190
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 7, số 5 - tháng 11/2017
JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY
- Địa chỉ liên hệ: Lê Thị Ánh Ngọc, email: thiensu21989@gmail.com
- Ngày nhận bài: 5/10/2017; Ngày đồng ý đăng: 9/11/2017; Ngày xuất bản: 16/11/2017
ĐẶC ĐIỂM DCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CủA CHủNG VI KHUẨN
ACINETOBACTER BAUMANII ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN
TRUNG ƯƠNG HUẾ VÀ BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y DƯỢC HUẾ
Lê Thị Ánh Ngọc1, Lê Nữ Xuân Thanh1, Nguyn Thị Nam Liên3,
Ngô Viết Quỳnh Trâm1, Antonella Santon2, Pietro Cappuccinelli2
(1) Trường Đại học Y Dược - Đại học Huế
(2) Trường Đại học Sassari, Ý; (3) Bệnh viện Trung ương Huế
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem là tác nhân phổ biến nhất gây nhiễm trùng
bệnh viện, được ghi nhận như là một tác nhân đề kháng điều trị và khó kiểm soát. A. baumannii là thành
viên quan trọng nhất của nhóm vi khuẩn A. calcoaceticus- A. baumannii (nhóm ACB), nhóm này có đặc điểm
di truyền rất gần nhau và không thể phân biệt được bằng các phương pháp định danh dựa vào tính chất sinh
hóa. Mục tiêu: Định danh loài Acinetobacter sp. từ các chủng thuộc nhóm ACB đã được phân lập và kiểu
gen của A. baumannii. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu là 90
chủng vi khuẩn thuộc nhóm ACB được phân lập tại Bệnh viện Đại học Y Dược Huế và Bệnh viện Trung ương
Huế. Thực hiện kỹ thuật PCR đa mồi trên đoạn gen gyrB và giải trình tự đoạn gen rpoB để định danh loài. Xác
định mức độ kháng kháng sinh bằng phương pháp Kirby- Bauer. Thực hiện kĩ thuật Multi Locus Sequence
Type (MLST) cho 24 chủng A. baumannii để xác định kiểu gen. Kết quả: Các loài Acinetobacter sp. được định
danh là: A.baumannii (85,6%), A. nosocomialis (11,11%) và A. pittii (3,33%). Tất cả vi khuẩn nhóm ACB nhạy
cảm với colistin và đề kháng với cefotaxim, amikacin. Hơn 90% các chủng A.baumannii đề kháng với nhóm
carbapenem. Mười một kiểu gen của các chủng A.baumannii được xác định; trong số đó có hai kiểu gen mới
(ST1463 và ST1464) và 7 kiểu gen thuộc phức hợp dòng vô tính 92 (Clonal Complex 92-CC92), đây là dòng
được phân bố rộng rãi nhất trên thế giới; cả hai bệnh viện đang lưu hành các chủng có kiểu gen tương tự
nhau (ST795, ST797 và ST1463). Kết luận: Phối hợp kỹ thuật PCR đa mồi trên gen gyrB và giải trình tự gen
rpoB cho phép xác định được các loài Acinetobacter sp. Kỹ thuật MLST xác định được 11 kiểu gen từ 24 chủng
A.baumannii ở hai bệnh viện ở Huế.
T kha: nhóm ACB, Acinetobacter baumannii; MLST.
Abstract
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF
ACINETOBACTER BAUMANNII ISOLATES
IN HUE CENTRAL HOSPITAL AND HUE UNIVERSITY HOSPITAL
Le Thi Anh Ngoc1, Le Nu Xuan Thanh1, Nguyen Thi Nam Lien3,
Ngo Viet Quynh Tram1, Antonella Santon2, Pietro Cappuccinelli2
(1) Hue University of Medicine and Pharmacy - Hue University
(2) Unversity of Sassari, italia; (3) Hue Central Hospital
Introduction: Acinetobacter baumannii resistant to carbapenem is the most common cause of nosoco-
mial infection, they are recognized as one of the most difficult to control and treat resistant agents. A. bau-
mannii is the most important member of A. calcoaceticus- A. baumannii complex (ACB complex), which are
closely related genetically then biochemical test systems are not able to identify unambiguously genomic
species. Objective: To identify species of Acinetobacter sp. strains of ACB complex and sequence types of A.
baumannii strains. Methods: Cross- sectional study. The subjects were 90 strains of ACB complex isolated and
identified by biochemical methods at Hue University Hospital (UH) and Hue Central Hospital (CH). Perform-
ing the multiplex PCRs on the target gene gyrB and sequencing rpoB gene to identify species. Determining of
antibiotic resistance by Kirby-Bauer method. Multi Locus Sequence Type (MLST) method was performed for
24 strains of A. baumannii to identify sequence types. Results: Acinetobacter sp. were identified as A.bau-
DOI: 10.34071/jmp.2017.5.26
191
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 7, số 5 - tháng 11/2017
JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY
mannii (85.6%), A. nosocomialis (11.11%) and A. pittii (3.33%). All strains of ACB complex were sensitive
to colistin and resistant to cefotaxime, amikacin. More than 90% of A.baumannii strains were resistant to
carbapenem. Eleven sequence types (STs) of A.baumannii strains were identified; two of them were news
(ST1463 and ST1464) and seven STs belonged to the Clonal Complex 92 (CC92), the most globally distributed
clones; the ST795, ST797 and ST1463 are circulating in both of hospitals. Conclusion: Combining multiplex
PCRs on the target gene gyrB and sequencing rpoB gene have shown to be adequate for Acinetobacter sp.
identification. MLST identified 11 sequence types from 24 A.baumannii isolates at two hospital in Hue.
Key words: ACB complex, Acinetobacter baumannii; MLST.
1. ĐẶT VẤN Đ
Trực khuẩn gram âm Acinetobacter baumannii
là tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện quan trọng
nhất hiện nay, thường được phân lập trên các bệnh
như viêm phổi, nhiễm trùng vết mổ và nhiễm trùng
máu từ những bệnh nhân nặng, suy giảm miễn dịch
nằm ở các khoa Chăm sóc đặc biệt (Intensive Care
Unit: ICU)[1]. Vi khuẩn này được ghi nhận đề kháng
với hầu hết các nhóm kháng sinh, bao gồm cả kháng
sinh nhóm carbapenem, nhóm kháng sinh được sử
dụng rộng rãi để điều trị những bệnh nhiễm trùng
nghiêm trọng do các loại vi khuẩn Acinetobacter đa
kháng thuốc. Trong đó A. baumannii là thành viên
quan trọng nhất của nhóm vi khuẩn A. calcoaceticus-
A. baumannii (nhóm ACB) bao gồm: A. baumannii,
A. nosocomialis, A. pittii và A. calcoaceticus, nhóm
này có đặc điểm di truyền rất gần nhau và không thể
phân biệt được bằng các phương pháp định danh
dựa vào tính chất sinh hóa [2]. Bên cạnh đó, nhiều
nghiên cứu đã cho thấy rằng dịch Acinetobacter liên
quan đến chủng đa kháng thuốc có thể gặp trên
toàn quốc và thế giới [3]. Do đó xếp nhóm các loài
gần giống nhau thành một nhóm phức hợp có thể
gặp nhiều khó khăn và có thể gây nhầm lẫn vì chúng
có thể có ý nghĩa lâm sàng khác nhau.Vì vậy, việc
định danh loài và xác định kiểu gen được đặt ra để
phục vụ công tác nghiên cứu, kiểm soát nhiễm trùng
và điều trị.
Để góp phần hiểu rõ hơn về dịch tễ học phân
tử của A. baumannii của các nhiễm trùng do A.
baumannii ở hai bệnh viện Trung ương Huế và bệnh
viện Trường Đại học Y Dược Huế chúng tôi thực hiện
đề tài này nhằm định danh loài Acinetobacter sp. từ
nhóm ACB đã được phân lập bằng nuôi cấy và xác
định kiểu gen của các chủng A. baumannii.
2. ĐốI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CỨU
2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt
ngang
2.2. Đối tượng nghiên cứu: 90 chủng vi khuẩn
thuộc nhóm ACB được thu thập từ tháng 3-2016
đến tháng 9-2016 ở các đơn vị lâm sàng khác nhau,
trong đó có 73 chủng từ 16 đơn vị tại Bệnh viện
Trung ương Huế và 17 chủng từ 5 đơn vị tại bệnh
viện Trường Đại học Y Dược Huế. Những mẫu này
đã được phân lập, định danh là vi khuẩn nhóm A.
baumannii bằng bộ sinh phẩm định danh vi khuẩn
API 20E (bioMérieux, Pháp).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Định danh loài bằng kỹ thuật PCR đa mồi trên
gen gyrB và giải trình tự một phần gen rpoB theo
quy trình của Lee và cộng sự (hình 1)[4].
Hình 1. Các vị trí bắt cặp của các mồi được sử dụng trong kĩ thuật PCR đa mồi trên gen gyrB,
kích cỡ của sản phẩm PCR và các loài Acinetobacter sp. được đặc trưng
(GS3 = A. pittii; GS = A. nosocomialis)
- Xác định mức độ kháng kháng sinh bằng
phương pháp Kirby- Bauer trên môi trường Mueller
Hinton (MH) và đọc kết quả theo tiêu chuẩn CLSI
(2015).
- Xác định kiểu gen bằng kỹ thuật MLST cho 24
chủng A. baumannii được phân bố theo các khoa
phòng bệnh viện (Bảng 1). Phân tích kết quả bằng
hệ thống dữ liệu thông tin của Oxford [15].
192
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 7, số 5 - tháng 11/2017
JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY
Bảng 1. Sự phân bố 24 chủng vi khuẩn A.baumannii sử dụng MLST ở khoa phòng bệnh viện
Mã Bệnh viện Khoa phng
597
Bệnh viện trung ương Huế
Khoa Ngoại lồng ngực
5Khoa Hồi sức Ngoại
270
Trung tâm Hồi sức tích cực
S3
63
S2
789
6Khoa Hồi sức tích và Đột quỵ
616
177 Khoa Nội
502
262 Khoa chấn thương chỉnh hình
375 Tai Mũi Họng
710 Hồi sức ngoại khu A
340
603 Hồi sức ngoại khu B
S9
36
Bệnh viện trường ĐH Y Dược Huế
Khoa Hồi sức cấp cứu
34
S11
35 Ngoại Lồng ngực
29
31 Khoa Ngoại
22 Khoa chấn thương chỉnh hình
Chương trình eBURSTv3 (http://eburst.mlst.net/) được sử dụng để phân lập các phức hợp kiểu gen và để
đánh giá các mối quan hệ di truyền.
3. KẾT QU NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn nhóm ACB theo Khoa lâm sàng
Biểu đồ 1. T lệ phân bố vi khuẩn nhóm ACB theo khoa lâm sàng
193
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 7, số 5 - tháng 11/2017
JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy A. baumannii liên
quan nhiều nhất đến tình trạng nhiễm khuẩn bệnh
viện ở khắp nơi trên thế giới, chiếm khoảng 80% số
ca bệnh được báo cáo trong tài liệu [11].
Chúng phân bố chủ yếu ở khoa Chăm sóc đặc
biệt từ bệnh phẩm đàm và mủ [12]. Bệnh viện
Trung ương Huế, khoa lâm sàng có t lệ nhiễm
Acinetobacter sp cao nhất là các khoa Chăm sóc đặc
biệt (60,3%), còn ở bệnh viện Trường Đại học Y Dược
Huế là ở các khoa Ngoại (70,6%). Acinetobacter sp
được xem như là một tác nhân thường trú trong
bệnh viện và có khả năng phát tán và lây lan thành
các vụ dịch, đặc biệt là ở khoa Chăm sóc đặc biệt,
ở những bệnh nhân nặng, nằm điều trị kéo dài, có
thực hiện các thủ thuật xâm lấn giúp chẩn đoán,
điều trị.
3.2. Định danh loài bng kĩ thuật PCR đa mồi trên gen gyrB và giải trình t mt phần gen rpoB
Bảng 2. T lệ phân bố 90 chủng vi khuẩn nhóm ACB
API 20E Loài GyrB multiplex (N) Partial rpoB
sequencing (N) Tổng %
ACB
A. baumannii 77 - 77 85,56
A.nosocomialis 9 1 10 11,11
A.pitii 2 1 3 3,33
A.calcoaceticus 0 - 0 0,0
Thực hiện hai kỹ thuật PCR đa mồi PCR1 và PCR2
cho tất cả 90 chủng Acinetobacter sp. xác định được
77 chủng thuộc loài A. baumannii (chiếm tỷ lệ cao
nhất 85,56%), 9 chủng thuộc loài A. nosocomialis và
2 chủng thuộc loài A. pittii. Có hai chủng vi khuẩn âm
tính với cả PCR 1 và 2, được xác định bằng giải trình
tự một phần gen rpoB là A. nosocomialis và A. pittii
(Bảng 2). Kết quả của chúng tôi phù hợp với các báo
cáo khác ở Bệnh Viện Chợ Rẫy, Viện Pasteur Tp Hồ
Chí Minh. [7], [8]. Bên cạnh đó, kết quả cho thấy kỹ
thuật sinh học phân tử này là một công cụ có giá trị
để xác định loài A. baumannii.
3.3. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh ca các chng vi
khuẩn thuc nhóm ACB
Bảng 3. phân bố 90 chủng vi khuẩn nhóm ACB đề kháng kháng sinh
A. baumannii (n=77) A.nosocomialis A.pitii
Nhóm KS Kháng sinh RSRSRS
β-lactam
Cephalosporin Ceftazidime 30 µg 74 (96,1%) 3 9 1 2 1
Cefotaxime 30 µg 77 (100%) 0 10 0 3 0
Carbapenem Imipenem 10 µg 73 (94,8%) 4 7 3 2 1
Meropenem 10 µg 71 (92,2%) 6 7 3 2 1
Aminoglycoside
Amikacin 30 µg
Gentamycin 10 µg 72 (93,5%) 5 8 2 2 1
77(100%) 0 10 0 3 0
Fluoroquinolone
Levofloxacin 5 µg
Ciprofloxacin 5 µg 73 (94,8%) 4 7 3 1 2
73 (94,8%) 4 7 3 1 2
Sulfamide Sulfathomexazol/
Trimethoprim 25 µg 70 (90,9%) 7 8 2 2 1
Polymyxin Colistin 10 µg 0 (0,0%) 77 0 10 0 3
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn nhóm
ACB đề kháng với hầu hết kháng sinh nhóm β-lactam,
aminoglycoside, fluoroquinolone, sulfamide với t
lệ đề kháng cao, cao nhất là cefotaxim, amikacin
(100%). Tlệ đề kháng của A.baumannii với kháng
sinh nhóm carbapenem cũng rất cao trên 90%
(imipenem 73/77 và meropenem 71/77). Duy nhất
chỉ có kháng sinh colistin là còn nhạy cảm 100% với
tất cả các loài. Kết quả này cũng tương tự như báo
cáo tại bệnh viện Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung
Ương, Hà Nội, hơn 90% số chủng vi khuẩn phân lập
được là đề kháng với cacbapenem; 25,4% kháng
với tất cả các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam,
quinolones và aminoglycosides; tất cả các chủng vi
khuẩn đều còn nhạy cảm với colistin [5]. Sự thường
gặp của chủng A. baumannii kháng carbapenems
đã đạt đến mức báo động trong thập k qua ở
những vùng khác nhau trên thế giới trong đó có việt
194
Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Tập 7, số 5 - tháng 11/2017
JOURNAL OF MEDICINE AND PHARMACY
nam [9], t lệ này đặc biệt cao ở các nước Đông
Nam Á như Thái Lan (76,3%), Việt Nam (89,5%) và
Singapore (90,5%) [10].
Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy sự nổi lên của
các chủng thuộc hai loài còn lại A. nosocomialis và A.
pittii mặc dù ở mức độ thấp hơn. A.nosocomialis và
A. pittii là những mầm bệnh cơ hội quan trọng cũng
có liên quan đến sự bùng phát nhiễm trùng bệnh
viện [6].
Vi khuẩn ngày càng trở nên đề kháng kháng sinh
làm cho việc điều trị một số bệnh nhiễm trùng bị
thất bại. Tần số cao bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch,
liên quan đến việc nằm điều trị lâu dài tại các đơn vị
ICU, cùng với các bề mặt của các dụng cụ can thiệp ở
bệnh nhân như catheter, shunts, ventilators và tiếp
xúc vật lý trong quá trình chăm sóc người bệnh làm
cho bệnh viện trở thành môi trường lý tưởng cho sự
phát triển và lan truyền của vi khuẩn A. baumannii
gây bệnh cơ hội. Kháng sinh được sử dụng một cách
rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng, sự lạm
dụng kháng sinh quá mức đã tạo áp lực cho vi khuẩn
phát triển thành những dòng kháng thuốc.
3.4. Multilocus Sequence Typing ca A.
baumannii và phân tích eBURST v3
A. baumannii kháng carbapenem (CRAb) được
đánh giá là một trong những loại vi khuẩn khó điều
trị và kiểm soát, tạo ra mối quan tâm lớn của cộng
đồng. Điều này tạo ra nhu cầu theo dõi liên tục sự
phát triển và lây lan của chúng thông qua các cuộc
điều tra dịch tễ học phân tử. Kết quả phương pháp
phân tích kiểu chuỗi dựa vào bảy đoạn gen khác
nhau (MLST) để theo dõi nguồn lây truyền và bùng
phát các chủng A. baumannii gây nhiễm trùng bệnh
viện, MLST là một công cụ hiệu quả giúp phân loại
kiểu gen, lưu trữ và tái sử dụng các dữ liệu gen
trên hệ thống. Mười một kiểu gen (ST) khác nhau
đã được xác định trên 24 chủng A.baumannii; bao
gồm kiểu gen ST795 (8/24) và ST797 (4/24) , tiếp
theo là ST1463 (2/24), ST800 (2/24), ST451 (2/24) và
các kiểu gen ST195, ST738, ST801, ST848, ST860 và
ST1464 chỉ gặp ở một chủng.
Biểu đồ 2 dưới đây thể hiện kết quả MLST. Kết quả
MLST cho thấy sự lan truyền các chủng A.baumannii
trong bệnh viện và giữa các bệnh viện vì cả hai đều
đang lưu hành các kiểu gen tương tự nhau (ST795,
ST797 và ST1463). Nhóm kiểu gen ST195 kháng
carbapenem, phân lập ở Bệnh viện Trung ương Huế,
đã được tìm thấy trước đây (từ tháng 8 năm 2010
đến tháng 12 năm 2014) ở Hà Nội (doi: 10.1007/
s10096-016-2784-8), trong khi ST795, ST797 hiện
diện ở cả hai bệnh viện, và ST800 và ST801, hiện
diện ở Bệnh viện Trung ương Huế, gần đây được tác
giả Tatsuya Tada (Hồ Chí Minh) phân lập tại thành
phố Hồ Chí Minh, nhưng số liệu vẫn chưa được công
bố [14]. Một số chủng ở các khoa phòng thuộc nhiều
bệnh viện ở Việt Nam, có kiểu gen tương đồng có
thể giải thích do sự lây truyền giữa hai bệnh viện
qua bệnh nhân và/hoặc nhân viên y tế, đặc biệt là
các bác sĩ làm việc ở nhiều bệnh viện ... Vấn đề này
đòi hỏi việc giám sát lây lan A.baumannnii nên được
thực hiện bằng việc cải thiện các biện pháp vệ sinh,
như rửa tay trước khi chăm sóc bệnh nhân và đảm
bảo rằng các thiết bị y tế được sử dụng trên bệnh
nhân được khử trùng một cách hiệu quả [13], đặc
biệt trong các Khoa Ngoại của bệnh viện Đại học Y
Dược Huế và trong Khoa Hồi sức tích cực của Bệnh
viện Trung ương Huế, nơi các chủng A. baumannii
được phân lập chủ yếu, có thể hạn chế sự khuếch
tán giữa các khoa và bệnh viện.
Phân tích bằng chương trình eBurst cho thấy bảy
trong số mười một kiểu gen xác định thuộc phức
hợp dòng vô tính 92 (CC92) tương ứng với phức hợp
CC2 thuộc hệ thống Pasteur, dòng này chiếm chủ yếu
và phân bố rộng khắp trên thế giới [15]. Hai trong
bốn kiểu gen không thuộc CC92 là các kiểu gen mới:
ST1463 (2/24) và ST1464 (1/24) do bắt nguồn từ sự
kết hợp mới của các allen đã có trong cơ sở dữ liệu
MLST của A.baumannii.
Trong hai chủng có kiểu gen ST1463, một chủng
được phân lập ở bệnh viện ĐHY Dược Huế (Khoa
ngoại lồng ngực) đề kháng carbapenem, chủng còn
lại được phân lập từ đơn vị ICU ở Bệnh viện Trung
ương Huế nhạy cảm với carbapenem và các kháng
sinh khác. Hai kiểu gen còn lại là ST738 thuộc CC109
(Pasteur CC1) và ST860. (Bảng 1)
Biểu đồ 2. Phân bố các kiễu chuỗi của A. baumannii trong hai bệnh viện