Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Ahpnd) trên tôm biển

Chia sẻ: Cho Gi An Do | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

143
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Ahpnd) trên tôm biển

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Ahpnd) trên tôm biển

QT6.2/KHCN1-BM21 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TÔM BIỂN Chủ nhiệm đề tài: ThS. NGUYỄN THỊ TRÚC LINH Chức danh: Giảng viên Đơn vị: Khoa Nông nghiệp - Thủy sản Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TÔM BIỂN Xác nhận của cơ quan chủ quản Chủ nhiệm đề tài (Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Trúc Linh Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 2 TÓM TẮT Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2015 với mục đích tìm ra chủng vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mạnh nhất và ứng dụng chúng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp cũng như hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản vì thế đề tài "nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm biển" được tiến hành. Vi khuẩn lactic (LAB) được phân lập từ các nguồn khác nhau như: (1) ruột tôm biển; (2) ruột cá rô phi (Oreochromis niloticus); (3) bùn và nước của các ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh, và Sóc Trăng. Các dòng vi khuẩn LAB được sàng lọc bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, và sinh hóa sau đó xác định tính đối kháng với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn bằng bacteriocin và khả năng chịu đựng nồng độ muối của 5 chủng vi khuẩn kháng với Vibrio parahaemolyticus cũng được tiến hành. Kết quả phân lập từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi, bùn và nước ao tôm biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng là như sau: 30 chủng vi khuẩn lactic ở Trà Vinh, và 25 chủng vi khuẩn lactic ở Sóc Trăng đã được phân lập. Kết quả xác định khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus như sau: trong tất cả các chủng LAB phân lập được có 02 chủng có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus rất yếu với đường kính vô trùng nhỏ hơn 11 mm. Các chủng vi khuẩn này không thể ứng dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp. 40 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhưng vòng vô trùng chỉ ở mức trung bình (++) từ 11-16mm. 13 chủng vi khuẩn còn lại có vòng vô khuẩn lớn (+++) từ lớn hơn 16 mm. Trong 13 chủng vừa nêu có 2 chủng rp5.4.1 và rp5.5.1 có vòng vô khuẩn lớn nhất tương ứng là 18,2 và 18 mm. Nghiên cứu này cho thấy dòng rp5.4.1 và rp5.5.1 có thể được sử dụng trong việc phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm biển. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của bacteriocin với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của 5 chủng vi khuẩn lactic là do vi khuẩn tiết acid lactic không phải tiết bacteriocin. Các chủng vi khuẩn thí nghiệm đều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 5-15‰, và phát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰. Tuy nhiên ở chủng vi khuẩn lactic TV20 thì phát triển mạnh nhất ở độ mặn 25‰. 3 MỤC LỤC TÓM TẮT ...................................................................................................... 3 DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................... 6 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .................................... 7 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... 8 LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ 9 PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................... 10 1 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 10 2 Tổng quan nghiên cứu ................................................................................ 11 2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm nước lợ ............................................ 11 2.1.1 Trên thế giới ................................................................................... 11 2.1.2 Ở Việt Nam .................................................................................... 11 2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi ....................................................... 12 2.2.1 Bệnh do virus trên động vật thủy sản .............................................. 12 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm .............................................................. 13 2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic .................................................................... 23 2.4 Ứng dụng vi sinh vật hửu ích trong nuôi trồng thuỷ sản ..................... 28 3 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 30 4 Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu....................................... 30 4.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................... 30 4.2 Quy mô nghiên cứu .............................................................................. 30 4.3 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 30 4.3.1 Dụng cụ và hóa chất ....................................................................... 30 4.3.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 31 4.3.2.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu ....................................................... 31 4.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm ............................................................... 32 4.4 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 37 PHẦN NỘI DUNG ....................................................................................... 38 Chương 1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau và các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa ................................................................................. 38 4 1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau ............. 38 1.2 Sàng lọc các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic .. 39 Chương 2: Tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro ...................................................... 40 2.1 Kết quả xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro ............................... 40 2.2 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahemolyticus của vi khuẩn lactic bằng bacteriocin ........................................................................ 42 2.3 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của vi khuẩn lactic ................................................................................................... 43 Chương 3 Kết quả định danh dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ..................................... 45 3.1 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ................................................................................................................. 46 3.2 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.4.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ................................................................................................................. 46 3.3 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ................................................................................................................. 47 3.4 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 và T5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ...................................................................................................... 48 PHẦN KẾT LUẬN ....................................................................................... 50 1 Kết luận ................................................................................................... 50 2 Kiến nghị ................................................................................................. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 51 PHỤ LỤC ..................................................................................................... 64 5 DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng Số trang Bảng 2.2.1. Các loại virus chính gây bệnh trên tôm biển 14 Bảng 1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic 40 6 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Tên biểu đồ Số trang Hình 2.2.2a. Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tuỵ 18 Hình 2.2.2b. Hình dạng vi khuẩn V. Parahaemolyticus và thể thực 18 khuẩn Hình 2.2.2c. Hình mô bệnh học của tôm khoẻ 19 Hình 2.2.2 d. Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy 19 Hình 2 .2.2 e. Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 20 Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, cá rô phi, 32 bùn đáy và nước ao nuôi tôm biển Hình 2: Quy trình xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn 34 lactic với V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Hình 3 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 40 parahaemolyticus Hình 4 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41 parahaemolyticus ở Trà Vinh Hình 5 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41 parahaemolyticus ở Sóc Trăng Hình 6 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41 parahaemolyticus tại Sóc Trăng Hình 7 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn V. 42 parahaemolyticus bằng bacteriocin Hình 8 Kết quả thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng 43 lên mật số của vi khuẩn lactic 7 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU, ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG, TỪ NGẮN HOẶC THUẬT NGỮ AHPNS Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome CFU Colony Forming Unit ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long DNA Deoxyribo Nucleic Acid EMS Early Mortality Syndrome FAO Food and Agriculture Organization GAV Gill Associated Virus HPV Hepatopancreatic Parvovirus IHHNV Hypothermal And Hematopoietic Necrosis Virus MBV Monodon Baculovirus MRS Man Rogosa Sharpe NA Nutrient Agar OIE Office International des Epizooties PCR Polymerase Chain Reaction PL Post Larval TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar TSA Tryptone Casein Soy Agar TSB Tripticase Soya Broth TSV Taura Syndrome Virus V. P : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus WSSV White Spot Syndrome Virus YHV Yellow Head Virus 8 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em đồng nghiệp, Ban Lãnh đạo Khoa Nông nghiêp Thủy sản, Phòng Khoa học Công nghệ và Ban Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và cấp kinh phí cho tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS Trương Quốc Phú đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn đến PGS. TS Đặng Thị Hoàng Oanh, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận về cơ sở vật chất và dành rất nhiều thời gian để giúp tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn các anh chị em tại Bộ môn Bệnh học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người thân, bạn bè và các em sinh viên lớp DA11TS đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường Đại học Trà Vinh. Xin chân thành cảm ơn! 9 PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc nuôi tôm sú, tôm thẻ ở Đồng Bằng sông Cửu Long trong những năm trước đây đã đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể và góp phần vào việc phát triển nền kinh tế cho cả nước. Nhưng trong khoảng thời gian gần đây (2010 -2012), nghề nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt đã gây ra thiệt hại kinh tế hơn 800 tỷ đồng. Trong đó đáng quan tâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome - AHPNS) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) (Lightner et al., 2012). Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al., 2012; Flegel, 2012). Bệnh này xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre và Kiên Giang. Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng. Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn (Bateriophage) (Loc Tran, et al, 2012). Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học,.... Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất, kháng sinh thì hiệu quả không cao, dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh. Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trong thực phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nông nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện pháp pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh mà còn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng các loài vi khuẩn hữu ích. Vi khuẩn lactic đã được ứng dụng rộng rãi và ngày càng phổ biến trong việc sản xuất chế phẩm sinh học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn nuôi cũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản. Trong nghiên cứu về các loài vi khuẩn hữu ích thì có một số dòng vi khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác như Lactobacillus sp. kháng lại vi khuẩn Vibrio sp. (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv, 2010). Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000; 10 Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000). Kishinouye (1996) đã sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh trong ương tôm Gân (Penaeus latisulcatus). Ngô Văn Hai et al., (2009) đã sử dụng vi khuẩn lactic để kháng lại vi khuẩn Photobacterium damselae subsp. piscicida trong nuôi cá bơn (Solea senegalensis). Các nghiên cứu vừa nêu đã chỉ ra rằng dòng vi khuẩn lactic có khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Việc nghiên cứu khả năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi và đặc biệt là việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại chế phẩm sinh học. Chúng phân chia thành các loại như chế phẩm phân hủy chất hữu cơ, kiềm hãm, và tiêu diệt các dòng vi khuẩn gây hại. Trên thực tế, người nuôi đã sử dụng nhiều loại chế phẩm sinh học khác nhau trong quá trình nuôi tôm, nhưng bệnh hoại tử gan tụy vẫn diễn ra và gây thiệt hại to lớn về kinh tế. Thế nhưng, vẫn chưa có công bố nào về việc nghiên cứu chế phẩm sinh học trong phòng bệnh hoại tử gan tụy trên tôm biển. Do đó, để giải quyết vấn đề cấp bách trong việc phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cũng như góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao chất lượng tôm biển trên thị trường thế giới. Việc "nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm biển" là việc làm cần thiết. 2. Tổng quan nghiên cứu 2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm nước lợ 2.1.1 Trên thế giới Hiện nay, có rất nhiều mô hình và đối tượng nuôi tôm nước lợ trên thế giới như tôm hùm, tôm thẻ, tôm sú,…. Trong đó 2 loài tôm được nuôi phổ biến nhất đó là tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) (weidner and Rosenberry, 1992). Theo thống kê của FAO (2011) trong năm 2010 tổng sản lượng thủy sản thế giới đạt đến 148,5 triệu tấn. Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản toàn cầu có thể đạt kỷ lục mới 160 triệu tấn trong năm 2013, so với 157 triệu tấn của năm 2012 trong khi xuất khẩu thủy sản sẽ đạt 136 tỉ USD, nuôi trồng chiếm 59,9 triệu tấn, ước tính tăng khoảng 25 triệu tấn so với năm 2001. Trong đó, sản lượng cá nước ngọt chiếm 56,4% (33,7 triệu tấn), nhuyễn thể chiếm 23,6% (14,2 triệu tấn), giáp xác chiếm 9,6% (5,7 triệu tấn), cá nước lợ chiếm 6,0% (3,6 triệu tấn), cá nước mặn chiếm 3,1% (1,8 triệu tấn) và những động vật thủy sản khác chiếm 1.4 % (814. 300 tấn). 2.1.2 Ở Việt Nam Đồng bằng Sông Cửu long là vùng nuôi tôm trọng điểm tại Việt Nam, bao gồm các tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre, Trà Vinh,…. với hai đối tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ. Tổng diện tích nuôi trồng thủy sản ở 11 ĐBSCL với diện tích khoảng 1.366.430 ha, trong đó nuôi nước lợ mặn là 886.249 ha (chiếm 89% cả nước). Diện tích nuôi của vùng tăng từ 527.398 ha năm 2011 lên 746.373 ha năm 2008, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 5,09%/năm (Viện kinh tế và quy hoạch thuỷ sản, 2009). Theo Tổng cục Thuỷ sản (2013) trong năm 2012, toàn quốc có 30 tỉnh thành nuôi tôm nước lợ diện tích trên 657.523 ha tăng 0,2% so với năm 2011 nhưng do ảnh hưởng của dịch bệnh đã khiến sản lượng trong năm giảm từ 495.657 tấn chỉ còn 476.424 tấn. Trong đó, tôm sú chiếm 94,1% tổng diện tích và 62,7% sản lượng tôm nuôi trong cả nước; thẻ chân trắng nuôi chiếm 5,9% diện tích với sản lượng chiếm 27,3%. Khu vực ĐBSCL vẫn là vùng nuôi tôm nước lợ chủ lực của cả nước với diện tích 595.723 ha với sản lượng 358.477 tấn chiếm 90,61% diện tích, 75,2% sản lượng nuôi tôm cả nước). Trong đó diện tích nuôi tôm sú là 579.997 ha, sản lượng 280.647 tấn (chiếm 93,6 % diện tích, 94% sản lượng tôm sú cả nước) và diện tích nuôi tôm chân trắng là 15.727 ha, sản lượng 77.830 tấn (chiếm 41,2% diện tích, 42% sản lượng tôm chân trắng nuôi cả nước) tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng và Bến Tre (Tổng cục Thủy sản, 2013). 2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi 2.2.1 Bệnh do virus trên động vật thuỷ sản Theo Fulks và Main, 1992: Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho tôm. Hiện nay trên thế giới đã phát hiện hơn 20 loài virut gây bệnh trên tôm biển trong đó có khoảng 6 loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc nuôi tôm biển trong đó có các bệnh truyền nhiễm như WSSV (white spot syndrome virus), YHV (Yellow Head virus), MBV (Monodon Baculo virus), IHHNV (Infectious hyperdermal and hematopoetic virus), TSV (Taura syndrome virus), và IMNV (Infectious Myonecrosis virus). Các loại bệnh này đã gây tỉ lệ chết rất lớn. Trong các bệnh do virus gây ra thì bệnh WSSV (white spot syndrome virus) đã gây tổn thất lớn về kinh tế hơn bất cứ dịch bệnh nào trước đó với ước tính thiệt hại khoảng 30 tỷ USD. Bệnh xuất hiện mọi lứa tuổi và cảm nhiễm trên rất nhiều đối tượng nuôi giáp xác khác nhau (FAO, 2005). Trong các bệnh do virus gây ra trên tôm biển, MBV (Monodon Baculo virus) cũng gây thiệt hại không kém. MBV đã được xác định là một bệnh phổ biến đối với tôm sú và có phân vùng địa lý khá rộng. Trong đó, tôm sú thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004). Bệnh có khả năng gây chết cao đối với các giai đoạn ấu trùng (zoea và mysis) và giai đoạn đầu của postlarval nhưng lại ít nguy hiểm hơn ở giai đoạn trưởng thành. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tuỳ thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Bùi Quang Tề, 2003; Walker and Mohan, 2009). Ngoài ra, nhiều nhà nghiên cứu còn chứng minh rằng MBV còn làm cho tôm yếu đi, sức đề kháng kém và dễ dàng mẫn 12 cảm với các mầm bệnh nguy hiểm khác như Vibrio, HPV, IHHNV và WSSV, gây tỷ lệ chết cao trong quần đàn (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004). Một bệnh do virus gây ra gây thiệt hại không kém đó là bệnh TSV (Taura syndrome virut). Thiệt hại do TSV gây ra tại Mỹ ước tính từ 1-2 tỷ USD vào năm 2001, và vẫn chưa có thống kê chính xác về hậu quả của loại virus này gây ra tại khu vực châu Á đến thời điểm này (Walker and Mohan, 2008). Bên cạnh TSV thì bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV) cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới, bệnh gây ra ”Hội chứng dị hình còi cọc” và ước tính thiệt hại khoảng 10-15% của mỗi vụ nuôi. Tuy nhiên IHHNV (Infectious hyperdermal and hematopoetic virus) lại ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh sản của tôm sú (Walker and Mohan, 2008). 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm Tác nhân gây bệnh nguy hiểm đe dọa đến nghề nuôi tôm ở một số quốc gia trên thế giới là vi khuẩn, chủ yếu là các loài thuộc nhóm Vibrio (Lightner, 1996; Flegel, 2012). Vibriosis trên tôm thường do các tác nhân chính: Vibrio anguillarum, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. penaeicida (Lightner, 1996) trong đó V. harveyi được xem là loài gây bệnh chủ yếu. Các chủng V. harveyi phát sáng được báo cáo gây thiệt hại trầm trọng trên tôm nuôi ở Philiphine, Australia, Mexico (Rao, 2007). Vibriosis được ghi nhận gây thiệt hại mỗi năm khoảng 30.800 tấn tôm he (Marsupenaeus japonicus) với giá trị thiệt hại xấp xỉ 85 triệu USD (Prayitno and Latchford, 1995). Theo Saulnier et al. (2000) bệnh do vi khuẩn Vibrio thường xảy ra trong tháng nuôi đầu tiên khi tôm bị ảnh hưởng bởi một số thay đổi từ môi trường nuôi (pH, nhiệt độ, độ mặn,..) liên quan đến một số bệnh như nhiễm khuẩn cục bộ, nhiễm khuẩn trên gan tụy (Lighner, 1996), hoại tử đuôi (Tail necrosis), đỏ thân (Red disease), hội chứng mềm vỏ (Losse shell syndrome),… (Jayaree et al., 2006). - Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp. gây bệnh trên động vật thủy sản. Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh, tất cả chúng đều yếm khí tùy tiện và hầu hết là oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7 diisopropyl pteridine phosphat (O/129). Cơ bản chúng sống trong môi trường nước biển và cửa sông (vùng nước lợ). (Nguyễn Thị Minh Trang, 2013). 13 Tôm có sự thay đổi màu sắc và chuyển sang màu hồng nhợt nhạt khi cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio gây bệnh phát sáng (Bùi Quang tề, 2006). Đặng Thị Hoàng Oanh et al. (2006) trong nghiên cứu về xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) thu được kết quả kháng sinh đồ của 26 trong số 27 dòng vi khuẩn phát sáng được thử với 6 loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi thủy sản cho thấy 100% số dòng vi khuẩn thử nghiệm kháng với ampicilin. Các dòng vi khuẩn phát sáng thử nghiệm mẫn cảm với chloramphenicol, norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Phần lớn các dòng vi khuẩn thử nghiệm chỉ kháng với một loại kháng sinh (77%). Có khoảng 15% dòng vi khuẩn kháng với 2 loại kháng sinh và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử. Có 4% số dòng vi khuẩn kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm. Các chủng vi khuẩn phát sáng có những đặc điểm hình thái điển hình của vi khuẩn giống Vibrio. Các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrit từ nitrat, mọc trên môi trường chọn lọc cho nhóm Vibrio (Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose TCBS) và nhất là nhạy với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129,150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl, sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol và trehalose (West et al.1986). Bảng 2.2.2a Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm S Tên bệnh Giai đoạn tôm Vi khuẩn gây bệnh Tác hại V.parahaemolyticus Gây chết hàng 1 Bệnh phát sáng ấu trùng, giống V.harveyi loạt 2 Bệnh đỏ dọc thân Ấu trùng, giống V.alginolyticus Gây chết rải rác 3 Bệnh đỏ thân Tôm thịt Vibrio spp. Gây chết rải rác Vibrio spp., Bệnh vỏ hay ăn mòn ở các giai đoạn của chết rải rác, 4 Pseudomonas spp., kitin, đen mang tôm cua hàng loạt Proteus sp. 5 Nhiễm khuẩn ở cá Cá nuôi ao, lồng Vibrio spp. chết rải rác ( Bùi Quang Tề, 2006) 14 Chen (1989) phân lập được trong gan tụy tôm sú có 18 loài Vibrio trong đó: Vibrio harveyi chiếm 26,9% và V. splendidus chiếm khoảng 0,5%. Hai loại này thường làm tôm bị chết nhiều, có lúc tới 100%, chúng có thể kháng lại 24 loại thuốc kháng sinh (Baticados et al., 1991). Chỉ có một loại kháng sinh kiềm chế sự phát triển của hai loại Vibrio này. + Các bệnh Vibriosis trên tôm he (Marsupenaeus japonicus) Trong quá trình nuôi, việc quản lý môi trường ao nuôi là rất quan trọng. Khi điều kiện môi trường ao nuôi bất lợi thì một số loài vi khuẩn cơ hội, đặc biệt là vi khuẩn Vibrio sẽ tồn tại trong môi trường nước ao nuôi, xâm nhập vào cơ thể tôm và có khả năng gây ra bệnh. Nếu môi trường ao nuôi tiếp tục xấu đi thì mật độ vi khuẩn ngày càng gia tăng, chúng có thể gây ra chết tôm trong thời gian ngắn hoặc gây bệnh mãn tính trên tôm. Các bệnh thường gặp trên tôm khi môi trường ao nuôi bị nhiễm bẩn như là bệnh phân trắng, bệnh phát sáng, đen mang,… Bệnh phân trắng hay còn gọi là “bệnh phân trắng, teo gan”, tôm bị bệnh thải ra phân trắng và gan tụy bị teo hay mềm nhũng gây thiệt hại đáng kể cho người dân nuôi tôm (Nguyễn Khắc Lâm, 2004). Bệnh phân trắng không lây lan thành dịch mà thường xảy ra ở một số ao nuôi thâm canh, nuôi với mật độ cao, ít thay nước (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2008). Trong các nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2008) khi thu 220 mẫu tôm trong các ao có bệnh phân trắng ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Bến Tre từ tháng 5/2005 đến tháng 5/2006 và phân tích bằng phương pháp mô bệnh học, cho thấy có sự hiện diện của các mầm bệnh trong đó có ký sinh trùng, vi khuẩn và virus, các mầm bệnh này nhiễm trên các cơ quan gan tuỵ, mang, cơ quan lymphoid và ruột giữa. Bệnh phát sáng trên tôm nuôi thường xảy ra ở tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2001). Vibrio gây bệnh phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn…, bệnh phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, chất thải đáy ao tích tụ nhiều, và phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30-35‰, bệnh xuất hiện khi pH 7,5-9, có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động mạnh (Harris et al., 1996). + Nghiên cứu Vibriosis trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vanamei) Tôm thẻ chân trắng là một trong những đối tượng nhạy cảm với mầm bệnh Vibriosis ở một số quốc gia trên thế giới. Hiện tại, đã có nhiều nghiên cứu thí nghiệm về độc lực của các chủng Vibrio trên đối tượng này bằng một số phương pháp khác nhau đã được ghi nhận như cảm nhiễm bằng cách ngâm ấu trùng tôm thẻ chân trắng với V. harveyi và V. campbellii (Robertson et al., 1998; Soto- Rodríguez et al., 2006) và phương pháp tiêm trên tôm trưởng thành (Wanget al., 2005). Tôm được gây cảm nhiễm trong các thí nghiệm này đều xảy ra hiện tượng chết cao (> 50%) trong thời gian 48 – 96 giờ tương ứng với mật độ vi khuẩn 15 105 CFU/ml đối với phương pháp ngâm và 104 CFU/ml đối với phương pháp tiêm. Hầu như không ghi nhận được bất kì dấu hiệu lâm sàng nào trên tôm cảm nhiễm trong các thí nghiệm nói trên nhưng khi tiến hành phân tích mô bệnh học trên các mẫu thì phát hiện được một số biến đổi mô học đặc trưng trên một số cơ quan gan tụy, mang và cơ quan lymphoid. Tôm nuôi nhiễm Vibriosis nói chung thường biểu hiện một số đặc điểm mô học đặc trưng như hiện tượng nhiễm khuẩn cục bộ trên các cơ quan, sau đó là sự tập trung của tế bào máu vây quanh các cụm vi khuẩn, kèm theo hiện tượng melamin hóa thường thấy trên cơ quan lymphoid, gan tụy, mang, mô liên kết mang, hệ thống tiêu hóa,.. (Lightner, 1996; Robertson et al., 1998; Pitogo et al., 1990). Các đặc điểm bệnh học tương tự cũng được ghi nhận khi gây cảm nhiễm V. harveyi lên tôm thẻ (Penaeus semisulcatus) với các mật độ vi khuẩn khác nhau (Mohajeri et al, 2011) và trong thí nghiệm cảm nhiễm của Jayasree et al., (2012) trên tôm sú với các chủng vi khuẩn phân lập được trên tôm bị hội chứng mềm vỏ. Bên cạnh đó, cũng ghi nhận được hiện tượng các tế bào máu bao vây các cụm vi khuẩn trên cơ quan lymphoid (Nash et al., 1992) và hiện tượng mất các không bào trên vùng gan tụy, làm ảnh hưởng đến khả năng dự trữ lipid và glycogen của gan (Anderson et al., 1988; Mohajeri et al., 2011). + Sơ lược về bệnh hoại tử gan tụy trên tôm biển Đặng Thị Hoàng Oanh et al. (2012) vào đầu năm 2011, sự xuất hiện của hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính chưa rõ nguyên nhân đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng tôm nuôi cả nước nói chung và khu vực ĐBSCL nói riêng. Tôm mắc phải hội chứng gan tụy cấp tính thường biểu hiện một số dấu hiệu lâm sàng như gan tụy teo, dai; vỏ mềm, ruột rỗng; đôi khi xuất hiện những đốm đen có thể nhìn thấy bằng mắt thường; tôm thường chết đáy và chết cấp tính trong khoảng 2 – 4 ngày sau khi xuất hiện các dấu hiệu trên. Theo Lightner., et al (2013) bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm biển lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2009 được gọi là “Hội chứng tôm chết sớm-EMS (Early Mortality Syndrome)”. Năm 2011, một tên mới được đặt dựa trên mô tả bệnh tích cấp tính, gọi là “hội chứng hoại tử cấp” (AHPNS -Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome). Năm 2013, tên gọi “bệnh Hoại tử Gan tuỵ Cấp” (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) được dùng khi tác nhân gây bệnh được xác định). Bệnh gây tác hại lớn trên tôm sú, thẻ chân trắng ở các trang trại tôm Đông Nam Á, Thái Bình Dương và phía Tây Mê Hi Cô. Bệnh AHPND ban đầu được phân loại là bệnh không rõ nguyên nhân, bởi vì không có mầm bệnh chuyên biệt nào được xác nhận. Tuy nhiên kể từ đầu năm 2013, Phòng nghiên cứu Bệnh học Thuỷ sản Trường Đại học Arizona (UAZ-APL) đã phân lập được dòng vi khuẩn thuần của mầm bệnh AHPND là Vibrio Parahaemolyticus phân lập từ cả hai nước 16 Việt Nam và Mê Hi Cô đều cho cùng tác nhân gây bệnh. Dòng vi khuẩn này thuộc nhánh của vi khuẩn Vibrio harveyi, gần nhất với loài vi khuẩn V. parahaemolyticus. Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (2013) trong năm 2012, cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh, trong đó tôm sú là 91.174 ha gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi và ảnh hưởng đến sản lượng, giá trị xuất khẩu. Nguyên nhân chủ yếu được xác định là do dịch bệnh hoại tử gan tụy và bệnh đốm trắng gây ra kèm theo một số nguyên nhân như thời tiết biến đổi bất thường, chất lượng môi trường nuôi chưa tốt; nuôi tôm không theo lịch thời vụ khuyến cáo; sử dụng hóa chất, thuốc thú y, chế phẩm sinh học còn tùy tiện, chưa được kiểm soát chặt chẽ; chất lượng con giống chưa bảo đảm,.... Các địa phương bị dịch bệnh nhiều nhất là Sóc Trăng thiệt hại 23.371,5 ha (56,6% diện tích thả nuôi); Bạc Liêu 16.919 ha (50% diện tích thả nuôi); Bến Tre thiệt hại 2.237 ha nuôi thâm canh, bán thâm canh (29,06% diện tích thả nuôi); Trà Vinh thiệt hại 12.200 ha (49,3% diện tích thả nuôi); Cà Mau diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh 958,58 ha, tăng trên 420 ha so với năm 2011. Riêng Tiền Giang, diện tích tôm nuôi thâm canh và bán thâm canh bị thiệt hại là 922,88 ha, chiếm 30,63% tổng diện tích thả nuôi tôm. Đầu vụ nuôi năm 2013, tình hình dịch bệnh vẫn tiếp tục diễn biến và gây thiệt hại đến diện tích nuôi tôm ở một số tỉnh ĐBSCL. Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Trà Vinh, tính đến tháng 3, trên địa bàn tỉnh đã có gần 400 hộ nuôi tôm tại các huyện Duyên Hải, Cầu Ngang và Trà Cú thả nuôi tôm thẻ chân trắng với gần 140.000 con, thì trong đó có gần một nửa trong số này đã bị thiệt hại và chưa có dấu hiệu dừng lại. Tình trạng tương tự cũng được ghi nhận ở một số ao nuôi tôm sú thâm canh thuộc các huyện Đầm Dơi, Phú Tân, Cái Nước với thiệt hại trên 116 ha trong số 2.740 ha diện tích tôm đang nuôi. Trong 3 tháng đầu năm 2013, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của tỉnh Cà Mau chỉ đạt 45.000 tấn, thấp hơn nhiều so với cùng kỳ, báo hiệu một năm kinh tế thuỷ sản đang đứng trước nhiều khó khăn. Nguyên nhân tôm chết ở 2 tỉnh đã được xác định đa phần do nhiễm bệnh đốm trắng và hoại tử gan tụy cấp làm cho tôm chết ở giai đoạn 25- 40 ngày tuổi, gây thiệt hại nặng, đặt ra nhiều thách thức cho nghề nuôi tôm trong năm. Lê Hữu Tài và ctv., 2011; Nguyễn Thị Hiền và ctv., 2011 còn cho biết nhiệt độ và độ mặn cũng có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh và lây lan của AHPNS. Ở những vùng nuôi có nhiệt độ và độ mặn càng cao thì khả năng nhiễm bệnh và tỷ lệ tử vong càng lớn. Một số triệu chứng lâm sàng đối với bệnh hoại tử gan tụy cấp như gan tụy teo, dai, có màu nhợt nhạt như trắng hoặc vàng nhạt, có những đốm đen hoặc sọc đen. Vỏ tôm mềm, ruột rỗng (không có thức ăn, tổ chức gan tụy thoái hóa cấp tính, tế bào ống thận (R, B, F và E) mất chức năng, tế bào có nhân lớn bất thường, biểu bì 17 của ống thận bị bong tróc. Có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp. Bệnh AHPNS do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn gây ra và chỉ lây nhiễm qua đường tiêu hóa (Loc Tran et al., 2013), thể hiện ở hình 2.2.2 a; A:Tôm có màu sẫm B: Gan tuỵ teo C: gan tuỵ có màu sẫm, nhũn, ruột rỗng Hình 2.2.2a Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tuỵ (Đặng T. H. Oanh, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ) Hình vi khuẩn V. Parahaemolyticus Thể thực khuẩn ( Nguồn Lightner, 2013) Hình 2.2.2b Hình dạng vi khuẩn V. Parahaemolyticus và thể thực khuẩn Theo Trần Hữu Lộc và ctv, 2012 nghiên cứu ảnh hưởng của cá rô phi trong việc khống chế sự lây nhiễm bệnh AHPND lên tỉ lệ chết của tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) bởi dòng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND). Trong nghiên cứu này cho thấy kết quả sau 2 tuần tảo chlorella phát triển. Sau đó cảm nhiễm với dòng vi khuẩn gây bệnh AHPND. Kết quả đem lại những tác dụng tích cực để khống chế sự bùng phát của bệnh AHPND. Lê Hồng Phước và ctv, 2012 đã nghiên cứu hội chứng hoại tử gan tụy gây chết hàng loạt tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tôm có dấu hiệu hoại tử gan tụy sớm nhất là 19 ngày, trung bình từ 2-2,5 tháng. Mẫu tôm thu từ các ao không có biểu hiện bệnh lý, lúc thu mẫu cũng có tỷ lệ hoại tử 0-16%. Khả năng hồi phục của tôm nuôi khi bị hoại tử gan tụy là không có. Theo Lê Hồng Phước và ctv (2012) thì dấu hiệu hoại tử gan tụy xuất hiện sớm nhất ở ngày thứ 17 và muộn nhất vào ngày thứ 77 (nhiều nhất từ 20-45 ngày và tập trung ở giai đoạn 19-31 ngày tuổi). Tất cả mẫu thu từ ao có tôm chết và được 18 ghi nhận có dấu hiệu hoại tử gan tụy đều phải thu hoạch sau khi phát hiện hoại tử 2- 3 ngày và tôm bệnh không có khả năng hồi phục. Theo Chien, 2012 nghiên cứu các giải pháp môi trường nhằm ngăn ngừa và quản lý dịch bệnh đối với Hội chứng hoại tử gan tụy do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus khi bị cảm nhiễm bởi một thể thực khuẩn sẽ tạo ra độc tố cực mạnh. Bên cạnh đó sự gia tăng và sinh sôi nhanh chóng của các mầm bệnh virus trong môi trường ương nuôi, sự tương tác của 2 điều kiện bất lợi: sức đề kháng của tôm yếu và môi trường nuôi xấu đi thường tạo điều kiện thuận lợi cho dịch bệnh bùng phát. Quản lý môi trường tốt có thể làm giảm bớt áp lực bên ngoài, ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, tăng sức đề kháng giúp tôm chống lại sự xâm hại của mầm bệnh. Để hạn chế dịch bệnh EMS nên sử dụng vi khuẩn có lợi, như sử dụng dòng đặc biệt Subtilis sp., Pseudomonas sp., và Lactobacillus sp., để ngăn chặn sự phát triển của Vibrio sp., và cũng giảm hàm lượng nitơ trong nước, ngăn dịch EMS. Nuôi kết hợp với rong biển (aquaponic) giúp cải thiện và ổn định chất lượng nước, và thậm chí hợp chất sulfated polysarcharides trong rong biển giúp tăng sức đề kháng trong tôm. + Đặc điểm mô bệnh học của bệnh hoại tử gan tụy Lightner et al. (2012) khi phân tích mô bệnh học đối với tôm sú, thẻ chân trắng bị nhiểm AHPNS, đã mô tả chi tiết như sau: tổ chức gan tụy thoái hóa cấp tính, tế bào ống thận (R, B, F và E) mất chức năng, tế bào có nhân lớn bất thường, biểu bì của ống thận bị bong tróc, có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp. Hình 2.2.2c Hình mô bệnh học của tôm khoẻ Giai đoạn cấp tính Giai đoạn cuối Hình 2.2.2d Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy 19 Kết quả này cũng tương tự như mô tả của Prachumwat và ctv (2012) trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan. Theo Lê Hồng Phước và ctv (2012) đã chỉ ra kết quả phân tích mô bệnh học ở Sóc Trăng với tiêu bản mô bệnh học nhuộm Hematoxylin và Eosin, tôm có hai dấu hiệu hoại tử. + Các tế bào ống gan tụy của tôm bị thoái hoá hoàn toàn và bong tróc vào trong lòng ống, không có những biến đổi bệnh lý đặc trưng trên tế bào gan tụy khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Các tế bào bị thoái hoá này có thể bị hiện tượng tự hủy do các enzyme nội bào. Có những trường hợp toàn bộ các tế bào hình thành nên cấu trúc ống gan tụy bị mất hoàn toàn chỉ còn lại bộ khung là các tế bào nền. + Gan tôm teo dai, sậm màu, cấu trúc ống gan hoàn toàn biến mất, số lượng các tế bào gan tụy giảm chỉ còn lại vô số tế bào máu bao bọc sung quanh khối hoại tử. Bên trong khối hoại tử là các tế bào chết và vô số trực khuẩn Gram âm khi quan sát tiêu bản nhuộm bằng Giemsa và bằng phương pháp nhuộm Gram. Có hiện tượng melanin hoá, viêm quanh các ống gan tụy với sự xuất hiện của vô số tế bào và sự hiện diện của trực khuẩn Gram âm trong vùng hoại tử. Do đó trên lâm sàng đôi khi thấy xuất hiện một số đốm đen có thể quan sát bằng mắt thường. + Dấu hiệu bệnh lý: Tôm khi bị bệnh hoại tử gan tụy thường có dấu hiệu bệnh lý như sau: dấu hiệu lâm sàng: tôm bỏ ăn, lờ đờ, tấp mé, màu sắc nhợt nhạt, vỏ mềm. Khi giải phẩu tôm quan sát thấy ruột tôm rỗng, gan tuỵ teo, nhạt màu. Trên gan tụy có những đốm đen có thể quan sát bằng mắt thường. Tỉ lệ chết cao sau 10 ngày thả giống (Eduardo and Mohan, 2012; Lightner và ctv., 2012) + Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Họ: Vibrionaceae Giống: Vibrio Loài: Vibrio parahaemolyticus Hình 2.2.2e Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (nguồn Kozo Makino et al., 2003) 20 V. parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí không bắt buộc, di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt môi trường có độ nhớt cao (McCarter, 1999). Nghiên cứu bộ gen của V. parahaemolyticus đã xác định được gen mã hoá hemolysin không bền nhiệt (TLH - thermolabile haemolysin) là gen đặc hiệu của loài, gen mã hoá hemolysin bền nhiệt (TDH – thermostable direct haemolysin) mã hoá protein TDH có tác dụng làm vở tế bào máu và gây tan huyết (Iida et al., 1998; McCarthy et al., 1999). Vi khuẩn này còn có thể tiết ra protease và phospholipase làm bất hoạt enzyme gây đông máu ở tôm (Lee et al., 1999). V. parahaemolyticus tồn tại phổ biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông trong đó có các ao nuôi, đặc biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000). Nó có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài và xâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác (Kaneko and Colwell, 1973; Kaneko and Colwell ,1975) và phát triển tốt hơn so với các loài vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and Larock, 1985). Theo Twedt et al. (1969) V. parahaemolyticus có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ dao động từ 22 – 420C với nhiệt đố tối ưu là 37oC, ngưỡng pH 5 – 11 và nồng độ muối 1 – 7%. Khi nghiên cứu về sự tồn tại của loài vi khuẩn này trong các sản phẩm thủy hải sản đông lạnh khác nhau Vanderzant and Nickelson (1972) cho biết V. parahaemolyticus có thể tồn tại trong khoảng pH từ 5 – 10 và chỉ vô hoạt ở nhiệt độ 80 – 1000C trong 15 phút. V. parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt tôm là loài tương đối nhạy cảm với vi khuẩn này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Xie et al., 2005; Zulkifiet al., 2009; Lightner, 1996). Trên tôm, V. parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy (Lighner, 1996; , Bruno et al., 1998; Sung et al., 2001). Các chủng V. parahaemolyticus cùng với V. harveyi, V. vulnificus gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) và Philiphine (Lavilla – Pitogo et al., 1998) có liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú (Lightner, 1996). Trong cuộc điều tra về các bệnh do Vibrio spp. trên tôm sú nuôi ở vùng ven biển Andhra Pradesh, Ấn Độ, bệnh đỏ thân và mềm vỏ gây chết với tỉ lệ cao được xác định có liên quan đến vi khuẩn V. Parahaemolyticus (Jayasree et al., 2006). + Các yếu tố thúc đẩy sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus Iraqi (1980) đã nghiên cứu acid Glutamic ở nồng độ 1,8% thúc đẫy sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus dòng thứ 12. Hơn nữa, Trehalose và mannital cũng làm gia tăng sự phát triển của vi khuẩn ở nồng độ 0.1%. Kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng các yếu tố như K2PO4 (0,25%); KH2PO4 (0,015%); MgSO4.7H2O 21 (0,02%) với nồng độ muối là 2% và pH là 7.6 là thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus dòng 12. + Các nghiên cứu về độc lực của V. parahaemolyticus Các nghiên cứu về độc lực cũng như đặc điểm sinh học của loài vi khuẩn này được thực hiện từ những năm 1990. Tedenci et al. (1997) đã tiến hành gây cảm nhiễm chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được từ tôm bị bệnh đỏ thân gây nhiễm bằng cách tiêm trên tôm sú có trọng lượng 8 -12g với các nồng độ 103 – 106 CFU/g và theo dõi trong thời gian 7 ngày đã ghi nhận xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý. Kết quả cảm nhiễm cho thấy có sự chuyển màu đỏ trên cá thể tôm được cảm nhiễm tương tự như dấu hiệu của các mẫu tôm bị hội chứng đỏ thân thu trước đó. Đồng thời, thí nghiệm xác định được liều gây chết 50% (LD50) trong vòng 7 ngày của chủng vi khuẩn này trên tôm sú là 104 – 105 CFU/g. Dấu hiệu bệnh lý tương tự cũng được ghi nhận trong thí nghiệm cảm nhiễm tôm sú bằng phương pháp ngâm với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được từ tôm mắc hội chứng đỏ thân ở vùng ven biển Andhra Pradesh, Ấn Độ của Jayasree et al., (2006), xác định được liều gây chết 50% (LD50) trong 48 giờ của chủng vi khuẩn dùng trong cảm nhiễm là 4.0 x 104 CFU/ml. Thông qua hai thí nghiệm trên đã chứng minh được V. parahaemolyticus là tác nhân gây nên hội chứng đỏ thân trên tôm sú. Phương pháp ngâm cũng được Roque et al. (1998) áp dụng trong thí nghiệm gây cảm nhiễm của vi khuẩn này trên tôm thẻ chân trắng với các nghiệm thức khác nhau (1) tôm bị tổn thương, tiếp xúc với vi khuẩn, (2) tôm tiếp xúc với vi khuẩn, (3) tôm chỉ bị tổn thương, (4) tôm khoẻ. Thí nghiệm được theo dõi trong 4 ngày cho thấy tỉ lệ tôm chết cao nhất ở nghiệm thức tôm bị thương cho tiếp xúc với vi khuẩn dao động từ 37 – 50%, điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng, đặc biệt khi tôm bị tổn thương hoặc bị sốc do các yếu tố môi trường nuôi. Tuy nhiên không ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý nào của tôm cảm nhiễm đối với vi khuẩn này. Theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Sơn (2013) về xác định khả năng lây nhiễm của hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm he bằng phương pháp cho tôm khoẻ ăn mẫu tôm bệnh. Thí nghiệm này được tiến hành trên tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong 35 ngày. Kết quả cho thấy AHPNS không có lây nhiễm cho tôm khoẻ khi sử dụng mẫu tôm bệnh bảo quản trong điều kiện đông lạnh (-800C). Kết quả phân tích mô bệnh học cho thấy có 11/405 mẫu có dấu hiệu tổn thương vùng gan tuỵ trên tôm sú và 16/324 mẫu tôm thẻ. Tuy nhiên, các dấu hiệu bệnh tích này không phải là dấu hiệu mô bệnh học đặc trưng của AHPNS. Kết quả nhuộm Gram mẫu kính phếch trên gan tụy tôm cảm nhiễm có 49 mẫu gan tụy tôm sú và 43 mẫu tôm thẻ ở nghiệm thức cho ăn mẫu tôm bệnh phát hiện vi khuẩn Gram âm tập trung xung quanh tế bào gan tụy nhưng số 22 lượng không nhiều. Số mẫu còn lại không có hiện tượng nhiễm khuẩn. Bên cạnh đó, tỉ lệ tôm chết ở các nghiệm thức cho ăn mẫu bệnh phẩm cao hơn tỉ lệ tôm chết tại các nghiệm thức cho ăn mẫu tôm khoẻ và thức ăn công nghiệp ở cả 3 độ mặn thí nghiệm (10, 15, và 20 ‰). 2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic bao gồm một số giống: Carnobacterim, Enterococcus, Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute (Ercolini et al., 2001; Jay, 2000; Holzapfel et al., 2001). Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương (Fooks et al., 1999) và lên men hydrate cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic (Jay, 2000). Nhóm vi khuẩn này còn sản xuất các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm được lên men (Caplice và Fitzgerald, 1999). Sự phân loại vi khuẩn lactic dựa vào trình tự rARN (Gevers et al., 2001; Holzapfel et al., 2001). Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa (Carr et al., 2002; Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) và gần đây chúng được phân lập từ các sản phẩm lên men như: thịt, các sản phẩm từ sữa, rau quả, nước uống và bánh mì lên men (Aukrust and Blom, 1992; Caplice and Fitzgerald, 1999; Harris et al., 1992; Gobbetti and Corsetti, 1997; Jay, 2000; Liu, 2003; Lonvaud-Funel, 2001; O`Sullivan et al., 2012) - Giới thiệu về vi khuẩn lactic và tình hình nghiên cứu probiotics và bacteriocin Những dòng mang các đặc tính hình que, không di động, sinh acid lactic, gram dương, không sinh bào tử, catalase và oxidase âm tính, không sinh H 2S, không sinh indole từ tryptophan, không dịch hóa gelatin là những dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic (Kandler and Wiss, 1986). * Vi khuẩn lactic và quá trình lên men acid lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria-LAB) đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm. Sản phẩm chủ yếu mà chúng tạo ra trong quá trình lên men carbohydrate (glucose và lactose) là acid lactic. Một vài giống quan trọng như: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee et al., 1999). Tùy thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà người ta chia quá trình lên men acid lactic thành hai loại: lên men acid lactic đồng hình và lên men acid lactid dị hình. Theo Abee et al. (1999) thì hai quá trình này có những đặc điểm sau: 23 + Lên men acid lactic đồng hình: nhờ hoạt động lên men của nhóm vi khuẩn lactic đồng hình. Chúng biến đổi đường thông qua quá trình đường phân và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic. Quá trình lên men acid lactic đồng hình được cho là có lợi về mặt năng lượng (ATP) cho vi khuẩn acid lactic vì chúng tạo ra được 2 phân tử ATP và 2 phân tử acid lactic từ 1 phân tử đường được lên men. Có rất nhiều loài vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình: Lactobacillus lactis ssp. lactis, Lactobacillus lactis ssp. cremoris, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,… Quá trình lên men lactic đồng hình: 1 Glucose → 2 acid lactic + 2 ATP + Lên men acid lactic dị hình: nhờ hoạt động lên men của vi khuẩn lactic dị hình. Trong trường hợp này chỉ tạo thành 1 phân tử acid lactic từ 1 phân tử glucose được lên men, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol, CO2. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Một số loài LAB lên men acid lactic dị hình: Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum,… Quá trình lên men acid lactic dị hình: 1 Glucose → 1 Acid lactic + 1 CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + Một số sản phẩm phụ + Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic Tác động kháng lại vi sinh vật của vi khuẩn lactic chủ yếu là do acid lactic và các sản phẩm acid hữu cơ. Chúng làm giảm pH của môi trường sinh sống của vi sinh vật khác (Caplice và Fitzgerald, 1999; Kuipers et al., 2000). Ở pH thấp thì các acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan và khuếch tán qua màng tế bào chất (Gottschalk, 1988). Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở cá nước ngọt như: A. hydrophila, E. tarda 524362, Yersinia ruckerii và Staphylococcus aureus 169E. Vi khuẩn lactic cũng sinh ra acetadehyde, H2O2, diacetyl, CO2, đường đa và bacteriocins (Caplice và Fitzgerald; de Vuyst và Degee, 1999; Rodríguez et al., 2003). + Thành phần kháng khuẩn sinh ra từ bacteriocin Theo De Vuyst (1994) đã nghiên cứu bacteriocin là những protein hoặc phức hợp protein có hoạt tính kháng khuẩn. Khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y học, nó là các phân tử protein dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu hóa người. Chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc. 24 Có nhiều loại bacteriocin được tạo ra bởi vi khuẩn acid lactic. Parada et al. (2007) đã tổng hợp nhiều kết quả phân loại bacteriocin bởi nhiều tác giả khác nhau và cuối cùng đưa ra hệ thống phân loại bacteriocin thành ba nhóm chính: Lantibiotics, Non – Lantibiotics và những peptide lớn, có khối lượng phân tử lớn (> 30 kDa). Lactobacillus plantarum là loài vi sinh vật hữu ích, hiện diện trong nước bọt và đường tiêu hóa của người (Lonnermark et al., 2009), vi khuẩn này được sử dụng phổ biến trong việc lên men thực phẩm. Lactobacillus plantarum NCDO 1193 sinh ra từ một số dạng bacteriocin có tên là Plataricin B hoạt động ức chế đáng kể các loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Charlotte West và Philip Warner, 1998). Lactobacillus sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin có tên là P. sakacin ức chế đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây hỏng thịt, cá, do đó chúng còn ứng dụng rộng rãi trong việc bảo quản các sản phẩm thịt lên men và một số sản phẩm cá (Milton, 2005). Nghiên cứu của Reid (1999) và Vázquez et al. (2005) cho thấy Lactobacilli mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào; ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh; kích thích miễn nhi