Đồ án tốt nghiệp: Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẠO CHẾ PHẨM DIỆT SÂU KHOANG Spodoptera litura TỪ DỊCH NUÔI CẤY

VI KHUẨN Serratia marcescens SH1

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN HOÀI HƢƠNG

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG

MSSV: 1211100056 Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả

nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình

nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

đƣợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện luận văn

Lê Thị Ngọc Dung

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quãng đời con đi học, chƣa một ngày nào bố mẹ thôi lo lắng và

chăm sóc cho con, nhƣng con không mấy khi biểu hiện hay đơn giản là câu nói

“con thƣơng bố mẹ”. Nhân lúc này đây, con xin đƣợc ghi khắc công ơn dƣỡng dục

của bố mẹ, có những lúc con vô tình làm bố mẹ buồn, nhƣng cả hai đã không bỏ

mặc con với khó khăn mà đã luôn dõi theo, giúp đỡ và sát cánh bên con để con

đƣợc trƣởng thành đến ngày hôm nay. Bố mẹ là chỗ dựa tinh thần vững chắc mỗi

khi con gặp phải vấn đề khó khăn; là động lực để con đứng dậy sau mỗi lần vấp

ngã; là bách khoa toàn thƣ giúp con giải quyết mọi vấn đề. Và sẽ luôn là nhƣ vậy

cho đến mãi sau này.

Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô

trƣờng đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những

kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu em bƣớc vào giảng đƣờng đại học.

Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy

đáng kính, luôn quan tâm và tận tình chỉ dạy để em có thể hoàn thành đồ án. Và

quan trọng hơn là cô đƣa ra những lời khuyên và chỉ dạy em cách đối mặt với

những va chạm trong cuộc sống, và đó sẽ là những trang vàng trong hành trang sau

này của em.

Em cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã quan tâm và có những

hƣớng dẫn đúng lúc khi em đang tập nuôi sâu khoang và cô là ngƣời cho con nguồn

nấm bệnh trong phòng thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị

Tuyến đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ em về địa điểm quét phổ UV – vis.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng,

cô Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại

phòng thí nghiệm.

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã luôn động viên, giúp đỡ

mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha,

anh Lê Quốc Vũ, bạn Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Kiều Nguyễn Phƣơng Vy, bạn

Phan Thị Gìn cùng các em Trƣơng Hoài Nguyên lớp 13DSH03, em Nguyễn Thị

Đồ án tốt nghiệp

Băng Khanh, em Nguyễn Trung Hậu, em Lê Thị Ngọc Hân đã cùng đồng hành và

sát cánh trong suốt những ngày làm đồ án tố nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016

SVTH: Lê Thị Ngọc Dung

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ...................................................................... 4

1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................ 4

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay ........................................... 4

1.1.3 Những mặt ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ............................ 5

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens. ............................................................ 7

1.2.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................................ 7

1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. .................................................... 8

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens. ................................................................... 8

1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí .............................................................................................. 9

1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa ........................................................................................... 9

1.2.3.3 Đặc điểm phân bố .......................................................................................... 11

1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens. .................................. 11

1.3.1 Sắc tố ................................................................................................................ 11

1.3.2 Biosurfactants ................................................................................................... 12

1.3.3 Acid béo ........................................................................................................... 13

1.3.4 Enzyme ............................................................................................................. 13

1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens. ......................................................... 13

1.4 Giới thiệu về Prodigiosin .................................................................................... 14

1.4.1 Khái niệm về prodigiosin ................................................................................. 14

1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .............................................................. 15

1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin ................................................................. 18

______________________________i______________________________

Đồ án tốt nghiệp

1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin từ vi khuẩn Serratia

marcescens. ............................................................................................................... 19

1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens....................................... 20

1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới .......................................................................... 25

1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ..................................................... 25

1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin .................................................................... 25

1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura ........................................................ 27

1.8.1 Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 27

1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái ........................................................................ 28

1.8.3 Thiên địch ......................................................................................................... 29

1.8.4 Biện pháp phòng trừ ......................................................................................... 29

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30

2.1 Thời gian, địa điểm ............................................................................................. 30

2.1.1 Thời gian .......................................................................................................... 30

2.1.2 Địa điểm ........................................................................................................... 30

2.2 Vật liệu – thiết bị – hóa chất .............................................................................. 30

2.2.1 Nguồn vi sinh vật ............................................................................................. 30

2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................... 30

2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị .................................................................................. 30

2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh ........................................................................................... 31

2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura ........................................................... 31

2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất ..................................................................... 31

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................... 31

2.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 33

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm ...................................................... 37

2.4.1 Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ............................................... 37

2.4.2 Phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens .................................. 37

2.4.2.1 Phƣơng pháp xử lí acid ................................................................................. 37

2.4.2.2 Phƣơng pháp xử lí nhiệt ................................................................................ 38

______________________________ii______________________________

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học ......................................................... 39

2.4.3.1 Phƣơng pháp định tính enzyme ..................................................................... 39

2.4.3.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn .............................................. 43

2.4.3.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm ................................................. 46

2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp quét lá ................................... 48

2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trƣờng lên men sau xử lí ............................ 49

2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invivo ..................................................................... 50

2.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm ............................................................ 51

Chƣơng 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN ...................................................................... 53

3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens

từ phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N ............................................................................ 53

3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens

từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ .................................................................................. 60

3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................................ 62

3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí acid ...................... 62

3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ ................ 66

3.4 Khả năng kháng khuẩn ........................................................................................ 68

3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí

acid ............................................................................................................................ 68

3.5 Hoạt tính kháng nấm ........................................................................................... 69

3.5.1 Khả năng kháng nấm của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí

acid ............................................................................................................................ 69

3.6 Hiệu lực diệt sâu .................................................................................................. 71

3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trƣờng lên men đã qua xử lí .................................... 71

3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm ......................................................................... 73

3.7. Xác định thời gian bảo quan canh trƣờng đã xử lí ............................................. 75

3.8. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm ............................................................. 79

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 85

______________________________iii______________________________

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................... 10

Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ...

....................................................................................................................................... 17

Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin .......................................................... 26

Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1. ........................................................ 60

Bảng 3.2. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí

bằng phƣơng pháp xử lí acid. ........................................................................................ 64

Bảng 3.3. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí

bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt........................................................................................ 66

Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của

hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ......................................................... 68

Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí ............................. 70

Bảng 3.6. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. ............................................................ 73

Bảng 3.7 Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3 .............................................................. 75

Bảng 3.8. Tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản (%) ....................................... 82

______________________________iv______________________________

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ......... 8

Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và

Gibbs, 2011) ................................................................................................................ 9

Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất prodigiosin (Krishna, 2008) ....... 16

Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................ 17

Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009) ...... 19

Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC

39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ

Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................. 22

Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) .............................. 24

Hình 1.8. Vòng đời của sâu khoang Spodoptera litura ........................................... 28

Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và

hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ............................... 34

Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn

S.mercescens ............................................................................................................. 35

Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử

lí acid ......................................................................................................................... 36

Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin ................................ 36

Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Lipit .......................... 40

Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Casein ......... 41

Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng huyền phù

chitin 1%. .................................................................................................................. 43

Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch môi trƣờng

NA. ............................................................................................................................ 45

Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................ 47

Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại các thời

điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 ............................................................ 56

______________________________v______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Giá trị OD499 của prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng

nghiệm thức ............................................................................................................... 57

Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng

nghiệm thức ............................................................................................................... 59

Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid đƣợc trang trên đĩa môi trƣờng PGA, sau 24h ủ

tối. .............................................................................................................................. 61

Hình 3.5. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng

S.marcescens đã xử lí ................................................................................................ 64

Hình 3.6. Khả năng bảo toàn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men đã

xử lí ........................................................................................................................... 66

Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của

hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men đã xử lí. ....................................... 68

Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối

chứng ......................................................................................................................... 70 Hình 3.9. Nồng độ pha loãng cho thí nghiệm hiệu lực diệt sâu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. ................................................................................................................ 72

Hình 3.10 Tỉ lệ sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid ........................................... 72

Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do prodigiosin trong canh trƣờng

S.marcescens đã xử lí acid ........................................................................................ 73 Hình 3.12 Chế phẩm và các nồng độ pha loãng:10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 .... 74

Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian ............................................ 75

Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

S.marcescens đã xử lí ở môi trƣờng ngoài sáng ........................................................ 76

Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở môi trƣờng tối ... 77 Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ 2oC .. 78

Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ phòng

................................................................................................................................... 78

Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quản, ở điều kiện ngoài

trời ............................................................................................................................. 79

______________________________vi______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản. ............................................... 80

Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm ................................................................ 80

Hình 3.21. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện môi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phòng, nhiệt độ ngoài trời và nhiệt độ cao (60oC) ........................................................................................................................ 82

______________________________vii______________________________

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Các sản phẩm xuất khẩu là mặt hàng nông nghiệp của Việt Nam đang dần có chỗ

đứng trên thị trƣờng quốc tế, nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Tuy nhiên, việc

sản xuất và thu hoạch các loại nông sản thiếu tính chuyên nghiệp và khoa học, lạm

dụng các chất bảo vệ thực vật hóa học gây tồn đọng dƣ lƣợng thuốc trong sản phẩm –

là lí do làm sản phẩm Việt khó có chỗ đứng ở các thị trƣờng lớn. Thêm vào đó là tình

hình thời tiết những năm trở lại đây có chuyển biến phức tạp do hiện tƣợng thời tiết El

Niño đã làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của cây trồng và sự xuất hiện của các loài côn

trùng gây hại. Để hạn chế sự tấn công của côn trùng lên rau màu, ngƣời nông dân đã

dùng thuốc hóa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả

năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức

tạp hơn. Trong đó, sâu khoang Spodoptera litura là loài sâu đa thực và gây hại nặng

đến màu màng. Chúng có thể phá hại đến 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật bao

gồm các loại rau đậu, cây thực phẩm, cây công nghiệp, cây lƣơng thực, cây phân

xanh,... có khả năng kháng thuốc hóa học nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc

trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy, xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ

sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu

dài, an toàn cho sức khỏe con ngƣời, đồng thời không gây ô nhiễm môi trƣờng.

Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì các loại thuốc phòng trừ

sinh học có nguồn gốc từ hợp chất thứ cấp đang chiếm đƣợc sự chú ý của ngƣời dùng,

vì khả năng tiêu diệt sâu bệnh mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng

xung quanh. Tuy nhiên, các sản phẩm trên chƣa thật sự nổi bật. Những năm gần đây,

việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng

diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp

chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài

nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo chế

______________________________1______________________________

Đồ án tốt nghiệp

phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin. Vì những lợi ích của hợp chất thứ cấp

prodigiosin, ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là: “Tạo chế

phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia

marcescens SH1”.

2. Mục đích nghiên cứu

Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Xác định phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens trong canh

trƣờng lên men

Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ

tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, không còn chứa tế

bào sống.

4. Các kết quả cần đạt đƣợc

Khảo sát đƣợc khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý

acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy)

Khảo sát đƣợc khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý

acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy). Chọn chế độ xử lý thích

hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, còn giữ đƣợc hoạt tính enzyme).

Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm,

kháng sâu Spodoptera litura tuổi …)

Khảo sát đƣợc hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuôi cấy xử lý acid

Khảo sát đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm.

5. Kết cấu của đồ án

Đồ án “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ chủng vi khuẩn

Serratia marcescens SH1 phân lập từ nguồn tuyến trùng EPN” đƣợc trình bày gồm

3 chƣơng:

1. Tổng quan tài liệu

______________________________2______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Giới thiệu về định nghĩa thuốc trừ sâu sinh học, phân loại loài cũng nhƣ các đặc

trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens, tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ

cấp prodigiosin, giới thiệu về sâu khoang.

2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm

Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đề tài. Cách bố

trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm.

3. Kết quả thảo luận

Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành.

______________________________3______________________________

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học

1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm có nguồn gốc sinh học, đƣợc làm từ

những nguyên liệu rất dễ kiếm nhƣ gừng, tỏi, ớt, xả, các loại lá, các chủng nấm vi sinh,

hợp chất thứ cấp của vi sinh vật có hiệu quả cao trong việc phòng trừ các loại sâu bệnh

nhƣng lại rất an toàn với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng đất. (Nguyễn Văn Tấn,

2004)

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay trên thị trường

Nhƣ chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ƣu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt

sâu nhanh nhƣng có nhƣợc điểm quan trọng là có độ độc cao với ngƣời và các động vật

có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, do yêu cầu

bảo vệ sức khỏe con ngƣời và sự trong sạch của môi trƣờng, các thuốc trừ sâu hóa học

cần đƣợc hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học. Hiện nay,

trên thị trƣờng thuốc bảo vệ thực có có 7 loại thuốc trừ sâu sinh học:

1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc

chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên

các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có

nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần

hoà thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0- 1,2 kg/ha.

2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000

IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc

họ Leptidopera.

3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae

1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả

tới 86,5%. Dạng nấm xanh đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả

______________________________4______________________________

Đồ án tốt nghiệp

đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để

trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.

TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu

róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”.

4. Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 3- 3,2 x 109Bt/gr trừ bệnh hại cây trồng

nhƣ bệnh lở cổ rễ bắp cải, nấm đất đạt 41,5- 60%.

5. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá,

đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa

vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại

mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá).

6. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt

45- 50%.

7. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn

quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004)

1.1.3 Những mặt ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học.

Nhìn chung, thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm so với

thuốc trừ sâu hóa học, nhƣ:

 Ƣu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với ngƣời và môi

trƣờng. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu nhƣ không

độc với ngƣời và các sinh vật có ích.

 Ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh

học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng

phát sâu hại.

 Ít độc với ngƣời và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dƣ

lƣợng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng

cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè… Muốn có nông

______________________________5______________________________

Đồ án tốt nghiệp

sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ

sâu.

 Ngoài ra, các yếu tố sinh học trừ sâu nhƣ các vi sinh vật và thực vật thƣờng có

sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và

hầu nhƣ vô tận. Đồng thời với các chế phẩm đƣợc sản xuất theo quy mô công

nghiệp, hiện nay ngƣời ta vẫn có thể dùng các phƣơng pháp chế biến thô sơ để

sử dụng. Có thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong

nƣớc rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây

thuốc cá băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nƣớc để phun cũng rất có hiệu

quả.

Bên cạnh những ƣu điểm vƣợt trội vừa nêu ở trên đây, thuốc trừ sâu bệnh hại

sinh học vẫn còn những điểm hạn chế nhƣ:

 Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với

thuốc hóa học.

 Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣờng yêu cầu điều

kiện cũng chặt chẽ hơn.

Nhƣng so với các ƣu điểm to lớn thì các nhƣợc điểm trên đây của thuốc sinh học

là rất nhỏ và hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày

càng đƣợc khai thác sử dụng nhiều.

Ở nƣớc ta, ngoài các chế phẩm Bt đã đƣợc biết đến tƣơng đối lâu, hiện nay có

nhiều chế phẩm mới đã đƣợc đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng có nhiều nông sản

và thực phẩm an toàn phục vụ đời sống cũng là điều kiện quan trọng thúc đẩy sự phát

triển của các thuốc sinh học.

______________________________6______________________________

Đồ án tốt nghiệp

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens

1.2.1 Lịch sử phát hiện

Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6

trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì.

Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội Macedonian

của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có “máu” trên đó. Và

họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong

thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.

Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện

kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã

phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ vậy

đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.

Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc

sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên, điều

này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép

lạ (Gillen và Gibbs, 2011).

Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia

marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu.

Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo.

Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ.

Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý

nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên loài marcescens có

nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh

bánh mì và polenta.

Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy

những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa

học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

______________________________7______________________________

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens.

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với

nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia

marcescens.

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:

 Giới: Bacteria

 Ngành: Proteobacteria

 Lớp: Gramma proteobacteria

 Bộ: Enterobacteriales

 Họ: Enterobacteriaceae

 Chi: Serratia

 Loài: Serratia marcescens

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia

marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có

thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens

______________________________8______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi

(Gillen và Gibbs, 2011)

1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả là

khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là

sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thƣờng bị

mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch,

tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 –

30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

1.2.3.2 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng hiếu khí và kỵ khí. Chủ

yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lƣợng và nhờ có các

enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas, peroxides,… bảo vệ chúng khỏi các phản

ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trƣờng oxy hóa.

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ

Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri

và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả

năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và haemolysin

______________________________9______________________________

Đồ án tốt nghiệp

(Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của

Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất

phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào

để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.

Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7.

(Tariq và John, 2010).

Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens

Đặc điểm sinh STT Kết quả hóa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Di động Indole Methyl Red Voges Proskauer Citrate Dnase Catalase Oxidase Urease Gelatinase Chitinase + – – + + + + – – + +

Môi trƣờng chuyển sang acid, 12 Triple sugar iron

không sinh khí và không sinh H2S

peoduction

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Hydrogen sulphide Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Lên men glucose Lên men sucrose Lên men sorbitol Lên men fructose Lên men xylose Lên men rhaminose Lên men lactose Lên men arabinose – + + + + + + – – – –

______________________________10______________________________

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3.3 Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực

vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống.

Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và

Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng một

vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu

cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).

Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng

(Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.

Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng

đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết

sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là

trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của

chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).

Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài

Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới nhất

của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens

với Steinernema carpocapsae.

1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens

1.3.1 Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn

Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc

biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:

prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,

metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn

______________________________11______________________________

Đồ án tốt nghiệp

dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin

hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1

và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont,

1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng gặp

trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977;

Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc biểu

hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo thành

này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn

MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến là có khả

năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi

Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng hợp

prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và

Falkiner, 1997).

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic

semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid

(3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme

này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên,

hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp

chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006).

1.3.2 Biosurfactants

Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia

marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất thấm

này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản xuất ở 37°C trong

phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt

động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986).

______________________________12______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã

từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961).

1.3.3 Acid béo

Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là

3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid. Các

acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đó, n- tetradecanoic acid

chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).

1.3.4 Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase,

DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa

chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh học đối

với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự, 1989).

Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase

(ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21)

(Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988;

Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996;

Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng có

khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động

chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986).

1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens

Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác

nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh sự tự

bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà phổ biến

là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và Hewlett,

1986).

______________________________13______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm

sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose-resistant, mannose-sensitive,

LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình

tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.

Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể có

bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất

polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không có

fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám dính

nhờ các fimbriae này.

Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có

dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các fimbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều protein

xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ có một

loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ

trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các

fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ.

Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính

nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết

với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào

khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi

oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử LPS,

gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.

Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng

đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase,

chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).

1.4 Giới thiệu về Prodigiosin

1.4.1 Khái niệm về prodigiosin

______________________________14______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ

“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng

túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào

(Kobayashi và Ichikawa, 1991).

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn

Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:

prodigiosin,cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,

metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn

dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin

hydrochloride (cPrG–HCI).

1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-

methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng

lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;

Williamson và cộng sự, 2006).

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo

thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp

với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và

Williams,

1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả

là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

______________________________15______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008)

Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã đƣợc phân lập là đặt tên là “prodigiosine”

bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin tổng

hợp bởi S. marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ

nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo

prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng

pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và

cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc

macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền

thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc

phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).

______________________________16______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc.

Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong

chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977;

Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số

bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.

Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Trọng lƣợng Danh pháp Loài Tên sắc tố phân tử và prodigiosin công thức

Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da

methoxy-prodigiosene C20H25N3O

Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da

hydroxy-prodigiosene C10H23N3O

______________________________17______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Serratia marcescens Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4,6- 334,4 Da

dipyrromelhenr dimethoxypy- C19H18N4O2

prodigiosin prodigiosene

Nocardia Nonylprodigio sin 2-Nonly-6-methoxy- 363,5 Da

(Actinomadura) prodigiosene

Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- C23H31N3O 265,5 Da Nocardia

prodigiosin melhoxy-prodigiosene (Actinomadura) Madurae

Methylcyclodc cyl- 2,10-Nonano-6- C23H33N3O 391,5 Da Nocardia

prodigiosin Methoxy-prodigiosene

Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- Rnethoxy- C25H33N3O 393,6 Da (Actinomadura) Madurae Streptomyces

prodigiosene C25H35N3O Longisporusr Pellctieri

uber và

Nocardia Streplonlyces Metacyclo- 2,4-(9-Ethylnonano) 391,6 Da

(Actinomadur longisporusr prodigiosin -6-methoxy- C25H33N3O

a) pelletieri uber prodigiosene

1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi khuẩn

(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả

năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA

gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi

khuẩn (Ramina và Samira,2009).

______________________________18______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009)

A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli

Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng

một số loài vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,

Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis,

Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự,

2012).

Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thƣ (Pandey và cộng

sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự

2007)

1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin đƣợc phân lập từ vi khuẩn

Serratia marcescens

Theo Grimont & Grimont, 2006, Serratia spp. là vi khuẩn gram âm thuộc họ

Enterobacteriaceae. Đại diện của chi Serratia là Serratia marcescens. Có thể phân lập

Serratia spp. từ môi trƣờng đất và nƣớc, thực vật, côn trùng cũng nhƣ động vật có

xƣơng sống. Serratia spp. có khả năng tổng hợp enzymes DNase, lipase, protease và

chitinase. Đặc biệt, Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ

prodigiosin, một pyrrole alkaloid (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene)

(C20H25N3O = 323,44). Serratia marcescens Bizio từ lâu đƣợc biết có khả năng diệt

______________________________19______________________________

Đồ án tốt nghiệp

sâu Serratia entomophila đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân diệt sâu sinh học ở New Zealand

để tiêu diệt Costelytra zealandica. Prodigiosin thuộc nhóm prodiginine đƣợc biết đến

nhƣ một hợp chất thứ cấp vi sinh vật có tác dụng diệt khuẩn, diệt tảo, ức chế miễn dịch

và tế bào ung thƣ .

Hoạt tính diệt sâu của prodigiosin đã đƣợc mô tả bởi Wang và cộng sự., 2012 thử

nghiệm trên ấu trùng Drosophila, , từ đó đề nghị chủng Serratia marcesens TKU011

phân lập từ đất đƣợc phát triển làm thuốc trừ sâu sinh học. Hợp chất thứ cấp

prodigiosin của chủng này có hoạt tính diệt sâu mạnh. Điều này cho thấy có thể ứng

dụng hợp chất thứ cấp prodigiosin của S.marcescens làm chế phẩm diệt sâu sinh học.

Trên thực tế, công nghệ sản xuất và bảo quản sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật khả

thi hơn sản xuất chế phẩm tuyến trùng EPN, còn ứng dụng bản thân vi khuẩn làm tác

nhân diệt sâu khó đƣợc chấp nhận hiện nay vì lý do an toàn sinh học. (Nguyễn Hoài

Hƣơng và Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2015), (Nguyễn Hoài Hƣơng, Đinh Minh Châu,

2016).

1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.

Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006

(Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc

báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).

Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ

enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-

carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6-

methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và

cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP

và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của

dòng tế bào này đƣợc báo cáo.

______________________________20______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong

Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm).

Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố,

bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR

(Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất

prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào

sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã

đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).

Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và

Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng

hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình 2.18.

Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL)

tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene

của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thƣớc và trình

tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001).

______________________________21______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia

ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ

Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)

Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng

đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách

nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa

monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc thể hiện

qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp đƣợc thể hiện

qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ.

Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là

PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai gene

pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một pig operon

trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép dƣới dạng

polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater et al., 2003) và cụm

sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng polycistronic thông tin.

Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và pigD. Khoảng cách 184 bp

giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy khả năng chứa hai đơn vị

phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai bên của khoảng cách này đã

chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu dùng lacZ hợp với pigA và pigH (Crow,

2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so

với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23

gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản

phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Streptomyces coelicolor (Harris và cộng

sự, 2004).

Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đƣờng tổng hợp

cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nó có sự thay đổi

rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene tƣơng đồng

______________________________22______________________________

Đồ án tốt nghiệp

trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về nguồn gốc và sự

tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram

âm. Vẫn chƣa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến

sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu

nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác

biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hóa. PigD và pigE là hai

pig gene không có sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL và

pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon

tetrachloride) nhƣ pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri

(Lewis và cộng sự, 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm cạnh nhau, giống nhƣ pigD và pigE

trong cụm pig. PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ Streptomyces

coelicolor A3(2), đƣợc mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm màu đỏ (38%

giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ Sma 274; cả hai

đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa protein tham gia

vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không đƣợc liên kết

với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đƣợc mã hóa tƣơng đồng bởi cụm pig,

nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba nguyên tử carbon của vòng

pyrrolr và chuổi bên undecyl của undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng sự, 2001). Các

gene mã hóa tƣơng đồng tƣơng ứng có thể có mặt tại một vị trí trên nhiễm sắc thể

Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh tổng

hợp prodigiosin trong Serratia.

Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia coli

và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia coli và

enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi các nhóm

sắc tố (Harris và cộng sự, 2004).

______________________________23______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014)

Vào năm 2004, cụm gen sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc nhân bản từ trình tự

gen của hai chủng Serratia sp. ATCC 39.006 và Sma 274, đƣợc biểu hiện ở 14 và 15

ORFs. Các cụm gen đƣợc thể hiện qua các vật chủ dị tƣơng đồng. Dựa vào ghi chú

gen, một chƣơng trình đƣợc đề xuất cho sự sinh tổng hợp các prodigiosin. Hai tiền

thân chính, 4-methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carbaldehyde (MBC) và 2-metyl-3-n-amilic-

pyrrole (MAP) đƣợc sản xuất song song tại hai nhánh gen, sau đó ngƣng tụ

thành prodigiosin ở bƣớc cuối cùng. (Caspi R, 2014).

______________________________24______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Trong một dự án tiếp theo, trong khung xóa hoặc chèn đƣợc tạo ra trong tất cả các

gen sinh tổng hợp trong cụm từ Serratia sp. ATCC 39.006 , và các chất trung gian sinh

tổng hợp tích lũy trong mỗi đột biến đã đƣợc phân tích bằng LC-MS, cross-cho ăn, và

các nghiên cứu bổ di truyền. Dựa trên những kết quả này là một phiên bản sửa đổi của

con đƣờng đã đƣợc đề xuất, nhƣ đƣợc mô tả ở đây.

Cả hai chi nhánh sử dụng hóa học thú vị. Các chi nhánh của đài MBC bao gồm

một cơ chế không phổ biến cho sinh tổng hợp pyrrole từ L-proline , trong đó bao gồm

các protein có tính tƣơng đồng với adenylation và peptidyl-carrier lĩnh protein

của sythetases peptide không ribosome (cơ chế tƣơng tự cũng đƣợc tìm thấy trong sinh

tổng hợp các hợp chất pyrrole chứa khác, nhƣ coumermycin A1 , pyoluteorin ,

và undecylprodigiosin ). Các chi nhánh MAP bao gồm PigD , một loại enzyme xúc tác

cho một phản ứng Stetter assymetric.Một homolog của enzyme này đã đƣợc mô tả

trong Pseudomonas stutzeri , và đƣợc tham gia vào quá trình tổng hợp của carbon

tetrachloride chất khử clo pyridin-2,6-bis (thiocarboxylate). (Caspi R, 2014).

1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới

1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens

Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serratia

marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của Serratia

marcescens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh.

Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát Pyricularia

oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng Serratia marcescens.

Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Serratia

marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria

mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng.

1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigiosin

bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết

______________________________25______________________________

Đồ án tốt nghiệp

quả cho thấy prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram

dƣơng và vi khuẩn Gram âm.

Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng

khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candida

albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp..

Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn

trùng.

Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ

chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp.

và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng độ

diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử

dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 g/ml.

Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin

Ngày công Tên Patent Tóm tắt Tác giả bố

Kim Hwanmook,

Han Sangbae, United States Một ứng dụng mới của prodigiosin Lee Changwoo, Patent để điều trị bệnh tiểu đƣờng mà 10/28/2003 Lee Kihoon, 6638968 không có bất kỳ tác dụng phụ nào. Park Sehyung,

Kim Youngkook.

Prodigiosin từ Serratia marcescens Kim Hwanmook, United States có tác dụng nhƣ một ức chế miễn Kim Youngkook, Patent 11/11/2003 dịch trong nhiều lĩnh vực khác Han Sangbae, 6645962 nhau. Yoo Sungak.

United States Prodigiosin, một loại kháng sinh, Nakamura 05/05/1981

______________________________26______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Patent đƣợc sản xuất một cách hiệu quả Katsumi

4266028 bằng chủng Serratia marcescens Kitamura

R-2. Kumpei

Kim Hwan-Mook

Han Sang-Bac

Lee Chang-Woo United States Sử dụng prodigiosin cho việc điều Lee Ki-Hoon Patent 07/01/2004 trị bệnh viêm thấp khớp. Park Se-Hyung 20040127547 Kim Hyoung

Chin

Kim Young-Kook

1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura.

Sâu khoang còn đƣợc gọi là sâu ăn tạp gây hại trên tất cả các loại rau, là đối

tƣợng gây hại nặng trên rau, đậu. Sâu non tuổi nhỏ thƣờng gây hại nghiêm trọng nhất

bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chóng làm lá cây xơ

xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất.

1.8.1 Đặc điểm hình thái

Sâu khoang có nhiều loại, trƣởng thành là loại ngài có màu xám hoặc nâu xám,

cánh trƣớc có màu nâu vàng, có các vân ngang bạc trắng óng ánh, cánh sau màu hơi

trắng.

Trứng hình bán cầu, mới đẻ màu vàng, sau màu tro tối xếp với nh au thành ổ, có

phủ một lớp lông màu vàng rơm.

______________________________27______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Sâu non mới nở có màu xanh sáng, Sâu tuổi lớn có màu từ xám xanh đến nâu đen

với những sọc vàng hoặc trắng, đốt bụng thứ nhất có một vết đen to bao quanh, trên

mỗi mảnh lƣng có vân hình trăng khuyết.

Nhộng màu đỏ sẫm, cuối bụng có một đôi gai ngắn.

1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái

Vòng đời: 25 - 48 ngày

 Trứng: 3 - 7 ngày

 Sâu non: 12 - 27 ngày

 Nhộng: 8 -10 ngày

 Trƣởng thành: 2 – 4 ngày

Hình 1.8. Vòng đời của sâu khoang Spodoptera litura

Ngài hoạt động mạnh vào ban đêm, có xu tính với mùi chua ngọt và ánh sáng

bƣớc sóng ngắn.

Trứng đẻ thành ổ trên lá, một ổ có từ 50 - 200 trứng. Một con cái có thể đẻ từ 500

– 2.000 trứng.

Sâu tuổi nhỏ sống tập trung ăn hết thịt lá chừa lại biểu bì và gân. Ở tuổi 3 – 4 sâu

phân tán và ăn khuyết lá hoặc có khi ăn trụi lá. Sâu non có 6 tuổi, khi đẫy sức ở tuổi 6

______________________________28______________________________

Đồ án tốt nghiệp

dài từ 35 - 50 mm. Khi mật độ sâu cao có thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây

hại thƣờng không nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây. Khi đẫy sức sâu

chui xuống đất hoá nhộng, sau khoảng 10 ngày thì vũ hoá.

1.8.3 Thiên địch

Các loài ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng.

Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus.

Vi khuẩn BT, virus nhân đa diện.

1.8.4 Biện pháp phòng trừ

Biện pháp canh tác:

Vệ sinh đồng ruộng trƣớc và sau khi trồng, cày ải phơi đất.

Dẫn nƣớc ngập ruộng trƣớc khi làm đất.

Biện pháp cơ giới vật lý:

Diệt ổ trứng và sâu non bằng tay.

Biện pháp sinh học:

Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các loài thiên địch thƣờng xuất hiện trên ruộng

nhƣ nhện, bọ rùa, ong kí sinh...

Dùng bẫy pheromone hoặc bẫy chua ngọt có hiệu quả.

Biện pháp hóa học:

Dùng các loại thuốc ít độc nhƣ nhóm Abamectin (Abamectin; Tập kỳ 1.8 EC

Abatin 1.8 EC; Silsau 3.6 EC…); các loại chế phẩm vi sinh: thuốc có nguồn gốc từ Bt

nhƣ V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP có nguồn gốc NPV nhƣ Vicin- S… hoặc

thuốc thảo mộc nhƣ Rotenone hoặc Neem. Có thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp nhƣ

Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC… /. (Phòng kỹ thuật thuộc chi cục bảo vệ thực vật

Tp.HCM, 2010)

______________________________29______________________________

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 16/05/2016 đến ngày 07/08/2016

2.1.2 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi

trƣờng, trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2 Vật liệu – thiết bị – hóa chất

2.2.1 Nguồn vi sinh vật

2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens

Chủng vi khuẩn Serratia marcessens – SH1, do anh Nguyễn Hoàng Anh Kha

phân lập đƣợc từ tuyến trùng Steinerma quangdosense XT (S –XT) và Heterorhabditis

indica CP 16 (H – CP16) vào năm 2009.

2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị

Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus do anh Lê Quốc Vũ,

sinh viên khóa 2011, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng cung cấp.

2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh

Nguồn nấm bệnh Fusarium sp., Collectotrichum sp. do TS. Nguyễn Thị Hai

phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng đại học

Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura

Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc bắt ngoài thiên nhiên và nhân nuôi trong môi

trƣờng nhân tạo với nguồn thức ăn chính là lá thầu dầu.

2.2.2 Môi trường nuôi cấy và hóa chất

a. Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục A)

______________________________30______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Môi trƣờng Nutrient agar (NA)

Môi trƣờng Nutrient broth (NB)

Môi trƣờng Peptone Glycerol agar (PGA)

Môi trƣờng Peptone Glycerol broth (PG)

Môi trƣờng Casein

Môi trƣờng Lipit

Môi trƣờng huyền phù Chitin 1%

Môi trƣờng Potato Dextrose agar (PDA)

b. Hóa chất, thuốc thử

Cồn 70, cồn 96

HCl 1N

NaOH 1N

Trichloroacetic acid (TCA) 10%

Thuốc thử lugol

Tween 80 0,02%

Rỉ đƣờng 1%

Carboxymethyl cellulose (CMC) 1%

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị

a. Dụng cụ

Hộp nuôi sâu

Thùng nuôi bƣớm

Ống nghiệm

Đĩa petri

Erlen 100 ml, 250 ml, 1000 ml

Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml

Pipetman 100 , 1000

Đầu côn 100 , 1000

______________________________31______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Đũa thủy tinh

Bao hấp, giấy gói, thun

Đèn cồn, que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy trang

Bông thấm, bông không thấm

Kim tiêm

b. Thiết bị

Autolave

Tủ cấy vi sinh

Tủ sấy

Tủ ủ vi sinh

Tủ lạnh

Cân phân tích

Bếp từ

Máy nƣớc cất

Máy ly tâm

Máy lắc

Bể điều nhiệt

2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm

Mục đích: sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin.

Mục tiêu: sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1

phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, không còn

chứa tế bào sống.

Nội dung

i) Khảo sát khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid

lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy)

______________________________32______________________________

Đồ án tốt nghiệp

ii) Khảo sát khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid

lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuôi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế

bào chết, nồng độ prodigiosin cao, còn giữ đƣợc hoạt tính enzyme).

iii) Khảo sát hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm,

kháng sâu Spodoptera litura tuổi 3

iv) Khảo sát hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuôi cấy xử lý acid

v) Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm.

Phƣơng pháp luận

Các nghiên cứu trƣớc đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens SH1

(phân lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế

phẩm diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình downtream processing đối với canh

trƣờng lên men vi khuẩn. Vì vậy hai phƣơng pháp đƣợc đề nghị là xử lý acid hoặc xử

lý nhiệt để tiêu diệt tế bào S. marcescens SH1 và sau đó làm chế phẩm. Tiêu chí của

chế độ xử lý canh trƣờng lên men là tiêu diệt tế bào mà không ảnh hƣởng lên nồng độ

prodigiosin tổng hợp cũng nhƣ ít ảnh hƣởng nhất lên enzyme ngoại bào.

Để khảo sát hoạt tính dịch nuôi cấy sau xử lý, thử nghiệm kháng khuẩn, kháng

nấm đƣợc sử dụng có ý nghĩa thăm dò. Hoạt tính diệt sâu đƣợc thử nghiệm trên

Spodoptera litura là đối tƣợng trƣớc kia đã thử nghiệm cho prodigiosin sau trích ly.

Chế phẩm bƣớc đầu đƣợc sản xuất bằng cách bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt

prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ kết dính, rỉ đƣờng kích thích sâu ăn

Bố trí thí nghiệm

Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ Hình 2.1

______________________________33______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Giống vi khuẩn S.mercescens

Tăng sinh 48h

Xử lý

Xử lý nhiệt ở 65oC với acid HCl 1N

Khảo sát hoạt tính sinh học

Thử nghiệm khả năng diệt sâu

Tạo chế phẩm

Thử nghiệm khả năng diệt sâu

Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm

Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt

tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí.

______________________________34______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Giống vi khuẩn S.mercescens

Tăng sinh 48 giờ

Đo quang A = 620 nm

Đo quang A = 499 nm

Xử lý

Xử lý nhiệt ở 65oC với acid HCl 1N

Kiểm tra khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn ở

Đo quang, Đếm khuẩn lạc

A = 620 nm và A = 499 nm

Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn

S.mercescens

______________________________35______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Giống vi khuẩn S.mercescens

Xử lí acid

Khảo sát hoạt tính sinh học

năng Kháng nấm Enzyme Khả diệt sâu Kháng khuẩn

Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn

sau khi xử lí acid

Giống vi khuẩn S.mercescens

Xử lí acid HCl 1N, 4 giờ

Khả

năng

Khảo sát

Khảo sát điều kiện bảo quản

Tạo chế phẩm

diệt sâu thời gian bảo quản

Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin

______________________________36______________________________

Đồ án tốt nghiệp

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm

2.4.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm

Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu khoang phát

triển 25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%.

Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc thu mẫu từ ruộng rau đắng tại huyện Cần

Giờ, Tp.HCM, sâu khoang ngoài đồng mang về nuôi đƣợc tính là sâu thế hệ P.

Thế hệ P đƣợc nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá thầu dầu cho tới khi hóa

nhộng.

Khi sâu vào giai đoạn hóa nhộng, lót khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng

lá thầu dầu cho tới khi 5 - 6 ngày hóa nhộng trong hộp.

Sau khi vũ hóa, ngài thuộc thế hệ P đƣợc ghép cặp với nhau trong các thùng

giấy đƣợc lót giấy mềm và cung cấp thức ăn dƣới dạng lỏng là nƣớc đƣờng pha loãng

(tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày.

Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non đƣợc nuôi với thức ăn là lá thầu

dầu.

Nhân nuôi sâu khoang Spodoptera litura cho đến khi đủ số lƣợng để tiến hành thí

nghiệm.

2.4.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens

2.4.2.1 Phương pháp xử lí acid

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong Erlen có chứa 300 ml môi

trƣờng peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt

độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, 48 giờ.

Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ canh trƣờng và đem xử lí với acid HCl

1N. Từ 300ml canh trƣờng vi khuẩn, dùng pipet vô trùng hút 20 ml canh trƣờng lên

men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vô trùng.

Với mục đích đƣa môi trƣờng về pH = 1, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman

hút 1000 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men.

______________________________37______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Lắc 150 vòng / phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ.

Sau đó, đƣa môi trƣờng về pH = 7 với 1000 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620nm và OD499nm, song song đó tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng 100, 10-1 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ

Với mục đích đƣa môi trƣờng về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman

hút 450 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men. Lắc 150 vòng /

phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Đƣa môi trƣờng

của canh trƣờng lên men về pH = 7 với 450 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620 và OD499, song song đó tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng 100, 10-1 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ.

Đối chứng dƣơng: canh trƣờng lên men 48 giờ của vi khuẩn đƣợc tiếp tục tăng

sinh trên máy lắc 150 vòng / phút. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ

kế tiếp. Thu nhận mẫu canh trƣờng lên men, đo OD620 và OD499, song song đó tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng 10-6, 10-7 và 10-8. Ủ đĩa trong tối, 24

giờ.

Đọc kết quả:

Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn

Serattia marcescens trên môi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính prodigiosin

unit/tế bào sau xử lí acid.

2.4.2.2 Phương pháp xử lí nhiệt

Chuẩn bị vi khuẩn khảo sát: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong

Erlen có chứa 300 ml môi trƣờng peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống

1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng.

Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ canh trƣờng và đem xử lí ở nhiệt độ 65oC trong vòng 15 phút: từ 300ml canh trƣờng, dùng pipet vô trùng hút 20 ml canh

trƣờng lên men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vô trùng.

______________________________38______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Thí nghiệm thực hiện ở 3 nghiệm thức nhiệt độ: 50oC, 65oC và 80oC đƣợc xử lí

trong vòng 15 phút. Sau xử lí nhiệt, tiến hành cấy trang dịch canh trƣờng lên thạch PGA ở các nồng độ pha loãng 100,10-1 và 10-2. Ủ tối 24h, nhiệt độ phòng. Đồng thời

tiến hành trích ly thô dịch canh trƣờng ở mỗi nhiệt độ xử lí, đo OD 535nm nhằm xác định

lƣợng prodigiosin đƣợc sinh ra.

Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48h tiến hành cấy trang

trên đĩa PGA ở các nồng độ pha loãng 10-3,10-4 và 10-5.

Mỗi nghiệm thức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần.

Đọc kết quả:

Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn

Serattia marcescens trên môi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính tỉ lệ tế bào vi

khuẩn bị tiêu diệt. Tính tỉ lệ tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. Tính lƣợng prodigiosin thu

đƣợc từ giá trị OD535nm

2.4.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.4.3.1 Phương pháp định tính enzyme

Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi

trƣờng PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ.

Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn đã xử lí:

Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng PG broth vô trùng, dùng pipetman

hút 450 HCl 1N cho vào canh trƣờng lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 4 giờ. Tiến

hành thêm 450 NaOH 1N để đƣa canh trƣờng về pH = 7. Thêm vào 100 Tween

80 0,02%

Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Tween 80 đƣợc pha loãng về nồng độ 1%, sau đó hút

100 l Tween 80 1% cho vào lần lƣợt các dịch canh trƣờng đƣợc pha loãng với thể tích

5 ml.

Thử nghiệm hoạt tính lipase

Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi

______________________________39______________________________

Đồ án tốt nghiệp

trƣờng nguội đến khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa

agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d).

Đối chứng dƣơng: Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử

nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ

phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng.

Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5

ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng độ

pha loãng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào

ĐC

3 giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.5

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Lipit

Đọc kết quả:

Nếu dịch canh trƣờng có enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng

thạch.

Nếu dịch canh trƣờng không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung

quanh giếng thạch

Khả năng phân giải lipit đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn,

khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn.

______________________________40______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó :

D: đƣờng kính vòng phân giải (mm)

d: đƣờng kính giếng thạch (mm)

Thử nghiệm hoạt tính protease

Pha môi trƣờng casein agar, hấp 121 oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng,

đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d).

Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 canh trƣờng lên men vi khuẩn thử

nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đƣờng kính vòng phân giải.

Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5

ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha

ĐC

loãng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3

giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính casein, nhƣ hình 2.6.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng Casein

Đọc kết quả:

Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trƣờng:

______________________________41______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Nếu dịch canh trƣờng có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung

quanh giếng thạch.

Nếu dịch canh trƣờng không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng trong

suốt xung quanh giếng thạch.

Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng

lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn.

Trong đó :

D: đƣờng kính vòng phân giải (mm)

d: đƣờng kính giếng thạch (mm)

Thử nghiệm hoạt tính chitinase

Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để

môi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC , đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d).

Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử

nghiệm vào đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng

trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vòng phân giải trên bề mặt môi trƣờng.

Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5

ml, tiến hành pha loãng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha

loãng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3

giếng thạch ở môi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.7.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

______________________________42______________________________

Đồ án tốt nghiệp

ĐC

Hình 2.7 Cách b

ố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trƣờng

huyền phù chitin 1%.

Đọc kết quả:

Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trƣờng:

Nếu dịch canh trƣờng có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung

quanh giếng thạch.

Nếu dịch canh trƣờng không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong

suốt xung quanh giếng thạch.

Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng

lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn.

Trong đó :

D: đƣờng kính vòng phân giải (mm)

d: đƣờng kính giếng thạch (mm)

2.4.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn

Theo phương pháp đục giếng thạch.

______________________________43______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng

khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trƣờng thạch. Phƣơng

pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Vi khuẩn chỉ thị - Escherichia coli, Staphylococcus aureus:

Vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh 24 giờ trong môi trƣờng lỏng TBS vô trùng, lắc

150 vòng/ phút. Sau 24 giờ, khử trùng que cấy vòng tiến hành ria vi khuẩn lên môi trƣờng thạch NA, ủ 24 giờ ở nhiệt độ là 37oC. Dùng dây cấy vô trùng lấy sinh khối vi

khuẩn từ đĩa NA cho vào 9 ml nƣớc muối sinh lí vô trùng rồi so với thang McFahrland, pha loãng đến khi đạt mật độ 106 cfu/ml.

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng lỏng PG vô trùng, ủ

tối và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2

trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/

phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm

450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7.

Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí đem đi ly

tâm 10.000 vòng/phút trong vòng 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu

dịch canh trƣờng vô khuẩn. Tiến hành pha loãng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ

pha loãng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02%

Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha loãng dịch canh trƣờng

thành dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD 499nm ở từng nồng

độ pha loãng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 %

Kháng sinh chloramphenicol 20 mg/ml để làm đối chứng đối chứng dƣơng.

Môi trƣờng PG vô trùng đƣợc thêm Tween 80 0,02% để làm đối chứng âm.

Tiến hành thí nghiệm

Dùng tăm bông vô trùng quét đều dịch pha loãng vi khuẩn chỉ thị lên bề mặt môi

trƣờng NA. Tiến hành đục giếng thạch 7mm nhƣ hình 2.8

______________________________44______________________________

Đồ án tốt nghiệp

ĐC

.

Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch môi trƣờng

NA.

Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch, và 20 l

môi trƣờng PG vô trùng vào giếng thạch còn lại để làm đối chứng âm. Ủ đĩa ở nhiệt độ

phòng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng

thạch, và 20 l môi trƣờng PG vô trùng vào giếng thạch còn lại để làm đối chứng âm.

Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Đối chứng dƣơng: Hút 20 l chất kháng sinh chloramphenicol 20mg/ml giếng

thạch trên đĩa NA đã quét vi khuẩn.

Đối chứng âm: Hút 20 l môi trƣờng PG vô trùng có bổ sung Tween 80 đã chuẩn

bị trƣớc đó cho vào giếng thạch ở giữa đĩa môi trƣờng NA.

Đọc kết quả thí nghiệm:

______________________________45______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ hình thành những vòng trong suốt

quanh giếng thạch.

Nếu không xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ không hình thành những vòng

trong suốt quanh giếng thạch.

Khả năng kháng khuẩn đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn,

khả năng kháng khuẩn càng tốt

Trong đó :

D: đƣờng kính vòng phân giải (mm)

d: đƣờng kính giếng thạch (mm)

2.4.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm

Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng

khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trƣờng thạch. Phƣơng

pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Nấm bệnh – Colletotrichum sp., Fusarium sp.

Pha môi trƣờng PDA bổ sung thêm kháng sinh, vô trùng que cấy thẳng, tiến hành

cấy điểm nấm bệnh từ môi trƣờng thạch nghiêng sang môi trƣờng PDA có bổ sung

kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục thạch có đƣờng kính 5 mm

cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày

ở nhiệt độ phòng.

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng lỏng PG vô trùng, ủ tối

và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong

4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/ phút,

ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450

NaOH 1N để đƣa về pH = 7.

Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ly tâm 10.000

vòng/phút trong 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu dịch canh trƣờng đã

______________________________46______________________________

Đồ án tốt nghiệp

xƣ lí đƣợc vô khuẩn. Tiến hành pha loãng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ pha

loãng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02%

Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha loãng dịch canh trƣờng thành

dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha

loãng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 %

Tiến hành kháng nấm:

Chuẩn bị môi trƣờng PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 7mm. Vô trùng cây đục

thạch và đục lấy khối thạch với đƣờng kính 5mm có sinh khối nấm từ đĩa PDA phía

trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA nhƣ hình 2.8.

Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ

Nấm bệnh

phòng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng

thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA

Đọc kết quả thí nghiệm:

______________________________47______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị

ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn

lạc ở đĩa đối chứng

Nếu không xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí

nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng.

Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)

Đọc kết quả thí nghiệm:

Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị

ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn

lạc ở đĩa đối chứng

Nếu không xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí

nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng.

Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)

( )

Trong đó: đƣờng kính khuẩn lạc bằng đƣờng kính sau khi đo trừ đi đƣờng kính

khối thạch

2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá

Sâu thí nghiệm – sâu khoang Spodoptera litura.

Sâu khoang đầu tuổi 3 đƣợc chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lƣợng cả 30 con

rồi cho vào hộp có thể tích 950ml. Các hộp nuôi sâu đã đƣợc thanh trùng. Lặp lại 24

hộp

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng lỏng PG vô trùng, ủ

tối và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2

trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/

phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450

______________________________48______________________________

Đồ án tốt nghiệp

NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành pha loãng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng

độ pha loãng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 %

Tiến hành thí nghiệm.

Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012) Phƣơng pháp

này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo

sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng SH1.

Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 10 (cm2). Hút

100 l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng

độ pha loãng lên lá thầu dầu. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu

chết và trọng lƣợng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72

giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều

100 canh trƣờng PG vô trùng đƣợc bổ sung 450 HCl 1N, 450 NaOH 1N và

Tween 80 0,02%

Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều

100 thuốc trừ sâu Reasgant với Abamectin 1,8%. Abamectin là thuốc trừ sâu sinh

học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) đƣợc

phân lập từ quá trình lên men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis. Thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC đƣợc pha loãng để đạt nồng độ 6 ng/cm2.

Đọc kết quả kháng sâu:

Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian để

đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott

(1925).

2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trường sau xử lí

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

______________________________49______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng PG vô trùng, ủ tối

và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2

trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/

phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450

NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành hút 5ml canh trƣờng ra các ống nghiệm vô trùng, đặt tại các điểm môi trƣờng khảo sát: 2oC, nhiệt độ phòng và nhiệt độ ngoài trời,

tại mỗi điểm khảo sát, chia nhóm ống nghiệm thành 2 nghiệm thức nhỏ: canh trƣờng ở

điều kiện tối và canh trƣờng ở điều kiện ánh sáng, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần.

Nhỏ thêm 100 Tween 80 1%. Tiến hành đo OD499 ở các môi trƣờng khảo sát sau 24

giờ, theo dõi trong vòng 7 ngày.

2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu của chế phẩm

2.4.5.1 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invitro

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng PG vô trùng, ủ tối

và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2

trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/

phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450

NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành pha loãng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng

độ pha loãng. Sau đó, hút 100 Tween 80 0,02 % , 100 rỉ đƣờng 1%, 100 dịch

CMC 1%.

Tiến hành thí nghiệm.

Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012) Phƣơng pháp

này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo

sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hoá của hợp chất phrodigiosin của chủng SH1

Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 10 (cm2). Hút

100 l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng

______________________________50______________________________

Đồ án tốt nghiệp

độ pha loãng lên lá thầu dầu. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu

chết và trọng lƣợng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72

giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều

100 canh trƣờng PG vô trùng đƣợc bổ sung 450 HCl 1N, 450 NaOH 1N và

Tween 80 0,02% và bổ sung rỉ đƣờng 1%, dịch CMC 1%.

Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều

100 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã đƣợc pha loãng đạt nồng độ 6 ng/cm2.

Đọc kết quả kháng sâu:

Dựa vào số lƣợng sâu khoang Spodoptera litura chết ở từng mốc thời gian để

đánh giá hiệu quả diệt sâu của hợp chất. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott

(1925).

2.4.6. Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản chế phẩm

Chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin:

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong môi trƣờng PG vô trùng, ủ tối

và lắc 150 vòng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa pH về bằng 2

trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/

phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450

NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Hút 5 ml canh trƣờng cho vào ống nghiệm vô trùng.

Tiến hành đo OD499 của dịch canh trƣờng. Sau đó, hút 100 Tween 80 1 % , 100 rỉ

đƣờng đậm đặc, 5 ml dịch CMC 1%.

Tiến hành thí nghiệm:

Chế phẩm đƣợc chia ra ở các điều kiện: môi trƣờng ngoài trời, môi trƣờng nhiệt độ phòng, môi trƣờng tủ mát, môi trƣờng nhiệt độ cao (60oC), môi trƣờng đông lạnh để

theo dõi khả năng bảo toàn lƣợng prodigiosin sau khi tạo chế phẩm theo thời gian.

Theo dõi trong 7 ngày, tiến hành thu mẫu chế phẩm. Dùng phƣơng pháp trích ly lỏng –

______________________________51______________________________

Đồ án tốt nghiệp

lỏng để thu hồi lƣợng prodigiosin có trong chế phẩm, đo OD 535 nm trong dung môi

ethanol:HCl tỉ lệ 1:1.

Ở mỗi nghiệm thức môi trƣờng bảo quản lặp lại 3 lần.

Đọc kết quả:

Thay giá trị OD535 vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin Y = 1,1003X + (mg/ml) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 0.0041 và đƣợc tính theo công thức

2012).

Tính tỉ lệ prodigiosin còn lại trong chế phẩm theo công thức:

Trong đó: C1: lƣợng prodigiosin có trong chế phẩm (mg/ml)

C: lƣợng prodigiosin có trong canh trƣờng lên men ban đầu (mg/ml)

______________________________52______________________________

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ

phương pháp xử lí acid HCl 1N

Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố phần lớn gắn liền với màng ngoài tế bào vi

khuẩn Gram âm Serratia marcescens. Dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng

cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi

kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Chất này thể hiện hoạt tính

diệt sâu nhƣ đã trình bày trong phần tổng quan. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch

một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém, vì vậy đề tài

này muốn sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản

xuất chế phẩm diệt sâu. Tuy nhiên Serratia marcescens đƣợc báo cáo có thể gây bệnh

cơ hội và là vi khuẩn phát triển rất mạnh trong nhiều hệ sinh thái khác nhau, vì vậy

những thí nghiệm trong mục này nhằm mục tiêu tiêu diệt tế bào mà không ảnh hƣởng

lên hoạt tính sinh học của prodigiosin và các hoạt tính sinh học khác của tế bào nhƣ

enzyme ngoại bào có thể tác động hỗ trợ diệt sâu nhƣ protease, lipase, chitinase. Hai

phƣơng pháp khả thi, rẻ tiền là xử lý acid hoặc xử lý nhiệt dịch nuôi cấy.

Để thực hiện cho mục đích tạo chế phẩm trừ sâu, bƣớc đầu tiên phải xử lí đƣợc số

tế bào sống trong canh trƣờng lên men. Vì chủng vi khuẩn Serratia marcescenns SH1

đƣợc biết là chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội bệnh viện có khả năng gây hại cho cơ thể

con ngƣời và động vật máu nóng, với phƣơng thức lây truyền của vi khuẩn này bằng

cách trực tiếp hoặc bằng ống thông. Serratia marcescens có thể gây nên bệnh viêm

phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu,

nhiễm trùng mắt. Việc tìm ra biện pháp xử lí nhằm tiêu diệt 100% tế bào sống của vi

khuẩn là một bƣớc quan trọng để đảm bảo tính an toàn cho chế phẩm trừ sâu.

______________________________53______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Dựa trên sự ảnh hƣởng của nồng độ ion H+ lên thành tế bào vi khuẩn, tiến hành

xử lí acid HCl 1N đƣa môi trƣờng về pH 1 hoặc pH 2 để tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn

đồng thời chọn ra thời điểm thích hợp để thu hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng

lên men đạt giá trị nồng độ cao nhất có thể.

Kết quả trang dịch canh trƣờng sau xử lí trên môi trƣờng thạch PGA sau mỗi mốc

thời gian cho thấy:

Tại 2 giờ xử lí với acid HCl 1N, không thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của

chủng vi khuẩn Serratia marcescens. Để khẳng định vi khuẩn khảo sát đã chết tại pH 1

trong 2 giờ xử lí hay pH môi trƣờng chỉ tạm thời làm chậm sự phát triển của vi khuẩn.

Tiến hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24h. Kết quả cho thấy qua 48h trong điều kiện

không có ánh sáng, các đĩa môi trƣờng PGA đã có sự xuất hiện các khuẩn lạc hình

tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Nhƣ vậy, do pH môi trƣờng bị thay đổi đột ngột về

pH acid (pH 1) đã làm mất cân bằng ion giữa trong và ngoài màng tế bào do đó làm

chậm sự phát triển của vi khuẩn. Vì Serratia marcescens thuộc họ Enterobacteriaceae,

họ vi khuẩn đƣờng ruột nên có khả năng sống sót trong điều kiện môi trƣờng, nên việc

xử lí acid HCl 1N trong 2 giờ không khả thi trong việc tiêu diệt tế bào vi khuẩn.

Tiến hành xử lí acid HCl 1N tại môi trƣờng acid pH 2, các đĩa PGA không xuất

hiện khuẩn lạc trong 24h ủ tối, và chỉ xuất hiện các khuẩn lạc đặc trƣng khi ủ 48h. Vì

Serratia marcescens có thể bị ức chế trong môi trƣờng acid vì đột ngột bị hạ pH 2. Dù

là pH 1 hoặc pH 2 nhƣng với thời gian xử lí ngắn chỉ làm chậm sự phát triển của vi

khuẩn và giết chết vi khuẩn một phần. Kết quả của việc xử lí acid HCl 1N trong 2 giờ

tại pH 1 và pH 2 là không khả thi cho việc tiêu diệt tế bào sống của chủng Serratia

marcescens SH1.

Xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, không thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của

chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1. Để tránh sai lầm trong việc xử lí acid và

chắc chắn vi khuẩn khảo sát đã chết tại pH 1 trong 4 giờ xử lí hay pH môi trƣờng chỉ

tạm thời làm chậm sự phát triển của vi khuẩn nhƣ xử lí pH 1 và pH 2 trong 2h. Tiến

______________________________54______________________________

Đồ án tốt nghiệp

hành ủ tối các đĩa PGA thêm 24h. Kết quả cho thấy qua 48h trong điều kiện không có

ánh sáng, các đĩa môi trƣờng PGA không có xuất hiện các khuẩn lạc hình tròn, lồi,

bóng và có màu đỏ đậm. Nhƣ vậy, pH môi trƣờng bị thay đổi đột ngột về pH acid (pH

1) và trong thời gian dài đã làm mất cân bằng ion giữa trong và ngoài màng tế bào,

đồng thời làm biến tính các protein xuyên màng đính trên màng tế bào làm tế bào

không trao đổi chất đƣợc dẫn đến sự tử vong của tế bào. Dù Serratia marcescens có

khả năng sống sót trong điều kiện môi trƣờng acid nhƣng điều kiện sống tối ƣu của vi khuẩn này là ở 27oC và pH 7, nên việc xử lí acid HCl 1N trong 4h đã đủ thời gian giết

chết tế bào vi khuẩn chủng Serratia marcescens SH1.

Tiến hành xử lí acid HCl 1N trong 4h tại môi trƣờng acid pH 2, các đĩa PGA

không xuất hiện khuẩn lạc trong 24h ủ tối, và không xuất hiện các khuẩn lạc đặc trƣng

khi ủ 48h. Vì Serratia marcescens có thể thích nghi đƣợc với môi trƣờng acid nhƣng

pH môi trƣờng aicd hóa đã làm ảnh hƣởng khả năng thầm thấu của màng và làm biến

tính các protein xuyên màng nên hoạt động trao đổi chất của tế bào không thế diễn ra.

Dù là pH 1 hoặc pH 2 với thời gian xử lí hợp lí là 4 giờ chỉ làm chậm sự phát triển của

vi khuẩn và giết chết vi khuẩn một phần. Kết quả của việc xử lí acid HCl 1N trong 2

giờ tại pH 1 và pH 2 là khả thi cho việc tiêu diệt tế bào sống của chủng Serratia

marcescens SH1. Và vi khuẩn tiết ra hoạt chất prodigiosin, là sản phẩm thứ cấp, để

chống lại điều kiện khắc nghiệt của môi trƣờng sống nên màu canh trƣờng lên men của

2 nghiệm thức pH 1 và pH 2 tại 4 giờ có màu sắc đậm nhất trông 6 nghiệm thức thí

nghiệm.

Tại 24 giờ xử lí với acid HCl 1N, không thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc trƣng của

chủng vi khuẩn Serratia marcescens khi các đĩa petri đã trang 0,1 ml canh trƣờng đã

xử lí trong môi trƣờng thiếu anh sáng với thời gian ủ là 48h. Nhƣ vậy, pH acid (pH 1)

của môi trƣờng đƣợc duy trì trong 24h đã làm ảnh hƣởng đến khả năng thẩm thấu của

màng tế bào dẫn đến hoạt động trao đổi chất ở tế bào không xảy ra. Do đó, tế bào bị tử

______________________________55______________________________

Đồ án tốt nghiệp

vong. Mặc dù, Serratia marcescens có khả năng sống sót trong điều kiện môi trƣờng

acid.

Tiến hành thí nghiệm xử lí acid HCl 1N trong 24h tại pH 2, cho kết quả tƣơng

đồng với nghiệm thức xử lí acid tại pH 1. Khi ủ các đĩa thạch môi trƣờng PGA đã trang

canh trƣờng lên men đã qua xử lí trong tối với thời gian 48h; kết quả cho thấy ở tất cả các đĩa đƣợc trang canh trƣờng lên men đã qua xử lí ở các nồng độ pha loãng 100, 10-1 và 10-2 không thấy các khuẩn lạc tròn lồi, màu đỏ đậm xuất hiện. Do pH acid (pH 2)

của môi trƣờng đƣợc duy trì trong 24h đã làm ảnh hƣởng đến khả năng thẩm thấu của

màng tế bào dẫn đến hoạt động trao đổi chất ở tế bào không xảy ra. Do đó, tế bào bị

tử vong.

ĐC2h

A1

B1

A2

B2

ĐC4h

ĐC24h

B3

A3

Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại

______________________________56______________________________

Đồ án tốt nghiệp

các thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 ĐC2h, ĐC4h, ĐC24h là đối chứng tại 2h, 4h và 24h

A1, A2, A3: pH = 1 tại 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ xử lí với acid HCl 1N

25.000

a

a

b

20.000

b

b

bc

c

B1, B2, B3: pH = 2 tại 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ xử lí với acid HCl 1N

h n

bc

ỉ

bc

15.000

h c u ệ i

2 giờ

4 giờ

10.000

24 giờ

h 9 9 4 D O

5.000

0.000

pH 1

pH 2

Đối chứng

Hình 3.2. Nồng độ prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng thời điểm

Dựa vào kết qua đo giá trị OD 499nm (Mekhael và Yuosif, 2009) và phầm mềm xử

lí số liệu với khoảng tin cậy là 95%. Tại từng thời điểm xử lí với acid HCl 1N, cho kết quả: ở pH 1 tại 24 giờ xử lí (19,99a), cao thứ 2 là ở pH 2 tại 24 giờ xử lí (18,05b) và cao thứ 3 là ở pH 2 tại 4 giờ xử lí (18,00b).

Nhƣ vậy, việc xử lí acid trong 4 giờ là thời gian thích hợp cho việc tiêu diệt tế

bào vi khuẩn. Đến đây, có thể kết luận việc xử lí acid HCl 1N ở pH 2 trong 4 giờ là

nghiệm thức hợp lí cho việc tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1.

Để xác định khả năng sản sinh prodigiosin của chủng SH1, ta tính theo công thức

(Mekhael và Yuosif, 2009):

⁄ [ ( )]

Trong đó:

______________________________57______________________________

Đồ án tốt nghiệp

OD499: độ hấp thụ của sắc tố

OD620: độ hấp thụ của tế bào

1,381: hằng số

Lƣợng prodigiosin sau 48h tăng sinh đƣợc đem xử lí với acid HCl 1N tại 3 thời

điểm 2h, 4h và 24h. Tại mỗi thời điểm tiến hành đo giá trị OD499nm và

OD620nm(Mekhael và Yuosif, 2009). Ở cùng thời điểm, lƣợng prodigiosin ở 2 giá trị pH

1 và pH 2 lần lƣợt là tại 2h xử lí là 5043,2 và 4463,4 so với đối chứng là 3819,8. Có

thể nhìn nhận khách quan là khi hạ pH đột ngột làm vi khuẩn tiết hợp chất thứ cấp

prodigiosin để chống chịu với môi trƣờng. Tại 4h xử lí ở pH 1 là 6069,0 và pH 2 là

5876,1 so với đối chứng ở cùng thời điểm là 4529,1. Tại nghiệm thức xử lí 24h khi đƣa

pH về pH 2 và pH1 cho thấy số đơn vị prodigiosin do tế bào vi khuẩn tiết ra là 6760,1

và 7111,7 so với đối chứng ở cùng thời điểm là 5197,3. Điều này chứng minh, ở giá trị

pH càng thấp vi khuẩn càng sản sinh ra prodigiosin. Vì môi trƣờng bị đột ngột thay đổi

về pH thấp nên vi khuẩn sản sinh prodigiosin càng nhiều để chống chịu với môi

trƣờng, nhƣng do pH quá thấp làm cho tế bào vi khuẩn mất cân bằng ion trong và ngoài

tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt . (xem bảng 1 phụ lục B)

______________________________58______________________________

Đồ án tốt nghiệp

25

20

h n

ỉ

15

2h

h c u ệ i

4h

10

24h

h D O

5

0

OD 499nm OD 620nm OD 499nm OD 620nm OD 499nm OD 620nm

Đối chứng

pH1

pH2

Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng

nghiệm thức

Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1.

Giờ Đối chứng pH 1 pH 2

2h 3819,8 5043,2 4463,1

4h 4529,1 6069,0 5876,1

24h 5197,3 7111,7 6760,1

3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens

từ phương pháp xử lí nhiệt độ

Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đổ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ

cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn Serratia marcescens, và đƣợc

nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học này vào cuộc sống.Tuy

______________________________59______________________________

Đồ án tốt nghiệp

nhiên, chủng S. mercescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh cơ hội ở

ngƣời (Scheurlen, 1960), S. marcescens thƣờng gây nhiễm trùng ở bệnh viện, nhƣ

nhiễm trùng phổi và tiết niệu, viêm xoang, viêm tai giữa, viêm tâm nội mạc, nhiễm

trùng huyết, và nhiễm trùng da do S. marcescens là rất hiếm

Theo báo cáo của Nguyễn Hoàng Anh Kha (2009), hợp chất prodigiosin không bị biến tính tại khi ở nhiệt độ dƣới 100oC. Dựa vào kết quả trên, tiến hành xử lí canh trƣờng S.marcescens ở các nhiệt độ 50oC, 65oC và 80oC nhằm khảo sát mức nhiệt độ

cùng khoảng thời gian thích hợp để tiêu diệt vi khuẩn S.marcescen. Thí nghiệm nhằm

tạo môi trƣờng nghiên cứu an toàn bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt canh trƣờng sau tăng

sinh vi khuẩn SH1, đảm bảo vi sinh vật chết hoàn toàn, đồng thời khảo sát sự ảnh

hƣởng của quá trình xử lý nhiệt nào sẽ thu nhận nhiều sắc tố thô nhất.

Kết quả nhận đƣợc từ đĩa môi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 50oC, sau khi ủ tối suốt 24h có sự xuất hiện những khuẩn

lạc hình tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Có thể thấy, vi khuẩn SH1 có khả năng sống sót ở mức nhiệt khá cao là 50oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin là 1,200b.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là

không khả thi.

Kết quả nhận đƣợc từ đĩa môi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 65oC, sau khi ủ tối suốt 24h không có sự xuất hiện những

khuẩn lạc hình tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Có thể thấy, vi khuẩn bị tiêu diệt ở mức nhiệt 65oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin đo đƣợc là 1,287a.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là khả thi.

Kết quả nhận đƣợc từ đĩa môi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 80oC, sau khi ủ tối suốt 24h không sự xuất hiện những

khuẩn lạc hình tròn, lồi, bóng và có màu đỏ đậm. Có thể thấy, vi khuẩn SH1 bị tiêu diệt hoàn toàn năng ở mức nhiệt cao là 80oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin

______________________________60______________________________

Đồ án tốt nghiệp

đo đƣợc là 1,122c .Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 80oC để tiêu diệt

tế bào là là khả thi.

Vì mục đích cuối cùng là tạo đƣợc chế phẩm diệt sâu với quy mô sản xuất công nghiệp, nên xử lí canh trƣờng lên men bằng phƣơng pháp nhiệt ở 65oC, 15 phút là biện

pháp hợp lí, giảm đƣợc hao mòn vật tƣ sau này.

Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid trƣợc trang trên đĩa môi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối.

3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Đa phần các bộ phận trên cơ thể côn trùng đƣợc cấu tạo bởi 3 thành phần là lipit,

protein và chitin. Vì vậy canh trƣờng sau lên men thu hồi đƣợc lƣợng prodigiosin cao –

là yếu tố độc lực. Để hoạt tính của prodigiosin trong chế phẩm sau này hoạt động tối

ƣu thì cần có sự hỗ trợ từ các enzyme ngoại bào nhƣ lipase, protease hay chitinase.

3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí acid

Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên môi trƣờng thạch Tween 20 là sự hình

thành vòng tủa trắng đục do khả năng phân giải lipit của enzyme lipase có mặt trong

canh trƣờng lên men. Tween 20 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với ion Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh giếng thạch có màu

trắng đục. Tại các giếng thạch đƣợc bơm trực tiếp canh trƣờng lên men vi khuẩn mà

không qua ly tâm loại bỏ tế bào có sự xuất hiện vòng tủa trắng đục. Kết quả này tƣơng

______________________________61______________________________

Đồ án tốt nghiệp

đồng với các giếng bơm dịch ly tâm. Điều này giúp khẳng định lại thí nghiệm xử lí

acid để tiêu diệt tế bào vi khuẩn là hoàn toàn khả thi.

Thí nghiệm định tính protease tiến hành trên môi trƣờng Casein khi cho kết quả

enzyme protease gần nhƣ không bị ảnh hƣởng, cho vòng phân giải rất lớn. Khi nhỏ

TCA 10% lên môi trƣờng thấy sự xuất hiện vòng tròn trong suốt xung quanh giếng

thạch, và môi trƣờng chung quanh hóa đục, đây là phức hợp TCA – casein do enzyme

protease có mặt trong canh trƣờng lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải casein

trong môi trƣờng nên TCA tạo phức với casein. Vòng tròn trong suốt dễ dàng quan sát

đƣợc.

Tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy khi

hạ pH môi trƣờng về khoảng acid (pH = 1 hay pH = 2) để diệt tế bào vi khuẩn đã làm

ảnh hƣởng đến enzyme chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả

năng phân giải chitin trong môi trƣờng.

Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm:

lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH môi trƣờng từ trung

tính (pH 7 0,5) về acid (pH = 2) không gây ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme

protease. Enzyme lipase của vi khuẩn không giữ đƣợc hoạt tính mạnh nhƣ ban đầu,

nhƣng khả năng thủy phân lipit của enzyme này đƣợc bảo toàn đƣợc một phần trong

môi trƣờng acid khi xử lí. Chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin sau này sẽ hoàn hảo hơn

nếu giữ đƣợc enzyme ngoại bào chitinase, nhƣng pH môi trƣờng acid khi xử lí đã làm

mất hoạt tính phân giải chitin của enzyme này. Tóm lại, 2 trong 3 enzyme ngoại bào là

lipase và protease đã giữ đƣợc hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N.

______________________________62______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.2. Khả năng bảo toàn các enzyme trong canh trƣờng lên men bằng phƣơng

pháp xử lí acid.

Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm

trên môi trƣờng tƣơng ứng Hệ số STT pha loãng Casein agar Tween 20 Chitin agar

agar

1 21 0 28,3 1,5 15,7 2,9

2 22 0 27,3 0,6 13,3 1,2

3 23 0 28,3 3,9 12,3 1,5

4 24 0 0 25,3 2,5

5 25 0 0 17,0 14,8

______________________________63______________________________

Đồ án tốt nghiệp

A1

B1

C1

A2

B2

C2

A3

B3

C3

B4

C4

A4

A5

C5

B5 1

Hình 3.5. Khả năng bảo toàn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí A1, A2, A3, A4, A5: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha loãng : 21, 22, 23, 24, 25 B1, B2, B3, B4, B5: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25

______________________________64______________________________

Đồ án tốt nghiệp

C1, C2, C3, C4, C5: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25

3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí nhiệt độ

Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên môi trƣờng thạch Tween 20 cho thấy việc xử lí canh trƣờng ở 65oC đã làm mất đi hoạt tính phân giải lipit của enzyme lipase. Vì

vậy, xung quanh giếng thạch không có sự xuất hiện của vòng tủa trắng đục.

Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm:

lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy xử lí canh trƣờng lên men vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhiệt, tại mức nhiệt 65oC đã gây ảnh hƣởng một phần đến hoạt tính của

enzyme protease. Enzyme lipase và chitinase của vi khuẩn bị biến tính hoàn toàn.

Tóm lại, với thí nghiệm định tính enzyme đƣợc tiến hành ở phƣơng pháp xử lí

nhiệt và phƣơng pháp xử lí acid nhằm khảo sát khả năng bảo toàn hoạt tính của các

enzyme ngoại trong canh trƣờng xử lí.

Kết quả cho thấy phƣơng pháp xử lí acid có ƣu điểm bảo toàn đƣợc hoạt tính của

2 trong 3 enzyme ngoại bào là lipase và protease so với phƣơng pháp xử lí nhiệt.

Bảng 3.3. Khả năng bảo toàn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng

pháp xử lí nhiệt.

Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm Hệ số trên môi trƣờng tƣơng ứng STT pha loãng Casein agar Tween 20 agar Chitin agar

1 21 0 0 19,3 0,6

0 2 22 0 17,7 1,2

0 3 0 14,7 0,6

4 0 0 0

5 23 24 25 0 0 0

______________________________65______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.6. Khả năng bảo toàn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí A1, A2, A3,: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23

A1

B1

C1

B2

A2

C2

A3

B3

C3

B1, B2, B3,: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23 C1, C2, C3,: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23

Sau đây phƣơng pháp xử lý acid dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens đƣợc

chọn để khảo sát hoạt tính sinh học của prodigiosin dƣới dạng chƣa trích ly bằng dung

môi.

______________________________66______________________________

Đồ án tốt nghiệp

3.4 Khả năng kháng khuẩn

3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của prodigiosin từ phương pháp xử lí acid

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi khuẩn

(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả

năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA

gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi

khuẩn (Ramina và Samira,2009).

Kết quả kháng khuẩn cho thấy dịch nuôi cấy S. marcescens xử lý acid khả năng kháng

khuẩn cả vi khuẩn Gram âm E.coli và Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dƣơng

(Bảng 3.4 và hình 3.7)

Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt

chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men.

Khả năng kháng khuẩn

STT Hệ số pha loãng Vòng kháng khuẩn Vòng kháng khuẩn S.

E.coli (D – d) mm aureus (D – d) mm

1 21 6,7 1,1 8 0,0

2 5,7 2,5 7,7 0,6

0 0 3

0 0 4

0 0 5 22 23 24 25

______________________________67______________________________

Đồ án tốt nghiệp

B

A

Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli(A) và Staphylococcus aureus(B)

của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí.

3.5 Hoạt tính kháng nấm

Nấm Fusarium sp. và Collectotrichum sp. là hai loài nấm bệnh gây hại cho cây

trồng rất thƣờng gặp và gây thiệt hại về kinh tế rất nghiêm trọng.

Prodigiosin sau khi tinh sạch một phần bằng trích ly lỏng lỏng không thể hiện

hoạt tính kháng nấm. Dịch nuôi cấy S. marcescens sau khi xử lý acid còn giữ lại một

phần hoạt tính protease, mặc dù đã mất hoạt tính chitinase có thể hiện hoạt tính kháng

nấm không? Đó là lý do vì sao thí nghiệm này đƣợc tiến hành.

3.5.1 Khả năng kháng nấm của prodigiosin từ phương pháp xử lí aci

Kết quả kháng nấm Fusarium sp. và Collectotrichum sp. cho thấy enzyme chitinase

vốn có của vi khuẩn vẫn tồn tại trong canh trƣờng đã xử lí, đã ức chế việc phát tiển của

tơ nấm Fusarium sp., nhƣng canh trƣờng đã xử lí khả năng ức chế đối với nấm bệnh

Collectotrichum sp là không cao.

______________________________68______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí

Nấm bệnh Fusarium sp.

Đối chứng dƣơng Fusarium sp. – canh trƣờng

đã xử lí

Đƣờng kính vòng nấm 47 2,2 22,7 2,5

(mm)

Tỉ lệ ức chế (%) 53,19 5,6

______________________________69______________________________

Đồ án tốt nghiệp

ĐC

ĐC

Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối chứng

3.6 Hiệu lực diệt sâu

Sâu khoang Spodoptera litura là loài ăn tạp, phá hoại trên nhiều cây kí chủ khác

nhau nhƣ: rau muống, cây họ đậu, cải ngọt,... Việc thử canh trƣờng lên men có chứa

prodigiosin lên loài sâu này giúp mở ra một bƣớc phát triển mới về chế phẩm trừ sâu

sinh học từ hợp chất thứ cấp của vi khuẩn.

3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trường lên men đã qua xử lí

______________________________70______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quét lá với các

nồng độ riêng biệt để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất.

Tiến hành thử nghiệm với 1 đối chứng dƣơng là thuốc trừ sâu sinh học

REASGANT 3.6EC và 1 đối chứng âm là môi trƣờng PG broth vô trùng, cùng 6 nghiệm thức nồng độ pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6, theo dõi số lƣợng

sâu chết mỗi 24 tiếng trong vòng 6 ngày.

Kết quả cho thấy, với nồng độ pha loãng là 10-4 có nồng độ prodigiosin là 16,5 ng/cm2 cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, tƣơng đƣơng với khả năng kháng sâu của

thuốc trừ sâu sinh học Reasgant. Trong vòng 72h, tỉ lệ tử vong của sâu khoang đạt giá

trị 56,67 %. Đến ngày thứ 6 của thí nghiệm, số lƣợng sâu tử vong đạt 100%. So sánh

kết quả với khả năng diệt sâu khoang tuổi 3 đƣợc báo cáo trong đồ án của anh Nguyễn

Hoàng Anh Kha, 2009, thì nồng độ prodigiosin trong canh trƣờng đã qua xử lí thấp

hơn so với nồng độ prodigiosin đã thực hiện ở báo cáo của tác giả. Có thể thấy các

enzyme ngoại bào đã hỗ trợ cho quá trình kháng sâu của hợp chất prodigiosin.

______________________________71______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.9. Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu theo thứ tự pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6.

Hình 3.8 Sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid

Bảng 3.9. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3.

Tỉ lệ tử vong (%)

0h 24h 48h 72h 96h 120h

0.00 0.00 23.33 40.00 46.67 53.33

0.00 3.33 20.00 40.00 50.00 56.67

0.00 6.67 16.67 50.00 56.67 66.67 Nồng độ pha loãng 10-1 10-2 10-3

______________________________72______________________________

Đồ án tốt nghiệp

0.00 10.00 30.00 56.67 83.33 100.00

0.00 10.00 23.33 40.00 50.00 60.00

0.00 6.67 6.67 33.33 43.33 56.67 10-4 10-5 10-6

Khả năng diệt sâu của dịch nuôi cấy đã xử lí acid HCl 1N

120

100

)

%

80

2246.0 ng/cm2

1645.6 ng/cm2

60

164.6 ng/cm2

16.5 ng/cm2

( t ế h c u â s ệ

1.6 ng/cm2

40

l ỉ

T

0.2 ng/cm2

Thuốc trừ sâu (6ng/cm2)

20

0

2

6

8

0

4 Thời gian (ngày)

Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do canh trƣờng S.marcescens đã xử lí acid

(Abbout,1925)

3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm

Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quét lá với các

nồng độ riêng biệt để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất.

Tiến thử nghiệm với 1 đối chứng dƣơng là thuốc trừ sâu sinh học REASGANT

1.8EC và 1 đối chứng âm là môi trƣờng PG broth vô trùng có bổ sung Tween 80

0,02%, rỉ đƣờng 1 % và CMC 1 % , cùng 6 nghiệm thức chế phẩm ở nồng độ pha

______________________________73______________________________

Đồ án tốt nghiệp

loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 , theo dõi số lƣợng sâu chết mỗi 24 tiếng trong

vòng 6 ngày.

Kết quả cho thấy, với nồng độ pha loãng là 10-4 có nồng độ prodigiosin là 16,5

mg/ml cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, tƣơng đƣơng với khả năng diệt sâu của thuốc

trừ sâu sinh học Reasgant. Trong vòng 48h, tỉ lệ tử vong của sâu khoang đạt giá trị

56,67 %. Vì canh trƣờng đã xử lí đƣợc bổng sung vào rỉ đƣờng, CMC và Tween 80

giúp nâng cao khả năng kháng sâu khoang. Bổ sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám

của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát prodigiosin. Bên cạnh đó, loài sâu này thích

vị chua ngọt nên khi bổ sung rỉ đƣờng vào chế phẩm giúp kích thích sự khẩu vị của nó,

khi đƣợc tiêu hóa vào trong cơ thể lƣợng Tween bổ sung vào trong chế phẩm giúp

prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào giúp cho

hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn so với thử nghiệm diệt

sâu của canh trƣờng S.marcescens đã xử lí.

Hình 3.12Chế phẩm và các nồng độ pha loãng lần lƣợt 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6

Bảng 3.10Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3.

Tỉ lệ tử vong

Nồng độ pha 0h 24h 48h 72h 96h 120h

0.00 10.00 16.67 53.33 83.33 90.00 loãng 10-1

______________________________74______________________________

Đồ án tốt nghiệp

0.00 3.33 20.00 60.00 70.00 86.67

0.00 13.33 30.00 70.00 76.67 90.00

0.00 30.00 56.67 86.67 100.00 100.00

0.00 26.67 36.67 53.33 76.67 90.00

0.00 6.67 20.00 43.33 63.33 90.00 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Khả năng diệt sâu của chế phẩm

120.0

100.0

)

%

80.0

2246.0 ng/cm2

1645.6 ng/cm2

60.0

164.6 ng/cm2

16.5 ng/cm2

( t ế h c u â s ệ

1.6 ng/cm2

40.0

l ỉ

T

0.2 ng/cm2

Thuốc (6 ng/cm2)

20.0

0.0

0

1

2

3

4

5

6

7

Thời gian (ngày)

Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian (Abbott, 1925)

3.7 Xác định thời gian bảo quan canh trường S.marcescens đã xử lí

Tiến hành thí nghiệm bảo quản canh trƣờng nhằm xác định khoảng nhiệt độ cùng

thời gian làm prodigiosin bị biến tính để tìm ra hƣớng bảo quản chế phẩm trừ sâu tốt

hơn. Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở 3 môi trƣờng nhiệt độ khác nhau: ngoài trời, nhiệt độ phòng và nhiệt độ tủ mát (2oC).

Kết quả xử lí số liệu phần mềm SAS 9.0 và thống kê ANOVA, với kết quả tin cậy

là 95%. Cho thấy nồng độ của prodigiosin ở nghiệm thức ngoài sáng, giảm dần từ ngày

______________________________75______________________________

Đồ án tốt nghiệp

thứ 3 đến ngày thứ 7 của quá trình bảo quản. Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC và ngoài trời có hiệu suất bảo quản lần lƣợt là 94,2a và 90,3b, khác biệt có nghĩa. Và hiệu suất bảo quản tại nhiệt độ phòng 85,9b. (Hình 3.14)

Ở kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, nồng độ của prodigiosin ở

nghiệm thức trong tối, giảm dần từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 của quá trình bảo quản. Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC và ngoài trời có hiệu suất bảo quản lần lƣợt là 94,2a và 93,3a, không khác biệt có nghĩa. Và hiệu suất bảo quản tại nhiệt độ phòng 85,9b. (Hình

3.15)

Khả năng bảo quản dịch nuôi cấy đã xử lí (ngoài sáng)

120.0

)

100.0

%

i

80.0

i

i

60.0

Nhiệt độ 2oC

Nhiệt độ phòng

40.0

( n s o g d o r p ệ

Nhiệt độ ngoài trời

l ỉ

T

20.0

0.0

0

6

2 4 Thời gian (ngày)

Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí ở môi

trƣờng ngoài sáng

______________________________76______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng bảo quản dịch nuôi cấy đã xử lí (bao tối)

120.0

100.0

)

%

80.0

i

i

i

60.0

Nhiệt độ 2oC

Nhiệt độ phòng

40.0

( n s o g d o r p ệ

Nhiệt độ ngoài trời

l ỉ

T

20.0

0.0

0

1

5

6

4 3 2 Thời gian (ngày)

Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở môi trƣờng tối

Khi so sánh khả năng bảo quản canh trƣờng lên men trong 7 ngày giữa môi trƣờng trong tối và ngoài sáng thì kết quả cho thấy, ở điều kiện bảo quản là 2oC và

ngoài trời thì hiệu suất bảo quản là tốt nhất và không có khác biệt có nghĩa khi xử lí

bằng phần mềm SAS và ANOVA. Tuy nhiên, không loại trƣờng điều kiện khách quan

là nhiệt độ môi trƣờng, nên dẫn đến không khác biệt có nghĩa.

So sánh ở cùng nhiệt độ 2oC, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngoài sáng cho

kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ nhau và

không có sự khác biệt. (Hình 3.16)

So sánh ở cùng nhiệt độ phòng, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngoài sáng

cho kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ nhau và

không có sự khác biệt. (Hình 3.17)

So sánh ở cùng nhiệt độ ngoài trời, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngoài

sáng cho kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ

nhau và không có sự khác biệt. (Hình 3.18)

______________________________77______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Nhiệt độ 2oC

i ạ l

n ò c n i s o i g i

d o r P ệ l ỉ

T

108.0 106.0 104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 86.0

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Ngày thứ nhất Ngày thứ 3

Ngày thứ 5

Ngày thứ 6

Ngày thứ 7

Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng ở nhiệt độ 2oC

Nhiệt độ phòng

105.0

i ạ l

100.0

95.0

90.0

n ò c n i s o i g i

85.0

d o r p ệ l ỉ

80.0

T

75.0

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Ngày thứ nhất Ngày thứ 3

Ngày thứ 5

Ngày thứ 6

Ngày thứ 7

Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng ở nhiệt độ phòng

______________________________78______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Nhiệt độ ngoài trời

i ạ l

n ò c n i s o i g i

d o r p ệ l ỉ

T

104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 86.0 84.0

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Ngoài sáng

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Trong tối

Ngày thứ nhất Ngày thứ 3

Ngày thứ 5

Ngày thứ 6

Ngày thứ 7

Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin còn lại trong canh trƣờng ở ngoài trời

3.8 Xác định môi trường bảo quan chế phẩm.

Thí nghiệm đƣợc tiến hành với mục địc có thể bảo quản prodigiosin trong chế

phẩm càng ít biến tính và thất thoát do các yếu tố khách quan càn tốt, giúp đảm bảo

hoạt lực diệt sâu của chế phẩm.

Kết quả sau quá trình trích ly lỏng – lỏng thu đƣợc các kết quả. Ở nhiệt độ -20oC, thu nhận 8,184 mg/ml, đạt hiệu suất 38,16. Ở nhiệt độ tủ mát (2oC) thu nhận 20,016 mg/ml, đạt hiệu suất 93,32. Ở nhiệt độ phòng (37oC) thu nhận 18,228 mg/ml, đạt hiệu suất 84,99. Ở điều kiện môi trƣờng nhiệt độ 60oC thu nhận 7,808 mg/ml, đạt hiệu suất

36,40. Ở điều kiện môi trƣờng ngoài trời, chế phẩm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt

trời thu nhận 3,973 mg/ml, đạt hiệu suất 18,52. Tóm lại, hoạt chất prodigiosin đƣợc bảo quản tốt nhất ở điều kiện mát mẻ (2 1 oC); trong khi prodigiosin bị biến tính

trong điều kiện bảo quản là dƣới ánh sáng mặt trời (ngoài trời) và hoạt chất bị biến tính

đến 80% lƣợng prodiosin ban đầu.

______________________________79______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản.

Canh trƣờng vi khuẩn SH1 đƣợc xử lí với acid trong 4h, đƣợc đƣa về pH 7 và thêm các

phụ gia để tăng độ bám của prodigiosin trên lá (CMC 1%), tăng khả năng khuếch tán

của prodigiosin (Tween 80 0,02%) và giảm sự tiếp xúc trực tiếp của prodigiosin với

ánh sáng (rỉ đƣờng 1%). Vì vậy, chế phẩm sinh học diệt sâu ở nồng độ đậm đặc sẽ ở

trạng thái huyền phù, hơi sệch lại. Nếu đo trực tiếp canh trƣờng với OD 499 sẽ dẫn đến

sai số, ảnh hƣởng kết quả hiệu suất thu hồi. Vì vậy, tiến hành trích ly lỏng – lỏng canh

trƣờng đã xử lí với petroleum ether, đo ở OD 535.

Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm

______________________________80______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi tiến hành trích ly lỏng – lỏng, để thu lại prodigiosin còn lại trong chế

phẩm. Xử lí thống kê với phần mềm SAS và ANOVA với khoảng tin cậy 95%, kết quả

cho thấy sau 7 ngày bảo quản, nồng độ prodigiosin còn lại trong môi trƣờng nhiệt độ tử mát thì cao nhất 20,016a mg/ml, ở nhiệt độ phòng có lƣợng prodigiosin sau thu hồi là 18,228b mg/ml, và ở môi trƣờng ngoài trời có nồng độ prodigiosin sau thu hồi là thấp

nhất (Bảng 3.14). Có thể nói, chế phẩm sau khi bổ sung các chất phụ gia có khả năng bảo quản đƣợc 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) hoặc ở nhiệt độ phòng (30 3oC). Mặc dù bổ sung rỉ đƣờng giúp chế phẩm tránh ánh sáng trực tiếp, nhƣng tia

UV có trong tia nắng mặt trời làm biến tính gần nhƣ hoàn toàn prodigiosin khi để chế

phẩm ở môi trƣờng ngoài trời.

Bảng 3.14. Giá trị nồng độ prodigiosin sau 7 ngày bảo quản (mg/ml)

Trƣớc khi cho Bảo quản sau

phụ gia

21,449 7 ngày 8,184c 0,2 Nhiệt độ tủ đông (-20oC)

21,449 20,016a 0,5 Nhiệt độ mát (2oC)

21,449 Nhiệt độ phòng

21,449 18,228b 1,7 7,808d 0,1 Nhiệt độ 60oC

21,449 3,973e 0,1 Nhiệt độ ngoài trời

Dựa vào bảng 3.14, tính đƣợc hiệu suất bảo quản prodigiosin trong chế phẩm sau 7 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau là -18oC, 2oC, nhiệt độ phòng, 60oC và

ngoài trời. Từ đó chọn ra môi trƣờng bảo quản tốt nhất cho chế phẩm. Qua kết quả xử lí thống kê SAS và phân tích ANOVA, hiệu suất ở nhiệt độ 2oC là 93,319 2,3 là giá

trị hiệu suất bảo quản tốt nhất trong 5 điều kiện khảo sát, đạt giá trị tin cậy 95%. Hiệu

suất bảo quản ở nhiệt độ phòng cũng cho giá trị khá ổn ở mức 85 7,9. Đạt hiệu suất

thấp nhất trong 5 điều kiện bảo quản là nhiệt độ ngoài trời với 18,52 0,4. Do ảnh

______________________________81______________________________

Đồ án tốt nghiệp

hƣởng trực tiếp của tia mặt trời làm prodigiosin bị biến tính. Vậy nên, việc bảo quản chế phẩm tốt nhất nên ở nhiệt độ 2oC. (xem ở bảng 2 phụ lục B)

Khả năng bảo quản chế phẩm

100.00

90.00

i

ạ

l

80.00

70.00

i

60.00

i

50.00

i

40.00

30.00

n ò c n s o g d o r p ệ

l ỉ

20.00

T

10.00

0.00

Nhiệt độ phòng Nhiệt độ 60oC Nhiệt độ ngoài

Nhiệt độ tủ đông (-18oC)

Nhiệt độ mát (2oC)

trời

Điều kiện bảo quản

Hình 3.21. Hiệu suất bảo quản chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện môi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phòng, nhiệt độ ngoài trời và nhiệt độ cao (60oC)

______________________________82______________________________

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Sau khi canh trƣờng S.marcescens SH1 đƣợc xử lí nhiệt 65oC, 15 phút, tế bào vi

khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn và prodigiosin có giá trị OD 535 là 1,278; tuy nhiên các

enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lipase bị bất hoạt hoàn toàn và giữ lại một phần

enzyme protease.

Sau khi xứ lý canh trƣờng S.marcescens SH1 bằng HCl 1N về pH = 2 trong 4 giờ,

toàn bộ vi khuẩn cũng bị tiêu diệt, pH 1 và pH 2, tế bào của vi khuẩn Serratia

marcescens bị tiêu diệt hoàn toàn. Riêng pH2 có giá trị OD 499 của prodigiosin tại

thời điểm ngƣng xử lí với acid là 18,00. Khi canh trƣờng S.marcescens đƣợc xử lí bằng

phƣơng pháp acid có đƣợc ƣu điểm so với phƣơng pháp xử lí nhiệt là các enzyme

ngoại bào không bị biến tính. Vì vậy, phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N, đƣa về pH 2

trong 4 giờ xử lí là biện pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn khả thi và phù hợp để thu hợp

chất prodigiosin nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt sâu.

Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí có khả năng kháng nấm đối với nấm

Fusarium sp. với tỉ lệ ức chế là 53,19%,

Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí khả năng cạnh tranh lấn át với các vi

khuẩn gây bệnh Escherichia coli và Staphylococcus aureus.

Hiệu quả diệt sâu của canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens và chế phẩm sinh học diệt sâu tốt nhất ở nồng độ pha loãng là 10-4, tƣơng đƣơng nồng độ prodigiosin là 16,5 ng/cm2. Với canh trƣờng vi khuẩn đã qua xử lí acid, trong vòng 72h tỉ lệ sâu tử vong là

56,67% đến hết ngày thứ 5 thì tỉ lệ sâu tử vong đạt 100%. Đối với chế phẩm diệt sâu

sinh học, tỉ lệ tử vong ở sâu khoang tuổi 3 là 56,67% chỉ sau 48h cho ăn bằng phƣơng

pháp quét lá và đạt tỉ lệ tử vong 100% trong vòng 96h, có khả năng diệt sâu tƣơng

đƣơng với thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 3.6EC.

______________________________83______________________________

Đồ án tốt nghiệp

Cả canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí và chế phẩm sinh học trừ sâu có thể bảo quản

tốt ở nhiệt độ là 2oC, và nên tránh ánh sáng trực tiếp từ mặt trời.

Đối với canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí, tỉ lệ prodigiosin còn lại sau 7 ngày bảo quan đạt 94,2 ở cả hai môi trƣờng ủ tối và ngoài sáng tại nhiệt độ 2oC. Ở nhiệt độ

phòng, hiệu quả của việc bảo quản ở ngoài sáng và ủ tối là 85,7 và 85,9. Ở nhiệt độ môi trƣờng ngoài trời (30 3oC) khi ở ngoài sáng và ủ tối là 90,3 và 93,3.

Đối với chế phẩm, môi trƣờng bảo quản tốt nhất là 2oC với hiệu suất là 93,3, lần lƣợt ở các môi trƣờng nhiệt độ phòng là 84,9, nhiệt độ -18oC và 60oC là 38,6, 36,4; môi

trƣờng ngoài trời là 18,5.

Từ đây, có thể rút ra kết quả chung cho toàn bộ quá trình là sử dụng phƣơng pháp

xử lí acid HCl 1N, pH 2 trong 4 giờ để tiêu diệt hoàn toàn tế bào vi khuẩn. Khả năng diệt sâu khoang của canh trƣờng đã xử lí khi đƣợc pha loãng với nồng độ 10-4 để đạt

hiệu quả diệt sâu là tối ƣu. Đồng thời bảo quản canh trƣờng cũng nhƣ chế phẩm ở điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) vì đây là môi trƣờng nhiệt độ bảo quản tối ƣu.

2. Kiến nghị

Tiếp tục khảo sát khả năng diệt sâu của các chủng Serratia marcescens SB và

HB.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của chế phẩm lên thực vật, môi trƣờng.

Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu.

______________________________84______________________________

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:

Nguyễn Hiếu Dân (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia

marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng

prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn này, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công

nghệ TP. HCM.

Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp

bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học

Công nghệ TP. HCM.

Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai

(2013) Phân lập chủng vi khuẩn từ tuyến trùng EPN và khảo sát độc lực của

chúng trên sâu khoang Spodoptera litura, Báo cáo khoa học, P1 -16.

Nguyễn Hoài Hƣơng, Nguyễn Hoàng Anh Kha(2015) Khả năng diệt sâu khoang

Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng

EPN và hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển

KH & CN, tập 18.

Tài liệu tiếng Anh

Pryce L. Haddix* and Terry F. Werner (2000) Spectrophotometric Assay of Gene

Expression:Serratia marcescens Pigmentation.

Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin

from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid

Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol.

7 (2), pp. 32-38.

Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens

______________________________85______________________________

Đồ án tốt nghiệp

strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF

ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012

Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and

its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced

Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88.

Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial

Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49-61

Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and

production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC

Microbiology 2004, 4:11

Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review

of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological

Sciences 6 (1): 1-13, 2006

Helvia W. Casullo de Araújo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki (2010),

Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-

Resources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940

Tài liệu có nguồn từ Internet

http://bvtvld.gov.vn/quan-ly-thuoc-bao-ve-thuc-vat/tinh-hinh-su-dung-thuoc-bvtv/884-

dac-diem-cua-hoat-chat-abamectin.html

http://www.biocyc.org/META/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=PWY-

7547&detail-level=2&orgids=(AAEO224324%20ECOLI)#

http://www.bvtvhcm.gov.vn/document.php?id=51&cid=6

http://www.vietlinh.vn/giai-phap-sinh-hoc-huu-co/sinh-hoc-thuoc-tru-sau.asp

______________________________86______________________________