THE 20th NATIONAL CONGRESS OF VIETNAMESE SOCIETY OF RADIOLOGY AND NUCLEAR MEDICINE
ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG DƯỢC CHẤT PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB TRÊN CHUỘT
NGUYỄN THỊ THU Viện Nghiên cứu hạt nhân
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiệp hội Y học hạt nhân Châu Âu đã đề xuất phương án nghiên cứu độc tính tiền lâm sàng cho thuốc phóng xạ mới, để có thể đưa vào ứng dụng lâm sàng khi DCPX chưa có cấp phép hoặc chuyên khảo nào trong dược điển.
Thay cho việc nghiên cứu độc tính cấp truyền thống trước kia, khái niệm nghiên cứu độc tính liều duy nhất mở rộng được đặt ra để thực hiện với các thuốc phóng xạ mới nhằm tạo bộ số liệu tiền lâm sàng để đệ trình các cơ quan có thẩm quyền cấp phép sử dụng thuốc phóng xạ
Để có cơ sở dữ liệu về số liệu an toàn tiền lâm sàng về độc tính phóng xạ và định liều phóng xạ: việc đánh giá độc tính tiền lâm sàng của 90Y- nimotuzumab trên chuột được thực hiện.
Liều tiêm <1,5ug người: Liều này không độc tính, tuy nhiên độc tố tiềm ẩn, cần phải xác định và bàn luận.
Liều tiêm <100ug: Tiêm 100 lần liều tối đa dùng trên bệnh nhân, LD50>1000mg/kg thể trọng, hoặc tiêm 30 con chuột, 10 con mỗi nhóm.
Liều tiêm >100ug: thường là thuốc kháng thể
NỘI DUNG
Nội dung 1: Điều chế 90Y-nimotuzumab
Nội dung 2: Kiểm tra chất lượng 90Y-nimotuzumab Kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ Độ ổn định invitro và invivo Nồng độ phóng xạ Hoạt độ riêng
Nội dung 3: Đánh giá độc tính phóng xạ của 90Y-nimotuzumab trên chuột
Mỗi nhóm 10 con chuột được tiêm tĩnh mạch 90Y-nimotuzumab các liều 9,25, 92,5 và 462,5 MBq/kg, nhóm chứng tiêm NaCl 0,9% và nhóm tiêm nimotuzumab liều 500 mg.
Theo dõi trọng lượng chuột bằng cách cân chuột trước khi tiêm chế phẩm và hàng
tuần.
Lấy máu để đánh giá các chỉ số huyết học (CBC), sinh hóa (SGOT, SGPT) Tại thời điểm 3 ngày và 30 ngày
Kiểm tra vi thể tế bào các mô gan, thận, lách, phổi, tim.
So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90
ĐiỀU TRỊ UNG THƯ HiỆN NAY TRÊN THẾ GIỚI
Nguồn: Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 33
Thống kê trên 14 triệu bệnh nhân ung thư hàng năm, điều trị đích so với các
phương pháp khác chưa phổ biến
GIỚI THIỆU CÁC LOẠI DƯỢC CHẤT PHÓNG XẠ CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ
Nhiều dược chất phóng xạ đang trong giai đoạn lâm sàng như:
131I-antiCD45antibody, 213Bi-anti-CD33 IgG điều trị bệnh bạch cầu
90Y-epratuzumab điều trị lymphoma thể nang giai đoạn I/II,
177Lu-J591 điều trị ung thư tuyến tiền liệt,
Tuy nhiên điều trị các ung thư dạng rắn ác tính như ung thư vú, ruột kết, tuyến tụy, đầu cổ, thận, phổi, các tác nhân điều trị hiện nay đều chưa hiệu quả,
Việc điều trị vẫn còn nhiều thách thức.
dòng tủy,
GIỚI THIỆU KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ
• Nimotuzumab (h-R3, 2003), • Cetuximab (Erbitux, 2003), • Panitumumab (Vectibix, 2006), • Zalutumumab (HuMax, 2009).
Kháng thể gắn đồng vị phóng xạ nhắm đích lên tế bào ung thư
Đồng vị phóng xạ Yttri-90 (Y-90) phát bức xạ tia beta với năng lượng cao dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ.
NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT
• Kháng thể Nimotuzumab (có tên khác là Cimaher, chai 50mg/10ml,
• Đồng vị phóng xạ Yttri-90, 90Yttrium- acetat (CH3COO)3. 90Y, được tách chiết từ máy phát đồng vị 90Sr/90Y bằng phương pháp màng Supported Liquid Membrane (SLM) từ nguồn phóng xạ 90Sr.
Các hóa chất 2-ethylhexyl 2-ethylhexyl phosphonic axit (PC 88A), C16H35O3P, Daihatchi, Nhật, p-NCS-Bn-DOTA, Macrocyclic, Mỹ. MERCK, DMSO (Dimethyl Sulfoxide). CMPO Octyl(phenyl)-N,N diisobutylcarbamoylmethyl phosphin oxide. DTPA (Diethylentriaminpentaacetic axit)
Các dung môi như methanol. n- dodecan, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Chuột Swiss
hãng CIMAB, Cuba. Công thức phân tử C6566H10082N1746O2056S40, trọng lượng phân tử 150.000 Da
90Y-NIMOTUZUMAB
• Dược chất phóng xạ 90Y-DOTA-p- benzyl-nimotuzumab bao gồm
- Kháng thể đơn dòng nimotuzumab
- Đồng vị phóng xạ 90Y
• Kháng thể đơn dòng nimotuzumab được gắn với p-SCN-benzyl-DOTA bằng kỹ thuật tạo phức giữa một chất là phân tử sinh học với một chất là chất tạo phức càng cua p- SCN-benzyl-DOTA.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Điều chế 90Y-nimotuzumab
Kiểm tra chất lượng 90Y-nimotuzumab Kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ Độ ổn định invitro và invivo Nồng độ phóng xạ Hoạt độ riêng
Đánh giá độc tính phóng xạ của 90Y-nimotuzumab trên chuột
Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột các liều 9,25, 92,5 và 462,5 MBq/kg 90Y-nimotuzumab,
nhóm chứng tiêm NaCl 0,9% và nhóm tiêm nimotuzumab liều 500 mg.
Tại thời điểm 3 ngày và 30 ngày, lấy máu để đánh giá các chỉ số sinh hóa, huyết
học và kiểm tra vi thể tế bào các mô gan, thận, lách, phổi, tim
So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90
Tài liệu: EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry, Cold Spring Habor Laboratory Press. P.41
CHUỘT THỰC NGHIỆM TIÊM 90Y-NIMOTUZUMAB
•
Tiêm các liều 9,25, 92,5 and 462,5 MBq/kg và 500 mg kháng thể.
•
Sau khi tiêm 3 ngày và 30 ngày, đánh giá toàn thân.
• Đánh giá các chỉ số huyết học, chỉ số sinh hóa và chụp hình vi thể tế bào.
ĐIỀU CHẾ 90Y-DOTA-NIMOTUZUMAB:
• Phân tử DOTA gắn với kháng thể qua liên kết hóa học giữa nhóm
amin của lysin trên phân tử kháng thể và nhóm isothioxyanat (SCN) của phức càng cua SCN-Benzyl-DOTA (–C6H5-SCN-DOTA).
Liên kết phối trí
• Phức p-SCN-benzyl-DOTA-nimotuzumab được đánh dấu với đồng vị phóng xạ 90Y, tạo nên dược chất phóng xạ 90Y-DOTA-p-benzyl- nimotuzumab, có cấu trúc phân tử như sau:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CHẤT LƯỢNG PHỨC MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB
Chỉ tiêu chất lượng
90Y-DOTA-nimotuzumab
Phương pháp
Dung dịch 90Y-DOTA-
5 mCi/10ml
Đánh dấu qua n-Bn-DOTA, lọc sắc ký
nimotuzumab
lọc gel sephadex
Độ trong đục
Dung dịch trong suốt, không
Cảm quan
màu
Nồng độ phóng xạ
5 mCi/10 ml
Đo trên máy đo bêta nhấp nháy lỏng
LSC
Hoạt độ riêng
10 mCi/mg
Tính theo hoạt độ và khối lượng
pH
6,5
Giấy đo pH
Độ tinh khiết hạt nhân
90Sr (0,546 MeV) < 0,002%
- Đo phổ beta, - Đo EPC
phóng xạ
90Y (2,28 MeV) > 99,998 %
- Đo phổ gamma Theo TCCS-DPPX
14-2010
Độ tinh khiết hóa
90Y-DOTA-nimotuzumab
Sắc ký lớp mỏng TLC và TCC Theo
phóng xạ
TCCS-DPPX 13-2010
> 98,0%
Độ vô khuẩn
Đạt
Theo TCCS-DPPX 15-2010
Nội độc tố vi khuẩn
Giới hạn đo 175/V (EU/mL),
Thử nội độc tố vi khuẩn, phương pháp
LAL, đo trên máy PTS 100 theo TCCS-
Kết quả đo < 5 EU/ml
DPPX 16-2010
ĐỘ TINH KHIẾT HÓA PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB (TLC)
ĐỘ TINH KHIẾT HÓA PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB (TCC)
KẾT QUẢ KIỂM TRA TRỌNG LƯỢNG CHUỘT TIÊM 90Y-NIMOTUZUMAB
40
35
30
)
25
20
m a g ( t ộ u h c
15
g n ợ ư
10
l
5
Nhóm chứng Nhóm tiêm liều 9,25 MBq/kg Nhóm tiêm liều 92,5 MBq/kg Nhóm tiêm liều 462,5 MBq/kg Nhóm tiêm kháng thể 500 ug/kg
g n ọ r T
0
1
7
14
21
28
30
Thời gian (ngày)
Diễn biến trọng lượng chuột sau khi tiêm 90Y-nimotuzumab: Liều tiêm 9,25 - 462,5 MBq/kg, các nhóm chứng và nhóm thực nghiệm tăng giống nhau Kết quả trên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự biến đổi trọng lượng của các nhóm chuột với p>0,05
KẾT QUẢ KIỂM TRA CHỈ SỐ HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA (X± SD)
Sau khi tiêm 3 ngày
RBC (M/ml)
9,25 92,5 462,5 500 mg/kg Liều tiêm (MBq/kg)
WBC (K/ml)
8,76±0,62 8,88±0,44 9,54±0,80 8,48±4,24 NaCl 0,9% 8,58±0,3 2
1,14±0,48 1,14±0,64 1,16±0,32 1,42±0,38 2,09±1,00
710±136
540±102
632±120
452±92
596±187
PLT(K/mL)
SGOT(U/L) 78,8±41,8 109±23,3 83,6±33,9 118±22,5 96,5±25,1
Các chỉ số huyết học giữa nhóm đối chứng và nhóm tiêm thuốc không có khác biệt (p>0,05) nhóm chứng có chỉ số hồng cầu là 8,58 ± 0,32 M/ml và nhóm tiêm liều cao là 9,54 ± 0,80 M/ml
SGPT(U/L) 43,4±3,5 48,0±9,9 41,2±6,8 58,6±4,1 51,2±16,6
KẾT QUẢ KIỂM TRA CHỈ SỐ HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA (X± SD)
Sau khi tiêm 30 ngày
NaCl 0,9% 9,25 92,5 462,5
500 mg/kg
RBC (M/ml) 11,31±0,77
11,49±1,11
10,5±0,74
11,62±1,21
10,96±1,03
WBC (K/ml)
2,09±0,79
3,8±1,74
2,54±0,95
1,87±0,64
2,1±0,89
PLT(K/mL)
720±179
798±129
1013±243
631±267
863±250
SGOT(U/L)
84,6±39
94,2±56
105,8±57,6
102±57,6
83,2±39,8
SGPT(U/L)
47±9,64
42,8±24,4
51,2±34,3
50,3±26,2
44,7±12,04
Số lượng hồng cầu ổn định, nhóm chứng và nhóm tiêm thuốc liều cao là 11,31±0,77 M/ml và 11,62±1,21, bạch cầu 2,09±0,79 K/ml và 1,87±0,64 K/ml. Kết quả cho thấy không thấy sự khác biệt giữa các nhóm chuột tiêm thuốc và nhóm chứng.
Liều tiêm (MBq/kg)
Tế bào gan chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5mCi/kg (B) và chuột tiêm kháng thể liều 500 mg/kg.
- Các tế bào gan nhóm chứng trong giới hạn bình thường, không có nhân đông hay thoái hóa mỡ, không có hoại tử, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa.
KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO GAN
- Nhóm chuột tiêm liều cao tế bào gan có thoái hóa nhẹ gồm thoái hóa nước, thoái hóa hạt và hoại tử nhẹ quanh tĩnh mạch trung tâm, có thoái hóa hạt Eosin mức độ nhẹ, không có thoái hóa mỡ, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa.
- Nhóm chuột tiêm kháng thể, mô gan có thoái hóa nước, thoái hóa hạt nhẹ, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm và vùng giữa mức độ nhẹ, hoại tử quanh và trong khoảng cửa mức độ vừa, không có thoái hóa mỡ, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa .
Hình ảnh vi thể tế bào thận. Tế bào thận chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C)
KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO THẬN
Tế bào thận cho thấy có viêm mô thận kẽ mức độ trung bình, tế bào ống thận mất bờ bàn chải nhân co lại, có không bào
KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO LÁCH
Hình ảnh vi thể tế bào lách. Tế bào lách chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C)
Các mô lách của chuột cho thấy trong giới hạn bình thường, không viêm, không hoại tử, không xơ hóa.
KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO PHỔI
Hình ảnh vi thể tế bào phổi. Tế bào phổi chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C)
Phổi trong giới hạn bình thường, không có viêm hay xuất huyết nhu
mô phổi.
KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO TIM
Hình ảnh vi thể tế bào tim. Tế bào tim chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C)
Các tế bào cơ vân tim rõ cấu trúc, giới hạn bình thường, không hoại
tử cơ tim, không viêm cơ tim. không có xơ hóa mô kẽ cơ tim
So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90
Các tiểu thuỳ mô gan có cấu trúc rõ ràng, nhân đông nhẹ, có thoái hóa mỡ nhẹ, có tăng sinh tái tạo tế bào gan mức nhẹ ở các nhóm
Thận rõ cấu trúc các vùng vỏ và tủy, mô thận bình thường, không hoại tử ống thận, cầu thận không viêm, không xơ hóa
Chuột tiêm 131I-nimotuzumab các liều 92,5, 277,5 và 925 MBq/Kg
)
40
35
30
m a g ( t ộ u h c g n ợ ư
25
l g n ọ r T
20
15
10
5
0
1
5
10
15
20
25
30
Thời gian (ngày)
Các mô gan chuột bình thường, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, nhân đông nhẹ, bình gan thường. Thận rõ cấu trúc các vùng vỏ và tủy, mô thận bình thường. Các mô tim, lách, phổi trong giới hạn bình thường.
Chuột tiêm 99mTc- NCA90 các liều 10, 100, 500 uCi/con
ĐÁNH GIÁ CHUNG
Mục đích đánh giá mức độc tính tiền lâm sàng đối với dược chất phóng xạ kháng thể đơn dòng gắn đồng vị phóng xạ 90Y.
Thời gian thích hợp trong thí nghiệm là 30 ngày là hợp lý
đối với thuốc phóng xạ đánh dấu 90Y
Liều tiêm 0,185 MBq, 1,85 MBq và 9,25 MBq mỗi con,
tính theo trọng lượng quy đổi thì liều trên kg là 9,25 MBq, 92,5 MBq và 462,5 MBq. Tính theo liều tối đa cho phép đối với 90Y dùng trên người mà chưa có độc tính phóng xạ là 23,6 MBq/kg thì tiêm chuột liều 462,5 MBq/kg
ĐÁNH GIÁ CHUNG
Động vật thí nghiệm đều sống qua 5 tuần theo dõi, thậm chí với liều cao nhất là 462,5 MBq/kg. Mức liều tiêm kháng thể 500 mg được dùng, vì ngày nay các loại thuốc mới có bản chất peptid và protein dùng trong điều trị được ICH chỉ dẫn đánh giá ở mức >100 mg. Mức liều không gây ra sự biến đổi trầm trọng (NOAEL: No observed adverse effect level) được xem là dưới 1,5 mg tính cho 1 người 50 kg một ngày, đó là liều 9,25 MBq/kg.
LD50 do gây độc cấp tính không được tính, có thể là ở mức liều cao hơn các mức liều sử dụng trong nghiên cứu này, theo chỉ dẫn ICH S9 (International Conference on Harmonisation). Khi sử dụng liều rất cao, các tế bào máu vẫn ổn định, các mô không bị hư hại, có thể là do lượng yttri đưa vào cơ thể ít, hoạt tính riêng của yttri là 5,43 x 105 mCi/mg, tính ra có 0,05 x 10-4 nmol yttri tham gia trong phức hợp, nên không làm thay đổi tính chất dược lý.
KẾT LUẬN
Với hoạt tính phóng xạ dùng trong thí nghiệm cao hơn liều điều trị tối đa cho phép dùng trên người trong điều trị lâm sàng, độc tính của dược chất phóng xạ 90Y gắn kháng thể đơn dòng trên chuột thực nghiệm ở mức rất nhẹ. Mức gây độc được nghiên cứu xuyên khắp cơ thể nơi mà thuốc phóng xạ kháng thể đơn dòng đi qua.
Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, các cơ quan nội tạng không có hư hại nào trong các nhóm tiêm liều thấp và cả nhóm tiêm liều cao. Kết quả nghiên cứu giúp cho cơ sở sản xuất có số liệu đệ trình các cấp có thẩm quyền trong việc ứng dụng lâm sàng.
