TP CH Y HC VIỆT NAM TẬP 544 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
281
ngày theo đường uống với liều 10 g/kg, thể
hiện tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn và
dài hạn của động vật trên test né tránh thụ
động và test mê lộ chữ Y, ở liều thấp
5g/ngày sâm Lai Châu có xu hướng tương tự
như ở liều cao hơn.
TÀI LIU THAM KHẢO
1. Trần Đáng (2017), Thực phẩm chức năng,
Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.944-960.
2. Viện Dược liệu (2016), Danh lục cây thuốc
Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, tr. 818-819.
3. Drever B.D. et al (2007), “Memantine acts
as a cholinergic stimulant in the mouse
hippocampus”, J. Alzheimers Dis., 12(4), pp.
319-333.
4. Gerhard Vogel H. (2008), Drug discovery
and evaluation Pharmacological assays,
Springer, pp: 669-774.
5. Hritcu L., Cioanca O. and Hancianu M.
(2012), “Effects of lavender oil inhalation on
improving scopolamine-induced spatial
memory impairment in laboratory rats”,
Phytomedicine, 19(6), pp. 529-534.
6. Izquierdo I. et al (2006), “Different
molecular cascades in different sites of the
brain control memory consolidation”, Trends
Neurosci, 29(9), pp.496-505.
7. Lee K. Y. et al (2009), “Cognitive-
enhancing activity of loganin isolated from
Cornus officinalis in scopolamine-induced
amnesic mice”, Arch. Pharm. Res., 32(5),
pp.677-683.
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN TRÊN TẾ BÀO
U THẦN KINH ĐỆM NGƯỜI CỦA HỆ VI BỌT ĐA CHỨC NĂNG
Trần Thị Anh Thơ1,2, Nguyễn Xuân Bắc2, Mai Văn Hiên2, Đào Thị Mai Anh2,
Dương Thị Hồng Nhung2, Bùi Khắc Cường3, Nguyễn Thị Lập2
TÓM TẮT43
VEGFR2 là một thụ thể quan trọng trong sự
tăng sinh mạch nuôi dưỡng khối u biểu hiện ở
các tế bào nội mô bao quanh khối u và trên bề
mặt của tế bào ung thư. Do vậy, VEGFR2 là một
đích tác dụng tiềm năng chống ung thư. Từ kết
quả nghiên cứu trước, nhóm nghiên cứu đã tạo
được hệ vi bọt đa chức năng mang gen và kháng
1Trường Đại học Y khoa Vinh
2Trường Đại học Dược Hà Nội
3Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Lập
SĐT: 0983222726
Email: lapnt@hup.edu.vn
Ngày nhận bài: 31/8/2024
Ngày phản biện khoa học: 20/9/2024
Ngày duyệt bài: 02/10/2024
thể kháng VEGFR2 hướng đích tế bào u não
(VCMB-pDNA) kết hợp với siêu âm tập trung
(FUS) có ái lực với tế bào u thần kinh đệm lớn
hơn so với các vi bọt đối chứng trên mô hình in
vitro. Trong nghiên cứu này, hiệu quả chuyển
gen và khả năng sống sót của hệ vi bọt trên được
đánh giá trên tế bào u thần kinh đệm người (dòng
tế bào U87). Kết quả cho thấy hệ vi bọt có khả
năng làm tăng tính thấm màng tế bào u thần kinh
đệm, tăng hiệu quả chuyển gen và hạn chế mức
độ chết tế bào ở nồng độ 4x107 vi bọt/ml. Ngoài
ra, hiệu quả chuyển gen thay đổi theo các thành
phần lipid và phối tử trong cấu trúc vi bọt, trong
đó hệ vi bọt đa chức năng (VCMB) chứa lipid
DPTAP và kháng thể kháng VEGFR2 có hiệu
quả chuyển gen cao nhất trong số các loại vi bọt
thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu mở ra một liệu
pháp gen mới vừa tăng hiệu quả điều trị, vừa
giảm tổn thương tế bào.
HI NGH KHOA HC CÔNG NGH M RNG NĂM 2024 - TRƯNG ĐẠI HC Y KHOA VINH
282
Từ khoá: chuyển gen, khả năng sống của tế
bào, gen trị liệu, u não, vi bọt.
SUMMARY
EVALUATION OF THE GENE
TRANSFECTION EFFICIENCY ON HUMAN
GLIOMA CELLS OF THE
MULTIFUNCTIONAL MICROBUBBLE
SYSTEM
The vascular endothelial growth factor
receptor 2 (VEGFR2) expression has been
associated with tumor growth and aggressiveness
in various cancers. VEGFR2 is highly expressed
in tumor cells and endothelial cells in blood
vessels that nurture brain tumors, therefore it
becomes an ideal target to treat cancer. In
previous studies, we have developed a novel
multifunctional microbubble system, the gene-
loaded VEGFR2-targeted microbubble system
(VCMB-pDNA), and reported that the
combination of VCMB-pDNA and focus
ultrasound (FUS) exposure has much greater
cell-binding ability compared with other
untargeted microbubbles (MBs) in vitro. In this
study, the gene transfection efficiency and cell
viability of the above system were evaluated on
human glioma cells (U-87 MG human cell line).
The results showed that the multifunctional
microbubble enhanced the gene transfer
efficiency by increasing the glioma cell
membrane permeability, gene transfection
efficiency and limiting cell death at a
concentration of 4x107microbubbles per ml. We
also noticed that the transfection effect varied
with lipid and ligand components and that
VCMB containing DPTAP and anti-VEGFR2
antibody could be the most effective tool among
three types of MBs. These results suggest that
combining VCMB-pDNA with FUS exposure is
probably useful for efficient gene delivery and
less invasive brain tumor therapeutic system.
Keywords: Gene transfer, cell viability, gene
therapy, brain tumors, microbubbles.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Gần đây trị liệu gen mở ra nhiều hy vọng
về phương pháp điều trị mới đối với những
bệnh hiểm nghèo, khó điều trị như u não. Sự
kết hợp giữa siêu âm và vi bọt giúp cải thiện
tính thấm màng tế bào, tăng cường khả năng
vận chuyển thuốc/gen trị liệu [5]. Dưới tác
động của siêu âm, vi bọt có thể co lại và giãn
ra làm màng tế bào biến dạng tạo các lỗ hổng
tạm thời, thuận lợi cho vận chuyển gen vào
trong tế bào. Đây là một phương pháp
chuyển gen có hiệu quả cao nhưng có thể dẫn
đến tổn thương tế bào [4]. Để hạn chế nhược
điểm này, sử dụng siêu âm tập trung (focused
ultrasound (FUS)), tức là chỉ tập trung siêu
âm tại vị trí khối u, giúp tăng hiệu quả
chuyển gen nhưng giảm thiểu mức độ gây
tổn thương tế bào lành [3].
Dòng tế bào tế bào u thần kinh đệm
(glioma cell) là tiền thân chính của u nguyên
bào đệm đa dạng (Glioblastoma multiforme -
GBM), đây là loại ung thư não ác tính phổ
biến nhất. Thụ thể VEGFR2 được biểu hiện
nhiều trên màng tế bào nội mô và trên cả tế
bào u thần kinh đệm. Do vậy, để tăng hiệu
quả chuyển gen và hạn chế tác động đến mô
lành, việc liên hợp các kháng thể hoặc phối
tử đặc hiệu như VEGFR2 lên bề mặt vi bọt
để tăng cường hướng đích, tập trung chủ yếu
tại tế bào ung thư là một biện pháp đang
được quan tâm.
Từ kết quả nghiên cứu trước, nhóm
nghiên cứu đã tạo được hệ vi bọt đa chức
năng mang gen và kháng thể kháng VEGFR2
hướng đích tế bào u não và kết quả cho thấy
hệ vi bọt có khả năng liên kết tế bào u thần
kinh đệm lớn hơn nhiều so với các vi bọt đối
chứng khác [1]. Tuy nhiên, cần có các
nghiên cứu tiếp theo để đánh giá hiệu quả
của hệ vi bọt đa chức năng trên các mô hình
in vitro và in vivo khác. Do vậy, nghiên cứu
này được tiến hành với mục tiêu: đánh giá
hiệu quả chuyển gen trên tế bào u thần kinh
đệm người của hệ vi bọt đa chức năng.
TP CH Y HC VIỆT NAM TẬP 544 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
283
II. NGUYÊN LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC);
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho
ethanolamine-N-[methoxy(poly
(ethyleneglycol))-2000]-Biotin (DSPE-
PEG2000-Biotin); 1,2-dipalmitoyl-3-
trimethylammonium-propane (DPTAP); 1,2-
distearoyl-sn-glycero-3-phospho
ethanolamine-N-[methoxy(poly
(ethyleneglycol))-2000] (DSPE-PEG2000)
(Avanti Polar Lipids, Hoa Kỳ). Khí C3F8
(Fisher, Hoa Kỳ); FITC-avidin và calcein
(Sigma Aldrich, Hoa Kỳ); gen chỉ thị mã hóa
tạo luciferase, tích hợp trong plasmid (pLUC)
(Origene, Mỹ); D-luciferin (Biosynth AG,
Thụy Sĩ), kháng thể kháng VEGFR2 (Miltenyi
Biotec, Đức), kít dùng phân tích đánh giá khả
năng sống tế bào (Alamar Blue assay) (AbD
Serotec, Anh). Hóa chất khác đạt tiêu chuẩn
dùng trong phân tích.
Dòng tế bào u thần kinh đệm người U87
(U-87 MG human cell line) (ATCC, Hoa Kỳ).
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tạo hệ vi bọt mang gen và
kháng thể kháng VEGFR2
Tạo vi bọt bằng phương pháp hydrat hóa
lớp mỏng dựa theo nghiên cứu trước [1].
Quy trình tạo hệ vi bọt gắn kháng thể kháng
VEGFR2 và pLUC (plasmid mang gen mã
hóa luciferase) diễn ra tóm tắt các bước
chính như sau: Bước 1: tạo vi bọt CMB có
các thành phần gồm DPPC, DSPE-PEG2000,
DSPE-PEG2000-Biotin và DPTAP hòa tan
trong cloroform, sau đó cất quay chân không
để tạo màng. Màng được hydrat hóa bằng
dung dịch đệm glycerol-PBS, rồi sục khí
C3F8 vào để tạo vi bọt; Bước 2: ủ FITC-
avidin với CMB để tạo avidin-CMB (chỉ thị
huỳnh quang FITC được gắn trên vi bọt
thông qua cầu nối avidin-biotin); Bước 3: ủ
kháng thể kháng VEGFR2 với avidin-CMB
(do kháng thể kháng VEGFR2 liên hợp với
avidin), thu được VCMB; Bước 4: ủ pLUC
lên VCMB.
Tạo thêm 2 vi bọt đối chứng: vi bọt trung
tính và vi bọt mang điện tích dương (kí hiệu
tương ứng: MB và CMB) theo quy trình trên
nhưng thành phần khác nhau. CMB (vi bọt
mang điện tích dương) do có thêm thành
phần phospholipid là DPTAP so với MB.
VCMB có gắn thêm kháng thể kháng
VEGFR2 so với CMB.
Phương pháp đánh giá hiệu quả chuyển
gen thông qua khả năng thấm qua màng tế bào
Nguyên lý: Khả năng thấm qua màng tế
bào của hệ vi bọt sau khi chuyển vi bọt vào tế
bào kết hợp siêu âm tập trung được đánh giá
bằng cách theo dõi sự phát huỳnh quang theo
thời gian của chất chỉ thị (calcein) đánh dấu
trong tế bào sống.
Tiến hành: Một ngày trước khi tiến hành
nghiên cứu, các tế bào U87 (1x105 tế bào/ml)
được cấy vào đĩa 6 giếng. Các vi bọt VCMB
(nồng độ từ 0 đến 12x107 vi bọt/ml) được ủ
với chất chỉ thị huỳnh quang calcein (2 μM)
trong dung dịch nuôi cấy tế bào DMEM trong
30 phút, đậy bằng màng PCR (không có
không khí bên trong). Siêu âm các tế bào
trong 10 phút, với các thông số siêu âm phù
hợp đã được khảo sát ở kết quả nghiên cứu
trước [8] như sau: tần số trung tâm = 1 MHz;
độ dài xung = 10 ms; tỉ lệ bùng nổ (burst rate)
= 5 Hz; chu kì nhiệm vụ = 5 %; áp suất âm =
700 kPa; thời gian tiếp xúc = 60 giây, được
thực hiện với đầu dò FUS đường kính 6 mm.
Sau đó, các tế bào được rửa sạch bằng dung
dịch đệm PBS và đánh giá mức độ thấm qua
màng tế bào. Đây chính là thời điểm chụp ảnh
FITC và lấy tế bào thực hiện thí nghiệm đếm
tế bào dòng chảy (flow cytometry).
Để đánh giá mức độ thấm qua màng tế
bào, các tế bào u thần kinh đệm dương tính
với calcein được quan sát bằng kính hiển vi
huỳnh quang ở bước sóng kích thích 482 nm.
Đồng thời, cường độ huỳnh quang xanh lục
của các tế bào u thần kinh đệm dương tính với
HI NGH KHOA HC CÔNG NGH M RNG NĂM 2024 - TRƯNG ĐẠI HC Y KHOA VINH
284
calcein được đo bằng phương pháp đếm tế
bào dòng chảy (flow cytometry). Hiệu quả
thấm calcein, tức là tính thấm màng tế bào
được tính là tỷ lệ phần trăm tế bào u thần kinh
đệm dương tính với calcein ở giếng thử (có vi
bọt) với giếng chứng (không có vi bọt).
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị
trung bình.
Đánh giá ảnh hưởng của thành phần
tạo vi bọt đến hiệu quả chuyển gen thông
qua kết quả biểu hiện gen
Nguyên lý: Hiệu quả chuyển gen chỉ thị
pLUC thông qua mức độ biểu hiện luciferase.
Hoạt độ luciferase được đánh giá thông qua
đo mức độ phát quang sinh học
(bioluminescence) của sản phẩm tạo ra, sử
dụng cơ chất D-luciferin. Tiến hành song
song với đánh giá mức độ sống sót của tế bào
bằng phương pháp sử dụng nhuộm xanh
Alarma (Alarma blue assay).
Tiến hành: Một ngày trước khi tiến hành
nghiên cứu, các tế bào U87 (4x104 tế bào/ml)
được cấy vào đĩa 24 giếng. Các vi bọt
(VCMB) được ủ với 2 μg pLUC trong 4ml
DMEM trong 30 phút. Sau khi loại bỏ môi
trường trong đĩa 24 giếng, các vi bọt VCMB
(nồng độ 4x107 vi bọt/ml) được thêm vào mỗi
giếng, đậy bằng màng PCR (không có không
khí bên trong). Quá trình chuyển gen của vi
bọt kết hợp siêu âm tập trung với các thông số
siêu âm và các bước được thực hiện như
phương pháp đánh giá khả năng thấm qua
màng tế bào ở mục trên.
Sau siêu âm tập trung 4 giờ, các tế bào
được rửa sạch bằng dung dịch đệm PBS và tế
bào tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường
DMEM/F12. Sau 48 giờ, đánh giá hiệu quả
chuyển gen thông qua đo mức độ phát quang
sinh học của sản phẩm tạo ra có chứa cơ chất
là D-luciferin (10 μl của dung dịch có nồng độ
1,5 mg/ml pha trong dung dịch đệm PBS).
Tiến hành song song với 2 mẫu chứng là MB
và CMB.
Đánh giá mức độ sống sót của tế bào được
đánh giá bằng phương pháp sử dụng thuốc
nhuộm xanh Alarma. Tế bào được nuôi cấy và
tiến hành chuyển gen theo phương pháp mô tả
tương tự như phương pháp đánh giá mức độ
biểu hiện luciferase ở trên. Dung dịch thuốc
nhuộm xanh Alarma (5 mg/mL) được thêm
vào mỗi giếng và ủ ở 37°C trong 2 giờ. Độ
hấp thụ của mỗi đĩa được đo bằng hệ thống
đọc tấm huỳnh quang ở bước sóng 570 nm và
bước sóng tham chiếu 600 nm. Khả năng sống
của tế bào được tính bằng tỷ lệ phần trăm theo
độ hấp thụ của sản phẩm formazan tạo thành
của nhóm thử so với nhóm chứng.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị
trung bình.
Xử lý số liệu: Các số liệu được thu thập
và xử lý theo phương pháp phân tích phương
sai một chiều (oneway ANOVA) và kiểm
định t-test, bằng phần mềm thống kê R (ver
2.14.0). Số liệu được biểu diễn dưới dạng: X
± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá khả năng chuyển gen thông
qua mức độ tăng tính thấm màng tế bào
trên mô hình in vitro
Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả chuyển
gen thông qua khả năng nhập bào, tức tăng
tính thấm qua màng tế bào của hệ vi bọt đa
chức năng. Các tế bào đã được ủ với dung
dịch calcein và được chuyển gen kết hợp siêu
âm tập trung (FUS). Sử dụng các nồng độ vi
bọt đa chức năng (VCMB) khác nhau (từ 0
đến 12x107 vi bọt/ml) để đánh giá ảnh hưởng
của nồng độ vi bọt đến khả năng thấm qua
màng tế bào u não. Kết quả hình ảnh tế bào
phát huỳnh quang chỉ thị calcein cho thấy khi
tăng nồng độ VCMB dẫn đến tăng tính thấm
màng tế bào tương ứng, tuy nhiên có xu
hướng giảm từ mức 8x107 vi bọt/ml, mật độ tế
bào phát huỳnh quang nhiều nhất ở mức nồng
độ 4x107 vi bọt/ml (Hình 1).
TP CH Y HC VIỆT NAM TẬP 544 - THÁNG 11 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
285
Hình 1. Hình ảnh tế bào phát huỳnh quang biểu thị tính thấm qua màng tế bào thay đổi theo nồng
độ vi bọt
Ghi chú: “Chứng” là nhóm tế bào không được chuyển gen với hệ vi bọt.
Kết quả ở Hình 2 cũng thể hiện xu
hướng tương tự, khi tăng nồng độ VCMB
([1, 2, 4 và 8]x107 vi bọt/ml) dẫn đến tăng
cường tính thấm màng tế bào tương ứng
(18,97 ± 4,53%, 29,40 ± 10,4%, 59,01 ±
4,05% và 77,80 ± 3,52%). Tuy nhiên, đã có
sự giảm đáng kể về khả năng sống của tế
bào (96,13 ± 3,46 %, 94,01 ± 1,37%, 65,51
± 4,16% và 55,13 ± 0,73%) do sự xâm thực
của của vi bọt và tổn thương tế bào dưới
tác động của siêu âm tập trung. Ở mức
nồng độ của VCMB là 12x107 vi bọt/ml
cho thấy khả năng sống của tế bào giảm
còn 54,38 ± 2,50% với mức thấm calcein là
69,56 ± 7,78%. Do đó, việc tối ưu hóa
nồng độ vi bọt cần xem xét đồng thời tính
thấm của màng tế bào và khả năng sống
của tế bào.
Hình 2. Đồ thị biểu thị tính thấm qua màng và khả năng sống của tế bào
ở các nồng độ vi bọt khác nhau
Ghi chú: “Chứng” là nhóm tế bào không
được chuyển gen với hệ vi bọt; Hình trái:
Tính thấm của màng tế bào thể hiện qua
cường độ huỳnh quang; Hình phải: Hiệu quả
tăng tính thấm qua màng và khả năng sống
của tế bào.
Ở kết quả nghiên cứu trước đây cũng cho
thấy để cân bằng và đạt được cả 2 mục đích,
vừa tăng hiệu quả chuyển gen và vừa tăng số
lượng tế bào sống sót, chúng tôi lựa chọn
nồng độ 4x107 vi bọt/ml để tiến hành các
nghiên cứu kế tiếp.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thành
phần tạo vi bọt đến hiệu quả chuyển gen
thông qua kết quả biểu hiện gen
Thí nghiệm này đánh giá ảnh hưởng của
một số thành phần chính tham gia tạo các
loại vi bọt tới kết quả biểu hiện gen mã hóa
luciferase và khả năng sống của tế bào ở
nồng độ 4x107 vi bọt/ml và thời điểm 2 ngày
sau chuyển gen. Khả năng chuyển gen được
biểu thị thông qua mức độ phát quang sinh
học trung bình thể hiện ở Hình 3 và khả năng
sống của tế bào thể hiện ở Hình 4 của vi bọt