Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO

CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN

GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ,

TỈNH LÂM ĐỒNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện:

Phạm Thị Thảo

MSSV: 1151110516

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm

Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được

công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về

lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên

Phạm Thị Thảo

i

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức thật quý báu cho tôi trong suốt

quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Thầy đã luôn ở bên,

quan tâm, và giúp đỡ tôi trong việc gợi ra các ý tưởng trong quá trình làm luận văn

cũng như cung cấp các tài liệu và sách vở liên quan trong suốt quá trình nghiên cứu.

Ngoài ra tôi cũng xin cám ơn các bạn sinh viên trong nhóm của thầy như

Tâm, Hằng, Hồng Vân, Nhân, Vân Anh, Tuấn, Trí, Hiền và tất cả các bạn trong

phòng thí nghiệm của trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình

hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con

những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như

trong cuộc sống.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên

Phạm Thị Thảo

ii

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ................................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 1

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 1

4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................................. 2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………..……………………..............3

1.1. Sơ lược về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại vườn quốc gia Bidoup .............................................................................................. 3

1.1.1. Cây Podocarpus sp. ................................................................................ 3

1.1.2. Cây Polygala sp. ..................................................................................... 4

1.1.3. Cây Medinilla sp. .................................................................................... 5

1.1.4. Cây Elephantopus sp. ............................................................................. 6

1.1.5. Cây Eupatorium sp. ................................................................................ 7

1.2. Đại cương về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nước ................. 8

1.2.1. Carbohydrate .......................................................................................... 8

1.2.2. Flavonoid ................................................................................................ 9

1.2.3. Tannin ................................................................................................... 10

1.2.4. Alkaloid ................................................................................................. 11

1.2.5. Saponin ................................................................................................. 12

iii

Đồ án tốt nghiệp

1.2.6. Anthraglycoside .................................................................................... 13

1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật ......................... 15

1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật .................................... 15

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật .................... 16

1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ............................................................. 17

1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột .................................................. 17

1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ...................................................... 18

1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da .......................................................... 23

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 25

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................ 25

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25

2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ........................................................................ 25

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị .................................................................................. 25

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ....................................................................... 26

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 26

2.3.2. Hóa chất ................................................................................................ 26

2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27

2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc ................................. 27

2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị ........................ 27

2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực ............................................................................................................... 29 vật

2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu ..................................................................... 29

2.5. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 29

2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc ............................................................................................................... 30

2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc ................................................................................................. 32

2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian ....................................................................................... 33

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 38

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian ......................................................................................................................... 38

iv

Đồ án tốt nghiệp

3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian .................................................................................................... 39

3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc ..................................................................................................................... 50

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 54

4.1. Kết luận ........................................................................................................... 54

4.2. Đề nghị ............................................................................................................ 54

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl sulfoxide

pABA: p – aminobenzoic acid

mRNA: RNA thông tin

tRNA: RNA vận chuyển

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

vi

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao nước của một số loại cây

thuốc đối với một số chủng vi sinh vật .................................................................... 48

Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây

thuốc .......................................................................................................................... 51

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricartus ...................................................................... 3

Hình 1.2. Cây Polygala paniculata ............................................................................. 4

Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis ..................................................................... 5

Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis ............................................................................ 6

Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum .......................................................................... 7

Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và

nấm. ........................................................................................................................... 16

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm .............................................................. 30

Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc

dân gian ..................................................................................................................... 31

Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây

thuốc dân gian ........................................................................................................... 32

Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc .

Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian ............... 38

Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao chiết nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm

mẫu ............................................................................................................................ 38

Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp. .............. 39

Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp. ..... 41

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp. .................. 43

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp. ............... 45

Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp. .................. 47

Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD

(A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium

viii

Đồ án tốt nghiệp

sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và

cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2). ........................................................ 49

ix

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngay từ những ngày đầu khi xã hội loài người còn chưa phát triển, con người

đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngày

như làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một

trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Gần 150000

loài cây thuốc trong số 250000 – 300000 loài thực vật có hoa ở vùng nhiệt đới được

sử dụng làm cây thuốc, gần 5 % trong số cây thuốc đó được nghiên cứu thành phần

hóa học.

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên

cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bài

thuốc dân gian. Từ đó chiết suất tạo ra các dược phẩm có giá trị chữa bệnh có hiệu

quả. Do đó, việc điều tra các loại cây cỏ có tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm

dân gian là rất cần thiết.

Trong dân gian người ta thường sử dụng các loại cây cỏ để chữa bệnh bằng

cách sử dụng trực tiếp hoặc nấu nước uống để chữa các bệnh thông thường như tiêu

chảy, cảm mạo... Đối với các mẫu cây này người ta thường rửa sạch, sau đó cắt nhỏ

hoặc xay nhuyễn rồi đem đi nấu với nước trong nồi kín cho đến khi gần cạn rồi chắt

dịch cạn thu được để dùng . Do đó, người dân chủ yếu tách chiết các hợp chất trong

cây thuốc bằng dung môi là nước. Tuy nhiên, hiệu quả mang lại thật sự của phương

pháp này chưa thể chứng minh được hoạt tính thật sự của cây thuốc vì trong cây

thuốc có khá nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao không hòa tan được trong

nước. Vì thế, việc đánh giá hoạt tính của cao chiết nước của một số cây thuốc dân

gian đóng vai trò rất quan trọng.

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài "Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc của một số loại cây

thuốc dân gian tại Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng". Đề tài

1

Đồ án tốt nghiệp

này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm –

Môi trường, Trường ĐH Công nghệ Tp.HCM.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của các loại cây thuốc đối

với một số chủng vi sinh vật gây bệnh và bước đầu định tính thành phần hóa học

cao chiết nước của một số loại cây thuốc.

3. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của một số loại cây thuốc

dân gian

Bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước một số loại cây thuốc

dân gian.

4. Phạm vi nghiên cứu

Chỉ khảo sát một số cây thuốc dân gian như Podocarpus sp., Polygala sp.,

Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. thu được ở vườn quốc gia Bidoup

núi Bà – tỉnh Lâm Đồng.

Chỉ sử dụng một loại dung môi là nước

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lƣợc về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại

vƣờn quốc gia Bidoup

1.1.1. Cây Podocarpus sp.

1.1.1.1. Phân loại khoa học

 Giới: Plantae

 Ngành: Pinophyta

 Lớp: Pinopsida

 Bộ: Pinaes

 Họ: Podocarpaceae

 Chi: Podocarpus Hình 1.1. Cây Podocarpus imbricatus

1.1.1.2. Đặc điểm

Chi Podocarpus trong tiếng việt được gọi là chi thông tre. Có khoảng 105

loài thuộc chi này, thân của các loài trong chi có chiều cao từ 1 – 25 m, có thể lên

tới 40 m. Trong thân thường có nhựa mủ, lá của các loài thường là lá kim thon dài

như hình liềm hoặc tre trúc, dài từ 0,5 – 15 cm ( Farjon, 1998).

Podocarpus imbricatus là dạng cây gỗ lớn thuộc họ Kim giao

(Podocarpaceae), chi podocarpus. Cây cao tới 35 m, đường kính 50 – 70 cm có khi

tới 200 cm, thân thẳng, tròn, có nhiều cành xòe rộng, quả hơi vuông cạnh. Vỏ cây

có màu nâu đỏ, ghồ ghề, khi chặt chảy nhựa màu nâu nhạt, thịt vỏ màu da cam. Hoa

đực mọc ở nách lá dài 1 cm, hoa cái màu đỏ mọc trên đế nạc (Laub D, 1969).

Cây mọc rải rác trong rừng thường xanh ở các tỉnh Quảng Bình, Nghệ An,

Hà tĩnh, Gia Lai,.. Phân bố ở độ cao từ 300 – 1000 m, có khi xuống dưới 200 m.

Cây ưa sáng, nhưng lúc non cần che bóng, ưa ẩm ướt, tốt nhất là đất cát pha.

1.1.1.3. Công dụng

Cây có vị nhạt chát, có tác dụng tán nhiệt, sát trùng, chỉ dương. Có thể dùng

để trị cảm mạo và bệnh ngoài da… Ngoài ra lá thông còn có tác dụng trừ phong

3

Đồ án tốt nghiệp

thấp, sát trùng, kích thích mọc tóc nhanh, chữa bệnh cước khí (phù do thiếu vitamin

B1).

Gỗ nhẹ, không bền thường dùng để đóng đồ trong nhà, làm bột giấy…

1.1.2. Cây Polygala sp.

1.1.2.1. Phân loại khoa học

 Giới: Plantae

 Ngành: Magnoliophyta

 Lớp: Magnoliopsida

 Bộ: Fabales

 Họ: Polygalaceae

 Chi: Polygala

Hình 1.2. Cây Polygala paniculata 1.1.2.2. Đặc điểm

Polygalaceae là một họ thực vật có hoa, chúng gần như phân bố khắp thế

giới, có khoảng từ 17 – 20 chi, 900 – 1000 loài cây thân thảo, cây bụi và cây gỗ.

Khoảng một phần ba tổng số loài của họ này thuộc về chi Viễn chí (Polygala)

(Lüdtke và ctv, 2013).

Polygala paniculata L là một loài thuộc họ viễn chí Polygalaceae. Cây còn

được gọi là cây dầu nóng, cây thảo nhỏ hay bụi mảnh cao 30 – 40 cm. Đặc điểm dễ

nhận của cây là khi nhổ cây lên ngửi phần gốc rễ cây sẽ thơm mùi tinh dầu salicylat

methyl, thân cây mảnh không lông. Lá có phiến nhỏ hẹp 1,5 x 0,15 cm, đầu nhọn

mỏng không lông. Hoa có màu trắng nhỏ, cao 2 mm, không lông (Đỗ Tất Lợi,

2004).

Trên thế giới, Viễn chí lá nhỏ phân bố ở Nam Mỹ, châu Đại Dương, châu

Á… Ở nước ta thường gặp ven đường đi, đất hoang và có số lượng lớn ở Lâm Đồng

Thành phần hóa học: Rễ chứa nhiều tinh dầu có salicylat methyl nên có mùi

rất thơm, saponin…

4

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.3. Công dụng

Cây có vị đắng the, có tác dụng an thần, ích trí, khan đàm, hoạt huyết, trị sổ

mũi. Ngoài ra saponin có trong dược liệu sẽ kích thích sự bài tiết niêm dịch ở khí

quản, có tác dụng chữa ho, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da…

1.1.3. Cây Medinilla sp.

1.1.3.1. Phân loại khoa học

 Giới: Plantae

 Ngành: Magnoliophyta

 Lớp: Magnoliopsida

 Bộ: Myrtales

 Họ: Melastomataceae

Hình 1.3. Cây Medinilla septentrionalis  Chi: Medinilla

1.1.3.2. Đặc điểm

Medinilla là chi có khoảng 150 loài thực vật nở hoa trong họ

Melastomataceae, chủ yếu nằm trong các vùng nhiệt đới. Chúng là cây thường

xanh, cây bụi hoặc dây leo.

Medinilla thường mọc thành bụi nhỏ, cao khoảng từ 1 – 2 m, với những lá

đơn mọc đối với cụm hoa dạng chùm lớn với những hoa nhỏ li ti. Chùm hoa mọc từ

nách lá, cành hoa kéo dài khoảng 25 cm, hoa có màu tím hồng (Renner, 2004).

Medinilla septentrionalis thuộc loại cây bụi cây cao khoảng 1 – 7 m, cây có

nhiều nhánh. Cuống lá có bề dày từ 0,4 – 0,9 mm, có dạng hình trứng bản rộng rất

mỏng, kích thước lá 7 – 8,5 x 2 – 2,5 cm. Hoa của cây mọc theo từng chùm, dạng

hình chuông, cuống hoa mọc từ lá nách kéo dài khoảng 1 – 2,5 cm, hoa có màu

hồng hoặc đỏ tía (Chen Cheih và ctv, 1984).

Phân bố: Cây được phân bố chủ yếu ở các rừng rậm, lề rừng, các khu vực ẩm

ướt trong độ cao từ 200 – 1800 m. Cây mọc chủ yếu tại các vùng Quảng Đông,

5

Đồ án tốt nghiệp

Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc, ngoài ra còn có ở các nước như Thái lan,

Việt Nam...

1.1.4. Cây Elephantopus sp.

1.1.4.1. Phân loại khoa học

 Giới: Plantae

 Ngành: Spermatophyta

 Lớp: Dicotyledonae

 Bộ: Asterales

 Họ: Asteraceae

 Chi: Elephantopus Hình 1.4. Cây Elephantopus mollis 1.1.4.2. Đặc điểm

Elephantopus mollis có tên thường gọi là cúc chỉ thiên hoa trắng hay cúc

chân voi mềm. Là loại cây thân thảo lâu năm cao từ 0,5 – 1 m, cây phủ đầy lông. Lá

mọc dài theo thân, không cuống dài từ 10 – 15 cm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh

mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung (Mercadante, 2013)

Phân bố: Loài này có nguồn gốc ở Trung và Nam Mĩ, thường gặp ở các vùng

nhiệt đới. Ở nước ta, cây Elephantopus mollis mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc

đường đi ở các tỉnh Tây Nguyên.

1.1.4.3. Một số nghiên cứu dược liệu về cây E. mollis

Tại Brazil lá cây được sử dụng như một chất làm mềm, làm lành vết thương,

ra mồ hôi và để điều trị viêm phế quản, ho, cảm cúm trong y học dân gian

(Empinotti và Duarte, 2008)

Chiết xuất E. mollis chứng minh tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do

β – D –galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết thanh

glutamate – oxalate – transaminase và huyết thanh glutamate – pyruvate –

transaminase. Các biến đổi chất béo ở gan và hoại tử của lobule trung tâm rõ ràng

đã được cải thiện bằng cách xử lí với E. mollis (Lin và ctv, 1995)

6

Đồ án tốt nghiệp

Tabopda và ctv, (2008) đã xác định được một sesquiterpene lactone mới

trong E. mollis. Nó thể hiện tác động gây độc tế bào quan trọng chống lại tế bào

B104 chuột neuroblastoma.

1.1.4.4. Công dụng

Có vị đắng, se, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, trị cảm mạo…

1.1.5. Cây Eupatorium sp.

1.1.5.1. Phân loại khoa học

 Giới: Plantae

 Ngành: Angiospermae

 Lớp: Eudicots

 Bộ: Asterales

 Họ: Asteraceae

Hình 1.5. Cây Eupatorium odoratum  Chi: Eupatorium

1.1.5.2. Đặc điểm

Cây Eupatorium odoratum có tên thường gọi là cây cỏ hôi, cây cỏ lào… Là

một loại cây nhỏ, mọc thành bụi, thân hình trụ thẳng cao tới hơn 2 m, có nhiều

cành. Khi cây trưởng thành lá có hình dạng quả trám lệch, mép có răng cưa thưa, có

lông thưa và ngắn ở cả hai mặt lá. Nếu vò lá và cành non có mùi thơm hắc. Cụm

hoa đầu, hình trụ dài 9 – 11 mm, đường kính 5 – 6 mm. Lúc nở hoa có màu tím

nhạt, sau trắng (King, R. M. and H. Robinson, 1987).

Phân bố: Cây mọc ở khắp nơi và trên mọi địa hình

Thành phần hóa học: Tinh dầu 0,7 – 2,0 % màu vàng nhạt, ageratochromen,

demethoxy, cadinen, caryophyllen. Ngoài ra còn có saponin, alkaloid…

1.1.5.3. Công dụng

Có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, chữa rong huyết sau đẻ…

7

Đồ án tốt nghiệp

1.2. Đại cƣơng về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nƣớc

1.2.1. Carbohydrate

1.2.1.1. Khái niệm

Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh

vật, là hợp chất có chứa nhiều nhóm chức OH và một nhóm CHO (aldehyde) hoặc

một nhóm CO (ketone).

Cây xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp

carbohydrate từ CO2 và H2O. Carbohydrate thực vật là nguồn dinh dưỡng quan

trọng của người và động vật. Là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố C,

H, O

Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n.

1.2.1.2. Phân loại

Carbohydrate được chia làm 3 nhóm chính:

 Monosaccharide: Hay còn gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản

nhất của carbohydrate và không bị thủy phân như glucose, fructose,

galactose. Monosaccharide đầu tiên được tìm thấy là glucose với cấu trúc 5

nhóm hydroxyl, (Alexander Kolli, 1869).

 Oligosaccharide: Khi thủy phân cho từ 2 – 8 đường đơn như sucrose,

maltose, lactose

 Polysaccharide: Do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau, có khối

lượng phân tử lớn, do đó polysaccharide không có tính khử như tinh bột,

glycogen…

1.2.1.3. Vai trò

 Cung cấp năng lượng cho cơ thể, carbohydrate đảm bảo khoảng 60% năng

lượng cho các quá trình sống.

 Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglycan...)

 Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide)

8

Đồ án tốt nghiệp

 Góp phần bảo đảm tương tác đặc hiệu của tế bào (polysaccharide trên màng

tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật).

1.2.1.4. Tính chất

 Các monosaccharide là những chất không màu, phần lớn có vị ngọt. Chúng

hoà tan tốt trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực,

tan trong dung dịch ethanol 80%.

 Momosaccharide có tính khử

 Các oligosaccharide bị thủy phân trong môi trường acid, tuy nhiên chúng khá

bền với môi trường kiềm…

1.2.2. Flavonoid

1.2.2.1. Khái niệm

 Là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa,

giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa

 Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3

carbon

1.2.2.2. Phân loại

Dựa theo gốc aryl, flavonoid được chia như sau:

1.2.2.3. Tính chất

 Ðộ tan không giống nhau

 Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi

hữu cơ, tan được trong nước, cồn

 Aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước

9

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2.4. Vai trò

 Là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản

1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…)

 Tham gia lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa

1.2.3. Tannin

1.2.3.1. Khái niệm

Là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền

vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và

alkaloid).

1.2.3.2. Phân loại

 Tannin thủy phân được(Tannin pyrogalic)

o Thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo ra phần đường (glucose) và

phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este.

o Tủa xanh đen với muối sắt III

o Dễ tan trong nước

o Ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn…

 Tannin không thủy phân được(Tannin pyrocatechic)

o Dễ tạo thành chất phlobaphen không tan

o Thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là

những chất đồng trùng hợp của hai loại)

o Tủa xanh với muối sắt III

o Ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng…

1.2.3.3. Tính chất

 Có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và acetone

 Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ

 Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)

10

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3.4. Vai trò

 Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

 Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng

 Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy

1.2.4. Alkaloid

1.2.4.1. Khái niệm

Là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số

có nhân dị vòng, thường gặp chủ yếu ở thực vật.

1.2.4.2. Phân loại

 Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của

chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử.

 Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:

o Nhóm pyridine: piperin, coniin, cytisin,…

o Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin

o Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine

o Nhóm quinolin: quinine, quinidin, brucin…

o Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein…

o Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, serotonin

o Nhóm indol: serotonin, ergin, reserpin…

o Nhóm purin: caffeine, theobromin, theophyllin

o Nhóm terpenoid: cholin, aconitin,…

1.2.4.3. Tính chất

 Đa số các Alkaloid đều có tính base yếu

 Alkaloid trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng thể rắn như morphine

(C17H17NO3), quinine (C20H24N2O2)… Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở

dạng lỏng như coniin (C8H17N)…

11

Đồ án tốt nghiệp

 Đa số alkaloid không có mùi, không có màu, có vị đắng và một số ít có vị

cay như piperin…

 Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi,…) tạo ra muối phức.

1.2.4.4. Vai trò

 Diệt khuẩn

 Tác động lên hệ thần kinh

 Hạ huyết áp

 Chống ung thư

1.2.5. Saponin

1.2.5.1. Khái niệm

Thuộc nhóm glycoside, gặp rộng rãi trong thực vật. Dưới tác dụng của các

enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là

sapogenin) và phần glucid

1.2.5.2. Phân loại

 Dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia làm 2 loại: saponin triterpenoid và

saponin steroid.

 Saponin triterpenoid được chia làm hai nhánh lớn là saponin triterpenoid

pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic.

o Saponin triterpenoid pentacyclic gồm có các nhóm olean, ursan, lupan,

hopan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon thường có 5 vòng.

o Ví dụ: Asiaticosid có trong rau má là saponin của nhóm ursan…

o Saponin triterpenoid tetracyclic gồm có các nhóm drammaran, lanostan,

cucurbitan. Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon có 4 vòng.

o Ví dụ: Đại diện cho nhóm drammaran là saponin của nhân sâm, lanostan có

trong các loài hải sâm…

 Saponin steroid gồm có các nhóm spirostan, furostan, aminofurostan,

spirosolan. Đặc điểm chung của nhóm này là gồm có 27 carbon như

cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20 – 27 tạo thành hai vòng có oxy. Một

12

Đồ án tốt nghiệp

là hydrofutan (vòng E), và vòng còn lại là hydropyran (vòng F). Các nhóm

trên chỉ khác nhau ở sự biến đổi ở vòng F

1.2.5.3. Tính chất

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ

hoá và tẩy sạch.

 Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.

 Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm

mất các chất điện giải cần thiết…

 Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu…

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với một số các chất khác…

 Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,

abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị

ngọt.

 Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ete, hexan.

1.2.5.4. Vai trò

 Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng)

 Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt

 Một số saponin có tác dụng chống viêm

 Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus

1.2.6. Anthraglycoside

1.2.6.1. Khái niệm

 Những hợp chất anthranoid nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Những hợp

chất quinon được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao

và cả trong động vật.

 Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người ta sắp xếp

thành benzoquinon, naphthoquinon, anthraquinon và naphthacenequinon hay

còn gọi là anthracyclinon (4 vòng).

13

Đồ án tốt nghiệp

 Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là

anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác

Anthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường và

phần aglycon (genin).

 Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon. Gắn vào nhân thường

có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH... Tuỳ theo vị trí các nhóm

chức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau.

1.2.6.2. Phân loại

Dẫn chất antraquinon có thể chia làm ba nhóm là nhóm phẩm nhuộm, nhóm

nhuận tẩy và nhóm dimer.

 Nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinon). Các dẫn chất

của nhóm này thường có màu đỏ cam đến đỏ tía, trong cấu trúc có hai nhóm

OH kế cận nhau

o Ví dụ: Alizarin, purpurin…

 Nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquinon). Nhóm này

thường có nhóm CH3, CH2OH, CHO, COOH ở vị trí C3, các dẫn chất này có

thể ở dạng tự do hoặc kết hợp với phần đường ở dạng glycoside

o Ví dụ: Rein, cryzophanol…

 Nhóm dimer được hình thành do hai phân tử ở dạng anthron bị oxy hóa rồi

trùng hợp với nhau tạo thành

o Ví dụ: Hypericin, ararobinol…

1.2.6.3. Tính chất

 Những dẫn chất anthraquinon đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ.

 Dễ thăng hoa

 Ở thể glycosid dễ tan trong nước, có thể tan trong ether, chloroform và một

số dung môi hữu cơ khác.

 OH ở vị trí α thì có tính acid yếu hơn ở vị trí β do tạo dây nối hydro với

nhóm carbonyl

14

Đồ án tốt nghiệp

 Dẫn chất có 1,4-dihydroxy sẽ có huỳnh quang trong dung dịch acid acetic.

Ngoài ra các dẫn chất này còn cho màu xanh dương với H2SO4.

 Các dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy khi ở trong dung dịch kiềm tạo phenolat

có màu đỏ và dưới ánh sáng UV (365 nm) cho huỳnh quang tím hoặc đỏ nâu.

 Các dẫn chất anthranol có phản ứng với p-nitroso dimethylanilin để tạo thành

azomethin có màu.

1.2.6.4. Vai trò

 Các dẫn chất anthraglycoside, chủ yếu là các β-glucoside dễ hoà tan trong

nước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non. Khi đến ruột già,

dưới tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột thì các glycoside bị

thủy phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron và

anthranol là dạng có tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lí do tác dụng

đến chậm sau khi uống thuốc. Dạng genin thì bị hấp thu ở ruột non nên

không có tác dụng.

 Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất 1,8-

dihydroxyanthraquinon dưới dạng heteroside giúp cho sự tiêu hoá được dễ

dàng, liều vừa nhuận, liều cao xổ.

 Các dẫn chất anthraglycoside có tác dụng thông mật.

 Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây Rubra tinctoria L. có tác

dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận.

 Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben.

 Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất

anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư.

1.3. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật

1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực

vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triên của vi sinh vật. Các chất kháng

15

Đồ án tốt nghiệp

khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ

thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010)

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật bao gồm việc phá vỡ

màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng

chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây

đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của

tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant

secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi

tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt

động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013).

Hình 1.6. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm

 Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. Do tác động lên quá

trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do

thay đổi áp suất thẩm thấu.

16

Đồ án tốt nghiệp

 Ức chế chức năng của màng tế bào: Cơ chế làm mất chức năng của màng

làm cho các phân tử có kích thước lớn và các ion bị thoát ra ngoài

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

o Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm

cho quá trình dịch mã không chính xác

o Nhóm chlorarnphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các aid amin mới vào chuỗi

polypeptide

o Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome ngăn

cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

 Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid:

o Nhóm rifampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã

tạo thành mRNA

o Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch

đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của

DNA

o Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng

cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid

o Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân

purin làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.

1.4. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

1.4.1. Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột

1.4.1.1. Khái niệm

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn gram

âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có lên men oxidase, lên men đường

glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động

hoặc không và không sinh nha bào.

17

Đồ án tốt nghiệp

1.4.1.2. Đặc điểm hình thể và tính chất nuôi cấy

Tất cả vi khuẩn họ này đều là trực khuẩn gram âm, kích thước trung bình 2 – 4

µm x 0,4 – 0,6 µm. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi.

Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở xung quanh tế bào.

Họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường, trên

môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường

Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:

o Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

o Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì

o Dạng M: Khuẩn lạc nhầy, các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau

1.4.1.3. Khả năng gây bệnh

Khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, đầu tiên là khả năng nhiễm

khuẩn đường tiêu hóa. Chúng đứng đầu trong các căn nguyên gây bệnh vi khuẩn

gây bệnh tiêu chảy. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác

như tiết niệu, thần kinh… Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm

khuẩn huyết.

1.4.2. Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

1.4.2.1. Nhóm Salmonella

a, Đặc điểm hình thái

 Hình thái khuẩn lạc: Trên môi trường XLD khuẩn lạc có màu hồng trong

suốt, có hoặc không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen

bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc

 Hình thái tế bào:

o Salmonella do Daniel E. Salmon phát hiện ra năm 1885. Năm 1880 Grafhy

đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên

phân lập được S.typhi vào năm 1884.

18

Đồ án tốt nghiệp

o Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.

Salmonella là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước khoảng 0,6 – 2,0 μm,

kị khí tùy nghi, có tiên mao, có thể di động (trừ S. gallinarum và S.

pullorum) không tạo bào tử, có khả năng sinh hơi, lên men dextrose và sinh

khí H2S.

b, Khả năng gây bệnh

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện trong thực phẩm,

đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella

gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ tiêu thụ thực

phẩm bị nhiễm khuẩn đến khi có các triệu chứng biểu hiện là 12 – 36 giờ. Không

phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm salmonella đều bị ngộ độc.

Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt,

trứng…

Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải

thức ăn bị nhiễm khuẩn như thực phẩm, sữa, nước uống… Sau khi qua hàng rào

acid dạ dày, vi khuẩn di chuyển về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục đi qua

màng nhày và vào thành ruột.

c, Một số chủng salmonella gây bệnh cho người

 S. typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trọng nhất

trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn

 S. paratyphi A: Chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn

 S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động

vật

 S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây

viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết

 S. typhimurium và S. enteritidis: Có khả năng gây bệnh cho người và động

vật

19

Đồ án tốt nghiệp

 S. choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do

Salmonella

1.4.2.2. Nhóm Escherichia coli

a, Đặc điểm của E. coli

Escheriachia coli do Escherich phân lập 1885 từ phân trẻ em. E. coli là trực

khuẩn hình que ngắn kích thước 2 – 3 x 6µm, hai đầu tròn, tế bào đứng riêng lẻ, đôi

khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không

tạo bào tử, gram âm, thỉnh thoảng có hiện tượng bắt màu ở hai đầu.

E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 – 44oC (tối ưu ở 37oC), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Trên môi trường EMB

E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, thường có ánh kim, bờ tròn đều.

Có phản ứng lên men đường với các loại đường như Lactose, Glucose,… Ngoài

ra còn có phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứn H2S, VP, Urea âm tính.

b, Khả năng gây bệnh của vi khuẩn

E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E. coli có thể gây bệnh

cơ hội. Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục… Nhưng nguy

hiểm nhất là gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em

Trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng

kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành

ruột. ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá vỡ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột,

đồng thời sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin, gây ra hiện tượng tiêu chảy.

1.4.2.3. Nhóm Shigella

a, Đặc điểm chung

Là trực khuẩn gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, tăng trưởng ở nhiệt độ 10 40oC, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng

nguyên K, không có kháng nguyên H

20

Đồ án tốt nghiệp

Shigella lên men glucose, không sử dụng nitrat, không sinh hơi

Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có cấu trúc

kháng nguyên phức tạp. Shigella có kháng nguyên O, không có kháng nguyên H,

một số có kháng nguyên K

b, Khả năng gây bệnh trên người

Các loài shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chúng chỉ xâm nhiễm và

tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng. Trong môi trường nước các loài

này có thể tồn tại hơn 6 tháng. Ngộ độc thực phẩm do shigella chủ yếu là do ăn phải

thực phẩm kém vệ sinh. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua

người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ trong 1 – 7 ngày sau khi sử dụng

thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ tiêu chảy nhẹ đến

đi tiêu ra máu, mất nước, sốt cao… Các triệu chứng trên có thể kéo dài trong nhiều

ngày

Một số chủng shigella: Shigella dysenteriae, shigella flexneri, shigella sonnei,

shigella boydii

1.4.2.4. Nhóm Vibrio

a, Đặc điểm hình thái

Là phẩy khuẩn, Gram âm, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm. Chúng không

sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi

khuẩn (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004).

Là vi khuẩn gram âm, sống kỵ khí tùy nghi, có phản ứng catalase và oxidase

dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S và vi khuẩn

không phát triển trên môi trường không muối (NaCl). (Trần Linh Phước, 2008)

b, Khả năng gây bệnh

Các loài vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để

phát triển. Nhóm vibrio là tác nhân gây ra bệnh tả, được lan truyền rất nhanh qua

đường nước, gây nhiễm thực phẩm, và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ

21

Đồ án tốt nghiệp

sinh kém. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống,

rau quả… Ngoài khả năng gây nhiễm các bệnh về đường ruột, một số chủng của

nhóm này còn có khả năng gây nhiễm trùng máu cho người.

Một số chủng gây bệnh của nhóm vibrio: V. alginolyticus, V. harveyi, V.

parahaemolyticus…

1.4.2.5. Nhóm Listeria

a, Đặc điểm chung

 Đại diện của nhóm Listeria là L. monocytogenes, là trực khuẩn gram dương, kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1 – 45oC, không tạo bào tử nhưng có di

động.

 Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 1

- 2µm. Cho phản ứng Catalase dương tính

 Giống Listeria bao gồm 6 loài: L. monocytogens, L. innocua, L. ivanovii, L.

seeligeri, L. welshimeri, L. grayi

b, Khả năng gây bệnh

Bệnh do nhóm Listeria gây ra ít gặp ở người tuy nhiên các triệu chứng của

bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cao. Việc tiêu thụ các thực phẩm nhiễm

khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh viêm dạ dày – ruột với triệu chứng sốt. L.

monocytogenes là nguyên nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tuổi, phụ nữ

mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch

kém.

Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do Listeria gây ra tác động đến các bệnh

nhân mang bệnh về miễn dịch. Ngoài ra nhóm này cũng là nguyên nhân gây ra các

bệnh như viêm màng kết, bệnh về hạch bạch huyết… Phần lớn người bị nhiễm bệnh

đều có các dấu hiệu lâm sàng nhẹ, và triệu chứng không rõ ràng.

22

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da

1.4.3.1. Staphylococcus

a, Đặc điểm chung của staphylococcus

Là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính từ 0,5 – 1,5 µm, có thể đứng

riêng lẻ, từng đôi hoặc từng chùm. Vi khuẩn không di động và không sinh bào tử

thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng (Koch, 1878;

Pasteur, 1880)

Là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có cả sự trao đổi chất, hô

hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều

loại carbohydrate khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi. Staphylococcus

có thể mọc ở nhiều điều kiện và môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ từ 30 – 37oC và pH gần trung tính. Chúng kháng được với các chất diệt trùng, độ khô

nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 1,5% NaCl (Scott E

Martin và John J Iandolo, 2000).

b, Khả năng gây bệnh cho người

Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dưới

da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh…

Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: Thường xảy ra ở những người có sức đề kháng

yếu hoặc trẻ em.

Trong tự nhiên staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc

hay móng của các động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị thủy phân ở 100oC trong 30 phút.

Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này thì sau 4 – 6 giờ người bệnh có những

triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các loại thực phẩm như

jambon, nước súp… thường nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm

chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trính chế biến.

23

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3.2. Streptococcus

a, Đặc điểm

Là liên cầu khuẩn, có hình cầu hoặc oval kéo dài, thuộc vi khuẩn Gram dương,

không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày.

Là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng vẫn có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí.

Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm khi nuôi cây trong môi trường azide

tetrazolium chứa TTC

b, Khả năng gây bệnh

Mặc dù streptococcus có khả năng gây nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh

viện. Nhưng phải đến sau những năm 1970 mới được biết đến như tác nhân gây

bệnh nhiễm trùng bệnh viện. Nhóm vi khuẩn này trở thành tác nhân phổ biến đứng

thứ hai nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương.

Một số nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêm

màng trong tim. Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần kinh trung ương cũng như viêm

khớp, hạch, viêm xoang cũng có thể do nhóm này gây ra nhưng rất hiếm gặp.

24

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ Sinh học –

Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí

Minh.

 Thời gian nghiên cứu: 2/2015 – 8/2015

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguyên liệu nghiên cứu

Các loại cây thuốc dân gian bao gồm: Podocarpus sp., Medinilla sp.,

Elephantopus sp., Eupatorium sp., Polygala sp.

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị

Các chủng vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp

tại Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh bao gồm:

Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli (EC), E. coli O157 : H7 (EC.O157:

H7), E. coli 0208 (EC.0208), E. coli – ETEC (Enterotoxigenic).

 Nhóm vi khuẩn Listeria: L. innocua (LI), L. monocytogenes (LM).

 Nhóm vi khuẩn Samonella: S. dublin (SD), S. enteritidis (SE), S. typhi (ST),

S. typhimurium (STy).

 Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. boydii (ShB), Shi. flexneri (ShF), Shi. sonnei

ShS).

 Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. alginolyticus (VA), V. cholera (VC), V. harveyi

(VH), V. parahaemolyticus (VP)

 Và một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da khác: Pseudomonas aeruginosa

(PA), Staphylococcus aureus (SA), Enterococcus feacalis (EF)

25

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.3.1. Thiết bị và dụng cụ

 Tủ sấy, bình hút ẩm

 Đĩa petri, que trang, đèn cồn, dây cấy vòng

 Máy say mẫu

 Máy lọc, giấy lọc

 Bình tam giác, cốc thủy tinh

 Máy lắc

 Máy nước cất (Branstead USA)

 Máy đo quang phổ

 Tủ ấm 30oC, 37oC (Memmert mermany)

 Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

 Micropipette loại 100 – 1000 𝜇l, đầu tipe

 Cân phân tích (Orbital Germany)

 Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn

 Ống eppendorf, parafirm

 Nồi hấp autoclave (Huxky Đài Loan)

 Bông không thấm, dây cấy vòng

2.3.2. Hóa chất

 Cồn, nước cất, muối NaCl

 Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).

 Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).

 Thuốc thử Fehling A, Fehling B, Ninhydrin, Gelatin 1%, NaOH 10%,

Ferric chloride 10%, thuốc thử Hager, Wagner, chì acetate 10%, thuốc

thử Molisch, Barfoed, Dragendroff, Benzene, bột Magnesium.

26

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc

Khái niệm: Chiết xuất là tách các chất hòa tan trong dược liệu nhưng vẫn giữ đủ

thành phần và bản chất của của các hợp chất có trong cây.

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau.

Phương pháp chiết bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kĩ thuật chiết,

mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi.

Phương pháp tiến hành: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn,

sau đó đem phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm để

trích ly các hợp chất có trong mẫu cây, tiến hành ngâm trong 24 giờ rồi đem lọc,

quá trình lặp lại từ 3 – 5 lần cho đến khi dịch lọc trong thì thôi. Tiến hành cô quay dịch lọc ở nhiệt độ thấp hơn 50oC. Cao chiết thu được sẽ bảo quản lạnh ở - 4oC

(Atta và Mouneir, 2004)

2.4.2. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị

2.4.2.1. Phương pháp tăng sinh

Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường

vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không chỉ cần thiết đối với hoạt động

sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý

thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường.

Phương pháp tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các

giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành

tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường

TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang,

2013).

27

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.2. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng

và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản.

Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi

sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng

nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên

giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần.

Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy

chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.7.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có

thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu.

Mục đích:

o Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn hay bị mất hoạt tính. Vì

vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng trong thí nghiệm

cũng như sản xuất.

o Làm cho các giống vi sinh vật có tỉ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn

định và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật khác.

Phương pháp bảo quản lạnh sâu (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

o Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt

độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.

o Pha dịch tế bào với glycerol 40% đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối

cùng 10% và mật độ tế bào 106.

o Dịch huyền phù tế bào được đưa vào eppendoff và đóng.

28

Đồ án tốt nghiệp

o Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất

thẩm thấu trong và ngoài tế bào.

o Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Và được tiến hành giữ

giống ở - 15oC

2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật

Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào các giếng thạch đã cấy vi sinh vật kiểm

định. Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào môi trường

agar và tác động lên vi sinh vật chỉ, khi đó nó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật

chỉ thị tạo thành vòng vô khuẩn.

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dựa trên phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Murray và ctv, 1995; Olurinola, 1996)

Phương pháp được thực hiện trên môi trường TSA, vi khuẩn sau khi được

trang đều trên mặt đĩa, khi đó sẽ tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm. Chuẩn

bị các các loại dịch chiết khác nhau với nồng độ thích hợp. Hút 100 µl các loại dịch

chiết khác nhau vào trong từng giếng thạch, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 2 giờ. Tất cả các đĩa petri sau đó sẽ được đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 – 24 giờ

rồi đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn thu được.

2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm

Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey.

2.5. Bố trí thí nghiệm

29

Đồ án tốt nghiệp

Vi sinh vật chỉ thị

Mẫu cây thuốc

Tăng sinh

Xử lí mẫu Đo OD (600nm)

Cao chiết nước

Pha loãng thành 106 cfu/ml

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Định tính thành phần hóa học Cấy trang

Đọc kết quả

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm

2.5.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc

2.5.1.1. Quy trình xử lí mẫu và đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số

cây thuốc dân gian

30

Đồ án tốt nghiệp

Các mẫu cây thuốc Mẫu cây thuốc xay mịn

Rửa sạch Ngâm trong 4 giờ

(tỉ lệ 1 : 20; w/v)

Phơi khô

Lọc tinh

Xay mẫu thành bột mịn Cô cách thủy

70oC

Cân, xác định khối lượng ban đầu

Cao nước Bảo quản lạnh ở 4oC

Hình 2.2. Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc

dân gian

2.5.1.2. Thuyết minh quy trình

Các mẫu cây thuốc sau khi được thu mua sẽ được rửa sạch bằng nước máy,

sau đó đem đi phơi phô tự nhiên ở nơi có bóng mát, tránh cường độ ánh sáng quá

mạnh. Mẫu cây sau khi phơi khô đến khối lượng không đổi sẽ được đem đi xay

thành bột, Cân và xác định khối lượng bột thu được.

Để xác định được hiệu suất thu hồi cao nước của mỗi loại cây thuốc, ta tiến

hành cân một lượng mẫu bột cây thuốc nhất định, sau đó đem mẫu đi ngâm với

nước cất ở tỉ lệ mẫu: nước là 1/20 (w/v) trong vòng 4 giờ rồi tiến hành lọc mẫu. Dịch lọc thu được sẽ được đem đi đun cách thủy ở 70oC cho đến khi cô cạn, còn bã

cây thuốc sau khi lọc sẽ tiếp tục được ngâm với nước cất, quá trình trên được tiến

hành cho đến khi dịch lọc trong thì ngừng. Mẫu cao nước thu được sẽ được bảo quản lạnh ở 4oC để tiến hành các thử nghiệm liên quan. Mỗi nghiệm thức được tiến

hành lăp lại 3 lần.

31

Đồ án tốt nghiệp

𝑚′−𝑚 Hiệu suất thu hồi cao: H (%) =

x100

mo

Trong đó

o m’: Khối lượng cốc và cao thu được (g)

o m: Khối lượng cốc ban đầu (g)

o mo: Khối lượng bột mẫu ban đầu (g)

2.5.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một

số loại cây thuốc

2.5.2.1. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại

cây thuốc bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Vi sinh vật chỉ thị

Hút 100𝜇l vào đĩa petri chứa TSA/TSA + NaCl 1,5%

Cấy trang Pha cao bằng DMSO 1% Tăng sinh trong TSB/TSB +NaCl 1,5%

Lắc, 18 – 24 giờ Dịch cao Đục lỗ (d= 6 mm) ở nhiệt độ phòng [100] mg/ml

Đo OD (600nm) ủ 37oC/24 giờ

Đọc kết quả Pha loãng đến 106 cfu/ml

Hình 2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây

thuốc dân gian

32

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2.2. Thuyết minh quy trình

Tiến hành tăng sinh cho 20 chủng vi sinh vật chỉ thị thuộc các nhóm vi khuẩn

như Escherichia coli spp., Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp.,

Staphylococcus spp., Enterococcus spp., và môi trường tăng sinh TSB có bổ sung 1,5 % muối cho các chủng Vibrio spp. rồi đem đi hấp khử trùng ở 121oC trong 15

phút. Sau đó tiến hành tăng sinh bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của

vi khuẩn cấy vào môi trường TSB và đem lắc 120 vòng/phút, trong 18 – 24 giờ.

Lưu ý là tiến hành tăng sinh trong tủ cây vô trùng.

Vi khuẩn sau khi tăng sinh được đem đi đo OD ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa vào công thức McFahrland để pha loãng thành nồng độ 106 CFU/ml bằng nước

muối. Sử dụng micropipette hút 100 µl dịch vi khuẩn sau khi đã pha loãng cho vào

đĩa petri có chứa môi trường TSA hay môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl đối

với các chủng Vibrio spp., thực hiện trang đĩa để vi khuẩn được trải đều trên mặt đĩa

sau đó để yên 15 phút để cho đĩa khô hoàn toàn.

Tiến hành pha cao các mẫu cây thuốc ở nồng độ 100 mg/ml bằng DMSO 1%.

Đĩa thạch sau khi khô được đem đi đục lỗ với đường kính mỗi lỗ là 6 mm. Hút 100

µl dịch cao của mỗi cây thuốc rồi nhỏ vào các giếng thạch và để yên trong 2 giờ, sau đó các đĩa được đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ và đọc kết quả. Đối chứng được

sử dụng là kháng sinh Ciprofloxacin pha theo dãy nồng độ ở cấp số 2 từ nồng độ

1000 µg/ml đến 8 µg/ml, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

2.5.3. Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc một số

loại cây thuốc dân gian

2.5.3.1. Quy trình định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số cây

thuốc

33

Đồ án tốt nghiệp

Cao chiết nước

Pha loãng bằng dung dịch DMSO 1% Pha loãng bằng H2SO4 10%

Lọc Lọc

Định tính alkaloid

Định tính carbohydrate, flavonoid, anthraquinon glycosides, tanins, amino acid, saponin, phenolic, steroids

Hình 2.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc

2.5.3.2. Thuyết minh quy trình

Mẫu cao nước các loại cây thuốc được tiến hành thử nghiệm định tính thành

phần hóa học theo hai phần. Đối với các chỉ tiêu alkaloid, mẫu cao nước được ngâm

trong H2SO4 10% trong khoảng thời gian từ 30 – 60 phút sau đó tiến hành lọc qua

giấy lọc. Thu phần dịch để tiến hành thử nghiệm. Riêng đối với các thử nghiệm còn

lại thì lại tiến hành ngâm mẫu cao trong dung dịch DMSO 1%, sau đó tiến hành lọc,

thu dịch và tiến hành làm các thử nghiệm còn lại.

a, Thử nghiệm carbohydrate

Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào từ 5

– 6 giọt thuốc thử Molisch. Sau đó nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 trên thành ống nghiệm.

Kết quả dương tính nếu hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách hai chất

lỏng.

Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1

ml thuốc thử Fehling A và 1 ml thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa sẵn dịch

34

Đồ án tốt nghiệp

mẫu cây thuốc. Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết tủa dương tính nếu

có kết tủa màu đỏ của CuO ở dưới đáy ống nghiệm

Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc

thử Barfoed. Sau đó đun cách thủy hỗn hợp trên trong 5 phút , làm lạnh nhanh và

quan sát kết quả. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.

b, Thử nghiệm alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vào vài

giọt thuốc thử Mayer và quan sát kết quả. Kết tủa dương tính nếu kết tủa màu đục

được tạo thành.

Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài

giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát kết quả. Nếu dương tính sẽ hình

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử

Hager và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu vàng

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc

thử Wagner và quan sát. Kết quả dương tính nếu hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

c, Thử nghiệm saponin

Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh rồi quan

sát. Nếu trong ống nghiệm hình thành một lớp bọt ổn định thì cho kết quả dương

tính.

d, Thử nghiệm anthraquinon glycosides

Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

H2SO4 loãng và đun sôi, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Rồi thêm 3 ml

benzene, lắc đều rồi để yên sẽ thấy dung dịch trong ống nghiệm tách làm 2 lớp.

Tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dương

tính nếu lớp ammonia xuất hiện màu đỏ

35

Đồ án tốt nghiệp

e, Thử nghiệm flavonoid

Thử nghiệm alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, rồi cho vào

vài giọt NaOH 10 %, thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với mẫu đối chứng là

mẫu cây thuốc và nước cất để so sánh. Sau đó thêm HCl loãng nếu mất màu thì

chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.

Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho ít bột

Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung thêm 5 ml cồn

95%, rồi quan sát kết quả. Nếu dương tính thì dung dịch có cam, hồng hoặc đỏ tím

Thử nghiệm Ferric Chloride: Lấy 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài

giọt thuốc thử Ferric Chloride 10%. Dung dịch cho kết quả dương tính nếu xuất

hiện màu xanh hoặc tím.

f, Thử nghiệm phenolic

Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml chì

acetate 10%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng.

Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin

1%. Kết quả dương tính nếu xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm.

g, Thử nghiệm tannin

Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml

NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Ferric chloride 10%. Kết quả dương tính nếu dung dịch

xuất hiện màu xanh.

Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết mẫu cho vào ống nghiệm,

thêm 2 ml NaCl 10%, rồi thêm 4 giọt chì acetate. Kết quả dương tính nếu dung dịch

xuất hiện kết tủa màu vàng

h, Thử nghiệm steroid

Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào. Lắc mạnh rồi để yên cho dung

dịch tách thành 2 lớp. Quan sát kết quả ở mặt phân cách hai chất lỏng. Nếu xuất

36

Đồ án tốt nghiệp

hiện màu đỏ ở lớp dưới thì là steroid, còn nếu là màu vàng ở lớp dưới là

triterpenoid.

Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm

2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Tiếp đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm

đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ

ở mặt phân cách thì là steroid, còn nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm là

triterpenoid

i, Thử nghiệm amino acid

Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử

Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút rồi quan sát hiện tượng. Kết quả là dương

tính nếu xuất hiện màu tím.

37

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nƣớc của một số loại cây thuốc dân gian

Các mẫu cây thuốc được tiến hành xử lí cao nước trong 4 giờ và sau đó tiến

hành đánh giá hiệu suất thu hồi cao.

)

30.0 c % 25.0 b b

20.0 a

10.0

15.0 a

% 5.0

( i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

(

0.0 Cây thuốc

Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian

Hình 3.2. Màu sắc dịch lọc cao nước cây Elephantopus sp. qua các lần ngâm mẫu

Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao được thể hiện trong Hình 3.1. Dựa

vào Hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng đối với các loại cây khác nhau thì dung môi

nước có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết cao khác nhau. Trong 5 mẫu cây khảo

38

Đồ án tốt nghiệp

sát thì hiệu suất thu hồi cao nước của cây Eupatorium sp. là cho kết quả cao nhất

với 25,5 % và cao hơn một cách có ý nghĩa so với các mẫu cây còn lại (P < 0,05).

Kế đến là hiệu suất thu hồi cao của cây Medinilla sp., Polygala sp., Elephantopus

sp., và cuối cùng là cây Podocarpus sp. cho kết quả thu hồi cao nước thấp nhất với

11,6 %.

Khi tiến hành so sánh hiệu suất thu hồi của từng mẫu cây với nhau, chúng tôi

thấy rằng hiệu suất thu hồi của cây Podocarpus sp. và cây Elephantopus sp. không

có sự sai khác về mặt thống kê với nhau nhưng lại khác biệt có ý nghĩa so với các

cây còn lại. Tương tự đối với hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. và

cây Polygala sp. cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê với nhau với giá trị

lần lượt là 20,2 % và 20,6 % nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 mẫu còn

lại.

Sở dĩ kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các mẫu cây thuốc có

sự khác biệt như vậy có thể là do mức độ hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cây

thuốc đối với dung môi nước là khác nhau

3.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc một số loại cây

thuốc dân gian

3.1.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây

Podocarpus sp.

39

Đồ án tốt nghiệp

40.0

)

b 35.0

m m

(

30.0

25.0

b 20.0

b

a 15.0 b Podocarpus

g n á h k g n ò v h n

a

í

a a 10.0 Ciprofloxacin 5.0

0.0

k g n ờ ƣ Đ

Vi sinh vật ST ShS VH SA

Hình 3.3. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp.

(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn

đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là

200 mg/ml)

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước từ cây Podocarpus

sp. được trình bày trong Hình 3.3. Dựa vào kết quả này chúng tôi nhận thấy rằng

phổ kháng khuẩn của cao chiết nước từ cây Podocarpus sp. khá hẹp. Chúng chỉ ức

chế được 4/20 chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm các chủng như S. typhii, Shi.

sonnei, V. harveyi, S. aureus. Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cây thuốc

thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn cũng khá thấp (từ 7,7 mm đến

13,5 mm).

Khi so sánh kết quả kháng khuẩn của mẫu cây thuốc với kháng sinh

Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với nhóm vi khuẩn Virio spp.)

thì cao chiết nước của cây Podocarpus sp. thể hiện hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn

một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

40

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả này chứng tỏ rằng đối với cây Podocarpus sp. thì sự hòa tan các hợp

chất hữu cơ có trong cây với dung môi nước là khá yếu và kết quả này phù hợp với

kết quả thu được trong Hình 3.1 (với hiệu suất thu hồi của mẫu cây là 12,0 %).

3.1.1.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây Polygala

sp.

20.0 b 18.0 b

)

16.0

m m

(

a

b 14.0 b a b a 12.0 a a 10.0 a a 8.0

g n á h k g n ò v h n

í

6.0

Polygala 4.0

k g n ờ ƣ Đ

Ciprofloxacin 2.0

0.0 Vi sinh vật EC VA VC VH PA EF

Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp.

(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn

đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là

200 mg/ml)

Sau khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao chiết nước của cây

Polygala sp. thì kết quả được thể hiện trong Hình 3.4

Dựa theo kết quả trên Hình 3.4 cho thấy mẫu cao nước Polygala sp. ở nồng độ

200 mg/ml có phổ kháng khuẩn hẹp, chỉ kháng được 6/20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

Hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu do vòng đường kính vòng kháng khuẩn là từ

41

Đồ án tốt nghiệp

8,0 mm đến 11,5 mm. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn của mẫu cây đối

với các chủng vi sinh vật khảo sát là chưa cao.

Mẫu cao nước Polygala sp. kháng được các chủng gây bệnh trên da và gây bệnh

đường ruột. Trong đó có chủng Enterococcus feacalis có đường kính vòng kháng

cao nhất với 11,5 mm và cho kết quả kháng thấp nhất đối với chủng V. harveyi với

đường kính vòng kháng là 8,0 mm.

Dựa vào kết quả đã xử lí thống kê trên Hình 3.4 cho thấy rằng khả năng kháng

khuẩn của cao nước Polygala sp. đối với mỗi chủng vi sinh vật gây bệnh là khác

nhau và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Theo đó khi so

sánh với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với các

chủng Vibrio spp.) cũng cho thấy rằng đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cây

còn rất nhỏ và hầu hết là thấp hơn một cách có ý nghĩa về mặt thống kê so với vòng

kháng của mẫu đối chứng. Tuy vậy vẫn có trường hợp khả năng kháng khuẩn của

mẫu cây và kháng sinh Ciprofloxacin được cho là không có sự sai khác với nhau về

mặt thống kê. Cụ thể ở đây là trường hợp của chủng E. feacalis, đường kính vòng

kháng trung bình của cả mẫu cây và đối chứng được xem là tương đương về mặt

thống kê với số liệu lần lượt là 11,5 mm và 12,0 mm.

Điểm đáng chú ý ở đây là khi tiến hành đối chiếu kết quả thu được với kết quả

nghiên cứu của (Uthiraselvam và ctv, 2012) về hoạt tính kháng khuẩn đối với các

chủng như E. coli, Pseudomonas aeruginosa và E. feacalis thì kết quả cho thấy mẫu

Polygala sp. có đường kính vòng kháng khuẩn tốt hơn hẳn với đường kính vòng

kháng lần lượt là 8,2 mm; 9,3 mm và 11,5 mm, trong khi đường kính vòng kháng

của mẫu cây Polygala javana lần lượt chỉ là 7,0 mm; 7,0 mm và 9,0 mm.

Kết quả này chứng tỏ rằng sự hòa tan của các hợp chất có trong mẫu cao nước

của cây Polygala sp. tuy nhiều (hiệu suất thu hồi cao nước là 20,5 %) nhưng với

dung môi nước thì chỉ lôi kéo được phần lớn các hợp chất không có hoạt tính sinh

học như carbohydrate và amino acid. Trong khi đó phần lớn các thành phần hóa học

có hoạt tính sinh học lại không hòa tan được trong nước. Do đó, việc sử dụng nước

42

Đồ án tốt nghiệp

để tách chiết các hợp chất từ cây Polygala sp.sẽ không thu được tất cả các thành

phần hóa học có hoạt tính sinh học cao.

3.1.1.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây

Medinilla sp.

40.0

)

b 35.0

m m

(

30.0

25.0

20.0

a a b Medinilla 15.0 b b aa b a a b a

g n á h k g n ò v h n

a b ab a a

í

a a a 10.0 Ciprofloxacin 5.0

k g n ờ ƣ Đ

0.0

Vi sinh vật

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp.

(Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml)

Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với

một số chủng vi sinh vật chỉ thị được thể hiện trong Hình 3.5

Theo Hình 3.5 mẫu cao chiết nước Medinilla sp. kháng được 12/20 chủng vi

sinh vật chỉ thị. Trong đó kháng mạnh nhất là đối với chủng shigella flexneri với

đường kính vòng kháng là 13,3 mm, sau đó vòng kháng giảm dần và cuối cùng cho

kết quả kháng yếu nhất là đối với chủng Shi. sonnei với đường kính vòng kháng là

7.5 mm

Mẫu cao chiết nước kháng được cả những chủng gây bệnh đường ruột và gây

bệnh trên da. Trong đó kháng chủ yếu vẫn là các chủng gây bệnh tiêu chảy thuộc

43

Đồ án tốt nghiệp

các nhóm như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. và Listeria spp.

Ngoài ra còn kháng các chủng vi sinh vật khác như P. aeruginosa, S.aureus, và E.

feacalis. Mặc dù đường kính vòng kháng còn chưa cao nhưng nhìn chung phổ

kháng của mẫu cao chiết nước Medinilla sp. là khá rộng. Điều này chứng tỏ mẫu

cây Medinilla sp. cho khả năng kháng khuẩn khá tốt.

Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.5 cho thấy rằng

mức độ kháng khuẩn của mẫu cao nước Medinilla sp. đối với các chủng vi sinh vật

chỉ thị so với mẫu đối chứng Ciprofloxacin là khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê

với (P < 0,05). Ngoài ra dựa vào Hình 3.5 cũng cho thấy rằng khả năng kháng của

cao nước và mẫu kháng sinh đối với một số chủng vi sinh vật là tương đương nhau

về mặt thống kê, như đối với trường hợp của chủng S. dublin, S. typhi, và Shi.

flexneri. Đặc biệt đối với chủng Shi. boydii thì đường kính vòng kháng của mẫu cao

nước đối với chủng này là 11,3 mm trong khi mẫu đối chứng Ciprofloxacin lại

không có khả năng kháng được chủng này.

Nhìn chung đối với mẫu cao nước Medinilla sp. cho kết quả hoạt tính kháng

khuẩn khá tốt. Mặc dù mới khảo sát ở nồng độ là 100 mg/ml nhưng kết quả thu

được là rất khả quan với 12 chủng trên cho 20 chủng khảo sát và sự sai khác giữa

những lần lặp lại của các nghiệm thức là khá nhỏ và số liệu được chấp nhận về mặt

thống kê.

Kết quả này là phù hợp với kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước trong

Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi cao nước của cây Medinilla sp. là 20,2 %). Mặc dù phổ

kháng của mẫu cao nước là khá rộng song kết quả thu được khi đo vòng kháng

khuẩn là khá yếu. Sở dĩ có sự khác biệt này là do dung môi nước hòa tan được

nhiều hợp chất có trong mẫu cây thuốc nhưng hàm lượng của các thành phần hóa

học có hoạt tính sinh học trong mẫu cây còn ít dẫn đến kết quả là vòng kháng khuẩn

thu được yếu.

44

Đồ án tốt nghiệp

3.1.1.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây

Eupatorium sp.

20.00 b

)

18.00

m m

(

16.00

b a 14.00 b b b 12.00 a a a 10.00 a 8.00

g n á h k g n ò v h n

í

6.00 Eupatorium 4.00

k g n ờ ƣ Đ

Ciprofloxacin 2.00

0.00 Vi sinh vật LM ShF VH PA EF

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp.

(Ciprofloxacin đối với các chủng Vibrio spp. thì sử dụng nồng độ là 8 µg/ml, còn

đối với các chủng còn lại thì sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là

100 mg/ml)

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của mẫu cây Eupatorium

sp. được thể hiện trong Hình 3.6

Dựa vào kết quả được biểu hiện trên Hình 3.6 cho thấy rằng mẫu cao chiết nước

Eupatorium sp. kháng được 5 trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. Nhìn chung thì mẫu

cao chiết nước kháng được một vài chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy như

Listeria monocytogens, Shigella flexneri, Vibrio harveyi. Ngoài ra còn kháng được

các chủng gây bệnh ngoài da như Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus feacalis.

Mặc dù phổ kháng của mẫu cao chiết nước còn hẹp, nhưng xét một cách tổng

quát thì khả năng kháng khuẩn của mẫu cây thuốc đối với các chủng vi sinh là rất

tích cực tại nồng độ là 100 mg/ml. Và nhìn chung là mẫu Eupatorium sp. có thể

45

Đồ án tốt nghiệp

kháng rải rác ở cả 2 nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da và đường ruột. Với kết quả

trên sẽ là cơ sở quan trọng để tiếp tục làm thêm thử nghiệm khả năng kháng khuẩn

của mẫu cao nước Eupatorium sp. ở các chủng vi sinh vật khác.

Theo như kết quả trên Hình 3.6 thì cho thấy cao nước Eupatorium sp. cho khả

năng kháng tốt nhất đối với chủng V. harveyi với đường kính vòng kháng là 12,8

mm, sau đó đường kính vòng kháng giảm dần với các chủng lần lượt là E. feacalis,

P. aeruginosa, Shi. flexneri và cuối cùng là cho kết quả kháng yếu nhất là chủng

Lis. monocytogenes với đường kính vòng kháng khuẩn là 7,0 mm

Dựa theo kết quả xử lí số liệu được thể hiện trên Hình 3.6 cho biết rằng khả

năng kháng khuẩn của mẫu cao nước Eupatorium sp. so với kháng sinh

Ciprofloxacin là sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Và cụ thể ở đây

là hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao nước yếu hơn nhiều so với hoạt tính kháng

khuẩn của mẫu đối chứng Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và 8 µg/ml (đối với

các chủng Vibrio spp.)

Kết quả này cho thấy rằng đối với mẫu cây Eupatorium sp. thì sự hòa tan của

các hợp chất tuy nhiều (Hiệu suất thu hồi cao là 25,46 %) nhưng khả năng hòa tan

của các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như alkaloid và tannin trong dung môi

nước là rất yếu. Khi đó việc sử dụng dung môi nước sẽ không thể tách chiết được

các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học cao.

3.1.1.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc cây

Elephantopus sp.

46

Đồ án tốt nghiệp

14

)

b

m m

13.5

(

13

a 12.5

g n á h k g n ò v h n

í

12 ShF

k g n ờ ƣ Đ

11.5 Mẫu thử nghiệm Elephantopus sp. Ciprofloxacin

Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp.

(Ciprofloxacin sử dụng nồng độ là 500 µg/ml; nồng độ cao nước là 100 mg/ml)

Kết quả kháng khuẩn cao nước của mẫu câu Elephantopus sp. được trình bày

trong Hình 3.7

Theo kết quả trên Hình 3.7 ta thấy rằng với nồng độ 100 mg/ml mẫu cao

nước Elephantopus sp. chỉ kháng được 1/20 chủng vi sinh vật khảo sát đó là chủng

Shi. flexneri với đường kính vòng kháng là 12,2 mm

Dựa theo kết quả xử lí thống kê được thể hiện trên Hình 3.7 ta thấy rằng khi

so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao nước cây Elephantopus sp. so với mẫu

kháng sinh Ciprofloxacin tại nồng độ là 500 µg/ml thì cho kết quả thấp hơn một

cách có ý nghĩa về mặt thống kê. Cụ thể ở đây là đường kính vòng kháng khuẩn của

mẫu kháng sinh là 13,2 mm và đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu cao nước là

12,2 mm.

Mặc dù mẫu cao nước chỉ kháng được một chủng vi sinh vật nhưng đây sẽ là

cơ sở để có thể tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng khác nữa.

47

Đồ án tốt nghiệp

Và kết quả này phù hợp với kết quả hiệu thu hồi ở Hình 3.1 (hiệu suất thu hồi là

15,2 %).

Điều này chứng tỏ rằng đối với mẫu cây Elephantous sp. thì hàm lượng

thành phần hóa học có trong mẫu là rất ít và khi sử dụng dung môi nước để tách

chiết các hợp chất sinh học có trong mẫu cây thì kết quả thu được sẽ không khả

quan.

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao nước các loại cây thuốc

đối với một số chủng vi sinh vật chỉ thị

.

.

.

.

l

l

.

l

l

l

p s

Chủng VSV

p s

m u

p s s u p o t

m / g m

m / g m

a l l i

m / g m ] 0 0 2 [

m / g m ] 0 0 1 [

m / g m ] 0 0 1 [

p s a l a g y l o P

] 0 0 2 [

] 0 0 1 [

n i d e M

p s s u p r a c o d o P

i r o t a p u E

n a h p e l E

- - 13,2 ± 0,3 - - E.coli O157:H7

- - 12,3 ± 0,3 - - E.coli 0208

7,8 ± 0,3 8,2 ± 0,3 13,2 ± 0,3 - - E.coli

- 7,0 ± 0,5 - - - Lis.monocytogenes

- - 8,7 ± 0,3 - - Lis. innocua

- - 10,8 ± 0,8 - - S.dublin

- - 12,0 ± 0,5 - - S.typhii

- - 11,3 ± 0,3 - - Shi.boydii

- 13,3 ± 0,6 9,5 ± 0,5 12,2 ± 0,3 Shi.flexneri

- - 7,5 ± 0,9 - - Shi.sonnei

- - - 9,3 ± 0,3 9,2 ± 0,3 V.alginolyticus

- - - 13,5 ± 0,5 9,5 ± 0,9 V.cholerae

- - 7,7 ± 0,6 8,0 12,8 ± 0,3 V.harveyi

- - 9,3 ± 1,0 9,2 ± 0,8 10,0 P. aeruginosa

48

Đồ án tốt nghiệp

- - 11,0 - - S.aureus

(A2 )

(A1)

(B2)

(B1)

(C1)

(C2)

(D1)

(D2)

- 11,5 ± 1,5 10,8 ± 0,3 10,8 ± 0,3 - E.feacalis

Hình 3.8. Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp. đối với chủng SD

(A1) và ShB (A2), cây Polygala sp. đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium

sp. đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp. với chủng ST (D1) và

cạy Elephantopus sp. đối với chủng ShF (D2).

49

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao nước trên Bảng

3.1 cho thấy rằng khả năng kháng khuẩn của mỗi loại cao nước là khác nhau. Trong

đó mẫu cây Podocarpus sp. và Elephantopus sp. cho kết quả kháng yếu nhất với

mẫu Podocarpus sp. thì kháng được 4 chủng vi sinh vật chỉ thị ở nồng độ là 200

mg/ml và mẫu Elephantopus sp. thì chỉ kháng được 1 chủng vi sinh vật ở nồng độ

100 mg/ml. Trong khi đó với nồng độ khảo sát là 100 mg/ml thì các mẫu cây khác

cho khả năng kháng khuẩn tốt hơn như mẫu cây Eupatorium sp. kháng được 6/20

chủng vi sinh vật khảo sát. Và cho kết quả kháng tốt nhất là mẫu cây Medinilla sp,

với phổ kháng khá rộng là 12/20 chủng vi khuẩn khảo sát.

Dựa vào kết quả ở Bảng 3.1 cũng cho thấy rằng các mẫu cao nước chủ yếu

kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy. Cụ thể như đối với chủng Shi.

flexneri thì cả ba mẫu cây Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp. đều cho

kết quả kháng với vòng kháng khuẩn lần lượt là 13,3 mm, 9,5 mm, 12,2 mm.

Kết hợp với kết quả thu hồi hiệu suất cao nước của các mẫu cây thuốc trong

Hình 3.1 cho thấy kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên là phù hợp với kết

quả thu được

Nhìn chung với dung môi nước thì khả năng kháng khuẩn của các mẫu cây

thuốc đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh còn khá yếu. Nguyên nhân có thể là do

các hợp chất kháng khuẩn có trong các mẫu cây hòa tan kém trong dung môi nước.

Và hàm lượng thành phần hóa học có hoạt tính sinh học trong các mẫu cây còn khá

thấp.

3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nƣớc của một số loại cây

thuốc

Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây

thuốc

50

Đồ án tốt nghiệp

anthra Thí nghiệm carbohydrate alkaloid saponin quinone

Cây thuốc

t s e t

g n

i l

r e n g a

m a o F

r e g a r t n o B

h c s i l o M

h e F

f f r o d n e g a r D

r e y a M

d e o f r a B

W

r e g a H

Medinilla + + - - + - - + -

Polygala + + - + + + + + -

Elephantopus + + + - - - - + -

Eupatorium + - + - - - - + -

Podocarpus + + + - - - - + -

phenolic

Thí nghiệm flavonoid compoun tannin steroid Aa

d

e d

e d

i

n

Cây thuốc

e n

k s w o k

i

l

i

i

e t a t e c a d a e L

i r o l c c i r r e F

i r o l c c i r r e F

e t a t e c a d a e L

n i t a l e G

l a S

i l a k A

a d o n h S

i r d y h n N

n n a m r e b L

Triterpe Triterpe + - + + + + + - Medinilla noid noid

Polygala + + + + - + + - Triterpe Triterpe

51

Đồ án tốt nghiệp

noid noid

Sterol Sterol Elephantopus + - + + - + + -

Triterpe Triterpe + - + + - + + - Eupatorium noid noid

Podocarpus Sterol Sterol - - + + + + + -

Dựa vào kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy đối với mỗi loại cao nước khác nhau sẽ

cho kết quả định tính thành phần hóa học không giống nhau, ngoài ra chúng còn

khác nhau trong từng thử nghiệm. Cụ thể ở đây là đối với thử nghiệm carbohydrate

thì đối với mẫu cao nước Medinilla sp., Elephantopus sp., Podocarpus sp. thì cho

kết quả dương tính với tất cả các thử nghiệm trong khi các mẫu cao nước khác như

Polygala sp., Eupatorium sp., lại cho kết quả dương tính với thử nghiệm Molisch và

Barfoed nhưng lại cho kết quả âm tính với thử nghiệm Fehling. Hoặc nếu xét ở thử

nghiệm alkaloid thì chỉ có cây Polygala sp. là cho kết quả dương tính với các thử

nghiệm như Wagner, Hager, Mayer, Dragendorff trong khi tất cả các mẫu cao nước

còn lại đều cho kết quả âm tính hết.

Sở dĩ có sự khác biệt như vậy là do đối với mỗi hợp chất có trong mỗi loại

cây thuốc có độ hòa tan trong dung môi nước khác nhau và đối với mỗi thử nghiệm

sẽ dùng để kiểm tra một loại thành phần khác nhau. Do đó mà có thể trong cùng

một thử nghiệm mà khi dùng thuốc thử này thì cho kết quả âm tính nhưng khi sử

dụng loại thuốc thử khác thì lại cho kết quả dương tính. Cụ thể như đối với trường

hợp của thử nghiệm carbohydrate của cây Polygala sp., đối với thử này chúng tôi sử

dụng ba loại thuốc thử là Molisch, Fehling và Barfoed. Kết quả của mẫu cây cho

thấy rằng đối với thử nghiệm Molisch và Barfoed thì mẫu cây cho kết quả dương

tính trong khi thử nghiệm Fehling lại cho kết quả âm tính. Nguyên nhân là do đối

với thử nghiệm Molisch thì cho kết quả dương tính với tất cả các loại carbohydrate,

còn Barfoed thì cho kết quả dương tính với các loại đường không khử như

52

Đồ án tốt nghiệp

saccarose và thử nghiệm Fehling thì dùng để thử nghiệm sự có mặt của đường khử

như glucose, fructose…

Đối với mẫu cây Polygala sp. cho kết quả dương tính với thử nghiệm sapoin

và cho kết quả là Triterpenoid trong thử nghiệm Steroid. Kết quả này phù hợp với

nghiên cứu của (K’ Eogh, 1935). Đặc biệt khi so sánh kết quả này với nghiên cứu

của (Uthiraselvam và ctv, 2012) cũng cho kết quả tương tự với thử tất cả các thử

nghiệm.

Dựa theo kết quả trên Bảng 3.1 cho thấy đối với cây Eupatorium sp. ta nhận

được kết quả dương tính với thử nghiệm saponin, cardiac glycoside, tannin,

flavonoid và steroid. Đây là những hợp chất có khả năng kháng khuẩn đối với các vi

sinh vật, và kết quả này phù hợp với nghiên cứu của (Okeke và ctv, 2001; Ralman

và ctv, 2010). Tuy nhiên với kết quả âm tính của thử nghiệm alkaloid thì lại khác

biệt đối với kết quả nghiên cứu của (Okeke và ctv, 2001; Ralman và ctv, 2010), sự

khác nhau này có thể giải thích là do sự khác biệt về phương pháp tiến hành, hay do

tác động của môi trường nuôi cấy mẫu cây thuốc làm ảnh hưởng đến thành phần

hóa học có trong cây.

Theo nghiên cứu của (Wang và ctv, 2007) đã công bố kết quả tìm được các

hợp chất acid caffeic, acid 3,5-dicaffeoylquinic, 1,4-acid dicaffeoylquinic và 3,4-

dihydroxy-cinnamic acid methyl ester đều thuộc nhóm phenolic. Còn đối với thử

nghiệm hợp chất steroid nghiên cứu của (Liang và ctv, 2012) công bố tìm được các

hợp chất betulinic acid thuộc nhóm triterpenoid và hợp chất stigmasterol thuộc

nhóm sterol. Khi đối chiếu kết quả này với kết quả định tính thành phần hóa học thu

được từ mẫu cây Elephantopus sp. là trùng khớp

53

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Khi đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của năm mẫu cây thuốc thu tại vườn

quốc gia Bioup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng cho thấy rằng hiệu suất thu hồi cao nước

của các mẫu cây thuốc là khác nhau. Trong đó cho kết quả hiệu suất thu hồi cao

nước tốt nhất là mẫu cây Eupatorium sp. với 25,5 % rồi đến các mẫu cây như

Medinilla sp., Polygala sp., Elephantopus sp. và cuối cùng cho kết quả thấp nhất là

mẫu cây Podocarpus sp. với hiệu suất thu hồi là 12,0 %.

Với kết quả thu được khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của năm mẫu cao nước

đối với một số nhóm vi sinh vật chỉ thị cho thấy rằng kết quả kháng khuẩn rất khác

nhau đối với mỗi cao nước. Cụ thể là đối với mẫu cây Podocarpus sp. kháng được

4/20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính vòng kháng từ 7,7 mm đến 13,5 mm.

Mẫu cây Polygala sp. kháng được 6/20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính

vòng kháng là từ 8,0 mm đến 11,5 mm. Mẫu cây Medinilla sp. kháng được 12/20

chủng vi sinh vật chỉ thị với nồng độ kháng là 100 mg/ml, mẫu cây Eupatorium sp.

kháng được 5/20 chủng vi sinh vật chỉ thị và cuối cùng là mẫu cây Elephantopus sp.

chỉ kháng được 1/20 chủng vi sinh vật chỉ thị ở nồng độ kháng là 100 mg/ml.

Kết quả định tính thành phần hóa học cao nước của các mẫu cây thuốc cho thấy

sự khác nhau về thành phần hóa học của các mẫu cây. Cụ thể ở đây là đối với thử

nghiệm carbohydrate, saponin, flavonoid, phenolic và tannin đều cho kết quả dương

tính với các thử nghiệm. Với thử nghiệm alkaloid thì chỉ có cây Polygala sp. là cho

kết quả dương tính. Trong khi đó, năm mẫu cao nước đều cho kết quả âm tính với

thử nghiệm anthraquinone và thử nghiệm amino acid. Đối với thử nghiệm Steroid

thì mẫu cây Medinilla sp., Polygala sp., Eupatorium sp. đều cho kết quả là

triterpenoid, còn mẫu Elephantopus sp., và Podocarpus sp. cho kết quả là sterol.

4.2. Đề nghị

Khảo sát thêm hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân gian tại vườn

quốc gia Bioup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

54

Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh khác

Tiến hành khảo sát các mẫu cây thuốc trên nhiều loại dung môi khác nhau

Định lượng một số thành phần hóa học có trong các mẫu cây thuốc.

55

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Ngô Văn Thu. 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà

Nội

Phạm Thanh Kỳ và ctv. 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học

Dược Hà Nội

Đỗ Tất Lợi. 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y

học

Viện dược liệu. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I,

Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật.

Viện Dược liệu. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, tập II,

Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.

Phạm Minh Nhựt. 2013. Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học

Công Nghệ Tp. HCM.

Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi

sinh vật.

Lê Ngọc Thuỳ Trang. 2013. Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến

khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá

luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM.

Trần Linh Thước. 2010. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mỹ phẩm, tái bản lần thứ sáu. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.

56

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Radulovíc 2013. Antimicrobial Plant Metabolites: Structural Diversity and

Mechanism of Action. Current Medicinal Chemistry, 20, 932-952.

Aljos F., 1998. World Checklist and Bibliography of Conifers. Royal

Botanic Gardens, Richmond, UK

Laubenfels D., David J., 1985. A taxonomic revision of the genus

Podocarpus. Blumea 30 : 51- 278.

Lüdtke R., 2013. The genus Polygala L. in Southern Brazil. Hoehnea 40(1),

1-50.

Renner S. S., 2004. Multiple Miocene Melastomataceae dispersal between

Madagascar, Africa and India. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 359(1450):

1485-1494

Chen Cheih., 1984. Melastomataceae. In: Chen Cheih, ed., Fl. Reipubl.

Popularis Sin. 53(1): 135–293.

King R. M., Robinson H., 1987. The genera of Eupatorieae. Monographs in

Systematic Botany, Missouri Botanical Garden 22: 1-581.

Okeke MI., Iroegbu CU., Eze EN., Okali AS., Esimone., CO., 2001.

Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for antibacterial

activity. Ethnopharmacol J., 78: 119-127.

Rahman MA., Ahsna T., Islam S., 2010. Antibacterial and antifungal properties of

methanol extract from the stem of Argyreia argentea. Bang J. Pharmacol., 5: 41-44.

Abdillahi HS., 2011. Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and

phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in South

Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503.

Jemmi T., Stephan R., 2006. Listeria monocytogenes: food-borne pathogen

and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571-580.

57

Đồ án tốt nghiệp

Cavalcanti T. B., 2008. A New Species of Polygala from Brazil. Novon 18

(1), 90-93

Consolacion Y., Ragasa., Agnes B., Alimboyoguen., and Chien-Chang Shen

Antimicrobial Terpenoids from Elephantopus mollis. NRCP Research Journal,

2009, 10(1):33-38

Tomoko N., Takashi A., Hiromu T., Yuka I., Hiroko M., Munekazu I.,

Totshiyuki T., Tetsuro I., Fujio A., Iriya I., and Tsutomu N., Kazuhito W.

Antibacterial activity of extracts prepared from tropical and subtropical plants on

methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Health Sci (2002). 48, 273–276.

Fakras, G. L. and Kiraly, Z. Relation between phenol metabolism and stem

rust resistance in wheat. Phytopathology, (1962) 52;651 – 664.

Uthiraselvam M., et al. Screening Of Phytochemical And Antibacterial

Activity Of Polygala javana Plant Leaf, Stem And Root Extract Against Human

Pathogen. International Journal of PharmTech Research CODEN (USA): IJPRIF

ISSN : 0974-4304 Vol.4, No.4, pp 1792-1796.

58

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

CAO CHIẾT NƢỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC

A.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây

Podocarpus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

Podocarpus sp. (Cao nƣớc)

STT Chủng [200] mg/ml

lần 1 lần 2 lần 3

- - 1 Escherichia coli O157:H7 -

- - 2 Escherichia coli 0208 -

- - 3 Escherichia coli (K) -

- 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC -

- - 5 Listeria innocua -

- - 6 Listeria monocytogenes

- - 7 Salmonella dublin -

- - 8 Salmonella enteritidis -

8 7.5 9 Salmonella typhi (K) 8

- - 10 Salmonella typhimurium -

- - 11 Shigella boydii -

- - 12 Shigella flexneri -

9 9.5 13 Shigella sonnei 9.5

- - 14 Vibrio alginolyticus -

- - 15 Vibrio cholerae -

13 14 13.5 16 Vibrio harveyi

- - 17 Vibrio parahaemolyticus -

- - 18 Pseudomonas (K) -

8 7 19 Staphylococcus aureus 8

- - 20 Enterococcus feacalis -

1

Đồ án tốt nghiệp

A.2. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Polygala sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

Polygala sp. (cao nƣớc)

[100] mg/ml [200] mg/ml

STT Chủng lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3

E. coli O157:H7 1 - - - - - -

Escherichia coli 0208 2 - - - - - -

Escherichia coli (K) 8.5 8.5 3 8 8 8 8

E.coli-ETEC 4 - - - - - -

Listeria innocua 5 - - - - - -

Listeria monocytogenes 6 - - - - - -

Salmonella dublin 7 - - - - - -

Salmonella enteritidis 8 - - - - - -

Salmonella typhi (K) 9 - - - - - -

Salmonella typhimurium 10 - - - - - -

Shigella boydii 11 - - - - - -

Shigella flexneri 12 - - - - - -

Shigella sonnei 13 - - - - - -

Vibrio alginolyticus 14 - - 9 5 9.5 -

Vibrio cholerae 15 - - 10 10 8.5 -

16 8 8 8 Vibrio harveyi 8.5 8 8

- 9 - 13 - 10.5 - 10 - 8.5 - 11.5 17 Vibrio parahaemolyticus 18 19 20 Pseudomonas (K) Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis - - - 10 - - - 10.5 - - - 11

A.3. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Medinilla sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

STT Chủng Medinilla sp. (Cao nƣớc)

2

Đồ án tốt nghiệp

[100] mg/ml

lần 2 lần 3 lần 1

10 10 10 1 Escherichia coli O157:H7

10 11 10.5 2 Escherichia coli 0208

11.5 11 10.5 3 Escherichia coli (K)

- - - 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC

8.5 9 8.5 5 Listeria innocua

- - - 6 Listeria monocytogenes

10 11.5 11 7 Salmonella dublin

- - - 8 Salmonella enteritidis

11.5 12.5 12 9 Salmonella typhi (K)

- - - 10 Salmonella typhimurium

11.5 11 11.5 11 Shigella boydii

13 14 13 12 Shigella flexneri

6.5 8 8 13 Shigella sonnei

- - - 14 Vibrio alginolyticus

- - - 15 Vibrio cholerae

- - - 16 Vibrio harveyi

- - - 17 Vibrio parahaemolyticus

8.5 9 10 18 Pseudomonas (K)

11 11 11 19 Staphylococcus aureus

11 11 10.5 20 Enterococcus feacalis

A.4. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây Eupatorium sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

STT Chủng Eupatorium sp. (Cao nƣớc)

3

Đồ án tốt nghiệp

[100] mg/ml

lần 1 lần 2 lần 3

1 Escherichia coli O157:H7 - - -

2 Escherichia coli 0208 - - -

3 Escherichia coli (K) - - -

4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - -

5 Listeria innocua - - -

Listeria monocytogenes 7.0 7.5 6.5 6

7 Salmonella dublin - - -

8 Salmonella enteritidis - - -

9 Salmonella typhi (K) - - -

10 Salmonella typhimurium - - -

11 Shigella boydii - - -

12 Shigella flexneri 9.5 9.0 10.0

13 Shigella sonnei - - -

14 Vibrio alginolyticus - - -

15 Vibrio cholerae - - -

16 Vibrio harveyi 13 13 12.5

17 Vibrio parahaemolyticus - - -

18 Pseudomonas (K) 10 10 10

19 Staphylococcus aureus - - -

20 Enterococcus feacalis 11 11 10.5

A.5. Kết quả khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn của cao chiết nƣớc cây

Elephantopus sp. đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

Elephantopus sp. (Cao nƣớc)

STT Chủng [100] mg/ml

lần 1 lần 2 lần 3

1 Escherichia coli O157:H7 - - -

4

Đồ án tốt nghiệp

2 Escherichia coli 0208 - - -

3 Escherichia coli (K) - - -

4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC - -

5 Listeria innocua - - -

6 Listeria monocytogenes - -

7 Salmonella dublin - - -

8 Salmonella enteritidis - - -

9 Salmonella typhi (K) - - -

10 Salmonella typhimurium - - -

11 Shigella boydii - - -

12 Shigella flexneri 12 12 12.5

13 Shigella sonnei - - -

14 Vibrio alginolyticus - - -

15 Vibrio cholerae - - -

16 Vibrio harveyi - - -

17 Vibrio parahaemolyticus - - -

18 Pseudomonas (K) - - -

19 Staphylococcus aureus - - -

20 Enterococcus feacalis - - -

A.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin đối

với các nhóm vi sinh vật chỉ thị

Ciprofloxacin

[100] mg/ml [500] mg/ml

STT lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3

0 0 0 13 13 13.5 1

0 0 0 12.5 12 12.5 Chủng Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 2

0 0 0 13 13 13.5 Escherichia coli 3

5

Đồ án tốt nghiệp

(K)

0 30.5 31 31.5 0 0 4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC

0 11.5 12 12.5 0 0 5

0 12 12 12.5 0 0 6

0 12 11.5 13 0 0 7

0 13.5 13 12.5 0 0 8

0 13 12 12.5 0 0 9

0 11 11 11 0 0 10 Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhi (K) Salmonella typhimurium

0 0 0 0 0 0 11 Shigella boydii

0 13 13 13.5 0 0 12 Shigella flexneri

33 32.5 15 14.5 15.5 33.5 13

34 16.5 16 34 34.5 16 14 Shigella sonnei Vibrio alginolyticus

22 13 14 22.5 22.5 13 15 Vibrio cholerae

33 33.5 17.5 18.5 32.5 18 16

28 28.5 11.5 11.5 11 28

17

0 12.5 11.5 12.5 0 0 18

0 12 12 12.5 0 0 19

0 12 11.5 12.5 0 0 20 Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticu s Pseudomonas (K) Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis

6

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƢỚC CỦA

MỘT SỐ MẪU CÂY THUỐC

B.1. Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu cây Polygala sp. đối với một số

chủng vi sinh vật gây bệnh

B.2. Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu cây Eupatorium sp. đối với

một số chủng vi sinh vật gây bệnh

7

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MÊM

STATGRAPHIC

C.1. Kết quả sử lí thống kê đối với mẫu cao nƣớc Medinilla sp. đối với

một số chủng vi sinh vật chỉ thị.

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 7.04167 7.04167 0.166667 0.666667 7.70833 0.0029 42.25 1 4 5

Mean 11.0 13.1667 Homogeneous Groups X X Count 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 16.6667 16.6667 0.166667 0.666667 17.3333 100.00 0.0006 1 4 5

Homogeneous Groups

Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Col_5 E.coli(K) Cipro-E.coli Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 Lis.inno Cipro-inno Count 3 3 Mean 8.66667 X X 12.0

8

Đồ án tốt nghiệp

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2.66667 2.66667 0.583333 2.33333 5.0 0.0993 4.57 1 4 5

Homogeneous Groups

Count 3 3 Mean 10.8333 X 12.1667 X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.375 1.0 1.375 0.2879 0.375 0.25 1.50 1 4 5

Count 3 3 Mean 12.0 12.5 Homogeneous Groups X X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 5.04167 5.04167 0.166667 0.666667 5.70833 0.0053 30.25 1 4 5

Count 3 3 Mean 10.5 12.3333 Homogeneous Groups X X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 15.0417 15.0417 0.0416667 0.166667 15.2083 361.00 0.0000 1 4 5

Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_1 S.dublin Cipro-dub Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_3 S.typhi Cipro-typhi Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD A.Col_3 0208 Cipro-0208 Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.)

9

Đồ án tốt nghiệp

Count 3 3 Mean 10.0 13.1667 Homogeneous Groups X X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 192.667 192.667 0.0416667 0.166667 192.833 4624.00 0.0000 1 4 5

Count 3 3 Mean 0.0 11.3333 Homogeneous Groups X X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0416667 0.0416667 0.208333 0.833333 0.875 0.6779 0.20 1 4 5

Homogeneous Groups

Mean 13.1667 X 13.3333 X Count 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 975.375 2.0 977.375 1950.75 0.0000 975.375 0.5 1 4 5

Count 3 3 Mean 7.5 33.0 Homogeneous Groups X X

Multiple Range Tests for A.Col_2 by A.Col_1 Method: 95.0 percent Tukey HSD A.Col_1 0157:H7 Cipro-H7 Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_1 Cipro-boy Shi.boy Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_3 Cipro-flex Shi.flex Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_5 Shi.sonnei Cipro-son Bảng One way ANOVA

10

Đồ án tốt nghiệp

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 13.5 1.83333 15.3333 13.5 0.458333 0.0056 29.45 1 4 5

Homogeneous Groups

Mean 9.16667 X X 12.1667 Count 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2.04167 2.04167 0.0416667 0.166667 2.20833 0.0022 49.00 1 4 5

Mean 11.0 12.1667 Homogeneous Groups X X Count 3 3

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2.04167 2.04167 0.166667 0.666667 2.70833 0.0249 12.25 1 4 5

Homogeneous Groups

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_1 Pseu Cipro-pseu Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_3 S.aureus Cipro-aure Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E.Col_5 E.feacalis Cipro-fea Count 3 3 Mean 10.8333 X X 12.0

B.2. Kết quả xử lí thống kê của với mẫu Podocarpus sp. đối với một số chủng vi

sinh vật chỉ thị

Bảng One – Way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square 1 10.6667 4 0.666667 5 11.3333 10.6667 0.166667 F-Ratio P-Value 64.00 0.0013

11

Đồ án tốt nghiệp

Homogeneous Groups

Count 3 3 Mean 9.83333 X X 12.5

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 704.167 704.167 0.166667 0.666667 704.833 4225.00 0.0000 1 4 5

Homogeneous Groups

Count 3 3 Mean 11.3333 X X 33.0

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 459.375 459.375 0.25 1.0 460.375 1837.50 0.0000 1 4 5

Count 3 3 Mean 15.5 33.0 Homogeneous Groups X X

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 9.375 0.833333 10.2083 9.375 0.208333 0.0026 45.00 1 4 5

Homogeneous Groups

Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 S.typhi(K) Ciprofloxacin Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B.Col_1 Shi.sonnei Ciprofloxacin Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C.Col_1 V.harveyi Ciprofloxacin Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.) Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D.Col_1 S.aureus Ciprofloxacin Count 3 3 Mean 9.66667 X X 12.1667

12

Đồ án tốt nghiệp

B.3. Kết quả xử lí thống kê hiệu suất thu hồi cao nƣớc của một số mẫu cao

nƣớc cây thuốc

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 81.6229 326.492 1.43868 14.3868 340.878 0.0000 56.73 4 10 14

Bảng One way ANOVA Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Col_1 podocarpus elephantopus medinilla polygala eupatorium Count 3 3 3 3 3 Homogeneous Groups Mean 11.99 X 15.1533 X X 20.1833 X 20.5267 X 25.46

13

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG PHƢƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

D.1. Thử nghiệm carbohydrate

Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng

thành 100 ml

Thuốc thử Fehling:

o Fehling A: Hòa tan 34,6g CuSO4.5H2O vào 500 ml nước cất.

o Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g KaliNatritartrate.7H2O vào 500 ml

nước cất

Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000 ml nước cất. Cân

66,5g copper (II) acetate monohydrate, đổ hỗn hợp trên vào và đem đi đun, khuấy

cho đến khi tan hoàn toàn.

D.2. Thử nghiệm alkaloid

Thuốc thử Mayer : Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60 ml nước, sau đó đổ vào

trong dung dịch này 5g KI được pha trong 10 ml nước. Định mức hỗn hợp lên 100

ml

Thuốc thử Dragendorff: Gồm 2 dung dịch

o Dung dịch A: Hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml

acid acetic 20%

o Dung dịch B: Dung dịch KI 40% pha trong nước cất

o Khi sử dụng thì trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước

Thuốc thử Hager: Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất

Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g Iodine và 6g KI vào 100 ml nước cất.

D.3. Thử nghiệm cardiac glycosides

14

Đồ án tốt nghiệp

Thuốc thử Na nitro prusside: 1g Na nitroferricyanide và bổ sung 10 ml nước

cất.

15