6% và 3% rượu

etylic để thu được dấm 8-9%.

Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ

dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định, dịch

lên men được chuyển hóa nhanh thành acid acetic nhờ vi khuẩn.

Khi hầu hết rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic người ta

thường để trong dung dịch lên men khỏang 0,2-0,5% rượu etylic để tránh quá

trình oxy hóa ngược làm giảm nồng độ acid acetic. Cuối cùng rút giấm thành

phẩm và bắt đầu 1 chu kỳ mới. Thời gian lên men khỏang 6 ngày.

Trong thực tế sản xuất người ta cho dịch lên men chảy qua thành

thùng theo nhiều phương pháp, nhưng phổ biến nhất là 1 trong 3 phương pháp

sau: vận hành đơn, vận hành kép, tuần hòan. Trong thiết bị, dịch lên men

không lấp trùm tháp mà chỉ thấm dần dần qua lớp đệm khi cho đi từ đỉnh tháp

qua khối vật liệu mang. Dịch lên men được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị ,

khi chảy qua lớp đệm, rượu dần dần bị oxy hóa thành acid acetic. Lưu lượng

được tính sao cho quá trình oxy hóa trong tháp diễn ra nhanh nhất. Không khí

được đưa vào trong thiết bị thông qua các lỗ nhỏ dưới đáy tháp và bên thành

tháp. Sự thông khí nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa trong và ngòai thiết bị. Để

giảm bớt tổn hao acid acetic và rượu etylic do sự bay hơi theo khí thải, người

ta bố trí 1 thiết bị hấp phụ phía sau tháp. Với thiết bị như vậy có thể ổn định

làm việc trong 1 thời gian dài ( 20-30 năm), quá trình này được sử dụng trong

1 thế kỷ hoặc lâu hơn nữa, nhưng nếu phá vỡ quy định bình thường nào đó thì

sẽ dẫn đến hậu quả không hay và có khi ngừng sản xuất.

Do việc thông khí phụ thuộc nhiều vào độ chênh lệch giữa trong và

ngoài thiết bị nên quá trình sản xuất phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết.

Sự giảm hệ số nhiệt độ làm giảm sự thông khí cho thiết bị và họat động oxy

hóa của vi khuẩn. Điều đó dẫn đến sự giảm nhiệt độ trong thiết bị và giảm độ

thông khí, dẫn đến sự đình chỉ hòan tòan quá trình sản xuất khi nhiệt độ môi trường quá cao( to > 30oC ). Vấn đề kiểm tra nhiệt độ tự động trong thiết bị

được giải quyết bằng cách làm lạnh dịch lên men trước khi bơm tuần hòan trở lại thiết bị tới nhiệt độ 26-28oC. Nồng độ oxy được kiểm tra bằng

Oxygemeter, nồng độ oxy trong khí thải được bảo đảm lớn hơn 12%.

Có thể coi phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp công

nghiệp của Đức là ứng dụng đầu tiên về phương pháp cố định tế bào vi sinh

vật vào công nghiệp lên men.

Ưu điểm

- Thời gian lên men ngắn hơn so với phương pháp chậm khá nhiều, chỉ

trong 5-6 ngày.

-Giấm thu được có nồng độ cao .

Nhược điểm

-Hiệu suất kinh tế chưa cao do thiết bị khá phức tạp, điều chỉnh thiết bị

thông gió khó và cần phải nghiên cứu kỹ hơn.

-Hiệu suất của quá trình lên men không cao vì rượu và acid là chất dễ

bay hơi ( lượng thất thóat tới 2-6%). Có thể khắc phục bằng cách đặt 1 thiết bị

ngưng tụ bao gồm 2 thiết bị lọc than đặt kế tiếp nhau sau tháp lên men để

ngưng tụ rượu và acid.

1.3.3.3. Phương pháp chìm

Nguyên lý

Phương pháp chìm còn gọi là phương pháp sục khí. Việc sử dụng

phương pháp chìm cho oxy hóa rượu etylic thành acid acetic do Ebner và

Hromatka phát hiện ra vào năm 1949.

Trong phương pháp chìm không khí được sục qua khối dịch lên men

mãnh liệt và tạo thành 1 thể huyền phù có pha rắn là Acetobacter và pha lỏng

là dịch lên men trong các nồi lên men đặc biệt. Trong nồi lên men dịch rượu

etylic được chuyển thành acid acetic khá nhanh. Để lên men, dịch lên men

đưa vào thiết bị gồm 6-12% rượu etylic cộng 1-3% acid acetic. Thời gian 1

chu trình sản xuất khoảng 40-96 giờ. Sản phẩm tạo thành 7-13% acid acetic,

0,2-0,5% rượu sót. Thiết bị lên men chìm nổi tiếng nhất của Tây Đức gọi là

Axetator-Frings. Cho tới năm 1981 tòan thế giơí có khỏang 440 Axetator-

Frings họat động. Trong khi đó ở Việt Nam chưa có Axêtator-Frings nào họat

động.

Ở thiết bị Axetator-Frings tổng hàm lượng rượu và acid cho mỗi chu kỳ

khỏang 7-15% khi hàm lượng rượu trong thùng lên men còn 0,2-0,5%, quá

trình được coi là kết thúc.

Người ta lấy 40-60% dịch lên men ra với tốc độ sao cho tránh tiêu hao

toàn bộ rượu etylic. Sau đó cho dịch lên men mới vào đúng đến lượng ban

đầu, quá trình này diễn ra từ từ tránh tác động đến tế bào do sự thay đổi nồng

độ cơ chất trong dung dịch. Thùng lên men được gắn với 1 máy nén khí,một

bộ phận khuấy và 1 bộ phận phá bọt. Acid acetic và rượu etylic được xác định

tự động. Tùy loại nguyên liệu sử dụng và lượng rượu etylic cho vào, quá

trình lên men có thể kéo dài 40-96 giờ với hiệu suất 90-95%.

Mặc dù có những ưu điểm rất lớn nhưng mãi cho đến gần đây nó mới

được sử dụng rộng rãi trong đời sống, nguyên nhân kìm hãm là do nhu cầu

phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao, quan trọng nhất là yêu cầu

nghiêm ngặt của việc cung cấp oxy liên tục. Những công trình ngiên cứu từ

năm 1949 đã chỉ ra rằng các vi khuẩn Acetobacter khi ở trạng thái lơ lửng

trong môi trường gồm dấm, cồn, nước sẽ trở nên nhạy cảm với việc cung cấp

oxy ở những giai đọan ngắn nhất, đặc biệt khi nồng độ acid acetic đã khá cao.

Ví dụ: nồng độ tổng là 5%, khi ngừng cung cấp oxy trong khỏang 120 giây sẽ

làm chết 1/3 số vi khuẩn có mặt trong môi trường lên men, nếu nồng độ tổng

là 12% thì chỉ cần ngắt oxy trong 10-12 giây đã đủ làm chết 1/3 tổng số vi

khuẩn.

Ưu điểm

- Thời gian lên men nhanh.

- Thiết bị nhỏ hơn, gọn hơn, năng suất cao hơn.

- Hiệu suất cao( 90-95%).

- Có khả năng tự động hóa cao.

- Tổng sản lượng dấm sản xuất theo phương pháp đến năm 1981 là767

triệu lít năm (giấm10%), trong đó chủ yếu là nước Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Tây

Đức và 1 số nước khác. Ở Việt Nam đã tiên hành lên men dấm và acid acetic

theo phương pháp chậm,đang nghiên cứu các phương pháp lên men nhanh và

chìm.

Nhược điểm

-Thiết bị phức tạp.

-Tính ổn định không cao.

-Yêu cầu về việc cung cấp oxy rất phức tạp..

1.3.3.4. Phương pháp phối hợp

Nguyên lý

Đây là phương pháp kết hợp 2 phương pháp nhanh và chìm. Nó xuất

hiện gần đây ở Liên Xô cũ. Thiết bị lên men theo phương pháp này gồm 2

phần

*Phần trên

Như thùng lên men theo phương pháp nhanh.Bên trong thùng đổ đầy

đệm theo phương pháp nhanh.

*Phần dưới

Phần chứa dịch lên men sau khi qua vật liệu xốp có lắp thêm bộ phận sục

khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như 1 nồi lên men của phương pháp

chìm.

Ưu điểm

Phương pháp này có ưu điểm khi hệ thống lên men đang họat động, nếu

ngừng cung cấp điện ( ngừng cung cấp oxy qua bộ phận sục khí ) vẫn không

ảnh hưởng đến vi khuẩn. Lúc đó các van thông khí bên trong thiết bị được mở

ra và không khí vào nhờ vào sự thông khí tự nhiên, do đó màng vi khuẩn trên

đệm không bị chết, nhưng chỉ đảm bảo phần trên máy còn phần dưới vẫn phụ

thuộc vào nguồn điện thông khí cho vi khuẩn họat động.

Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả 2 phương pháp nhanh

và chìm.

Nhược điểm

-Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh.

-Giống vi khuẩn phải phù hợp cả 2 phương pháp.

1.3.3.5. Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

1.3.3.5.1. Định nghĩa tế bào cố định

Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động trong không gian bị giới

hạn, sự giới hạn của tế bào có được bằng đưa nó vào 1 phase cách ly với

phase dung dịch tự do. Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, là

polymer cao phân tử ưa nước.

1.3.3.5.2. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt

chất mang

Phương pháp này dự trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và

chất mang không tan trong nước.

a.Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Đây là phương pháp sử dụng để cố định enzyme và không được sử dụng

rộng rãi đối với tế bào vi sinh vật, vì tác nhân cần thiết đe tạo liên kết cộng

hóa trị có thể gây độc đến tế bào và gây khó khăn cho việc cố định.

Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là polypeptide,

polysaccharide, dẫn xuất cellulose như DEAE-cellulose, DEAE-saphadex….,

agarrose, các polyme tổng hợp.

Phương pháp tiến hành

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên

kết cộng hoá trị giữa bề mặt chất mang đã được họat hóa và tế bào vi sinh vật.

Quá trình liên kết cộng hóa trị giữa tế bào vi sinh vật và bề mặt chất

mang có thể xảy ra theo một hay hai giai đọan.

Một giai đọan nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia

trực tiếp với nhóm chức của protein màng tế bào vi sinh vật.

2 giai đọan diễn ra như sau

Giai đọan 1 :

Họat hóa chất mang bằng cách gắn lên bề mặt chất mang các nhóm chức

có khả năng phản ứng hơn, dễ liên kết với tế bào vi sinh vật.

Giai đọan 2

Tạo liên kết giữa các nhóm chức lên chất mang với tế bào vi sinh vật. Vì

vậy, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định lên chất mang.

.Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu diểm

-Khả năng trao đổi chất cao.

-Độ bền liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang tốt.

- Tế bào cố định vi sinh vật theo phương pháp này có tính chống chịu tốt

với các yếu tố gây biến tính.

Nhược điểm

- Ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào.

- Tế bào được cố định phải có phản ứng đặc thù để liên kết với chất

mang và chất mang phải được họat hóa dẫn đến tốn chi phí và phức tạp.

b. Phương pháp hấp phụ

Cơ sở của phương pháp là dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế

bào và bề mặt chất mang. Ở phương pháp này ngòai liên kết cộng hóa trị ra, tế

bào chất mang còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết khác . Các liên kết này

thể hiện ở các cơ chế sau: tạo liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt

chất mang, sự tương tác ion , và lực mao quản.

Chất mang

Chất không có cấu trúc xốp như thủy tinh.

Chất mang có cấu trúc xốp như than họat tính.

Chất mang có điện tích như nhựa trao đổi ion.

Phương pháp tiến hành

Phương pháp cổ điển

Ngâm chất mang vào dung dịch huyền phù vi sinh vật, vi sinh vật sẽ tự

động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó.

Phương pháp cổ điển có cải tiến

Sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân bố đều tế bào vi sinh vật

và chất mang trong dung dịch.

Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang

Phương pháp này cần có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất

gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang.

Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm

- Quá trình thực hiện đơn giản, dễ thực hiện,không đòi hỏi phải họat hóa

chất mang và các tác nhân phản ứng.

- Thực hiện trong điều kiện bình thường, tế bào vi sinh vật vẫn duy trì

được khả năng sống và phát triển của nó.

- Chi phí giá thành thấp.

- Ít gây ảnh hưởng đến tế bào sau khi cố định.

Nhược điểm

- Tế bào vi sinh vật dễ bị tách khỏi chất mang khi có tác động cơ học hay

điều kiện môi trường thay đổi.

- Lượng vi sinh vật cố định lên bề mặt chất mang không cao.

- Quá trình thực hiện thụ động và khó điều khiển vì vậy hiệu suất cố định

thường không cao.

- Giới han trong việc lựa chọn chất mang.

- Vật mang có thể xảy ra hấp phụ không đặc hiệu 1 số protein khác hay

các chất phi protein.

c. Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc gel

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel là phương pháp

nhốt tế bào vi sinh vật trong khuôn gel của nhiều loại polymer khác nhau.

Việc cố định tế bào vi sinh vật trong khuôn gel tức là ngăn không cho tế

bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, nhưng đồng thời vẫn cho cơ chất

có phân tử lượng nho thích hợp và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra

khỏi mạng lưới gel đó.

Các loại gel cơ bản

a. Ion gel: Khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang

đa điện tích và dung dịch đa điện tích trái dấu.

b. Covalent gel : là 1 loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình

thành từ những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.

c. Non-covalent gel: là loại gel mà mạng lưới được hình thành bằng

những liên kế khác không phải là liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử

polymer, thường là liên kết hydro.

d. Cryogel: là cấu trúc gel polimer mới, là loại gel được tạo nên bơi

phương pháp làm lạnh đông các tiền polime có phân tử lượng thấp hoặc cao.

Phương pháp tiến hành

a.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc ion gel

Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật và chất mang đa điện tích được

nhỏ vào dung dịch đa điện tích trái dấu để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới

gel. Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa

được hình thành.

b.Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc covalent gel

Cách 1: ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch các monomer.

Sau đó, tạo điều kiện để các monomer liên kết và tạo phân tử polimer. Các

phân tử polimer liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo nên cấu

trúc gel chứa tế bào vi sinh vật.

Cách 2 :ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch chất mang

polimer. Hỗn hợp sẽ được tiến hành với những phản ứng thích hợp để tạo liên

kết giữa các sợi polimer với nhau.Những liên kết mới được hình thành sẽ tạo

1 mạng lưới dày đặc chứa tế bào vi sinh vật.Sau đó khối gel này được đưa đến

thiết bị tạo hạt và thu được các hạt gel polimer chứa tế bào vi sinh vật cố định.

c.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel

Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu

trúc covalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ

những liên kết khác liên kết khác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết

hydro. Chất mang thường được sử dụng là carregeenan.

d. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấutrúc cryogel

Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông. Ở

điều kịen nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành

cấu trúc mới. Polyvinylalcohol là loại polimer được sử dụng trong tạo gel

cryogel có khả năng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc,

lượng tế bào bị rửa trôi không nhiều sau chu kỳ lên men và giữ được hoạt tính

trong thời gian dài do không tiếp xúc với dung môi hữu cơ.

e.Các phương pháp khác

Phương pháp làm thay đổi nhiệt độ: huyền phù dung dịch chất mang

và tế bào gel khi hạ nhiệt độ. Chất mang sử dụng: agar, gelatin. Phương pháp

này không thích hợp với những tế bào nhạy với nhiệt.

Phương pháp đóng rắn polimer: tế bào hòa với polimer lỏng rồi được

nhỏ vào bình chất đóng rắn tạo ra hạt xúc tác như cellulose triaxetat. Phương

pháp này không thích hợp với tế bào sống.

1.3.3.5.4. Ưu nhược điểm chung của phương pháp cố định tế bào vi

sinh vật trong lòng chất mang.

a.Ưu điểm

-Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc

gel polimer.

-Mật độ tế bào cố định trong cấu trúc gel lớn.

-Không có sự hình thành liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang mà

tế bào chỉ bị nhốt bên trong, vì vậy protein của màng tế bào vi sinh vật không

bị phá hủy.

-Không có sự tương tác trực tiếp giữa tế bào vi sinh vật với dung môi

hữu cơ nên ít gây ảnh hưởng đến sự sống và họat tính của tế bào.

b.Nhược điểm

-Tế bào vi sinh vật phân bố không đều trong gel vì vậy ảnh hưởng đến

hiệu suất quá trình trao đổi chất.

-Không thích hợp khi cơ chất là những phân tử lượng lớn vì khó khuếch

tán được qua màng gel.

- Một số chất mang có thể ảnh hưởng không tốt đến họat tính của tế bào

vì có thể gây cản trở đến sự trao đổi chất của vi sinh vật.

- Gel polimer cóthể bị phá hủy bởi tốc độ sinh trưởng của tế bào gây ảnh

hưởng đến quá trình sản xúât.

1.3.3.6. Cố định tế bào không chất mang

1.3.3.6.1.Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào

Đây là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành 1

khối tế bào cố định nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng

chất mang.

Trong phương pháp này, thông qua 1 số hợp chất đặc biệt có khả năng

hình thành các liên kết nối mạng, sẽ diễn ra phản ứng giữa tế bào hoặc các

tthành phần của tế bào như enzyme với các họat chất này. Nhờ vậy, các tế

bào sẽ liên kết với nhau tạo thành cấu trúc dạng hình viên.

Ứng dụng nổi bật nhất của phương pháp này trong công nghiệp là cố

định trực khuẩn Bacillus cogulans để sản xúât các dạng đồng phân của

đường glucose.

a.Ưu điểm

- Điều kiện nhẹ nhàng, có khả năng kéo dài thời gian họat động của tế

bào.

- Làm tăng tính chống chịu của tế bào đối với các yếu tố làm biến tính.

b.Nhược điểm

- Đây là phương pháp có độ bền cơ học kém nhất.

1.3.3.6.2. Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane

Đây là phương pháp cố định trong các cơ chất có phân tử lượng lớn

có thể thẩm thấu vào trong tế bào, các chất mang có thể tái sử dụng.Ở dạng

membrane tế bào được cố định thông qua quá trình siêu lọc và vi lọc bằng

màng membrane. Màng membrane được tạo ra là polimer có tính bán thấm

với những kích thước lỗ đủ nhỏ chỉ cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra mà

tế bào vẫn bị nhốt trong đó. Trước khi tạo màng bao tế bào lại cần phải biết

trọng lượng phân tử của tế bào để có thể tạo lỗ phù hợp trên màng.

a.Ưu điểm

-Mật độ tế bào cố định khá lớn.

-Độ bền cơ học cao.

-Có thể ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau.

b.Nhược điểm

-Độ bền cơ học kém.

-Sự sinh trưởng của tế bào làm phá hủy màng chắn.

1.3.3.7. Giá thể bacterial cellulose (BC)

a.Vi khuẩn sản xuất bacterial cellulose (BC)

BC được tổng hợp bởi 1 số vi khuẩn. Cấu trúc BC ở mỗi loài tuy khác

nhau nhưng con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở mỗi loài

có lẽ giống nhau. Các đặc điểm khác nhau thường là các đặc điểm vật lý của

sản phẩm BC, như chiều dài chuỗi glucan, tính kết tinh và trạng thái kết tinh

của nó. Trạng thái kết tinh khác nhau xácđịnh các tính chất vật lý khác nhau

như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác

nhân gây đột biến. Trong các lòai có thể dùng sản xúât BC thì Acetobacter

xylinum có khả năng tổng hợp BC hiệu quả nhất và được tập trung nghiên

cứu nhiều nhất.

Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di

động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể

già đi hay do điều kiện môi trường.

Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiei khí bắt buộc, pH tối ưu 5,5,

nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-30oC.

Nguồn hydrocacbon mà Acetobacter xylinum là gluccse, saccharose,

maltose, manitol. Môi trường thích hợp cho sự phát triển của Acetobacter

xylinum là nước dừa già.

b. Cấu trúc của BC

Ngày nay nhờ vào sự phát triển của công nghệ hiện đại người ta đã xác

định được cấu trúc của BC.BC có cấu trúc gần giống như cấu trúc của

cellulose thực vật, là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau

qua các nối -1,4-glucan.

Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Vander

Waals. Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo

nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5nm. Các sợi kết hợp với nhau tạo thành

các bó. Các bó kết hợp với nhau tạo thành các dãy có kích thước từ 3-4nm và

chiều rộng 70-80nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dãy là 3.2x133nm,

theo Brown và cộng sự (1976) là 4.1x177nm.

So với PC thì BC có độ polimer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn.

BC có độ polymer hóa từ 2000-6000, có khi lên đến 16000 hay 20000.Còn ở

PC thì khả năng polymer hóa của nó chỉ từ 13000-14000.

Trong tự nhiên, cellulose kết tinh ở hai dạng I vàII,đây là 2 dạng phổ

biến nhất. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà

dạng nào sẽ chiếm ưu thế nhưng thường trong tự nhiên dạng cellulose I được

tổng hợp phổ biến hơn. Ngòai ra, cellulose I có thể chuyển thành cellulose II,

nhưng cellulose II không thể chuyển ngược thành cellulose I được.

c. Đặc điểm của BC

BC là 1 sản phẩm polysaccharide ngọai bào của vi khuẩn. BC sẽ bao

quanh và bám chặt lấy tế bào vi khuẩn khi nó được tổng hợp.

BC có 1 số đặc điểm nổi bật thích hợp cho việc sử dụng làm giá thể cố

định tế bào vi sinh vật.

BC là dạng polimer có độ tinh sạch cao hơn các dạng cellulose khác,

chúng không có ligin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hòan tòan và

có thể phục hồi.

Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kíchthước ổn định và

sức căng cao, có độ bền sinh học cao đặc biệt là cellulose I. Có khả năng giữ

nước cao (99%). Trong điều kiện ngập nứơc, nước có thể vận chuyển xen vào

các sợi cellulose.

Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tíêp. Đặc biệt vi khuẩn có thể

tổng hợp được các loại màng mỏng và các sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC

có các trục đơn giúp cho lớp màng tạo thành trở nên mạnh hơn.

Trong suốt quá trình nuôi cấy chúng ta có thể kiểm sóat được đặc điểm

lý học của phân tử cellulose (trọng lượng phân tử và khả năng kết tinh) nhờ

quan sát cấu trúc của chúng bằng cách cho thuớc nhuộm vào môi trường nuôi

cấy.

Có thể tác động lên các gel liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose.

Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử của cellulose.

Chương 2: VẬT LIỆU - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu giấm

Mẫu giấm thu thập từ ở Tp.HCM, Long An, Bạc Liêu.

Số mẫu thu thập ở mỗi vùng

o Long An : 2 mẫu

o Bạc Liêu : 1 mẫu

o Tp HCM : 7 mẫu

2.1.2. Môi trường nuôi cấy [6], [7], [8], [45].

(cid:31) MT1 : Môi trường Ethanol-Cao nấm men

20ml - Ethanol

- Cao nấm men 10g

20g - CaCO3

- Agar 20g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Ethanol cho vào sau khi hấp khử trùng)

(cid:31) MT2 : Môi trường làm giàu sinh khối

- Glucose 10g

- Cao nấm men 5g

3g - Pepton

- Ethanol 5ml

0,3ml - Acid acetic

- Dịch chiết khoai tây 10% 100ml

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân 10g, cắt lát mỏng, thêm vào 100ml nước,

đun sôi 5 phút, lọc  dịch chiết khoai tây 10%)

(cid:31) MT3: Môi trường lên men dùng định tính acid acetic

- Glucose 30g

15g - KH2PO4

15g - (NH4)2SO4

30ml - Ethanol

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT4 : Môi trường lên men dùng định lượng acid acetic

- Ethanol 30ml

- Glucose 5g

1000ml - Nước cất bổ sung cho đủ

- pH 4,5

(cid:31) MT5 :Môi trường nhân giống cấp I

10g - Glucose

- Pepton 5g

3g - KH2PO4

3g - MgSO4

0,1g - (NH4)2SO4

5g - Cao nấm men

0,05g - CH3COOH

1ml - Ethanol

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT6 :Môi trường nhân giống cấp II

-Glucose 5g

- K2HPO4 0,1g

- KH2PO4

0,1g

0,5g - MgSO4

0,1g -(NH4)2SO4

5g -Cao nấm men

0,05g -CH3COOH

5ml -Ethanol

-Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT7: Môi trường cao thịt- pepton dùng nuôi vi khuẩn Acetic để

nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước tế bào.

- Cao thịt 3g

10g - Pepton

- NaCl 5g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

- pH 7,2

(cid:31) MT8: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của

vi khuẩn Acetic

- Glucose 20g

5g - Cao nấm men

- Pepton 3g

5ml - Ethanol

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT9: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng

của vi khuẩn Acetic

- Glucose 20g

5g - Cao nấm men

- Pepton 3g

5ml - Ethanol

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT10 : Môi trường glutamate xác định khả năng phát triển của vi

khuẩn

- Sodium glutamate 5g

10g - Glucose

1g - KH2PO4

0,2g - MgSO4.7H2O

- KCl 0,1g

- Agar 20g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

- pH 7,2

(cid:31) MT11 : Môi trường mannitol xác định khả năng phát triển của vi

khuẩn

- Mannitol 25g

5g - Cao nấm men

- Pepton 3g

20g - Agar

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

- pH 6

(cid:31) MT 12: Môi trường thử khả năng tạo H2S

- Cao thịt 3g

- Pepton 10g

5g - NaCl

2,5g - Na2S2O3

- Acetate chì 10% 5ml

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT13: Môi trường thử khả năng phân giải dextrin

20g - Dextrin

- Cao nấm men 10g

- Agar 20g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT 14: Môi trường thử khả năng phân hủy canxi-lactate thành

carbonate của vi khuẩn Acetic

- Canxi-lactate 10g

10g - Cao nấm men

20g - Agar

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

7 - pH

(cid:31) MT 15 : Môi trường thử khả năng phân giải gelatin của vi khuẩn

Acetic

- Gelatin 4g

0,05g - Glucose

- Pepton 0,01g

- NaCl 3g

1.5g - K2HPO4

1,5g - KH2 PO4

- Agar 20g

- Nước thịt 5ml

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Hoà tan các muối vào 100ml nước cất. Gelatin được hoà tan riêng trong

400ml nước cất, bổ sung đường, pepton, nước thịt. Trộn 2 dung dịch trên với

nhau rồi đun sôi vài phút. Agar được hoà tan riêng trong 500ml nước cất khác

và trộn chung với các thành phần còn lại thành 1000ml môi trường).

(cid:31) MT 16: Môi trường thử khả năng tạo -pyrone

- Glucose 30g

- Cao nấm men 10g

20g - CaCO3

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(cid:31) MT 17: Môi trường thử khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate

- Sodium acetate 2g

- Cao nấm men 2g

- Pepton 3g

- Brothymol blu 0,02g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

- pH 6,4

(cid:31) MT 18:Môi trường lên men sản xuất Bacterial cellulose

Môi trường nước dừa già

8g - (NH4)2SO4

2g - (NH4)2HPO4

- Sucrose 20g

- Nước dừa già 1000ml

- pH=4,5 ( Được chỉnh bằng acid acetic đậm đặc )

2.1.3. Thiết bị máy móc dùng cho quá trình thí nghiệm

1) Bếp từ NAMECO. NAMHONG MECHANICAL COMPANY.

Made in VIETNAM

2) Cân kỹ thuật: AND EK – 600G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD

BY A&D CO. ,LTD

3) Cân phân tích: AND HR – 200G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD

BY A&D CO. ,LTD

4) Kính hiển vi : SELLER INSTRUMENT MICROSCOPE DIVISION

ST.LOUIS, MO. 800-489-2282

5) Lò viba :MICROWAVE OVEN.SANYO.

6) Máy đo OD: THERMO ELECTRON CORPORATION. Made in

USA

7) Máy đo pH: ACCUMET MODEL 15 pH METER.OSI – BP 124 –

78312 MAUREPAS CEDEX

8) Máy khuấy từ: SEM – PTV. LTD. Made by AUTRALIA.

9) Máy lắc ngang: 3006 GFL. Made by GERMANY 10) Tủ ấm 300C : PROLABO N0 32519 11) Tủ ấm 340C : PROLABO N0 32519

12) Tủ sấy và khử trùng dụng cụ: EASTOCEAN ZTD 98-A.

13) Tủ lạnh SANYO

14) Nồi hấp khử trùng

15) Tủ cấy vô trùng

16) Thiết bị sục khí : máy khúây từ, cá khuấy từ, thiết bị bơm oxy

17) Thiết bị lên men hồi lưu: thiết bị bơm oxy, máy bơm

18) Một số dụng cụ thí nghiệm khác như: petri, ống nghiệm, erlen,

becher, buret, ống đong, pipet, pipetman, đèn cồn, que cấy….

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thu thập mẫu giấm

Để phân lập được các chủng lên men Acetic tốt, chúng tôi đã thu thập

nhiều mẫu giấm từ nhiêu nơi khác nhau, đồng thời các mẫu giấm này phải đạt

2 chỉ tiêu:

- Phải là giấm nuôi.

- Phải có vị chua.

2.2.2. Khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm

2.2.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng

Xác định hàm lượng acid tổng trong các mẫu giấm thu được bằng

phương pháp chuẩn độ dùng NaOH 0,1N với phenoltalein 1% làm chỉ thị

màu.

( V- V0)*x*0

a(g/l) = 006*1000; Số ml dịch lên men chuẩn

Hàm lượng acid tổng (qui ra acid acetic) được tính theo công thức:

Trong đó:

V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ số ml dịch lên men chuẩn.

V0 : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử không.

x :số hiệu chỉnh NaOH 0,1N so với acid oxalic 0,1N.

0,006 : Số mg acid acetic tương ứng 1ml NaOH 0,1N.

2.2.2.2. Xác định pH

Xác định pH của mẫu giấm bằng máy đo pH.

2.2.2.3. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm phân loại.

2.2.2.3.1. Phân lập

Trong môi trường có sử dụng nguồn cacrbon là ethanol và có sự hiện

diện của CaCO3, (MT1) các khuẩn lạc tạo được vòng phân giải xung quanh

(làm tan CaCO3) có thể được xem là dự tuyển của vi khuẩn sinh acid acetic.

Tiến hành pha loãng mẫu giấm ở các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ,10-4,10-5 ,10-6. Ủ trong tủ ấm 300C trong 3 ngày. Chọn những khuẩn lạc

riêng rẽ có vòng làm tan CaCO3. Làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần cho

đến khi quan sát chỉ còn 1 loại khuẩn lạc trên môi trường. Kiểm tra độ thuần

khiết bằng cách quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram.

2.2.2.3.2..Khảo sát đặc điểm phân loại

(cid:31) Dạng khuẩn lạc

Tiến hành cấy vi khuẩn phân lập được trên bề mặt môi trường ethanol-

cao nấm men có CaCO3 (MT1) sao cho có được những khuẩn lạc tách rời.

Nuôi ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc. Sau 3 ngày

quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.

(cid:31) Hình thái vi khuẩn

(cid:31) Khả năng di động

Quan sát khả năng di động của vi khuẩn dưới dạng tiêu bản giọt treo.

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường làm giàu sinh khối (MT2)

(cid:31) Nhuộm Gram

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cao thịt-pepton (MT7)

trong 16-24 giờ. Hút 1ml dịch vi khuẩn pha loãng trong nước cất vô trùng để

mật độ tế bào trong thị trường kính hiển vi vừa phải và dễ quan sát. Làm vết

bôi vi khuẩn với đối chứng là Bacillus Gram dương, E.coli Gram âm. Sau khi

nhuộm, soi kính với vật kính dầu 100X.

(cid:31) Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

(cid:31) Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic

(cid:31) Định tính acid acetic tạo thành

Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường lên men định tính (MT3) ở

nhiệt độ phòng trong 4 ngày.

Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH . Nhỏ

vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều ống nghiệm và đun sôi

trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có acid acetic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt

acetate tạo thành.

Đối chứng dương là ống đựng acid acetic chuẩn, đối chứng âm là môi

trường không nuôi cấy vi khuẩn.

Phản ứng diễn ra theo phương trình sau:

CH3COOH +NaOH  CH3COONa +H2O

CH3COONa + FeCl3  Fe(CH3COO)3 +3NaCl

Màu đỏ thẫm

(cid:31) Định lượng acid acetic tạo thành

Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh (MT2) rồi

chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1 (MT5), môi trường nhân giống cấp

2 (MT6). Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định

acid tổng.

(cid:31) Khảo sát đặc tính sinh catalase

Nguyên tắc

Catalase xúc tác sự phân giải H2O2 thành H2O và O2. Nếu vi khuẩn khảo

sát có khả năng tạo catalase thì khi nhỏ H2O2 vào dịch nuôi cấy vi khuẩn đó,

H2O2 bị phân giải thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt.

2H2O2 2 H2O

Catalase

Thực hiện

Nuôi cấy các chủng khảo sát trong ống nghiệm chứa môi trường tăng

sinh khối (MT2) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 1 giọt dịch nuôi cấy lên

tấm lam và nhỏ từ từ H2O2 vào. Quan sát và ghi nhận hiện tượng.

(cid:31) Khả năng tạo H2S

Đây là đặc điểm của vi sinh vật có khả năng sử dụng các amino acid trong

môi trường có Thiosulfate Natri. Chúng tạo thành những đường cấy màu đen

do tạo được sulfua chì theo phản ứng sau:

COOH.CH.NH2.CH2S.S.CH2.CH.NH2.COOH + H2 + 4H 

2H2S + 2NH3 + 2CH3COOH+ 2HCOOH

H2S + Pb(CH3COO)2  PbS + 2CH3COOH

Sulfua chì màu đen

Thực hiện

Cấy chủng khảo sát lên ống thạch đứng chứa môi trường thử khả năng

tạo H2S (MT13) bằng những đường cấy thẳng, sâu, gần sát thành ống nghiệm.

Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày, quan sát những đường cấy, nếu vi khuẩn tạo

H2S thì đường cấy sẽ có màu đen do tạo sulfua chì.

(cid:31) Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate

Tiến hành theo phương pháp của Leifson. Đây là phương pháp nhanh và

dễ dàng nhất để phân loại vi khuẩn Acetic đến cấp giống. Nếu chủng khảo sát

có khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate thì chủng đó thuộc giống

Acetobacter còn ngược lại chủng đó thuộc giống Gluconobacter .

Nguyên tắc

Sử dụng môi trường sodium acetate hoặc sodium lactate có

bromothymol-blue làm chất chỉ thị màu. Chỉ thị màu này có pH nhạy cảm

trong khoảng pH 5,6-7,4 và biến đổi màu từ màu vàng sang xanh dương. Khi

acetate hoặc lactate bị oxy hoá thì môi trường trở nên kiềm tính. Bằng cách

quan sát sự chuyển màu của môi trường (vàng chuyển sang xanh dương) cho

phép đánh giá được khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của chủng vi sinh

vật khảo sát.

Thực hiện

Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường sodium acetate. Nuôi ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày quan sát sự chuyển màu của môi

trường.

2.2.3. Khảo sát đặc điểm lên men acetic

2.2.3.1.Chọn giống

Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác

định được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những

thí nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát.

2.2.3.2. Chọn môi trường

(cid:31) Xác định pH thích hợp

Tiến hành nuôi các chủng khảo sát trong môi trường tăng sinh khối

(MT2) trong 24 giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống

nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch

nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát ở

các pH (MT8) tương ứng: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 6,8. Nuôi các chủng cần khảo sát trong 4 ngày ở 300C, đo OD ở bước sóng 660nm và

ghi nhận kết quả.

(cid:31) Xác định nhiệt độ thích hợp

Tiến hành nuôi cấy các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh khối

(MT2) trong 24giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống

nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch

nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát nhiệt độ (MT 9 ) tương ứng là 150C, 180C, 250C , 300C ,350C, 370C, 400C, 450C. Đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.

(cid:31) Mật độ giống ban đầu thích hợp cho quá trình lên men

Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I,

II và chuyển vào môi trường định lượng. Sau đó định hàm lượng acid tạo

thành bằng phương pháp xác định acid tổng.

(cid:31) Xác định nồng độ ethanol thích hợp

-Nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát ở môi trường tăng sinh và nhân giống

cấp I, II. Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường định lượng có nồng độ ethanol

tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%.

-Tiến hành thí nghiệm 2 lô: 1 lô hấp khử trùng và 1 lô không hấp khử

trùng. Môi trường 1: hấp khử trùng; Môi trường 2 : không hấp khử trùng.

(Mục đích thực hiện môi trường không hấp khử trùng để xem giống có khả

năng chống được sự nhiễm khuẩn hay không).

-Xác định hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng

và ghi nhận kết quả.

-Sau khi xác định được nồng độ ethanol ban đầu thích hợp cho quá trình

lên men chúng tôi sẽ sử dụng nồng độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.

(cid:31) Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp

- Cấy chủng khảo sát vào các erlen chứa môi trường tăng sinh khối

(MT2) nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sóng 660nm cứ

24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả.

- Cho 25% dịch tăng sinh có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen

chứa môi trường nhân giống I (MT5), nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi

chủng ở bước sóng 660nm, cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi

nhận kết quả.

(cid:31) Xác định mật độ vi khuẩn phát triển trong môi trường nhân giống

II để chuẩn bị lên men

- Cho 25% dịch nhân giống I có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào

erlen chứa môi trường nhân giống II (MT6), nuôi cấy lắc trong khoảng thời

gian thích hợp. Để tính số vi khuẩn trong thể tích khảo sát ta cần đếm số

khuẩn lạc trên đĩa petri.

Đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch

(cid:31) Nguyên tắc:

Mỗi sinh vật đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc trên môi

trường thích hợp. Đếm số khuẩn lạc ta có thể tính ra số vi sinh vật trong 1 thể

tích cần nghiên cứu.

(cid:31) Thực hiện:

Pha loãng dịch cần đếm bằng cách dùng pipetman hút 1ml dịch vào 9ml

nước cất vô trùng. Tùy độ đục của dịch nuôi cấy mà pha loãng ở nhiều nồng

độ khác nhau. Sau đó trãi 0,1ml dịch pha loãng khác nhau lên hộp petri chứa

môi trường Ethanol-Cao nấm men . Ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc

trên các đĩa (hai đĩa trãi cùng nồng độ pha loãng). Đếm số khuẩn lạc trên

những đĩa có từ 30-300 khuẩn lạc để tính kết quả.

Tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính theo công thức sau:

A(CFU/ml) = Error!

Trong đó :

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng

V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa

fi : độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

2.2.4. Các phương pháp nuôi cấy

2.2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tĩnh

Chuyển 25% dịch nhân giống II của chủng khảo sát vào môi trường

định lượng,nuôi cấy tĩnh. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương

pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu.

2.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí

Chuyển 25% dịch nhân giống II vào môi trường định lượng, nuôi cấy

bằng thiết bị lên men sục khí. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương

pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. Mỗi lần đo

cách nhau 24giờ, nuôi cấy cho đến khi hàm lượng acid acetic sinh ra bắt đầu

giảm.

Mô tả thiết bị lên men sục khí

Thiết bị lên men sục khí được cấu tạo như sau: Bình lên men (erlen

1000ml); Trong bình có 1 cá khuấy từ và bình đặt trên máy khuấy từ; Không

khí từ bên ngoài vào bình lên men được vô trùng nhờ đi qua 1 phễu lọc, phễu

lọc được nối với máy sục khí mục đích cung cấp oxy để quá trình oxy hoá

diễn ra nhanh; Ống thoát khí giúp không khí từ trong bình lên men thoát ra

bên ngoài môi trường; Ngoài ra còn có ống thu dịch lên men, ống tiếp nguyên

liệu trong quá trình lên men.

7 8

9 6

3

Hình 2.1 :Sơ đồ thiết bị lên men sục khí

6: Thiết bị lọc khí. 1. Bình lên men

7: Ống thoát khí. 2: Cá khuấy từ.

8: Ống thu dịch lên men. 3: Máy khuấy từ.

9: Ống tiếp môi trường. 4: Máy sục khí.

5: Ống thu khí.

2.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu

(cid:31) Mô tả thiết bị lên men hồi lưu

Thiết bị gồm có 2 phần

Phần trên : là thùng lên men được thiết kế theo phương pháp nhanh với

mục đích tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn acetic với không khí để

oxy hóa rượu. Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được

chuyển từ dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố

định. Trong thiết bị này dịch lên men được cho thấm dần qua giá thể BC và

được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị, khi chảy qua giá thể BC rượu dần dần

bị oxy hóa thành acid acetic.

Phần duới: chứa dịch lên men sau khi đi qua giá thể BC, có lắp thêm bộ

phận sục khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như nồi lên men của phương

pháp chìm. Ở phần dưới chúng tôi đặt thêm 1 máy bơm để dịch lên men sau

khi qua giá thể BC sẽ được bơm trở lại thùng lên men qua 1 ống dẫn từ máy

bơm qua thùng lên men, và dịch lên men được cho chảy xuống từ từ, tưới đều

lên giá thể nhờ 1 vòi sen. Ngòai ra, chúng tôi lắp thêm 1 ống dẫn dịch lên men

xuống trở lại thùng chứa dịch lên men tạo nên sự hồi lưu của thiết bị, và ống

dẫn này nối với thiết bị sục khí mục đích cung cấp oxy làm cho quá trình lên

men diễn ra nhanh hơn.

3 8 2

6 5

9 1

Hình 2.2: Sơ đồ thiết bị lên men hồi lưu

1: Bình chứa dịch lên men.

2: Bình lên men.

3: Ống dẫn dịch lên men đi lên bình lên men.

4: Ống dẫn dịch sau khi lên men xuống bình chứa dịch lên men.

5: Lưới đỡ giá thể mang.

6: Giá thể BC.

7: Máy bơm.

8: Vòi sen phân phối dịch lên men.

9: Máy sục khí.

10: Van để lấy dịch sau khi lên men.

(cid:31) Thu nhận cellulose vi khuẩn

-Nhân giống I: Cấy giống Acetobacter xilynum dùng sản xuất BC được

giữ trên môi trường thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường sản

xuất BC (MT19). Tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày.

-Nhân giống II: Giống cấp I được chuyển vào môi trường nhân giống cấp

II (sử dụng 150ml MT15). Lượng giống bổ sung chiếm khoảng 10% thể tích

môi trường nhân giống cấp II.

-Lên men bề mặt để thu BC: Quá trình lên men được tiến hành trong

khay nhựa chứa 1000ml MT15 và 10% giống cấp II, để yên ở nhiệt độ phòng.

Thời gian thu BC là 1 tuần sau khi cấy giống cấp II vào.

(cid:31) Phương pháp xử lý BC để sử dụng làm chất mang cố định vi

Sau 7 ngày nuôi cấy tĩnh



Thu BC



Rữa kỹ BC bằng nước máy



khuẩn

Ngâm và thay nước liên tục trong 2ngày đối với BC thu được từ môi trường nước

dừa già (4 giờ thay nước 1 lần)



Cân trọng lượng tươi của BC



Vớt các miếng BC ra và sấy cho ráo nước



Cân các miếng BC sau khi sấy



So sánh trọng lượng của miếng BC sau khi sấy với trọng lượng của miếng BC trước

khi sấy (trọng lượng giảm khoảng 9 lần)

 Đem hấp khử trùng miếng BC ( 1210C, 20 phút)

(cid:31) Phương pháp cố định

-Ngâm BC đã xử lý trong dịch nhân giống cấp II trong 24 giờ.

-Xác định mật độ vi khuẩn bám trên BC bằng phương pháp đếm gián tíêp

khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa .

(cid:31) Cho môi trường định lượng vào thiết bị lên men hồi lưu. Đo hàm

lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với

phenoltalein làm chỉ thị màu. Mỗi lần đo cách nhau 12 giờ, nuôi cấy cho đến

khi hàm lượng acid acetic sinh ra bắt đầu giảm.

2.2.5. Lên men giấm bằng cơ chất là trái cây

2.2.5.1 Xử lý trái cây để làm rượu

(cid:31) Xử lý nho để làm rượu

Chuẩn bị 2kg nho tiến hành sắt nhỏ và thêm men ( 2 ống giống thạch

nghiêng Saccharomyces cerevisiae) và bổ sung đường với hàm lượng là 500g,

sau đó thêm 1000ml nước đun sôi, để nguội, khuấy đều. Cho lên men tự nhiên

trong vòng 2 tuần.

(cid:31) Xử lý dứa để làm rượu

Chuẩn bị 2kg dứa tiến hành sắt nhỏ và thêm men ( 2 ống giống thạch

nghiêng Saccharomyces cerevisiae) và bổ sung đường với hàm lượng là 500g,

sau đó thêm 1000ml nước đun sôi, để nguội, khuấy đều. Cho lên men tự nhiên

trong vòng 2 tuần.

2.2.5.2 Khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có sử

dụng rượu trái cây

(cid:31) Xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp chuẩn độ

Số lượng ethanol sinh ra khi lên men được xác định bằng phương pháp

đo oxy hoá trên cơ sở oxy hoá ethanol thành acid acetic và nước bằng hỗn

hợp bicromat kali và acid sulfurit.

3 CH3CH2OH + 2K2Cr2O7 +8 H2SO4 =

3CH3COOH + 2Cr(SO4)2 + K2SO4 +11H2O

Khi kết thúc quá trình oxy hoá rượu, ta chuẩn độ phần bicromat thừa

bằng dung dịch muối Morh

K2Cr2O7 + 6FeSO4(NH4)2SO4 + 7 H2SO4=

Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)3 +6(NH4)2SO4 + 7H2O + K2SO4

Dựa vào số lượng bicromat đã được dùng để oxy hoá mà tính ra nồng độ

rượu. Phương pháp sẽ cho kết quả chính xác hơn cả khi lượng rượu chứa

trong dịch thể khoảng 1-2%. Do đó khi nồng độ rượu cao hơn, ta cần pha

loãng dịch nuôi cấy, còn khi nồng độ thấp hơn ta pha loãng muối Morh và

bicromat.

Các bước thực hiện

Trong bình định mức loại 100ml, ta cho 20ml dịch nuôi cấy đã được tách

bỏ các tế bào bằng cách để lắng, lọc hoặc li tâm. Bổ sung nước cất cho tới

100ml, khuấy trộn và lấy ra 10ml cho vào bình cầu đáy tròn loại có dung tích

50-75ml. Trong bình nhận có 3 chỗ phình hình cầu, ta rót 25ml dung dịch

bicromat và 10ml H2SO4 đặc. Đậy bình cầu bằng nút cao su có gắn với 1 ống

dẫn mà đầu cuối của nó phải chạm tới đáy của bình nhận. Sau đó trong 10-

15phút cất 2/3 dung tích bình. Dung dịch bicromat trong thời gian đó sẽ

chuyển từ màu da cam sang màu nâu bẩn.

Đem chất dịch từ bình nhận chuyển vào bình định mức loại 100ml.

Tráng bình nhận và ống dẫn bằng nước cất, sau đó rót nước này vào bình định

mức nói trên. Sau đó thêm nước cất đến vạch mức, khuấy trộn, lấy ra 20ml

cho vào 1 bình tam giác loại 250ml, thêm 20ml nước cất và chuẩn độ bằng

muối Morh. Đồng thời ta tiến hành chuẩn độ đối chứng để xác định xem cần

bao nhiêu muối Morh để chuẩn độ 5ml dung dịch bicromat. Muốn vậy trong

bình tam giác ta trộn 5ml bicromat, 2ml acid sunfuric đặc, 30-40ml nước cất,

rồi chuẩn độ bằng muối Morh. Vì muối Mohr là hợp chất không bền cho nên

phải chuẩn độ đối chứng mỗi lần xác định. Kết thúc chuẩn độ bằng cách xác

định 1 giọt mẫu với dung dịch ferrixianid. Muốn vậy dung đũa thủy tinh lấy 1

giọt chất dịch chuẩn độ đặt 1 tấm bằng sứ hay bằng gốm trắng và cạnh đó nhỏ

1 giọt ferrixianid, khi hoà lẫn 2 giọt nếu thấy có màu xanh đậm hơn nhiều là

phản ứng kết thúc. Chuẩn độ 2 lần dung dịch thí nghiệm và dung dịch đối

chứng. Lần chuẩn độ đầu dùng để nhận được các kết quả định hướng, do đó

phản ứng của dịch chuẩn độ với dung dịch ferixianid được tiến hành sau mỗi

lần thêm 1ml dung dịch muối Morh.

(

01.0

Số lượng ethanol tính bằng g/10ml dịch nuôi cấy được tính theo công

ba  5.25). a

thức:

a :số ml dung dịch muối Morh đã dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng

b : số ml dung dịch muối Morh đã dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm

25: Số ml K2Cr2O7

5: Độ pha loãng dịch nuôi cấy (20ml pha loãng tới 100ml)

0,01: g ethanol ứng với 1ml K2Cr2O7

Sau khi xác định độ rượu, tiến hành lên men. Tiếp 25% giống ( dịch nhân

giống II) vào môi trường lên men có chứa 20% thể tích rượu trái cây đã xác

định độ rượu, từ đó bổ sung rượu trắng cho đủ nồng độ ethanol thích hợp.

Theo dõi sự tạo thành acid qua các ngày lên men. Lên men bằng phương

pháp sục khí ở nhiệt độ phòng và đo hàm lượng acid sinh ra mỗi ngày cho đến

khi hàm lượng này không tăng nữa.

2.2.5.3. Khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có

sử dụng dịch chiết từ xác bã trái cây

(cid:31) Thời gian tự lên men của xác bã

Xác bã trái cây sau khi làm rượu trái cây, cho lên men tự nhiên trong

vòng 5 ngày và 15 ngày. (Xác bã trái cây: 500g; Đường :150g;

Nước đun sôi để nguội : 1000ml)

Sau đó vắt xác thu được dịch xác bã từ trái cây.

(cid:31) Lên men acetic dịch chiết từ xác bã trái cây

Tiếp 25% giống A6 (nhân giống II) vào môi trường dịch chiết xác bã nho

và bổ sung thêm 5% ethanol. Lên men bằng phương pháp sục khí. Theo dõi

sự tạo thành acid qua các ngày lên men, đo hàm lượng acid sinh ra mỗi ngày

cho đến khi hàm lượng này không tăng nữa.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Thu thập mẫu giấm và khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm

Từ 10 mẫu giấm thu được ở Long An, Thành phố Hồ Chí Minh, Bạc

Liêu chúng tôi xác định hàm lượng acid tổng của các mẫu giấm và xác định

giá trị pH của các mẫu giấm.

3.1.1. X ác định hàm lượng acid tổng của các mẫu giấm

Xác định hàm lượng acid tổng trong các mẫu giấm bằng phương pháp

chuẩn độ dùng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chất chỉ thị màu ta thu được

kết quả trình bày ở bảng 3.1

3.1.2. Xác định giá trị pH của các mẫu giấm

Đi đôi với việc xác định hàm lượng acid tổng chúng tôi tiến hành xác

định độ pH của các mẫu giấm. Giá trị pH của các mẫu giấm được trình bày ở

bảng 3.1.

Ký hiệu mẫu

Địa điểm thu mẫu

Hàm lượng acid tổng (g/l)

Giá trị pH

Long An

18,1

2,8

Long An

21,7

2,57

Tp HCM

25,6

2,46

Tp HCM

17,03

2,89

Tp HCM

33,2

2,3

Tp HCM

9,4

3,04

Tp HCM

13,5

2,95

Tp HCM

12,5

3,12

Tp HCM

8,3

3,3

Bạc Liêu

19,3

2,7

Bảng 3.1 :Hàm lượng acid tổng và giá trị pH của các mẫu giấm

Biểu đồ 3.1 Hàm lượng acid tổng (g/l) của các mẫu giấm

å

H/l acid toång

) l / g ( g n o t d i c a

l /

H

1 2 3

4 5 6 7

8 9 10

maãu giaám

Biểu đồ 3. 2: Giá trị pH của các mẫu giấm

H p

maãu giaám

Nhận xét:

Tùy theo phương thức lên men và nguyên liệu lên men và chủng giống

sẽ tạo nên sản phẩm có hàm lượng acid khác nhau.

Các mẫu 2,3,5,10 có hàm lượng acid cao có khả năng sẽ phân lập đựợc

những chủng giống tốt từ nguồn giấm này.

3.2. Phân lập và khảo sát 1 số đặc điểm phân loại của vi khuẩn acetic

3.2.1. Phân lập

Qua quá trình phân lập các mẫu giấm trên môi trường ethanol-cao nấm

men-CaCO3 trong 3-4 ngày kết quả tạo được những khuẩn lạc có hình dạng,

màu sắc, kích thước khác nhau. Trong đó có các chủng tạo vòng tan, chúng

tôi tiến hành làm thuần được 11 chủng sinh acid khác nhau.

Bảng 3.2 : Các chủng phân lập được từ các mẫu giấm

Ky hiệu chủng Mẫu giấm Số chủng phân lập

được phân lập

2 2 A1, A2

3 1 A3

4 1 A4

5 2 A5, A6

7 2 A7, A8

10 3 A9, A10, A11

Hình 3.1 : Khả năng làm tan CaCO3 của chủng A3

3.2.2. Một số đặc điểm phân loại của vi khuẩn

3.2.2.1. Dạng khuẩn lạc và hình thái của các chủng khảo sát

Đặc tính về hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trạng thái di động,

hình dạng tế bào và trạng thái Gram được trình bày ở bảng 3.3

Hình 3.2 Trạng thái Gram của chủng A3

Hình 3.3:Dạng khuẩn lạc của chủng A3

Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc

Kích

Màu sắc Hình thái tế bào

Khả

Gram

Bảng 3.3 : Dạng khuẩn lạc và hình thái chủng khảo sát

khuẩn lạc

năng di động

Chủng

thước khuẩn lạc (mm) 0.3-0.4

Que,đơn

Trắng ngã vàng

0.3-0.4

Que, đơn

Vàng nhạt

0.4-0.5

Vàng nhạt

Que, đơn,kết đôi hoặc kết ba

0,3-0.5

Que,kết đôi

0.3-0.4

0.4-0.5

Vàng nhạt Trắng đục Vàng

Que.đơnhoặc kết đôi Que, đơn

0.3-0.4

Que,đơn

0.3-0.4

0.1-0.2

A10

Trắng đục Trắng ngã vàng Trắng đục Vàng nhạt

Que, đơn hoặc kết đôi Hình que,đơn hoặc kết đôi Que,kết đôi hoặc đơn

0.1-0.15

Que

A11

Vàng nhạt

Bìa tròn,gom gọn,bề mặt khuẩn lạc lõm Bìa tròn. Gom gọn,bề mặt khuẩn lạc hơi lõm Bìa tròn, đều,bề mặt khuẩnlạc phẳng,trơnláng Bìa tròn, bề mặt bóng, hơi nhô cao Bìa nhăn, bề mặt lì, Bìa tròn đều,bề mặt khuẩn lạc bóng Bìa nhăn,bề mặt khuẩn lạc lõm Bìa tròn,bề mặt láng,nhô cao Bìa tròn,bề mặt khuẩn lạc bóng Bìa tròn, gom gọn.Bề mặt khuẩnlạc nhô cao, bóng Bìa tròn,bề mặt khuẩn lạc không nhô cao

Các đặc tính về khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường Ethanol-Cao

nấm men-CaCO3, các đặc trưng về hình thái tế bào,trạng thái Gram đã sơ bộ

được các chủng khảo sát mang đặc tính của vi khuẩn sinh acid. Nhưng để

định danh sơ bộ các vi khuẩn này đến cấp độ giống chúng tôi tiếp tục khảo sát

các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vừa xét.

3.2.2.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của các chủng khảo sát

Vi khuẩn Acetic có đặc tính chung như sinh catalase, phát triển trên môi

trường Glutamate, môi trường manitol, không làm tan chảy gelatin, không

phân giải Dextrin….

(cid:31) Định tính acid acetic

Trong quá trình phân lập, trên moi trường có nguồn cacbon là ethanol

chúng tôi tuyển chọn được các chủng có vòng phân giải là CaCO3, tức là các

chủng này có khả năng oxy hóa ethanol thành acid hữu cơ tương ứng là acid

acetic. Để kiểm chứng điều này, chúng tôi tiến hành định tính acid acetic tạo

thành trong môi trường nuôi cấy các chủng trên bằng phương pháp dùng dung

dịch FeCl3 5%. Kết quả là tất cả các chủng phân lập đều có khả năng tạo

acetic acid.

Hình 3.4. Khả năng tạo acid acetic của các chủng phân lập

(cid:31) Định lượng acid acetic

Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh, rồi chuyển

sang môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, sau đó là

môi trường định lượng. Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương

pháp xác định acid tổng. Kết quả trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Hàm lượng acid tổng trong môi trường nuôi cấy các chủng

khảo sát

Chủng vi khuẩn Hàm lượng acid tổng(%)

0,54 A1

1,77 A2

1,98 A3

1,34 A4

1,25 A5

2,01 A6

0,56 A7

1,64 A8

1,728 A9

1,56 A10

0,576 A11

Biểu đồ 3.3: Hàm lượng acid tổng trong môi trường nuôi cấy các chủng

phân lập

)

å

H/l acid toång(%)

% ( g n o t d i c a

l /

2.5 2 1.5 1 0.5 0

H

A 1

A 3

A 7

A 5

A 9

A 11

Chuûng

Nhận xét:

Chủng A3 và A6 có hàm lượng acid tổng tạo thành cao hơn các chủng

còn lại. Ở những thí nghiệm về các điều kiện lên men chúng tôi chọn 2 chủng

này tiếp tục khảo sát.

(cid:31) Đặc tính sinh catalase

Khi nhỏ H2O2 vào giọt dịch nuôi cấy các chủng khảo sát trên tiêu bản.

Kết quả các chủng đều sủi bọt.

Như vậy các chủng đều sinh catalase

(cid:31) Khả năng phân giải Dextrin của vi khuẩn

Các chủng đều không có khả năng phân giải dextrin.

Hình 3.5: Khả năng không phân giải Dextrin của chủng A3

(cid:31) Khả năng tạo -pyrone của vi khuẩn

Kết quả khảo sát cho thấy các chủng không có khả năng tạo -pyrone.

(cid:31) Khả năng tạo H2S của vi khuẩn

Kết quả khảo sát cho thấy tất cả các chủng đều không có khảnăng tạo

H2S

(cid:31) Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của vi khuẩn

Kết quả cho thấy chủng A3, A4, A5 có khả năng oxy hoá acetate( thể

hiện qua sự chuyển màu từ màu vàng hơi xanh sang xanh dương), còn các

chủng còn lại không có khả năng oxy hoá acetate( màu vàng hơi xanh).

Như vậy, trong 11 chủng khảo sát có 3 chủng thuộc giống Acetobacter

(A3 , A4, A5) và 8 chủng thuộc giống Gluconobacter (A1, A2, A6 ,A7, A8, A9,

A10, A11 )

Hình 3.6 : khả năng oxy hoá acetate của các chủng phân lập

(cid:31) Khả năng phát triển trên môi trường Mannitol của vi khuẩn

Kết quả khảo sát khả năng phát triển trên môi trường Mannitol cho thấy

tất cả các chủng đều có khả năng phát triển trên môi trường này.

Hình 3.7: Khả năng phát triển trên môi trường Mannitol của chủng A3

và chủng A6

3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến sự lên men acetic

3.3.1. Chọn giống

Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác định

được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những thí

nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát.

3.3.2. Chọn môi trường

3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH

Nuôi cấy các chủng khảo sát ở môi trường có pH khác nhau biến thiên từ 2,5 đến 6,8 và nuôi trong 30 o C trong 4 ngày, đo OD ở bước sóng

660nm thu được kết quả trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của các chủng thông

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

Chủng

0,024

0,078

0,085 0,42

0,475 0,67

0,73

0,59

0,53

0,034

0,073

0,178 0,34

0,438 0,56

0,63

0.572 0,475

qua mật độ quang

Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của các chủng khảo

sát thông qua mật độ quang

0.8

0.6

0.4

H p

0.2

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

Trò soá maät ñoä quang

Nhận xét

Qua kết quả thu được chúng tôi nhận thấy các chủng khác nhau có

khỏang pH rộng hẹp khác nhau.

Khoảng pH thích hợp cho hầu hết các chủng 4,5-> 6,0. pH=5,5 là tối

thích đối với chủng khảo sát, ở những thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng giá

trị pH này để khảo sát.

3.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nuôi các chủng khảo sát ở môi trường pH giống nhau ( pH= 4.5), nhưng nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 150C, 200C, 280C, 300C, 350C, 370C, 400C, 450C. Sau 4 ngày đo OD ở bước sóng 660nm thu được kết quả trình bày ở

bảng sau.

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của các chủng

Nhiệt độ

150C

200C

280C

300C

350C

370C

400C

450C

Chủng

0,095

0,185

0,31

0,227

0,163

0,098

0,262

0,334

0,23

0,157

thông qua mật độ quang

Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của các chủng

0.4

0.3

thông qua mật độ quang

D O

Chủng A3

0.2

Chủng A6

ị r t iá g

0.1

nhiệ t độ

Nhận xét

Qua kết quả thu được chúng tôi nhận thấy khoảng nhiệt độ để các chủng có thể tăng trưởng được là 25-370C. Nhiệt độ tối thích là 300C, ở những thí

nghiệm sau chúng tôi sử dụng nhiệt độ này để lên men.

3.3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ giống ban đầu

Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I,

II rồi chuyển vào môi trường định lượng, nuôi cấy lắc trong 7 ngày.

Sau đó định hàm lượng acid tạo thành bằng phương pháp xác định acid

tổng.

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của hàm lượng giống ban đầu đối với sự tạo thành

acid của các chủng khảo sát

5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

13,1 g/l 13,9 g/l 14,3 g/l 19,8 g/l 20,5 g/l 15,9 g/l 15,5 g/l A3

11,2 g/l 14,4 g/l 15,3 g/l 20,3 g/l 21,5 g/l 16,7 g/l 15,5 g/l A6

Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của mật độ giống ban đầu đối với sự tạo thành

acid của các chủng khảo sát

å

) l / g ( g n o t d i c a

ä

à

25 20 15 10 5 0

o ñ g n o n

5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

maät ñoä gioáng ban ñaàu

Nhận xét

Hàm lượng giống ban đầu (chủng A3 và A6) là 25% thì nồng độ acid là

cao nhất.

Nếu hàm lượng giống ban đầu thấp thì không đủ vi khuẩn để chuyển hóa

ethanol thành acid acetic. Nếu hàm lượng giống ban đầu quá cao thì sẽ có sự

cạnh tranh của vi khuẩn gây ra ức chế sự oxy hóa ethanol thành acid acetic.

Do đó ở những thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sử dụng lượng giống ban

đầu là 25%.

3.3.2.4. Nồng độ ethanol thích hợp cho quá trình lên men

Sau khi nuôi cấy chủng vi khuẩn ở môi trường tăng sinh và nhân giống

cấp I, II. Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường định lượng có nồng độ ethanol

tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%. Kết quả xác định hàm lượng acid

tổng sinh ra của 2 chủng: A3, A6 sau 7 ngày được trình bày ở bảng 3.8

Bảng 3.8: ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của

Nồng độ

10%

12%

ethanol

Môi trường

15,3 g/l 17,7 g/l 21,3 g/l 19,6 g/l 14,9 g/l

13,5 g/l

9,7 g/l

chủng A3

15,5 g/l 18,5 g/l 22,5 g/l 21,1 g/l 16,8 g/l

12,3 g/l

12,5 g/l

MT1

MT2

Biểu đồ 3.7: ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của

MT1

MT2

chủng A3

) l / g ( g n oå t d i c a l / h

25 20 15 10 5 0

3% 4% 5% 6% 8% 10% 12%

noàng ñoä ethanol ban ñaàu

Bảng 3.9: Anh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của

10%

12%

Nồng độ ethanol

15,1 g/l

18,6 g/l

21,8 g/l

21,4 g/l

17,3

12,0 g/l

9,5 g/l

MT1

16,3 g/l

19,4 g/l

22,7 g/l

18,5 g/l

13,2 g/l

11,5 g/l

MT2

chủng A6

Biểu đồ 3.8 : Ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng

của chủng A6

å

MT1

g n o t d i c a

MT2

l / h

25 20 15 10 5 0

3% 4% 5% 6% 8% 10% 12%

noàng ñoä ethanol ban ñaàu

Nhận xét:

- Nồng độ ethanol ban đầu thích hợp nhất là 5%. Nồng độ ethanol quá

thấp hoặc quá cao đều cho hàm lượng acid tổng thấp.Vì ở nồng độ thấp giống

đã chuyển hoá hết ethanol mà không còn nguồn cơ chất để chuyển hoá tiếp

theo. Còn ở nồng độ cao giống bị ức chế.

- Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng nồng độ ethanol là 5%

- Môi trường 2 không hấp khử trùng vẫn lên men tạo được sản phẩm

chứng tỏ rằng hàm lượng giống đưa vào môi trường đã khống chế được sự

nhiễm.

3.3.2.5. Thời gian nuôi cấy thích hợp

Cấy giống từ môi trường thạch nghiêng vào erlen chứa môi trường tăng

sinh, nuôi cấy lắc, đo mật độ tế bào, cho đến khi tỉ số OD giảm. Kết quả trình

bày ở bảng sau

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường tăng

Thời gian

sinh của các chủng thông qua mật độ quang

Chủng

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ

0,065 0,096 0,237 0,189 0,145 0,159 A3

0,090 0,148 0,173 0,164 0,153 0,253 A6

Biểu đồ 3.9: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường tăng

0.3

sinh của các chủng thông qua mật độ quang

D O

0.2

ò r t

ù

0.1

a i g

120

144

giôø

Sau đó dịch nuôi cấy sang môi trường nhân giống cấp I, nuôi cấy lắc, đo

mật độ tế bào, cho đến khi tỉ số OD giảm.

Bảng 3. 11: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường nhân

Thời gian

giống cấp I của các chủng thông qua mật độ quang

Chủng

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ

0,070 0,166 0,215 0,297 0,264 0,155 A3

0,098 0,53 0,303 0,231 0,217 0,208 A6

Biểu đồ 3.10: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường nhân

0.4

0.3

giống cấp I của các chủng thông qua mật độ quang

D O

0.2

ò r t

ù

0.1

a i g

120

144

giôø

Nhận xét

Kết quả cho thấy: đối với chủng A3 ở giờ 96 đo được trị số mật độ quang

cực đại và sau đó giảm dần; đối với chủng A6 ở giờ 72 đo được trị số mật độ

quang cực đại và sau đó giảm dần.

Do đó khi chuyển sang môi trường nhân giống II: đối với chủng A3

chúng tôi lấy dịch nhân giống I ở thời điểm 96 giơ; đối với chủng A6 chúng

tôi lấy dịch nhân giống I ở thời điểm 72 giờ.

3.3.2.6. Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch nhân giống để chuẩn bị

lên men

Sau đó chuyển 20% dịch nuôi cấy sang môi trường nhân giống cấp II,

nuôi cấy lắc: + Chủng A3 sau 96 giờ , đếm khuẩn lạc.

+ Chủng A6 sau 72 giờ, đếm khuẩn lạc.

Bảng 3.12 : Tổng số vi khuẩn hay khuẩn lạc trong 1ml dịch nuôi cấy

Chủng

Khuẩn lạc (CFU/ml) 47.106 53.106 A6

Nhận xét

Kết quả thu được cho thấy số vi khuẩn trong dịch nhân giống II của các

chủng khảo sát đủ lớn để tiếp tục bước vào giai đoạn lên men.

3.3.3. Các phương pháp nuôi cấy : nuôi cấy tĩnh- nuôi cấy bằng thiết

bị lên men sục khí, thiết bị lên men hồi lưu

Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định

lượng, đồng thời nuôi cấy bằng 3 phương pháp: phương pháp nuôi cấy tĩnh,

phương pháp nuôi cấy sục khí, phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men

hồi lưu

3.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tĩnh

Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng,

nuôi cấy tĩnh, đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid

tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.13

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của các

chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy tĩnh)

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

1,99 g/l 2,7 g/l 4,03 g/l 4,75 g/l 6,6 g/l A3

2,45 g/l 2,89 g/l 4,52 g/l 5,67 g/l 6,76 g/l A6

Biểu đồ 3.11: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của

các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy tĩnh

å

) l / g ( g n o t d i c a

ä

à

o ñ g n o n

120

giôø

3.3.3.2 Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí

Chuyển 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, nuôi

cấy bằng thiết bị lên men sục khí , đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương

pháp xác định acid tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.14

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các

chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy sục khí

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

10,2 g/l 15,5 g/l 20,1 g/l 27,8 g/l 17,2 g/l A3

9,8 g/l 13,6 g/l 21,6 g/l 29,7 g/l 18,7 g/l A6

Biểu đồ 3.12: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của

các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy sục khí)

) l / g ( g n oå t d i c a l / h

120

giôø

3.3.3.3 .Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu

(cid:31) Thu nhận BC sử dụng để làm giá thể

Nhân giống 1: Sau khi cấy Acetobacter xilynum trên môi trường sản

xuất BC và lên men tĩnh trong vòng 5 ngày nhận thấy 1 lớp màng trắng trên

bề mặt môi trường.

Nhân giống2: Sau khi cấy giống cấp I vào môi trường , lên men tĩnh

nhận thấy xuất hiện 1 lớp màng trắng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.

Hình 3.8 : Kết quả nhân giống cấp 2 (thu BC)

Lên men thu BC: Tiến hành lên men tĩnh trong khay nhựa, sau 1 tuần

thu được các miếng BC có bề dày khoảng 1,5cm.

(cid:31) Cố định chủng khảo sát trên chất mang BC:

Ngâm miếng BC đã qua xử lý để làm giá thể trong dịch nhân giống 2 của

chủng khảo sát (Chủng A3 và chủng A6) trong 24 giờ, đặt trên máy lắc. Mật

độ vi khuẩn phát triển trên giá thể BC ta có thể tính được bằng cách đếm gián

tiếp khuẩn lạc, thu được kết quả trình bày ở bảng 3.15

Bảng 3.15: tổng số khuẩn lạc hay vi khuẩn hiếu khí trên 1g BC

Chủng Khuẩn lạc (CFU/ml hoặc CFU/g)

5,1.105 6,8.105 A6

3.3.3.3 Lên men acetic bằng thiết bị lên men hồi lưu

Hàm lượng acid sinh ra tính bằng phương pháp xác định acid tổng. Kết

quả trình bày ở bảng 3.16

Bảng 3.16: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các

Thời gian

chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu)

Chủng

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

15,5 g/l 17,9 g/l 23,3 g/l 29,5 g/l 24,6 g/l A3

13,4 g/l 19,3 g/l 24,6 g/l 29,8 g/l 23,7 g/l A6

Biểu đồ 3.13: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của

các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu)

) l / g ( d i c a

l / h

120

giôø

Nhận xét

Phương pháp nuôi cấy tĩnh tốn nhiều thời gian hơn phương pháp lên men

sục khí và lên men bằng phương pháp lên men hồi lưu. Do vi khuẩn acetic là

loài hiếu khí bắt buộc nên khi có nhiều oxy thì sự oxy hóa ethanol thành acid

acetic sẽ diễn ra nhanh hơn.

Ở phương pháp sục khí và hồi lưu: Hàm lượng acid tổng tăng dần từ lúc

bắt đâu nuôi cấy cho đến 96 giờ, sau đó bắt đầu giảm dần, nguyên nhân do vi

khuẩn đã chuyển hóa hết ethanol, sau đó xảy ra sự quá oxy hóa .

Hình 3.9 : Thiết bị lên men hồi lưu

Hình 3.10 : Thiết bị lên men sục khí

3.4. Ứng dụng: lên men giấm bằng cơ chất là trái cây

3.4.1 Xử lý trái cây để làm rượu

Sử dụng các loại trái cây: dứa, nho để làm rượu thu được, rượu dứa và

rượu nho với hàm lượng được trình bày ở bảng sau

Bảng 3.17: Hàm lượng rượu trái cây

Rượu Rượu nho Rượu dứa

Hàm lượng rượu 8g/l 7g/l

Dùng rượu này để lên men giấm. Xác bã các loại trái cây sẽ cho lên men

tiếp trong khỏang thời gian thích hợp, thu dịch chiết từ xác bã với hàm lượng

rượu không đáng kể để lên men giấm.

3.4.2 Lên men giấm từ xác bã trái cây.

(cid:31) Xác bã dứa

- Xác bã dứa thu được sau khi làm rượu, cho lên men tự nhiên trong 5

ngày và 15 ngày, vắt lấy dịch chiết. Sử dụng dịch chiết này làm nguyên liệu

để lên men giấm bằng phương pháp sục khí.

Thu được kết quả sau

Bảng 3.18: Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết

xác bã dứa

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

5 ngày 14,2 g/l 16,5 g/l 25,6 g/l 30,8 g/l 19,9 g/l

15 ngày 15,4 g/l 16,8 g/l 26,8 g/l 32,5 g/l 21,4 g/l

Biểu đồ 3.14 :Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết xác bã dứa

å

5 ngaøy

15 ngaøy

) l / g ( g n o t d i c a

l / h

120

giôø

Nhận xét

Trong môi trường có dịch chiết xác bã trái dứa hàm lượng acid tổng tăng

rõ rệt.

Lượng acid tổng của xác ba dứa lên men 15 ngày cao hơn xác bã lên men

5 ngày do lượng ethanol trong xác bã lên men 15 ngày cao hơn (do lượng

glucozơ chuyển hoá thành ethanol nhiều hơn). Lượng ethanol cao đủ để cho

chủng khảo sát chuyển hóa ethanol thành acid acetic.

(cid:31) Xác bã nho

Xác bã nho thu được sau khi làm rượu, cho lên men tự nhiên trong 5

ngày và 15 ngày, vắt lấy dịch chiết. Sử dụng dịch chiết này làm nguyên liệu

để lên men giấm bằng phương pháp sục khí.

Thu được kết quả sau

Bảng 3.19: Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết

T/g lên men

xác bã nho

giấm

T/g lên men

xác bã

14,8 g/l

15,9 g/l

23,8 g/l

31,1 g/l

21,3 g/l

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ

15,3 g/l

17,2 g/l

25,7 g/l

33,5 g/l

21,5 g/l

5 ngày

15 ngày

Biểu đồ 3.15 :Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch

5 ngaøy

15 ngaøy

chiết xác bã nho

) l / g ( g n oå t d i c a g n ôï ö

l

120

m aø h

giôø

Nhận xét

Lượng acid tổng của xác bã nho lên men 15 ngày cao hơn xác bã lên men

5 ngày do lượng ethanol trong xác bã lên men 15 ngày cao hơn (do lượng

glucozo chuyển hoá thành ethanol nhiều hơn). Lượng ethanol cao đủ để cho

chủng khảo sát chuyển hoá thành acid acetic.

Chúng tôi nhận thấy hàm lượng acid tổng trong môi trường có dịch chiết

xác bã nho cao hơn trong môi trường dịch chiết xác bã thơm.Vậy nguyên liệu

là xác bã nho thích hợp để làm giấm hơn xác bã thơm.

3.4.3. Lên men giấm trong môi trường có rượu trái cây.

Trong môi trường lên men có chứa 20% rượu trái cây, cho lên men bằng

phương pháp sục khí, thu được kết quả sau:

Bảng 3.20 :Hàm lượng acid sinh ra trong môi trường có bổ sung rượu

Thời gian (giờ)

120

144

H/l acid tổng sinh ra

15,7g/l

17,5g/l

23,5g/l

32,6g/l

23,8g/l

26,4g/l

trong mt có rượu dứa

H/l acid tổng sinh ra

16,2g/l

18,9g/l

24,7g/l

33,8g/l

22,5g/l

27,2g/l

trong mt có rượu nho

trái cây

Biểu đồ 3.16 :Hàm lượng acid sinh ra trong môi trường có bổ sung rượu

trái cây

) l / g ( d i c a

m/t coù röôïu döùa

ï

g n ô ö

l

m/t coù röôïu nho

ø

m a h

120 144

giôø

Hàm lượng acid tổng tăng dần, đến 120 giờ bắt đầu giảm. Chúng tôi tiếp

tục bổ sung thêm 5% lượng ethanol và nhận thấy hàm lượng acid tăng

lên.Vậy chứng tỏ hàm lượng acid ở giờ 120 bị giảm có thể là do vi khuẩn đã

chuyển hoá hết ethanol mà không còn cơ chất để chuyển hoá tiếp. Do đó khi

chúng tôi tiếp thêm ethanol nghĩa là tiếp thêm cơ chất cho giống, giống tiếp

tục sử dụng ethanol để chuyển hoá tiếp nên hàm lượng acid lại tăng lên.

3.4.4. Nhận định về các mẫu giấm trái cây.

Mẫu giấm lên men từ xác bã trái cây và rượu trái cây có mùi đặc trưng

của từng loại trái cây, hương vị thơm ngon hơn các mẫu giấm ở các vị trí đã

thu mẫu.

Giấm lên men từ xác bã trái cây đục hơn giấm lên men từ rượu trái cây.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

Qua thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thực hiện được 1 số kết quả

như sau:

(cid:31) Thu thập được 10 mẫu giấm ở Tp.HCM và một số tỉnh khác,

đồng thời khảo sát hàm lượng acid và pH của các mẫu giấm thu được. Từ các

mẫu giấm trên, phân lập, khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa và xác định đến

cấp độ giống 11 chủng vi khuẩn. (3 chủng thuộc giống Acetobacter là A3, A4,

A5 và 8 chủng thuộc giống Gluconobacter là A1, A2, A6, A7, A8, A9, A10, A11).

(cid:31) Chọn 2 chủng sinh acid cao (Chủng A3 và chủng A6) để tiếp tục

khảo sát các điều kiện lên men.

(cid:31) Khảo sát được một số điều kiện lên men acetic để chủng khảo

sát cho hàm lượng acid cao như:

o Nhiệt độ: 300C.

o pH: 5,5.

o Mật độ giống bổ sung ban đầu: 25%.

o Nồng độ ethanol: 5%.

(cid:31) Thực hiện các phương pháp lên men acetic:

o Phương pháp tĩnh hàm lượng acid không cao do độ thoáng khí thấp.

o Phương pháp lên men sục khí và hồi lưu tạo được hàm lượng acid cao

trong thời gian ngắn do các phương pháp này cung cấp đủ oxy để các chủng

khảo sát nhanh chóng chuyển hoá ethanol thành acid acetic. Phương pháp hồi

lưu, chủng khảo sát được cố định trên chất mang BC nên hàm lượng acid tạo

thành cao hơn phương pháp sục khí.

(cid:31) Ứng dụng trong lên men giấm từ môi trường có bổ sung rượu trái

cây và môi trường có bổ sung dịch chiết xác bã trái cây bằng phương pháp

sục khí. Thu được giấm trái cây có hàm lượng acid cao trong thời gian ngắn

và có hương vị thơm ngon đặc trưng của từng loại trái cây.

2. Đề nghị

Vì thời gian có hạn nên còn 1 số vấn đề chưa thực hiện được, do đó

chúng tôi xin đề nghị:

(cid:31) Tiếp tục khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra tại điểm 168 giờ, 192

giờ… ở phần lên men giấm bổ sung rượu trái cây có bổ sung thêm ethanol

khi hàm lượng acid tổng sinh ra giảm .

(cid:31) Tìm cách nâng cao hiệu suất của phương pháp lên men hồi lưu và ứng

dụng phương pháp này để lên men giấm trái cây.

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

TIEÁNG VIEÄT 1.

Nguyeãn Leâ Vaân Anh (2002),Khaûo saùt coâng ngheä saûn xuaát Acetic acid

coâng nghieäp, Khoùa luaän cöû nhaân sinh hoïc- Chuyeân ngaønh sinh

hoùa ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân TpHCM .

2. Kieàu Höõu AÛnh (1999), Vi sinh vaät coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Khoa

Hoïc Kyõ Thuaät.

3. Ñaùi Duy Ban vaø coäng söï (1998), Phoøng beänh ung thö, NXB Y hoïc-Haø

Noäi.

4. Laâm Thò Kim Chaâu, Nguyeãn Thöôïng Leänh, Vaên Ñöùc Chính, Thöïc taäp

lôùn sinh hoaù, Tuû saùch ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân-TPHCM.

5. Nguyeãn Laân Duõng (1997), Vi sinh vaät hoïc (taäp 1,2), NXB ÑH &

THCN-Haø Noäi.

6. Nguyeãn Laân Duõng ( dòch) N.X.Egoro (hieäu ñính) (1986). Thöïc taäp vi

sinh vaät hoïc, NXB Giaùo duïc.

7. Nguyeãn Laân Duõng vaø caùc taùc giaû (1977), Moät soá phöông phaùp nghieân

cöùu vi sinh vaät hoïc (taäp 2), NXB KH & KT.

8. Nguyeãn Laân Duõng, Ñoøan Xuaân Möôïu, Nguyeãn Phuøng Tieán, Phaïm

Vaên Ty (1975), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc

(taäp 1), NXB KH &KT.

9. Nguyeãn Theá Duõng(2006), Khaûo saùt coâng ngheä leân men töø 1 soá dòch traùi

caây vuøng nhieät ñôùi, Luaän vaên thaïc só sinh hoïc ÑHSP TPHCM

10. Nguyeãn Thaønh Ñaït (1953), Nguyeãn Duy Thaûo, Vi sinh vaät hoïc, NXB

Mir.

11. Phan Thò Hoàng Haûi (2001), Böôùc ñaàu söû duïng cuøi baép coá ñònh vi khuaån

acetic ñeå laøm giaám töø nöôùc eùp thôm. Khoùa luaän cöû nhaân khoa hoïc,

chuyeân nghaønh vi sinh-sinh hoïc phaân töû, ÑH khoa hoïc töï nhieân

TP.HCM

12. Vuõ Thò Hoàng (2000), Choïn vaø khaûo saùt vaøi ñaëc ñieåm phaân loaïi, öùng

duïng cuûa vi khuaån acetic, Luaän aùn thaïc syõ khoa hoïc, chuyeân

ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân.

13. Vuõ Thò Lan Höông (2007), Ñònh danh caùc chuûng vi khuaån sinh acetic

acid phaân laäp taïi Thaùi Lan trong boä söu taäp gioáng BCC ( Biotec

Culture Collection, Thaùi Lan), luaän vaên thaïc syõ khoa hoïc, chuyeân

ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân.

14. Leâ Duy Linh vaø coäng söï (2001), Thöïc taäp vi sinh cô sôû, NXB ÑH quoác

gia TP.HCM

15. Phuøng Ngoïc Thuøy Linh (2004), Phaân laäp vaø Tuyeån choïn caùc chuûng

naám men duøng trong röôïu vang döùa, Luaän vaên toát nghieäp sinh

hoïc ÑHSP TPHCM

16. Nguyeãn Quang Luaân (2005), Thu nhaän cheá phaåm töø vi khuaån acetic vaø

thöû nghieäm khaû naêng baûo quaûn trong thöïc phaåm cheá bieán, Khoùa

luaän cöû nhaân khoa hoïc, chuyeân ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc

Töï Nhieân.

17. Nguyeãn Thieän Luaân, Leâ Ñoõan Dieän, Phan Quoác Kinh, Caùc loïai thöïc

phaåm thuoác vaø thöïc phaåm chöùc naêng ôû Vieät Nam (1997), NXB

Noâng nghieäp-Haø Noäi

18. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (1996), Giaùo trình coâng ngheä sinh hoïc vi sinh vaät

(taäp 1), tröôøng ÑH Baùch Khoa TPHCM

19. Ñinh Thò Kim Nhung, Nghieân cöùu 1 soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa vi khuaån

Acetobacter vaø öùng duïng cuûa chuùng trong leân men acetic theo

phöông phaùp chìm, Luaän aùn phoù tieán só Khoa hoïc- chuyeân nghaønh

vi sinh hoïc,Ñaïi Hoïc Quoác Gia Haø Noäi

20. Löông Ñöùc Phaåm (1998), Coâng ngheä sinh hoïc vi sinh vaät, NXB noâng

nghieäp.

21. Nguyeãn Höõu Phuùc (1998), Caùc phöông phaùp leân men thöïc phaåm truyeàn

thoáng taïi Vieät Nam vaø caùc nuôùc trong vuøng, ÑH Môû- Baùn Coâng-

TPHCM

22. Nguyeãn Höõu Phuùc (1996), Coâng ngheä sinh hoïc, Vi sinh coâng nghieäp,

ÑH Môû- Baùn Coâng-TPHCM

23. Ñoøan Thò Ngoïc Thanh, Vuõ Xuaân Thònh,Tröômg Thieän Chí (2006), Leân

men acetic acid-Leân men daám, Thöïc taäp chuyeân ñeà vi sinh,chuyeân

ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân.

24. Ñoàng Thò Thanh Thu (1995), Hoùa Sinh öùng duïng, Tuû saùch Ñaïi Hoïc

Toång Hôïp TPHCM.

25. Buøi Thò Nhu Thuaän, Nguyeãn Phuøng Tieán, Buøi Minh Ñöùc (1991), Kieåm

nghieäm chaát löôïng vaø kieåm tra veä sinh an toøan thöïc phaåm ( taäp 1),

NXB Y Hoïc.

26. Traàn Linh Thöôùc vaø coäng söï ,Thöïc taäp vi sinh naêm 4, ÑHKHTN

TPHCM

27. Traàn Thò Thanh Thuûy (1998), Höôùng daãn thöïc haønh vi sinh vaät hoïc,

NXB Giaùo Duïc.

28. Voõ Thò Anh Thy (2005) ,Coá ñònh teá baøo vi khuaän Actobacter aceti treân

giaù theå Bacterial cellulose ñeå saûn xuaát acid acetic, Khoùa luaän cöû

nhaân sinh hoïc- chuyeân ngaønh vi sinh ÑH Quoác Gia TPHCM

29. Traàn Theá Tuïc- Vuõ Maïnh Haûi (2000), Kyõ thuaät troàng Döùa, NXB Noâng

nghieäp

TIEÁNG ANH

30. Asai,T.(1935), Taxonomic studies on acetic and bacteria and allied

oxidative bacteria isolated from fruits.A new claddification of

oxidative bacteria, J.Agric.Chem.Soc.Japan.

31. A.Jorgensen, Microogamism and Fermentation,1988

32. Boehringer Mannheim, Acetic acid-Enzymatic BioAnalysin-Food

Analysis – UV Methed, 1997

33. Beijerinck, M. W. (1898), Ueber die Arten der Essigbakterien,

Zbl.Bakteriol. Parasitenkde. Infektionskrankh. Hyg., 2Abt.

34. De Ley, J. (1961), Comparative carbohydrate metabolism and a

propsal for a phylogenetic relationship of the acetic acid

bacterial, J. Gen. Microbio.

35. Dutta, D. and Gachhui, R. (2006), Novel nitrogen-fixing Acetobacter

nitogenifigens sp. nov., isolated from Kombucha tea, Int. J. Syst.

Evol. Microbiol.

Gillis and Delley (1997), In Accetobacteraceae 36.

37. Jojima, Y., Mahara, Y.,SuZuki, S.,Yokozeki,K., Yamanaka, S.,

Fudou,R., (2004), Sacharibacter floricola gen, nov., sp. Nov., a

novel osmophilic acetic acid bacterium isolated from pollen,

Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,54,2263-2267.

38. Gossele, F., Swings, J., Kersters, K., and De Ley, J. (1983), Numerical

analysis of phenotyphic features and protein gel

electropherograms of Gluconobacter asai 1935 emend. mut. char.

Asai, Iizuka and Komagata 1964, Int. J. Syst. Bacteriol.

39. Greenberg, D. E., Porcella, S. F., Stock, F., Wong, A., Conville, P. S.,

Murray, P. R., Holland, S.M, Zelazny, A. M. (2006),

Granulibacter bethedensis gen. nov., sp. nov., a distinctive

pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae,

Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

40. Katsura, K., Kawasaki, H., Potacharoen, W., Saono, S., Seki, T.,

Yamada, Y., Uchimura, T., and Komagata, K. (2001), Asaia

siamensis sp. nov., an acetic acid bacterium in the -

Proteobacteria, Int. J. Syst. Evol. Microbiol

41. Kondo, K. and Ameyama, M. (1958), Carbohydrate metabolism by

Acetobacter species. Part I. Oxidative activity for various

carbohydrates, Bull. Chem. Soc. Jpn.

42. Kersters, K., Lisdiyanti, P., Komagata, K and Swings, J. (2006), The

family Acetobacteraceae: The genera Acetobacter , Acidomonas,

Asaia,Gluconacetobacter, Gluconobacter and Kozakia. In:

Dworkin, M., Flacow, S.,Rosenberg, E., Schleifer, K.-

H.,Stackebrands, E. (Eds.), The Procaryotes, 3rd ed., vol. 5,

Springer, New York.

43. H-J.Rehm and Greed, Biotechnology, Chapter 15 Vinegar, Volum 9

44. Michio Kozaki, Hisakazu Ino, Takashi Matsumoto (1997), Erlinda

I.Dizon, Kapti Rahayu. Kuswanto and Priscila C.Sandhez,Studies

on the Acid- producing Bacteria of Traditional vinegars from the

Philippines and Indonesia.

45. S.A.Norrell, KE.Mersley (1997), Micrology Laboratory.

46. Tanasupawat,S.,Thawai,C.,Yukphan,P.,Moonmangmee,D.,Itoh,T.,Ada

chi, O., and Yamada, Y. (2004), Gluconobacter thailandicus sp.

Nov., an acetic acid bacterium in the -Proteobacteria, J.Gen.

Appl. Microbiol., 50, 159-167.

47. Yamada, Y., Okada, Y., and Kondo, K. (1976), Isolation and

characteriazation of “ polarly flagelleted itermediate strains “ in

acetic acid bacteria, J. Gen. Appl. Microbiol.

48. Yamada, Y., Hosono, R., Lisdiyanti, P., Widyastyti, Y., Saono, S.,

Uchimura, T., and Komagata K. (1999), Idenfication of acetic

acid bacteria isolated from Indonesia sources, especially of

isolates classifield in the genus Gluconobacter, J. Gen. Appl.

Microbiol.

49. Yukphan, P., Malimas, M., Potacharoen, W., tanasupawat, S.,

Tanticharoen, M., and Yamada, Y. (2005a), Neoasaia

chiangmaiensis gen.nov., sp. Nov., a novel osmotolerant acetic

acid bacterium in the Proteobacteria, J.Gen. Appl.Microbiol.

50. L.A Unkerkofer, J.Hickey (1997), Inductrial Fermentation.