Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Ngọc Hạnh

MSSV: 1151110125

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM

nói chung và các anh chị công tác tại phòng Vi sinh nói riêng, đã tạo điều kiện cho

em tham gia làm đồ án tốt nghiệp tại đây.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn

Thị Thùy Dương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong

quá trình làm đồ án tốt nghiệp của em tại Trung tâm.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công

Nghệ Tp.HCM và quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức

cần thiết, bổ ích để chúng em có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình.

Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành và ủng hộ

em trong suốt quá trình này.

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN

TP.HCM, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Trần Thị Ngọc Hạnh

Sinh viên thực hiện

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân. Các kết quả và

số liệu trong đồ án là trung thực.

Ngƣời cam đoan

Trần Thị Ngọc Hạnh

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. .......................................................................... 3

1.1.1 Phân loại ...................................................................................................... 3

1.1.2 Vòng đời ...................................................................................................... 3

1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng ..................................................................... 4

1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng ............................................. 5

1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum ........................................................................ 5

1.2.1 Phân loại ...................................................................................................... 5

1.2.2 Điều kiện sống ............................................................................................. 6

1.2.3 Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 7

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng .................................................................................. 8

1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ................................................................. 8

1.2.6 Độc tố của P. lilacinum ............................................................................. 10

1.2.7 Quá trình kí sinh ........................................................................................ 11

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 12

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 12

2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu ............................................................. 12

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................ 12

2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu .................................................................. 12

2.2.3 Hóa chất ..................................................................................................... 14

2.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 16

2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm

P. lilacinum ........................................................................................................ 16

2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum ............................................................ 18

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 19

i

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 20

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ...... 20

3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease ...................................... 20

3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.

lilacinum ............................................................................................................. 26

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum ............................................... 30

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne

spp. của các chủng nấm P. lilacinum ................................................................. 31

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp.

............................................................................................................................ 36

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 39

4.1 Kết luận ............................................................................................................ 39

4.2 Đề nghị ............................................................................................................. 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 40

ii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Vũng Tàu ................................................................................................................... 12

Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau ............................................................ 20

Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau ............................................................ 22

Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ...................... 25

Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau ................................................................. 26

Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau ................................................................. 27

Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ...................... 30

Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng

nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ......................... 32

Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời

gian khác nhau ........................................................................................................... 35

Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P.

lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ..................................... 36

Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P.

lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian

khác nhau................................................................................................................... 38

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân

lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. ...................................... 24

Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân

lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian. ...................................... 29

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum

phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau. ................... 34

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.

................................................................................................................................... 37

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. ................................................ 3

Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp.. ................................................ 5

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường

PDA. ............................................................................................................................ 7

Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum. ...................... 7

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin. .................................................. 11

Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24

giờ; 48 giờ và 72 giờ ................................................................................................ 21

Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 ở 48 giờ ........ 21

Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 và KL 6.2 và KL 5.2 ở 72 giờ. 24

Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và

đất canh tác sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ. .................................................................... 25

Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ , 48 giờ , 72 giờ. ...... 27

Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ . ..... 29

Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký

sinh. hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh.

................................................................................................................................... 33

Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh.

hình dạng con cái ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, con cái bị kí sinh. ........................ 37

v

Đồ án tốt nghiệp

TÓM TẮT

Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của 38 chủng nấm Purpureocillium

lilacinum bằng phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch. Sau

thử nghiệm, chọn lọc ra các chủng nấm tiêu biểu có khả năng tiết enzyme ngoại bào

protease và chitinase mạnh để thử nghiệm khả năng ký sinh con cái và khối trứng

Meloidogyne spp. trực tiếp trên đĩa Petri.

Kết quả, tất cả các chủng nấm Purpureocillium lilacinum đều có khả năng

tiết enzyme ngoại bào và khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase.

Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải cơ chất tối ưu nhất đạt được

sau 48 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh là PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2

và KL 5.3. Đối với enzyme protease thì các chủng nấm khảo sát có khả năng tiết

mạnh nhất sau 72 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy casein mạnh là PB 2.10, PB

1.3, KL 5.3 và KL 6.2. Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết enzyme

ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Kết quả thử

nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất cả các chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3,

PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 đều có thể ký sinh con cái Meloidogyne spp. nhanh và

mạnh hơn so với khối trứng của nó.

vi

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Tuyến trùng ký sinh trên thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế đối

với nhiều loại cây trồng có giá trị thương nghiệp. Hàng năm, tuyến trùng gây tổn

thất 11% năng suất các loại cây ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây,

củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% năng suất các loại cây trồng

kinh tế quan trọng (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, tuyến

trùng phát triển khá mạnh và gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều

vùng, đặc biệt là rau và các loại cây công nghiệp trong đó có cây hồ tiêu. Cây hồ

tiêu là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, được trồng ở nhiều nơi và có giá

trị xuất khẩu cao trên thế giới. Diện tích đất canh tác ở Vũng Tàu chiếm 9047 ha,

trong đó có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân là do

tuyến trùng gây nên.Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật

kéo theo các tác động tiêu cực đến môi trường và an toàn sức khỏe cho con người

và vật nuôi. Bên cạnh đó, nó còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc

phòng trừ ngày càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác

nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong

kiểm soát tuyến trùng gây hại. Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm có khả

năng ký sinh tuyến trùng là vấn đề đang được quan tâm hiện nay.

Nấm Purpureocillium đã được chứng minh có khả năng ký sinh tuyến trùng

hiệu quả và sống hoại sinh trong vùng rễ nhiều loại cây trồng. Chúng đã được

nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác

định khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Purpureocillium còn rất hạn chế đặc

biệt là các chủng nấm được phân lập ở vùng Đông Nam Bộ. Do đó, năm 2014,

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh đã xác định sự phân bố của nấm

này ở các hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) ở vùng này.

Kết quả cho thấy nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng, trong đó có hệ sinh thái rừng

ngập mặn ở Vũng Tàu. Việc xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh

tuyến trùng của các chủng nấm này là rất cần thiết có thể giúp ích trong việc kiểm

1

Đồ án tốt nghiệp

soát bệnh do tuyến trùng gây ra trong tương lai. Do đó dẫn đến lý do chọn đề tài:

“Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng

của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất

canh tác ở Vũng Tàu”.

Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái

và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacium

(P. lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào cũng

như kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng ngập

mặn và đất canh tác ở Vũng Tàu. Từ đó, xác định được hệ sinh thái đất (đất rừng

hay đất canh tác) tồn tại những chủng nấm P. lilacinum có đặc tính tốt.

Ý nghĩa thực tiễn

So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng xâm nhập tuyến trùng

của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác giúp chọn lọc

được chủng nấm kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhằm ứng dụng chúng để phòng trừ

tuyến trùng gây hại cây trồng.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp.

1.1.1 Phân loại

Meloidogyne spp. là tuyến trùng ký sinh thực vật. Chúng tồn tại trong đất ở

nơi có khí hậu nóng hay có mùa đông ngắn. Khoảng 2000 loài thực vật bị nhiễm

loại tuyến trùng này, nó chiếm 5% trong nguyên nhân gây mất mùa trên thế giới

(Sasser, 1985). Ấu trùng xâm nhập vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, hấp

thụ chất dinh dưỡng của thực vật. Gây ra hiện tượng chết ở cây con và giảm năng

suất ở cây trưởng thành khi xâm nhập vào cây. Phân loại theo Goeldi (1889) như

sau:

Giới: Animalia

Nghành: Nematoda

Lớp: Secernentea

Bộ : Tylenchida

Họ: Meloidogynidae

Chi: Meloidogyne

1.1.2 Vòng đời

Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật.

(Nguồn: www.daf.qld.gov.au)

3

Đồ án tốt nghiệp

Tuyến trùng rễ bắt đầu vòng đời ở giai đoạn trứng phát triển thành ấu trùng

tuổi 1. Giai đoạn này ấu trùng sống trong túi trứng và lột xác chuyển sang giai đoạn

ấu trùng tuổi 2. Ấu trùng ở thời kỳ này có thể bắt đầu xâm nhập vào rễ thực vật,

chúng tấn công vào chóp rễ rồi đi vào các gian bào. Ấu trùng di chuyển đến các tế

bào đang phân chia để tạo vị trí lấy thức ăn bằng cách tiêm dịch tiết của tuyến thực

quản vào trong các tế bào rễ. Những dịch được tiết ra này là nguyên nhân gây ra sự

thay đổi các chức năng sinh lý của tế bào ký sinh. Ấu trùng tuổi 2 chưa có cơ quan

sinh sản. Giống với giun tròn, tuyến trùng rễ trải qua 4 giai đoạn ấu trùng, trong mỗi

giai đoạn chúng lột xác giống như côn trùng. Nhờ vậy ấu trùng có một vài nét tương

đồng với tuyến trùng đực và cái ở giai đoạn trưởng thành. Ở giai đoạn tuổi 4, là quá

trình từ ấu trùng chuyển sang dạng hình cầu ở con cái trưởng thành hay dạng giun

của con đực trưởng thành có thể nhìn thấy rõ ràng hơn. Con cái trưởng thành có thể

đẻ từ 500 đến hơn 1000 trứng.

Chiều dài của vòng đời tuyến trùng rễ khác nhau tùy theo mỗi loài, nhưng

ngắn nhất là trong khoảng 2 tuần. Các loài ở những vùng lạnh hơn thì vòng đời sẽ

dài hơn. Trứng của tuyến trùng có thể ở nguyên trong rễ hay lẫn vào trong đất.

Trứng nở một cách ngẫu nhiên, không cần tiếp xúc với các dịch chiết ở rễ. Trong

điều kiện thuận lợi, trứng có thể tồn tại trong đất ít nhất trong vòng 1 năm

(Mitkowski và cộng sự, 2003).

1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng

Tuyến trùng cái đẻ trứng vào chất nền gelatin được sản xuất bởi 6 tuyến trực

tràng, và được tiết ra trước và trong suốt quá trình đẻ trứng. Hình dạng chất nền ban

đầu là ống thông qua các lớp ngoài của mô rễ bao quanh trứng, tạo thành một lớp

bảo vệ chống mất nước bằng cách duy trì một mức độ ẩm cao quanh trứng (Bird,

1887).

Cấu tạo của trứng tuyến trùng: lớp vỏ trứng là phần bền nhất của trứng tuyến

trùng, có vai trò trong việc chống lại các tác nhân bất lợi về mặt hóa học và sinh học

(Wharton, 1980). Vỏ trứng của tuyến trùng có thể bao gồm từ một đến năm lớp tùy

thuộc theo từng bộ tuyến trùng. Cấu trúc thường thấy nhất của vỏ trứng gồm: lớp

4

Đồ án tốt nghiệp

trong cùng là lớp lipid, một lớp chitin ở chính giữa (thành phần chính) và lớp màng

vitelline ở ngoài cùng (Bird và cộng sự, 1976). Lớp chitin đóng vai trò quan trọng

trong việc tạo ra một cấu trúc bền vững để bảo vệ cho lớp lipid trong cùng. Lớp

lipid bao gồm một chuỗi màng lipoprotein và dày nhất trong khoảng 0,02 – 0,04

µm, có vai trò trong việc chống thấm để bảo vệ trứng khỏi các tác nhân hóa học bất

lợi (Wharton, 1980). Nếu lớp chitin bị loại bỏ thì lớp lipid cũng dễ dàng bị phá hủy.

1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng

Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp..

(Nguồn: www.lsuagcenter.com)

Con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp. hình cầu với cổ ngắn chứa kim hút

(nên gần giống với hình quả lê), diều giữa và tuyến thực quản (Mitkowski và cộng

sự, 2003). Thành cơ thể của tuyến trùng cái được bao bọc bởi lớp cutin chứa rất ít

chitin mà chủ yếu là protein và collagen (Watson, 1965). Lớp cutin Meloidogyne

incognita dày khoảng 1,5 µm bao gồm lớp vỏ, lớp trung gian và lớp cơ bản. Lớp vỏ

được phân tối thiểu thành 5 lớp và có dộ dày khoảng 0,1 µm, lớp giữa thì khoảng

0,4 µm và lớp cơ bản là 0,5 µm (Baldwin và cộng sự, 1975).

1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum

1.2.1 Phân loại

P. lilacinum được mô tả lần đầu bởi nhà nghiên cứu nấm người Mỹ Charles

Thom vào năm 1910, dưới tên gọi Penicillium lilacinum (Thom, 1910). Phân loại

giống với chủng Penicillium amethystinum của Wehmer và Spicaria rubidopurpurea

5

Đồ án tốt nghiệp

của Aoki (Thom, 1974). Năm 1974, Robert A. Samson chuyển tên Penicillium

lilacinum thành Paecilomyces (Samson, 1974). Các ấn phẩm được xuất bản trong

những năm thập niên 20, chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là một đơn ngành

(Inglis và cộng sự, 2006), và có họ hàng gần với các chủng Paecilomyces

nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola. Chi mới

Purpureocillium được tạo ra để giữ sự phân loại này (Sung và cộng sự, 2007). là tên

chung dùng để chỉ các loại nấm sản sinh bào tử tím (Luangsa-Ard và cộng sự, 2011).

P. lilacinum được phân loại là nấm sinh sản vô tính bằng bào tử theo loài

Isarioidea, và đã được chấp nhận ở khắp nơi trên thế giới, do dạng sinh sản hữu tính

hiếm khi được tìm thấy. Phân tích phát sinh loài cho thấy P. lilacinum phân lập được

có mối quan hệ gần với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài

Paecilomyces kí sinh côn trùng khác trong bộ Hypocreales (Inglis và cộng sự, 2006).

Nấm này được phân loại theo Samson và cộng sự (2011) như sau:

Giới: Fungi

Nghành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Ophiocordycipitaceae

Chi: Purpureocillium

Loài: Purpureocillium lilacinum

1.2.2 Điều kiện sống

Nấm P. lilacinum là nấm sợi hoại sinh phổ biến, đã được phân lập từ một loạt

các môi trường sống như đất trồng trọt, đất bỏ hoang, rừng đồng cỏ, sa mạc, trầm

tích ở cửa sông và bùn thải. Nó cũng được tìm thấy trên trứng của tuyến trùng và

con cái của tuyến trùng gây nốt sần ở rễ cây. Bên cạnh đó, nó cũng được tìm thấy ở

vùng rễ của nhiều loại cây trồng.

Nhiều loài có thể phát triển trên một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng từ 8oC đến 38oC và phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 26oC đến 30oC. Nấm này có thể chịu

6

Đồ án tốt nghiệp

được một khoảng pH rộng và có thể phát triển trên nhiều loại môi trường tự nhiên

(Samson, 1974; Anderson và cộng sự, 1995).

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.

(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp)

Khuẩn lạc của P. lilacinum trên môi trường thạch Malt tăng trưởng khá nhanh đạt đường kính 5 – 7 cm trong vòng 14 ngày ở 25oC (77oF), gồm dạng nền bông với

hệ sợi nấm dinh dưỡng tăng trưởng nhanh, ban đầu màu trắng nhưng khi hình thành

bào tử thì chuyển sang màu tím. Mặt khác, có một số chủng đôi khi không có màu

nhưng thường thì đều có màu tím (Samson, 1974).

Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum.

(Nguồn: http://thunder-house4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html)

P. lilacinum tạo thành một hệ sợi nấm dày đặc sản sinh ra cuống bào tử đính.

Sợi nấm sinh dưỡng có vách trơn, trong suốt, rộng từ 2,5 – 4 µm. Cuống bào tử

được sinh ra từ các sợi nấm cơ chất, hoặc những sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng

400 – 600 µm. Thể bình phình ra ở gốc và thon dần về phía ngọn. Bào tử trần được

7

Đồ án tốt nghiệp

sinh ra tạo thành chuỗi dài, ở phía cuối thể bình gắn trên cuống bào tử. Bào tử nảy

mầm khi có đủ độ ẩm và dinh dưỡng thích hợp. Bào tử trần có dạng elip đến hình

thoi, có vách trơn hơi nhám. Không xuất hiện bào tử đảm (Samson, 1974).

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Nấm không có diệp lục tố nên cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (dị

dưỡng) sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong trứng và

tuyến trùng Meloidogyne spp.) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Do trứng và tuyến

trùng là nguồn hữu cơ phức tạp nên nấm sẽ tiết ra enzyme ngoại bào (protease,

chitinase) để phân giải các chất khó hấp thụ thành những chất đơn giản dễ sử dụng

(Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005).

1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Vỏ trứng được cấu tạo từ 3 lớp khác biệt và thành phần chính gồm protein và

chitin, đã tạo thành cấu trúc dạng sợi nhỏ chứa glycoprotein ở dạng vô định hình

(Perry, 2002). Chitinase và proteases đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình

xâm nhập vào vỏ trứng, và tác động vào sự phân hủy của vỏ trứng (Morton, 2003;

Segers, 1996). Nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào (đặt biệt là enzyme protease,

chitinase và collagenase) có ảnh hưởng nhiều trong việc ký sinh lên trứng của tuyến

trùng (Huang, 2004).

P. lilacinum có khả năng tiết enzyme serine protease và chitinase để tham gia

vào quá trình phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Morgan và cộng sự, 1984; Khan và

cộng sự, 2004). Nhiều enzyme được tiết bởi P. lilacinum đã được nghiên cứu.

Enzyme serine protease cơ bản có khả năng phân hủy sinh học trứng Meloidogyne

hapha (Bonants và cộng sự, 1995). Một chủng P. lilacinum đã được phân lập và

nghiên cứu có khả năng tiết enzyme protease và chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến

trùng Meloidogyne javanica để cho móc xâm nhiễm có thể đâm xuyên qua vỏ trứng

(Khan và cộng sự, 2004).

8

Đồ án tốt nghiệp

Enzyme protease

Enzyme protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm enzyme có khả

năng phân giải protein. Đó là quá trình chuyển hóa protein bằng cách cắt các liên

kết peptide (-CO-NH-) liên kết các acid amin trong một chuỗi polypeptide. Protease

được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn

nhóm: Serin proteinase - những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong

trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của

enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Các serine

proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ

chất tương đối rộng. Cysteine proteinase - chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt

động. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc

hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase - chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt

động. Các aspartic thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase -

được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các

metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh

dưới tác dụng của EDTA (Trần Thị Nhã Uyên, 2010).

Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới

sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có

chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett,

1994). Bước 1 - hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với

nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm

imidazole từ histidine. Bước 2 (khử acyl hóa) phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi

phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển

proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.

Enzyme chitinase

Chitinase là enzyme thủy phân liên kết glycoside trong chitin (Jolles, 1999).

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β-

D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt

9

Đồ án tốt nghiệp

nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides. Chitin 1,4-β-

chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer

chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin

từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-

glucosamine. Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và

chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân

tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính

endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt

chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3]

từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2, β-N-acetyl

hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu

không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc).

Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên

cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém

hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm (Lê Thị Huệ, 2010).

1.2.6 Độc tố của P. lilacinum

Ngoài khả năng tiết enzyme ngoại bào P. lilacinum còn có khả năng sinh độc tố.

Độc tố chính của nấm P. lilacinum là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các

tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một

chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C.

Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2[2-(3-

arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl]propan-2-ylcarbamoy]-3-

methylbutyl]carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2-

hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-

[(E.4S)-4-methylhex-2-enoyl]pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen và cộng sự,

1977).

Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi

chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài

10

Đồ án tốt nghiệp

khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin,

viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ

cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin.

1.2.7 Quá trình kí sinh

Nấm xâm nhập vào trứng và con cái của tuyến trùng thông qua chất nền

gelatin của trứng và lỗ sinh dục hay cổ của tuyến trùng cái. Một khi vào bên trong,

sợi nấm sẽ phân nhánh và đâm xuyên qua bề mặt vỏ trứng. Chỗ phình ra ở đầu sợi

nấm sẽ tạo ra những đĩa áp tiếp xúc với bề mặt trứng. Móc xâm nhập được tạo nên

bên dưới sợi áp sẽ đâm xuyên và mọc bên trong vỏ trứng. Trứng bị xâm nhiễm sẽ

phình ra và biến dạng. Sau đó, lớp màng vitelline chia thành ba vùng, xuất hiện một

lượng lớn không bào và lớp lipid hầu như biến mất (Esser và cộng sự, 1993). Khi

sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng tiêu diệt các ấu trùng bên trong

trước khi tiến ra khỏi vỏ trứng rỗng để sản sinh bào tử đỉnh và mọc về phía các

trứng liền kề. Ở con cái trưởng thành giai đoạn bị nhiễm nấm là khi sợi nấm tiến

vào lỗ sinh dục hoặc hậu môn (Jatala và cộng sự, 1979).

11

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2:

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4 – tháng 8 năm 2015

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Vi sinh – Trung tâm công nghệ sinh

học thành phố Hồ Chí Minh.

2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị

Nồi hấp khử trùng

Que cấy điểm

Dao cấy

Đĩa Petri

Ống ngiệm

Đèn cồn

Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm

Micropipette

2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu

Vật liệu: Khối trứng và tuyến trùng cái Meloidogyne spp. được thu nhận từ rễ

cây.

Đối tượng: 38 chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Vũng Tàu do Phòng Công nghệ Vi sinh của Trung Tâm Công nghệ sinh học cung

cấp.

Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Vũng Tàu

NGUỒN GỐC

Đất rừng Bình Châu - Phước Bửu ở Vũng Tàu

STT 1 2 3 4 TÊN PB 1.1 PB 1.3 PB 1.7 PB 1.10

12

Đồ án tốt nghiệp

Đất canh tác ở Vũng Tàu

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 PB 2.9 PB 2.10 PB 3.1 PB 3.3 PB 3.4 KL 1.2 KL 1.3 KL 1.4 KL 3.1 KL 4.1 KL 5.1 KL 5.2 KL 5.3 KL 6.1 KL 6.2 KL 8.2 HT 1.1 HT 1.2 HT 1.3 HT 2.1 HT 2.2 HT 2.3 HT 3.1 HT 3.2 HT 3.3 HT 4.1 HT 4.2 HT 4.3 HT 5.1 HT 5.2 HT 6.1 HT 6.3 HT 7.2 HT 7.3

13

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3 Hóa chất

Các môi trường sử dụng

Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

PDA 39 g

Nước cất 1000 ml

pH = 6,1 – 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút.

Môi trường cảm ứng enzyme protease

1,5 g KH2PO4

1,4 g K2HPO4.3H2O

0,4 g CaCl2.2H2O

0,41 g MgSO4.7H2O

NaCl 0,2 g

Agar 16 g

Casein 1%

Nước cất 1000 ml

pH = 6,1 – 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút.

Cách pha dung dịch casein 1%: Đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch

đệm sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorensen cho đủ 100 ml.

Chuẩn bị dung dịch đệm casein 1%: Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: Hoà tan

5,96 g Na2HPO4 trong nước cất thành 250 ml. Dung dịch KH2PO4 1/15 M: Hòa tan

0,9072 g KH2PO4 trong nước cất thành 100 ml. Dung dịch đệm sorensen 1/15 M:

Trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh

lại pH = 7,6.

Môi trường cảm ứng enzyme chitinase

1,5 g KH2PO4

1,4 g K2HPO4.3H2O

0,4 g CaCl2.2H2O

0,41 g MgSO4.7H2O

14

Đồ án tốt nghiệp

NaCl 0,2 g

15 g NaNO3

Chitin huyền phù 1%

Agar 16 g

Nước cất 1000 ml

pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút.

Cách chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột vỏ tôm được cho dần vào 20 ml HCl đậm đặc, để ở 4oC và khuấy đều qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/

phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính.

Thêm nước cất vào tủa cho đến thể tích 100 ml (Dai và cộng sự, 2011).

Môi trường Water Agar (WA)

Agar 16 g

Nước cất 1000 ml

pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút.

Môi trường Water Agar (WA) mềm

Agar 14 g

Nước cất 1000 ml

pH = 6,1 - 6,5 Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút.

Các thuốc thử sử dụng

Thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%

TCA 10 g

Nước cất 100 ml

Thuốc thử lugol

Iod tinh thể 1 g

KI 2 g

Nước cất 300 ml

15

Đồ án tốt nghiệp

Cách pha: Hòa tan KI trong cối với 5 - 10 ml nước cất. Thêm Iod tinh thể vào

và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và

thêm nước cất đến 300 ml. Bảo quản trong lọ màu và chỉ trong vòng 30 ngày trước

khi sử dụng (Nguyễn Đức Lượng, 2003).

Thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm lactophenol cotton blue (LPCB)

Phenol tinh thể 20 g

Cotton blue (Aniline blue) 0,05 g

Glycerol 40 ml

Acid lactic 20 ml

Nước cất 20 ml

Cách pha: Hòa tan phenol tinh thể, glycerol và acid lactic với nước cất trong

cốc thủy tinh đem đun cách thủy, sau đó cho thuốc nhuộm cotton blue rồi trộn đều.

Bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu (TCVN).

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase

của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.

- So sánh khả năng xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các

chủng nấm P. lilacinum này.

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm

P. lilacinum

Nguyên tắc

Đối với enzyme protease: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung

casein 1%, nấm sẽ tiết ra enzyme protease phân giải casein thành các amino acid.

Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 10%,

chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 10%.

Đối với enzyme chitinase: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung

chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc

16

Đồ án tốt nghiệp

mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng

màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi

trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương

pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ

chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase (Lê Thị Huệ, 2010).

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 38 chủng nấm khảo sát.

Thực hiện trên đĩa Petri chứa môi trường có chứa cơ chất cảm ứng enzyme cần

khảo sát và lặp lại 3 lần cho mỗi chủng nấm ứng với mỗi mốc thời gian khảo sát

(24, 48, 72 giờ).

Thực hiện

Cấy nấm từ ống giống vào môi trường thạch PDA trong đĩa Petri bằng phương

pháp cấy điểm rồi đem ủ trong 7 ngày. Sau đó, cấy chuyển nấm từ môi trường PDA

qua môi trường thạch WA trong đĩa Petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để sợi

nấm phát triển. Tiếp theo, đổ môi trường đã hấp khử trùng có chứa cơ chất cảm ứng

phù hợp với enzyme cần khảo sát vào đĩa Petri (9 ml môi trường / đĩa) và để nguội.

Sử dụng dụng cụ khoan thạch 5 mm để đục các tản thạch có chứa tơ nấm trên môi

trường WA, rồi dùng dao cấy chuyển các tản thạch này vào môi trường có chứa cơ

chất cảm ứng bằng phương pháp cấy úp ngược đĩa thạch để tránh hiện tượng phát tán

bào tử ra xung quanh môi trường. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi nhỏ thuốc thử phù hợp

với từng loại enzyme cần khảo sát (TCA 10% đối với enzyme protease và lugol đối

với enzyme chitinase) sau 24, 48, 72 giờ để xác định vòng phân giải cơ chất.

Chỉ tiêu theo dõi

Đo đường kính khuẩn lạc (d, mm) và đường kính vòng phân giải cơ chất (D,

mm) sau các khoảng thời gian 24, 48, 72 giờ sau khi cấy.

Xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm dựa vào hiệu D -

d (mm).

17

Đồ án tốt nghiệp

Đối với enzyme protease:

D - d ≥ 9: mạnh

7≤ D - d < 9: khá

5 ≤ D - d < 7: trung bình

D - d < 5: yếu

Đối với enzyme chitinase:

D - d ≥ 5: mạnh

4 ≤ D - d < 5: khá

3 ≤ D - d < 4: trung bình

D - d < 3: yếu

2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức là số chủng

nấm P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh ở hai vùng và được lặp

lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Mỗi lần lặp lại tiến hành trên 3 - 4 con cái hay khối

trứng đặt trong đĩa Petri chứa môi trường WA mềm.

Thực hiện

Theo phương pháp cải tiến của Stirling và West (1991), thu nhận trứng và con

cái từ các nốt sần của rễ tiêu. Rửa qua trứng và con cái vài lần bằng nước cất đã

được hấp khử trùng để loại bỏ chất bẩn, rồi đặt chúng lên khăn giấy vô trùng. Sử

dụng dụng cụ khoan lỗ thạch đục các tản thạch có chứa sinh khối nấm đã được nuôi

cấy sau 7 ngày trên môi trường PDA sao cho các tản nấm được đục nằm trên cùng

một vòng tròn để nấm trên các miếng thạch được tương đồng với nhau. Rồi, dùng

dao cấy chuyển các tản nấm lên môi trường WA mềm chứa trong đĩa Petri đã chuẩn

bị trước đó. Đồng thời, đặt các khối trứng hoặc con cái xung quanh tản nấm này.

Đem để ở nhiệt độ phòng và tiến hành quan sát để kiểm tra khả năng ký sinh

(Stirling và cộng sự, 1991).

18

Đồ án tốt nghiệp

Chỉ tiêu theo dõi

Tính số con cái hay khối trứng bị nấm ký sinh sau mỗi 24 giờ. Thí nghiệm này

sẽ kết thúc khi có một chủng nấm ký sinh hoàn toàn số con cái hay khối trứng trong

một thí nghiệm. Dùng thuốc nhuộm LPCB để quan sát sự xâm nhập của sợi nấm

vào trứng và con cái.

Xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm theo công thức: Tỷ

lệ con cái hay khối trứng được ký sinh trên tổng số con cái hay khối trứng có trong

một đĩa. Theo đó,

Tỷ lệ ký sinh trên 75%: ký sinh mạnh

Tỷ lệ ký sinh từ 50 - 75%: ký sinh khá

Tỷ lệ ký sinh từ 25 - 50%: ký sinh trung bình

Tỷ lệ ký sinh nhỏ hơn 25%: ký sinh yếu

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Tính hiệu D-d và tỷ lệ ký sinh tuyến trùng bằng chương trình Excel 2007. Sau

đó xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.0. Phân loại số liệu theo

LSD0,05.

19

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum

3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease

Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm được

phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu, ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết

quả thu được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2

Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau

Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm))

Chủng 24h 48h 72h

6,203i-l 9,347abc 7,070f-j TB (chủng) 7,540C PB 1.1

8,770a-e 8,130c-g 8,443b-f 8,448AB PB 1.3

6,820g-k 6,243h-k 5,800j-m 6,288D PB 1.7

8,790a-e 8,847a-d 6,143j-l 7,927BC PB 1.10

4,720lmn 4,957l-n 7,013f-j 5,564D PB 2.9

7,125f-j 9,907ab 10,003a 9,012A PB 2.10

7,247e-j 8,28c-g 7,787d-h 7,771BC PB 3.1

4,130n 5,393k-n 7,753d-i 5,759D PB 3.3

7,790d-h 6,096D 4,517mn 5,980j-m PB 3.4

7,534A 6,481B 7,454A TB (thời gian)

CV(%)=13,261 F*A = 15,73 F*B = 10,31 F**AB = 5,37

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi

kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α

= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

20

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào bảng kết quả 3.1, có thể thấy các chủng nấm phân lập ở đất rừng

Vũng Tàu đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy không có

sự khác biệt về khả năng tiết enzyme ngoại bào ở 48 giờ và 72 giờ. Ở thời gian đầu

nuôi cấy, các chủng nấm này phân hủy cơ chất yếu nên vòng phân giải chỉ đạt 6,481

mm do đây là giai đoạn thích nghi khi nấm mới vừa được cấy vào môi trường có

chứa cơ chất cảm ứng nên lượng enzyme được tiết ra để phân giải casein còn ít. Xét

riêng theo từng chủng, có thể thấy PB 2.10 có khả năng tiết enzyme protease mạnh

nhất, tiếp theo là chủng PB 1.3 và yếu nhất là chủng PB 2.9. Và chủng PB 2.10

cũng là chủng có khả năng phân giải cao nhất sau 48 và 72 giờ. Ngoài ra ở 48 giờ

chủng PB 1.1 và PB 1.10 cũng tiết enzyme mạnh. Nhìn chung, chủng PB 3.3 phân

A

C

hủy cơ chất yếu nhất ở 24 giờ.

B

Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ

A

(A); 48 giờ (B) và 72 giờ (C).

B

C

Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1 (A), PB 1.10 (B), PB 3.1 (C) ở 48 giờ

21

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau

Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 24h 48h 72h TB (chủng)

6,940q-e 7,917i-w 8,173h-t 7,697D-H KL 1.2

5,017g-k 5,397d-k 6,680t-f 5,698LM KL 1.3

6,910r-e 6,637t-f 9,410b-j 7,652E-H KL 1.4

6,643t-f 6,753t-e 8,930c-m 7,442F-I KL 3.1

6,883r-e 5,8933a-j 8,213g-t 6,997H-K KL 4.1

8,000h-v 7,247n-b 8,770d-n 8,006C-G KL 5.1

7,413m-b 8,167h-t 3,780k 6,453JKL KL 5.2

7,480m-a 9,523b-i 11,233a 9,412A KL 5.3

6,953q-e 9,343b-k 6,227x-h 7,508E-H KL 6.1

9,950a-f 8,093h-u 10,150a-e 9,398A KL 6.2

6,730t-f 5,130f-k 7,830j-x 6,563I-L KL 8.2

7,993h-v 9,347b-k 7,350m-b 8,230B-F HT 1.1

8,030h-v 8,777d-m 4,760h-k 7,189G-J HT 1.2

7,687l-y 10,290a-d 7,333m-b 8,437B-E HT 1.3

5,370e-k 6,066z-i 6,790s-e 6,076KLM HT 2.1

6,197y-h 7,013p-d 7,530l-z 6,913H-K HT 2.2

8,373f-s 7,223n-b 10,363a-d 8,653ABC HT 2.3

7,507a-z 9,600b-h 6,967q-e 8,024C-G HT 3.1

6,943q-e 4,370jk 4,500ijk 5,271M HT 3.2

22

Đồ án tốt nghiệp

8,553e-q 10,370a-d 6,950q-e 8,624A-D HT 3.3

6,680t-f 7,413m-b 10,467abc 8,187C-F HT 4.1

6,443v-g 7,807j-y 8,633e-o 7,628E-H HT 4.2

7,077o-c 6,990p-d 6,520u-g 6,862H-K HT 4.3

6,713t-f 4,547ijk 5,860b-j 5,707LM HT 5.1

7,767k-y 9,147b-l 10,557ab 9,157AB HT 5.2

5,553c-j 7,163n-c 9,533b-i 7,417F-I HT 6.1

6,927r-e 8,593e-p 7,570l-z 7,697D-H HT 6.3

6,447v-g 6,470v-g 8,480f-r 7,132G-J HT 7.2

6,343w-h 7,180n-b 9,820a-g 7,781C-H HT 7.3

7,087C 7,533B 7,910A TB (thời gian)

CV(%)= 13,372 F*A=10,16 F*B=14,63 F**AB=5,69

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi

kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α

= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

Theo bảng kết quả 3.2, có thể thấy các chủng nấm phân lập được từ đất canh

tác cũng đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy các chủng

tiết enzyme tốt nhất ở 72 giờ do giai đoạn từ 24 và 48 giờ nấm cần thích nghi với

môi trường. Xét riêng theo từng chủng thì KL 5.3 và KL 6.2 có khả năng tiết

enzyme mạnh nhất và yếu nhất là chủng HT 3.2. Chủng KL 5.3 và KL 6.2 cũng

phân giải casein mạnh ở thời gian 72 giờ, bên cạnh đó còn có thêm các chủng HT

2.3, HT 4.1 và HT 5.2. Ở 24 giờ, chủng KL 6.2 có khả năng phân giải cơ chất

mạnh. Còn chủng HT 1.3 và HT 3.3 có vòng phân giải lớn nhất ở 48 giờ. Nhìn

chung, thì chủng KL 5.2 phân hủy cơ chất yếu nhất ở 72 giờ.

23

C

A

B

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 (A) và KL 6.2 (B) và KL 5.2 (C) ở 72

giờ.

Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.

Theo biểu đồ 3.1, nhìn chung, có thể thấy ở các mốc thời gian khảo sát, vòng

phân giải casein trung bình của các chủng phân lập từ đất canh tác lớn hơn so với

đất rừng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nguyên nhân là

do khả năng tiết enzyme ngoại bào protease giữa các chủng trong cùng một vùng

không đồng đều. Cụ thể, ở thời gian 24 giờ có 3,45% các chủng phân lập từ đất

canh tác có khả năng tiết enzyme mạnh, 37,93% có khả năng tiết enzyme khá và

không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, hầu hết các chủng phân lập từ

đất rừng có khả năng phân hủy cơ chất ở mức độ khá (bảng 3.3). Sự khác biệt này

có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa

các hợp chất có bản chất protein. Ở mốc thời gian 48 giờ, số chủng nấm phân hủy

24

Đồ án tốt nghiệp

cơ chất ở mức độ mạnh, khá, trung bình tương đương nhau ở cả hai vùng. Tuy

nhiên, tỷ lệ phần trăm số chủng tiết enzyme ở mức độ yếu ở đất canh tác ít hơn so

với đất rừng. Ở 72 giờ, hầu hết các chủng phân lập ở đất rừng có khả năng tiết

enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, khả năng tiết

enzyme ngoại bào của các chủng ở đất canh tác yếu hơn so với thời gian 48 giờ. Sự

khác biệt này có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi

trường có chứa cơ chất bản chất là protein nên khi phát triển qua một thời gian nấm

đã điều tiết lượng enzyme vừa đủ để phân giải cơ chất, còn các chủng phân lập từ

đất rừng đã qua giai đoạn thích nghi nên phân hủy cơ chất mạnh hơn.

Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau

Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng

24 giờ

48 giờ

KL 1.2

B

A

A

KL 5.1

72 giờ Đất rừng Đất canh tác Đất rừng Đất canh tác Đất rừng Đất canh tác 9 29 9 29 9 29 Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme Yếu Trung bình Khá Mạnh 33,33 0 11,11 3,45 0 10,34 0 44,45 37,93 3,45 33.33 22,23 41,38 27,58 66,67 11,11 37,93 27,59 22,22 58,62 33,33 27,59 22,22 24,14

PB 3.1

PB 1.7

B

C

PB 3.4

KL 5.2

C

Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất

canh tác sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).

25

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.

lilacinum

Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase của các chủng

nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết

quả thu được tương ứng với bảng 3.3 và 3.4

Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau

Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 72h TB (chủng) 24h 48h

2,470def 2,700de 3,263C 4,620c PB 1.1

1,953fgh 1,193ij 2,588D 4,617c PB 1.3

1,560ghi 1,260hij 1,960F 3,060d PB 1.7

2,170efg 0,943ijk 2,460DE 4,263c PB 1.10

2,683def 3,110d 3,824B 5,680b PB 2.9

2,037efg 0,750jk 2,430DE 4,503c PB 2.10

2,023efg 0,273k 2,118DE 4,057c PB 3.1

2,530def 4,473c 4,518A 6,550a PB 3.3

2,490def 0,983ijk 2,598D 4,320c PB 3.4

2,213B 1,743C 4,630A TB (thời gian)

CV(%)= 15,848 F*A=31,12 F*B=314,94 F**AB= 6,31

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi

kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α

= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

Dựa vào bảng kết quả 3.4, có thể nhận thấy rõ ràng các chủng nấm thu được từ

đất rừng ở Vũng Tàu có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, và phân giải

chitin mạnh ở thời gian 48 giờ và giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng lên. Nhìn

26

Đồ án tốt nghiệp

chung, chủng PB 3.3 có khả năng tiết enzyme mạnh nhất và thấp nhất là chủng PB

1.7. Và chủng PB 3.3 cũng phân giải cơ chất mạnh nhất ở 48 giờ, tiếp theo là chủng

A

B

C

PB 2.9 và thấp nhất là chủng PB 3.1 ở 72 giờ.

Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).

Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau

Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm)) Chủng 72h TB (chủng) 24h 48h

KL 1.2

KL 1.3

KL 1.4

KL 3.1

KL 4.1

KL 5.1

KL 5.2

KL 5.3

KL 6.1

KL 6.2

KL 8.2

HT 1.1

HT 1.2

HT 1.3

5,537y-h 2,447y-h 1,680h-l 3,593q-v 2,557x-h 2,327z-y 2,527y-h 3,877p-t 1,953e-k 2,60w-h 2,677v-h 3,333s-z 2,950t-e 3,003t-d 3,627q-v 5,293i-n 5,360h-n 3,813p-u 6,097e-k 4,597m-q 3,457s-y 4,817l-p 6,907cde 5,443g-n 6,357d-h 5,017l-o 8,213ab 6,883cde 4,710l-p 6,170e-j 1,770g-l 0,883lmn 1,037k-n 1,307j-m 3,230s-a 2,137c-j 0,270n 4,153o-s 0,640mn 1,363i-m 1,977e-k 2,253a-j 2,683v-h 1,800f-l 2,753v-g 3,200J-N 2,897K-O 2,177P 3,666G-J 3,461H-K 2,64NOP 2,538OP 4,979BC 2,679M-P 3,440H-L 3,223J-M 4,600BCD 4,172D-G 3,171J-N 4,183D-G HT 2.1

27

Đồ án tốt nghiệp

HT 2.2

HT 2.3

HT 3.1

HT 3.2

HT 3.3

HT 4.1

HT 4.2

HT 4.3

HT 5.1

HT 5.2

HT 6.1

HT 6.3

HT 7.2

6,977cde 5,330i-n 7,183cd 5,023l-o 5,577f-m 6,577c-f 6,413c-g 6,303d-i 6,937cde 5,480g-n 5,110k-o 7,377bc 4,520n-r 5,040l-o 2,843u-e 3,890p-t 3,370s-y 3,237s-a 2,693v-g 3,113t-b 3,173s-b 3,263s-a 6,300d-i 2,107c-j 3,927p-t 3,027t-d 2,323z-i 2,263a-j 5,710f-l 3,557r-x 1,783f-l 1,087k-n 1,070k-n 1,750g-l 2,693v-g 2,180b-j 9,150a 1,027k-n 2,037d-k 2,787v-f 5,207j-n 2,447y-h 5,177B 4,259DEF 4,112D-G 3,116J-O 3,113J-O 3,813F-I 4,093D-G 3,916E-H 7,462A 2,871L-O 3,691F-J 4,397CDE 4,017E-H 3,250I-M HT 7.3

5,758A 3,007B 2,439C TB (thời gian)

CV(%)= 16,784 F*A=24,07 F*B=697,4 F**AB=8,03

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi

kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α

= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

Tương tự các chủng phân lập từ đất rừng, các chủng nấm từ đất canh tác ở

Vũng Tàu đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Ban đầu, các chủng

nấm này tiết enzyme trung bình 3,007, mạnh nhất ở thời gian 48 giờ và yếu dần khi

thời gian nuôi cấy tăng dần (bảng 3.5).

Ở bảng 3.5, khi xét theo trung bình, chủng HT 5.1 tiết enzyme chitinase mạnh

nhất (7,462 mm), tiếp theo là HT 2.2 (5,177 mm) và thấp nhất là chủng KL 1.4

(2,177 mm). Xét theo thời gian khảo sát, chủng có đường kính vòng phân giải cơ

chất lớn nhất là HT 5.1 ở thời gian 72 giờ, tiếp theo là HT 1.1 ở 48 giờ và thấp nhất

là KL 5.2 ở 72 giờ.

28

A

B

C

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).

Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.

Dựa theo biểu đồ 3.2, nhìn chung, vòng phân giải chitin trung bình của các

chủng nấm phân lập ở đất canh tác lớn hơn so với các chủng ở đất rừng. Tuy nhiên,

sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê là do khả năng tiết enzyme của

các chủng trong từng vùng không đồng đều.

Sau 24 giờ nuôi cấy, tất cả các chủng phân lập ở đất rừng chỉ tiết enzyme ở

mức độ yếu (bảng 3.6). Còn các chủng ở đất canh tác tiết enzyme mạnh đạt 6,89%,

trung bình là 44,83% còn lại là ở mức độ yếu. Ở 48 giờ, không có chủng nấm nào

tiết enzyme yếu. Hầu hết các chủng phân lập từ đất canh tác tiết enzyme mạnh,

trong khi các chủng ở đất rừng có mức độ tiết enzyme khá. Sau 72 giờ, hầu hết các

29

Đồ án tốt nghiệp

chủng điều phân giải cơ chất ở mức độ yếu. Trong đó, không có chủng nào ở đất

rừng tiết enzyme mạnh, còn tỷ lệ các chủng mạnh ở đất canh tác chiếm 10,34%.

Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau

Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh

9 100 0 0 0 Đất rừng 24 giờ 29 48,28 44,83 0 6,89 Đất canh tác

9 0 11,11 66,67 22,22 Đất rừng 48 giờ 29 0 6,9 13.79 79,31 Đất canh tác

9 77,78 11,11 11,11 0 Đất rừng 72 giờ 29 79,31 6,9 3,45 10,34 Đất canh tác

Tuyển chọn các chủng P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh

Qua kết quả thu được từ các bảng trên, có thể thấy được các chủng nấm phân

lập từ đất rừng hay đất canh tác đều có khả năng tiết enzyme protease và chitinase.

Tuy nhiên khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase.

Tiêu chí chọn chủng là phải có khả năng tiết enzyme protease hoặc chitinase

mạnh nhất hay tiết hai loại enzyme này đều mạnh. Theo đó, các chủng nấm phân

lập từ đất rừng được tuyển chọn: PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10 và PB 3.3.

Trong đó, chủng tiết enzyme chitinase mạnh nhất là PB 3.3 và chủng tiết enzyme

protease mạnh nhất là PB 2.10. Các chủng nấm được phân lập từ đất canh tác được

tuyển chọn: KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1. Trong đó, chủng HT 5.1 có khả

năng tiết enzyme chitinase mạnh nhất, chủng KL 5.3 và KL 6.2 tiết enzyme

protease mạnh nhất.

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum

Chúng tôi chọn các chủng nấm PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3, KL

5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1 có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và

30

Đồ án tốt nghiệp

chitinase mạnh để khảo sát khả năng ký sinh con cái và khối trứng tuyến trùng

Meloidogyne spp.

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne

spp. của các chủng nấm P. lilacinum

31

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và

đất canh tác ở Vũng Tàu

Tỷ lệ ký sinh (%) trên trứng

Chủng

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8

Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14

2,67c

3,67c

6c

7,67b

9,33c

11bc

12,67d

16d

23,67d

32b

39c

44,33ab 48,67ab 50,33ab

PB 1.1

17,67ab

27,67ab 33,33ab 39,67a

45,33ab

51a

56ab

61ab

66,67ab

74a

78,33a

80,33a

82a

82,33a

PB 1.3

13,33abc 17abc

23,33abc 27abc

30,67a-d

34,33a-d

40,67a-d

49ab

52,67abc

54ab

55ab

56,67ab

20ab

PB 1.10 9bc

29abc

38,67abc 44,67abc

58,33abc

73,67a

76,67a

78,33a

79,33a

80,33a

34ab

24ab

PB 2.10 11,67abc 15,33abc 20abc

4,67bc

7bc

9,33bc

12,33b

16,33bc

22,67bcd 26,67bcd

33bcd

36,67ab 39,33bc

42ab

44,33ab 46ab

19bc

PB 3.3

3,33c

4,33c

6c

10c

12,33c

13,33d

14,67d

17,33d

19,67b

23c

24,67b

25,67b

27b

7,67b

KL 5.3

2c

4c

5,33c

8,67c

10c

12,67d

15d

23,67d

28b

32,33c

34,33b

36b

37,67b

7,33b

KL 6.2

2,67c

4c

7c

11,33c

13,33bc 17cd

19cd

27cd

33b

35c

37,33b

39b

41b

9,33b

HT 3.3

23,33a

29a

33,33a

38,33a

44a

50a

54a

60a

67,67a

72a

76ab

79,33a

82a

83,67a

HT 5.1

3,38*

3,08*

2,75*

2,9*

2,95*

3,26*

3,2*

3,44*

3,33*

3,39*

3,36*

3,24*

3,09*

3,06*

F

43,09

40,48

36,3

34,15

31,77

30,11

27,89

24,3

22,94

21,12

20,43

20,28

19,57

CV(%)

42,97

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt

thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

32

Đồ án tốt nghiệp

Theo số liệu của bảng 3.7, có thể thấy nấm ký sinh trên trứng diễn ra trong

vòng 14 ngày. Và nấm xâm nhiễm trên 50% các khối trứng trong 1 đĩa sau ngày thứ

5, điều này phù hợp với nghiên cứu của Jatala và cộng sự (1979). Trong 5 ngày đầu

tiên, hầu hết các chủng nấm phân lập được đều có khả năng ký sinh yếu, do ở giai

đoạn này sợi nấm chỉ mới bắt đầu tiếp xúc với bề mặt khối trứng chứ chưa đâm

xuyên vào chúng. Ngày thứ 6, hầu hết các chủng nấm đều ký sinh khối trứng tuyến

trùng ở mức dưới trung bình, chỉ có chủng PB 1.3 và HT 5.1 đạt mức trung bình. Ở

ngày thứ 7 và thứ 8 kết quả cũng tương tự như vậy. Vào ngày thứ 9, ngoài hai

chủng PB 1.3 và HT 5.1 còn có thêm chủng PB 2.10 có mức độ xâm nhiễm tuyến

trùng trong khoảng 50 - 75%. Kết quả tương tự cho đến ngày thứ 11, nhưng có thêm

chủng PB 1.10 ký sinh ở mức khá. Ở ba ngày cuối, các chủng PB 1.3, PB 2.10, HT

5.1 có khả năng ký sinh mạnh, còn chủng PB 3.3, KL 5.3, KL 6.2 và HT 3.3 ở mức

trung bình và ở mức độ khá là chủng PB 1.10. Có thể thấy rằng, việc ký sinh lên

khối trứng của các chủng phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào protease

hoặc chitinase mạnh, trong đó chủng PB 2.10 có khả năng tiết protease mạnh và tỷ

lệ ký sinh đạt 80,33% ở ngày thứ 14. Còn tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của

C

B

chủng HT 5.1 đạt 83,67% (ở ngày 14) tiết enzyme chitinase mạnh nhất.

A A Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký A

sinh. (A) hình dạng khối trứng ban đầu, (B) nấm tiếp xúc khối trứng, (C) khối trứng bị kí

sinh.

33

Đồ án tốt nghiệp

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum

phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.

Nhìn chung các chủng nấm phân lập từ đất rừng có khả năng ký sinh khối

trứng cao hơn so với đất canh tác ở tất cả các khoảng thời gian khảo sát, nhưng sự

khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê do khả năng ký sinh khối trứng của

các chủng không đồng đều trong cùng một vùng.

Tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của các chủng nấm ở ngày đầu hầu hết

dưới 25% (bảng 3.8). Ngày thứ 2, 3, 4, 5, dưới 40% chủng có khả năng ký sinh khối

trứng ở mức độ trung bình, còn lại là yếu. Từ ngày 6 đến ngày 10, khả năng ký sinh

khối trứng của các chủng phân lập từ hai vùng tương đương nhau ở mức độ khá,

khả năng ký sinh ở mức độ yếu và trung bình của các chủng từ đất rừng là tương

đương nhau. Khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm ở ngày thứ

11,12,13,14 có sự khác biệt nhau rõ rệt. Cụ thể, có 40% các chủng nấm ở đất rừng

có mức độ ký sinh mạnh (trong khi, chỉ 25 % chủng từ đất canh tác).

34

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian

khác nhau

Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Trung bình Khá Mạnh

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 8

Ngày 9

Ngày 10

Ngày 11

Ngày 12

Ngày 13

Ngày 14 Yếu 100 100 80 75 80 75 80 75 60 75 40 75 40 75 20 75 20 50 0 25 0 25 0 25 0 0 0 0 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 5 4 Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác Đất rừng đất canh tác 0 0 20 25 20 25 20 25 40 25 40 0 40 0 60 0 40 25 60 50 40 50 40 50 40 75 20 75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 25 20 25 20 25 40 25 40 25 20 0 20 0 20 0 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 25 40 25 40 25 40 25

35

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp.

Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

Tỷ lệ ký sinh (%) trên con cái Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4

PB 1.1

PB 1.3

PB 1.10

PB 2.10

49,33ab 51,33ab 50,67ab 54,33a 37,67c 72,67d 76,67a-d 81,33abc 83a 74,33cd 84,67abc 88abc 88,33abc 90,67a 81,33c 87,67ab 91,33ab 91ab 93,33a 85,33b PB 3.3

KL 5.3

KL 6.2

HT 3.3

43,33bc 53a 46abc 52,33ab 75,67bcd 82,33ab 82ab 82ab 82bc 87,67abc 89,67ab 88,33abc 86,33ab 92ab 92,67ab 91ab HT 5.1

2,99* 2,77* 1,57* 1,31* F

11,09 5,29 5,27 4,85 CV(%)

Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi

kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α

= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

Dựa vào bảng 3.9, có thể thấy các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh

tác đều có khả năng ký sinh mạnh trên con cái. Sau 1 ngày, các chủng PB 1.3, PB

1.10, PB 2.10, KL 6.2, HT 5.1 đều có khả năng tiếp xúc và kí sinh trên 50% số con

cái thử nghiệm. Từ ngày thứ 2 trở đi, tất cả các chủng nấm thử nghiệm đều có khả

năng xâm nhiễm ở mức độ mạnh tuyến trùng cái, ngoại trừ chủng PB 1.1 và

PB 3.3 ở ngày thứ 2.

36

A

B

C

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. (A)

hình dạng con cái ban đầu, (B) nấm bắt đầu ký sinh, (C) con cái bị kí sinh.

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.

Nhìn chung, tỷ lệ ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ đất canh

tác và đất rừng ở các mốc thời gian khác nhau không khác biệt về mặt thống kê

(biểu đồ 3.4) do khả năng ký sinh không đồng đều giữa các chủng ở các vùng. Từ

đó có thể thấy việc ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm không phụ thuộc vào

nguồn gốc phân lập. Điều này cũng được chứng minh ở bảng 3.10. Mức độ ký sinh

con cái tuyến trùng của các chủng nấm từ đất rừng và đất canh tác đạt khá, trung

bình và tương đương nhau ở ngày thứ 1. Ở ngày thử nghiệm thứ 2, 100% các chủng

từ đất canh tác ký sinh mạnh tuyến trùng cái, còn đối với các chủng từ đất rừng thì

37

Đồ án tốt nghiệp

chỉ có 60% trên tổng số ký sinh đạt mức độ mạnh. Tuy nhiên, sau đó, tất cả các

chủng nấm khảo sát đều có khả năng xâm nhiễm mạnh tuyến trùng cái. Như vậy, có

thể thấy rằng khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. cái mạnh hay yếu

không phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng phân lập mà phụ thuộc vào hệ enzyme

ngoại bào được tiết ra bởi chúng. Các chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào

(protease hay chitinase) mạnh thì ký sinh tuyến trùng mạnh.

Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng

P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian

khác nhau

Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh

Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Yếu Trung bình Khá Mạnh

Đất rừng 0 5 40 60 0 Ngày 1 Đất canh tác 0 4 50 50 0

Đất rừng 0 5 0 40 60 Ngày 2 Đất canh tác 0 4 0 0 100

Đất rừng 0 5 0 0 100 Ngày 3 Đất canh tác 0 4 0 0 100

Đất rừng 0 5 0 0 100 Ngày 4 Đất canh tác 0 4 0 0 100

38

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

Tất cả các chủng nấm P. lilacinum khảo sát đều có khả năng tiết enzyme ngoại

bào protease và chitinase. Trong đó, khả năng tiết enzyme protease của các chủng

nấm mạnh hơn so với tiết enzyme chitinase. Và đường kính vòng phân giải casein

lớn nhất sau 72 giờ, trong khi đường kính vòng phân giải chitin đạt cực đại sau 48

giờ. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về khả năng tiết enzyme

ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Xét riêng theo

vùng đất rừng, chủng PB 2.10 và PB 3.3 tiết enzyme protease và chitinase mạnh

nhất; còn đối với đất canh tác thì các chủng KL 5.3, KL 6.2 và HT 5.1 tối ưu nhất.

Khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum

nhanh và mạnh hơn so với ký sinh khối trứng. Và việc ký sinh tuyến trùng mạnh

hay yếu cũng không phụ thuộc vào nguồn gốc mẫu phân lập mà phụ thuộc vào khả

năng tiết enzyme ngoại bào, chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào phân hủy cơ

chất mạnh là chủng có thể ký sinh tuyến trùng mạnh.

4.2 Đề nghị

Việc đánh giá các chủng nấm P. lilacinum dựa vào định tính hệ enzyme ngoại

bào thường ít chính xác nên tiến hành định lượng enzyme ngoại bào protease và

chitinase để việc chọn chủng được đầy đủ và chính xác hơn.

Cần tiến hành thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cái và trứng trên sần rễ để có

thể đánh giá chính xác hơn bởi vì thực tế tuyến trùng sống và ký sinh bên trong rễ

cây.

39

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Lê Thị Huệ (2010). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của

một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus. Trichoderma và ứng dụng. Luận

văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí

Minh.

Nguyễn Đức Lượng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2. Nxb ĐHQG

Tp.Hồ Chí Minh.

Trần Thị Nhã Uyên (2010). Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các

chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh

vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.

Tài liệu tiếng Anh

Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th ed., Academic Press, America.

Anderson, T.H., Domsch, K.H. and Gams, W. (1995). Compendium of Soil

Fungi. Lubrecht & Cramer Ltd, New York.

Baldwin, J.G. and Hedwig, H. (1975). “Body Wall Fine Structure of the

Anterior Region of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines Males”. Journal

of Nematology, 7 (2), 175 – 193.

Bird, A. F. (1958). “The adult female cuticle and egg sac of the genus

Meloidogyne Goeldi, 1887”. Nematologica, 3 (3), 205 - 212.

Bird, A.F. and McClure, M.A. (1976). “The tylenchid (Nematoda) egg shell:

structure, composition and permeability”. Parasitology, 72 (1), 19 - 28.

Bonants, P.J., Fitters, P.F., Thijs, H., Belder, D.E., Waalwijk, C. and Henfling,

J.W. (1995). “A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with biological

activity against Meloidogyne hapla eggs”. Microbiology, 141 (4), 775 - 784.

De-hui Dai, Wei-lian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li (2011). “Purification

and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus

sp. Hu1”. African Journal of Biotechnology, 10 (13), 2476 - 2485.

40

Đồ án tốt nghiệp

Huang, X., Zhao, N. and Zang, K. (2004). “Extracellular enzymes serving as

virulence factors in nematophagous fungi involved in infection of the host”.

Research in Microbiology, 155, 811-816.

Inglis, P.W. and Tigano, M.S. (2006). “Identification and taxonomy of some

entomopathogenic Paecilomyces spp. (Ascomycota) isolates using rDNA-ITS

Sequences”. Genetics and Molecular Biology, 29 (1), 132-136.

Jatala, P., R. Kaltenbach, and Bocangel, M. (1979). “Biological control of

Meloidogyne incognita acrita and Globoderra pallid on potatoes”. Journal of

Nematology, 11, 303.

Jolles, P. & Muzzarelli, R.A.A. (1999). Chitin and Chitinases. Springer,

America.

Khan, A., Williams, K.L. and Helena, K.M.N. (2004). “Effects of

Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and

hatching of Meloidogyne javanica juveniles”. Biol Control, 31 (3), 346-352.

Luangsa, A.J., Jos, H., Tineke-van, D., Seung-Beom, H., Andrew, M.B.,

Jones, N.L.H. and Robert A. S. (2011). “Purpureocillium, a new genus for the

medically important Paecilomyces lilacinus”. FEMS Microbiology Letters, 321 (2),

141-149.

Morgan, J.G., White, J.F. and Rodriguez, K.R. (1984). “Phytonematode

pathology: ultra structural studies II. Parasitism of Meloidogyne arenaria eggs and

larvae by Paecilomyces lilacinus”. Nematropica, 14 (1), 57-71.

Morton, C.O., Tim, H.M., Kerry, R. and Penny, R.H. (2003). “PCR-based

DNA fingerprinting indicates host-related genetic variation in the nematophagous

fungus Pochonia chlamydosporia”. Mycological Research, 107 (2), 198-205.

Nevalainen, H., Khan, A. and Williams, K. (2003). “Testing the

nematophagous biological control strain Paecilomyces lilacinus 251 for the

Paecilotoxin Production”. FEMS microbiology letter, 227 (1), 107-111.

Perry, R.N. (2002). “Hatching”. In: Lee, D.L. (ed), The biology of nematodes,

Taylor & Francis, London, 147 - 170.

41

Đồ án tốt nghiệp

Samson, R.A. (1974). “Paecilomyces and some allied hyphomycetes”. Studies

in Mycology (Baarn: Centralbureau voor Schimmelcultures), 6, 1-119.

Sasser, J.N. and Carter C.C. (1985). “An Advanced Treatise on Meloidogyne”.

North Carolina State University, 1, 19-24.

Segers, R. (1996). “The role of the proteinase VCP1 produced by the

nematophagous Verticillium chlamydosporium in the infection process of nematode

eggs”. Mycological Research, 100, 421-428.

Stirling, G.R. and West, L.M. (1991). “Fungal parasites of root-knot nematode

eggs from tropical and sub-tropical regions of Australia”. Australasian Plant

Pathology, 20 (4), 149-154.

Sung, G.H., Hywel-Jones, N.L., Sung, J.M., Luangsa-ard, J.J., Sherstha, B.

and Spatafora, J.W. (2007). “Phylogenetic classification of Cordyceps and the

clavicipitaceous fungi”. Studies in Mycology, 57 (1), 5-59.

Thom, C. (1910). “Cultural studies of species of Penicillium”. USDA Bureau

of Animal Industry Bulletin, 118, 1-109.

Watson, B.D. (1965). “The fine structure of the body-wall and the growth of

the cuticle in the adult nematode Ascaris lumbricoides”. Journal of Cell Science,

106 (1), 83-91.

Wharton, D. (1980). “Nematode eggshells”. Parasitology, 81, 447-463.

Tài liệu từ Internet

Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Diệp và Nguyễn Văn Thành (2005). Giáo trình

môn nấm học (online), 10/07/2015,

http://thuvien.yersin.edu.vn/doc/giao-trinh-mon-nam-hoc-phan-1-pgs-ts-nguyen-

van-ba-bien-soan-dh-can-tho-293739.htm

Esser, R.P.and El-Gholl, E.. Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes

nematode eggs, 7/2015,

https://www.freshfromflorida.com/content/download/10991/142237/nem203.pdf

Mitkowski, N.A. and Abawi, G.S. (2003). Root-knot nematodes, 5 July 2015,

http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNemato

de.aspx

42

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG NẤM

P. lilacinum

Phụ lục A.1: Khả năng tiết enzyme ngoại bào protease

Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng

Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein

Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm))

24 giờ

48 giờ

STT

Chủng

LL1

A1 PB 1.1 A2 PB 1.3 A3 PB 1.7 A4 PB 1.10 A5 PB 2.9 A6 PB 2.10 A7 PB 3.1 A8 PB 3.3 A9 PB 3.4

LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 6,47 9,19 7,94 9,64 3,32 8,23 7 2,84 3,41

6,1 8,17 6,7 8,27 3,76 7,075 6,8 4,72 6,28

6,04 8,95 5,82 8,46 7,09 6,07 7,94 4,83 3,86

9,68 7,3 7,27 6,74 4,72 8,94 8,58 5,18 6,5

8,1 8,18 5,46 10,14 5,44 10,63 8,78 5,68 5,96

LL3 10,26 8,91 6 9,66 4,71 10,15 7,48 5,32 5,48

72giờ LL2 LL3 7,46 6,22 7,5 8,57 6,18 5,22 7,05 5,44 7,06 6,42 8,78 9,7 8 7,47 7,85 7,94 6,6 7,24

7,53 9,26 6 5,94 7,56 11,53 7,89 7,47 8,28

Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian

A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô.

B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ

AB: Tên chủng theo thời gian

Class Level Information

Class Levels Values

A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

B 3 1 2 3

Number of Observations Read 81

Number of Observations Used 81

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.811437 13.26107 0.948961 7.155988

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

1

A 8 113.3572877 14.1696610 15.73 <.0001

B 2 18.5628451 9.2814225 10.31 0.0002

A*B 16 77.3413716 4.8338357 5.37 <.0001

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.900526

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 0.8969

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N A

A 9.0117 9 6

A

B A 8.4478 9 2

B

B C 7.9267 9 4

B C

B C 7.7711 9 7

C

C 7.5400 9 1

D 6.2878 9 3

D

D 6.0956 9 9

D

D 5.7589 9 8

D

D 5.5644 9 5

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.900526

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 0.5178

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N B

A 7.5337 27 3

Đồ án tốt nghiệp

2

A

A 7.4537 27 2

B 6.4806 27 1

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.900526

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 1.5534

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N A

A 10.0033 3 A6B3

A

B A 9.9067 3 A6B2

B A

B A C 9.3467 3 A1B2

B A C

B D A C 8.8467 3 A4B2

B D A C

E B D A C 8.7900 3 A4B1

E B D A C

E B D A C 8.7700 3 A2B1

E B D C

E B D F C 8.4433 3 A2B3

E D F C

E G D F C 8.2800 3 A7B2

E G D F C

E G D F C 8.1300 3 A2B2

E G D F

E G D F H 7.7900 3 A9B3

E G D F H

E G D F H 7.7867 3 A7B3

E G D F H

E G D F H I 7.7533 3 A8B3

E G F H I

Đồ án tốt nghiệp

3

E G J F H I 7.2467 3 A7B1

G J F H I

G J F H I 7.1250 3 A6B1

G J F H I

G J F H I 7.0700 3 A1B3

G J F H I

G J F H I 7.0133 3 A5B3

G J H I

G J K H I 6.8200 3 A3B1

J K H I

L J K H I 6.2433 3 A3B2

L J K I

L J K I 6.2033 3 A1B1

L J K

L J K 6.1433 3 A4B3

L J K

L J K M 5.9800 3 A9B2

L J K M

L J K M 5.8000 3 A3B3

L K M

L N K M 5.3933 3 A8B2

L N M

L N M 4.9567 3 A5B2

L N M

L N M 4.7233 3 A5B1

N M

N M 4.5167 3 A9B1

N

N 4.1300 3 A8B1

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh tác

Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein

4

Đồ án tốt nghiệp

Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm))

STT Chủng

5,25 7,4 7,5 9,17 4,1

72h 48h 24h LL3 LL2 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL1 8,7 7,7 8,12 7,68 8,08 7,99 7,33 7,8 5,69 6,74 7,02 6,28 4,75 5,84 5,6 6,01 5,12 3,92 9,11 9,5 9,62 6,25 6,35 7,31 6,1 7,61 7,02 9,6 9,29 7,9 5,89 6,4 7,97 7,6 5,41 6,92 8,58 8,21 7,85 6,59 6,19 4,9 7,32 6,76 6,57 8,41 9,48 8,42 6,74 8,09 6,91 8,06 7,58 8,36 3,78 3,62 3,94 7,69 8,17 8,64 7,18 7,85 7,21 8,85 10,05 9,54 12,82 12,03 8,98 7,36 7,18 7,9 6,1 9,6 10,15 6,91 5,67 8,28 4,95 7,4 8,51 9,23 9,44 10,36 10,86 8,49 6,35 10,92 10,17 8,76 9,66 6,54 7,29 6,62 5,9 2,87 6,32 7,3 6,57 7,94 6,52 7,59 10,4 9,36 8,28 8,52 7,56 7,9 4,25 3,72 6,31 7,91 8,06 8,12 8,78 8,2 9,35 9,36 5,43 7,21 7,14 10,99 10,36 9,52 8,23 7,69 6,77 6,33 6,86 7,18 6,18 5,48 3,95 6,68 5,87 7,77 6,65 6,17 5,77 6,13 8,27 8,19 7,02 7,15 10,38 10,69 10,02 8,66 8,06 8,4 7,52 5,36 8,02 10,47 9,16 7,72 6,9 7,9 4,47 4,5 4,53 7,17 6,77 6,89 4,64 4,37 7,54 6,25 7,06 7,18 11,33 10,21 9,57 8,41 10,07 0,83 10,24 10,33 6,99 6,71 7,24 6,09 9,17 6,89 9,84 8,72 6,68 5,67 6,98 6,01 7,85 5,7 5,28 7,31 6,96 6,96 4,47 6,12 5,95 6,11 7,15 6,88 6,99 8,2 12,18 11,29 9,65 8,01 7,07 8,22 9,23 9,65 9,72 6,26 4,59 6,19 5,88 8,11 7,25 7,35 8,56 5,82 6,1 8,36 8,17 9,13 8,14 3,24 5,91 5,75 6,94 7,84 10,4 8,67 11,22 5,17 6,23 5,61

7,37 7,65 7,08 3,7 8,95 7,41 8,94 8,52 6,22

7,88 7,05 8,61 3,99 8,84 7,82 8,28 7,65 6,65

A1 KL 1.2 A2 KL 1.3 A3 KL 1.4 A4 KL 3.1 A5 KL 4.1 A6 KL 5.1 A7 KL 5.2 A8 KL 5.3 A9 KL 6.1 A10 KL 6.2 A11 KL 8.2 A12 HT 1.1 A13 HT 1.2 A14 HT 1.3 A15 HT 2.1 A16 HT 2.2 A17 HT 2.3 A18 HT 3.1 A19 HT 3.2 A20 HT 3.3 A21 HT 4.1 A22 HT 4.2 A23 HT 4.3 A24 HT 5.1 A25 HT 5.2 A26 HT 6.1 A27 HT 6.3 A28 HT 7.2 A29 HT 7.3

Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian

A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô.

B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ

AB: Tên chủng theo thời gian

5

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.784170 13.37202 1.004238 7.510000

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

A 28 286.8814444 10.2457659 10.16 <.0001

B 2 29.5093540 14.7546770 14.63 <.0001

A*B 56 321.1693349 5.7351667 5.69 <.0001

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 174

Error Mean Square 1.008495

Critical Value of t 1.97369

Least Significant Difference 0.9344

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N A

A 9.4122 9 8

A

A 9.3978 9 10

A

B A 9.1567 9 25

B A

B A C 8.6533 9 17

B A C

B D A C 8.6244 9 20

B D C

B D E C 8.4367 9 14

B D E C

F B D E C 8.2300 9 12

F D E C

F D E C 8.1867 9 21

F D E C

F G D E C 8.0244 9 18

F G D E C

F G D E C 8.0056 9 6

F G D E C

F G D E C H 7.7811 9 29

Đồ án tốt nghiệp

6

F G D E H

F G D E H 7.6967 9 27

F G E H

F G E H 7.6767 9 1

F G E H

F G E H 7.6522 9 3

F G E H

F G E H 7.6278 9 22

F G E H

F G E H 7.5078 9 9

F G H

F G I H 7.4422 9 4

F G I H

F G I H 7.4167 9 26

G I H

G I J H 7.1889 9 13

G I J H

G I J H 7.1322 9 28

I J H

K I J H 6.9967 9 5

K I J H

K I J H 6.9133 9 16

K I J H

K I J H 6.8622 9 23

K I J

K L I J 6.5633 9 11

K L J

K L J 6.4533 9 7

K L

K L M 6.0756 9 15

L M

L M 5.7067 9 24

L M

L M 5.6978 9 2

Đồ án tốt nghiệp

7

M

M 5.2711 9 19

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 174

Error Mean Square 1.008495

Critical Value of t 1.97369

Least Significant Difference 0.3005

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N B

A 7.9097 87 3

B 7.5333 87 2

C 7.0870 87 1

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 174

Error Mean Square 1.008495

Critical Value of t 1.97369

Least Significant Difference 1.6183

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N AB

A 11.2333 3 A8B3

A

B A 10.5567 3 A25B3

B A

B A C 10.4667 3 A21B3

B A C

B D A C 10.3700 3 A20B2

B D A C

B D A C 10.3633 3 A17B3

B D A C

B D A C 10.2900 3 A14B2

B D A C

E B D A C 10.1500 3 A10B3

E B D A C

E B D A C F 9.9500 3 A10B1

Đồ án tốt nghiệp

8

E B D A C F

E B D A G C F 9.8200 3 A29B3

E B D G C F

E B D H G C F 9.6000 3 A18B2

E B D H G C F

E B D I H G C F 9.5333 3 A26B3

E B D I H G C F

E B D I H G C F 9.5233 3 A8B2

E B D I H G C F

E B J D I H G C F 9.4100 3 A3B3

E B J D I H G C F

E K B J D I H G C F 9.3467 3 A12B2

E K B J D I H G C F

E K B J D I H G C F 9.3433 3 A9B2

E K B J D I H G C F

L E K B J D I H G C F 9.1467 3 A25B2

L E K J D I H G C F

L E K M J D I H G C F 8.9300 3 A4B3

L E K M J D I H G F

L E K M J D I H G N F 8.7767 3 A13B2

L E K M J D I H G N F

L E K M J D I H G N F 8.7700 3 A6B3

L E K M J I H G N F

L E K M J O I H G N F 8.6333 3 A22B3

L E K M J O I H G N F

L E K M J O I H G N F P 8.5933 3 A27B2

L E K M J O I H G N F P

L E K M J O I H G N Q F P 8.5533 3 A20B1

L K M J O I H G N Q F P

L R K M J O I H G N Q F P 8.4800 3 A28B3

L R K M J O I H G N Q F P

L R K M J O I H G S N Q F P 8.3733 3 A17B1

L R K M J O I H G S N Q P

L R K M J O I H G S N Q T P 8.2133 3 A5B3

Đồ án tốt nghiệp

9

L R K M J O I H S N Q T P

L R K M J O I H S N Q T P 8.1733 3 A1B3

L R K M J O I H S N Q T P

L R K M J O I H S N Q T P 8.1667 3 A7B2

L R K M J O I H S N Q T P

L R K M J O I H U S N Q T P 8.0933 3 A10B2

L R K M J O I H U S N Q T P

L R K M J O I H V U S N Q T P 8.0300 3 A13B1

L R K M J O I H V U S N Q T P

L R K M J O I H V U S N Q T P 8.0000 3 A6B1

L R K M J O I H V U S N Q T P

L R K M J O I H V U S N Q T P 7.9933 3 A12B1

L R K M J O I V U S N Q T P

L R K M J O I W V U S N Q T P 7.9167 3 A1B2

L R K M J O W V U S N Q T P

L R K M J O X W V U S N Q T P 7.8300 3 A11B3

L R K M J O X W V U S N Q T P

L R K M J O X Y W V U S N Q T P 7.8067 3 A22B2

L R K M O X Y W V U S N Q T P

L R K M O X Y W V U S N Q T P 7.7667 3 A25B1

L R M O X Y W V U S N Q T P

L R M O X Y W V U S N Q T P 7.6867 3 A14B1

L R M O X Y W V U S N Q T P

L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5700 3 A27B3

L R M Z O X Y W V U S N Q T P

L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5300 3 A16B3

R M Z O X Y W V U S N Q T P

R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5067 3 A18B1

R A M Z O X Y W V U S N Q T P

R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4800 3 A8B1

R A M Z O X Y W V U S N Q T P

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4133 3 A21B2

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4133 3 A7B1

Đồ án tốt nghiệp

10

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.3500 3 A12B3

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P

B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.3333 3 A14B3

B R A Z O X Y W V U S N Q T P

B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.2467 3 A6B2

B R A Z O X Y W V U S N Q T P

B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.2233 3 A17B2

B R A Z O X Y W V U S N Q T P

B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.1800 3 A29B2

B R A Z O X Y W V U S N Q T P

B R A C Z O X Y W V U S N Q T P 7.1633 3 A26B2

B R A C Z O X Y W V U S Q T P

B R A C Z O X Y W V U S Q T P 7.0767 3 A23B1

B R A C Z X Y W V U S Q T P

B R A C Z X Y W V U S D Q T P 7.0133 3 A16B2

B R A C Z X Y W V U S D Q T P

B R A C Z X Y W V U S D Q T P 6.9900 3 A23B2

B R A C Z X Y W V U S D Q T

B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9667 3 A18B3

B R A C Z E X Y W V U S D Q T

B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9533 3 A9B1

B R A C Z E X Y W V U S D Q T

B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9500 3 A20B3

B R A C Z E X Y W V U S D Q T

B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9433 3 A19B1

B R A C Z E X Y W V U S D Q T

B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9400 3 A1B1

B R A C Z E X Y W V U S D T

B R A C Z E X Y W V U S D T 6.9267 3 A27B1

B R A C Z E X Y W V U S D T

B R A C Z E X Y W V U S D T 6.9100 3 A3B1

B R A C Z E X Y W V U S D T

B R A C Z E X Y W V U S D T 6.8833 3 A5B1

Đồ án tốt nghiệp

11

B A C Z E X Y W V U S D T

B A C Z E X Y W V U S D T 6.7900 3 A15B3

B A C Z E X Y W V U D T

B A C Z E X Y W V U D T 6.7533 3 A4B2

B A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.7300 3 A11B1

B F A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.7133 3 A24B1

B F A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.6800 3 A2B3

B F A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.6800 3 A21B1

B F A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.6433 3 A4B1

B F A C Z E X Y W V U D T

B F A C Z E X Y W V U D T 6.6367 3 A3B2

B F A C Z E X Y W V U D

B F A C Z E X Y W V U D G 6.5200 3 A23B3

B F A C Z E X Y W V D G

B F A C Z E X Y W V D G 6.4700 3 A28B2

B F A C Z E X Y W V D G

B F A C Z E X Y W V D G 6.4467 3 A28B1

B F A C Z E X Y W V D G

B F A C Z E X Y W V D G 6.4433 3 A22B1

B F A C Z E X Y W D G

B F A C Z E X Y W H D G 6.3433 3 A29B1

B F A C Z E X Y H D G

B F A C Z E X Y H D G 6.2267 3 A9B3

B F A C Z E Y H D G

B F A C Z E Y H D G 6.1967 3 A16B1

B F A C Z E H D G

B F A C Z E I H D G 6.0667 3 A15B2

B F A C E I H D G

B F A C E J I H D G 5.8933 3 A5B2

Đồ án tốt nghiệp

12

B F C E J I H D G

B F C E J I H D G 5.8600 3 A24B3

F C E J I H D G

F C E J I H D G 5.5533 3 A26B1

F E J I H D G

F K E J I H D G 5.3967 3 A2B2

F K E J I H G

F K E J I H G 5.3700 3 A15B1

F K J I H G

F K J I H G 5.1300 3 A11B2

K J I H G

K J I H G 5.0167 3 A2B1

K J I H

K J I H 4.7600 3 A13B3

K J I

K J I 4.5467 3 A24B2

K J I

K J I 4.5000 3 A19B3

K J

K J 4.3700 3 A19B2

K

K 3.7800 3 A7B3

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục A.2: Khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase

Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng

Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin

STT Chủng

24h

72h

A1 A2 A3 A4 A5

PB 1.1 PB 1.3 PB 1.7 PB 1.10 PB 2.9

Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm)) 48h LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 2,7 4,32 1,12 4,97 1,38 3 0,87 4,92 3,4 6,02

4,62 4,34 3,06 4,28 5,81

2,97 2,11 1,52 2,63 3,12

2,14 1,77 1,6 1,71 1,81

3,19 1,07 0,88 1,1 2,93

4,92 4,54 3,12 3,59 5,21

2,3 1,98 1,56 2,17 3,12

2,21 1,39 1,52 0,86 3

13

A6 A7 A8 A9

PB 2.10 PB 3.1 PB 3.3 PB 3.4

1,49 1,6 2,57 2,09

2,36 2,41 2,52 2,82

2,26 2,06 2,5 2,56

4,83 3,79 6,05 4,34

3,48 4,67 6,64 4,76

5,2 3,71 6,96 3,86

1,08 0,04 4,28 1,79

0,77 0,65 3,9 0,74

0,4 0,13 5,24 0,42

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất chitin theo thời gian

A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô.

B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ

AB: Tên chủng theo thời gian

Class Level Information

Class Levels Values

A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

B 3 1 2 3

Number of Observations Read 81

Number of Observations Used 81

R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean

0.947763 15.84820 0.453572 2.861975

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

A 8 51.2151506 6.4018938 31.12 <.0001

B 2 129.5815580 64.7907790 314.94 <.0001

A*B 16 20.7663086 1.2978943 6.31 <.0001

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.205727

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 0.4287

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N A

A 4.5178 9 8

B 3.8244 9 5

C 3.2633 9 1

D 2.5978 9 9

14

D

D 2.5878 9 2

D

E D 2.4589 9 4

E D

E D 2.4300 9 6

E

E F 2.1178 9 7

F

F 1.9600 9 3

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.205727

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 0.2475

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N B

A 4.6300 27 2

B 2.2130 27 1

C 1.7430 27 3

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 54

Error Mean Square 0.205727

Critical Value of t 2.00488

Least Significant Difference 0.7425

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N AB

A 6.5500 3 A8B2

B 5.6800 3 A5B2

C 4.6200 3 A1B2

C

C 4.6167 3 A2B2

C

C 4.5033 3 A6B2

Đồ án tốt nghiệp

15

C

C 4.4733 3 A8B3

C

C 4.3200 3 A9B2

C

C 4.2633 3 A4B2

C

C 4.0567 3 A7B2

D 3.1100 3 A5B3

D

D 3.0600 3 A3B2

D

E D 2.7000 3 A1B3

E D

E D F 2.6833 3 A5B1

E D F

E D F 2.5300 3 A8B1

E D F

E D F 2.4900 3 A9B1

E D F

E D F 2.4700 3 A1B1

E F

E G F 2.1700 3 A4B1

E G F

E G F 2.0367 3 A6B1

E G F

E G F 2.0233 3 A7B1

G F

H G F 1.9533 3 A2B1

H G

H G I 1.5600 3 A3B1

H I

H J I 1.2600 3 A3B3

J I

Đồ án tốt nghiệp

16

J I 1.1933 3 A2B3

J I

K J I 0.9833 3 A9B3

K J I

K J I 0.9433 3 A4B3

K J

K J 0.7500 3 A6B3

K

K 0.2733 3 A7B3

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh tác

Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin

Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm))

24h

72h

STT

Chủng

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21

KL 1.2 KL 1.3 KL 1.4 KL 3.1 KL 4.1 KL 5.1 KL 5.2 KL 5.3 KL 6.1 KL 6.2 KL 8.2 HT 1.1 HT 1.2 HT 1.3 HT 2.1 HT 2.2 HT 2.3 HT 3.1 HT 3.2 HT 3.3 HT 4.1

48h LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 1,53 5,09 2,49 0,95 4,73 2,18 1,03 3,96 1,7 2,01 5,58 3,76 3,26 5,31 2,34 1,11 4,92 2,03 0,27 4,85 2,75 4,36 6,23 2,98 0,28 5,66 1,49 0,87 5,98 2,75 3,04 4,2 2,57 2,15 6,82 3,12 2,43 5,98 3,32 1,19 4,76 2,02 1,47 5,48 3,05 5,2 7,52 2,78 4,09 5,43 3,42 2,19 7,22 3,17 0,86 4,82 3,51 0,98 4,56 2,98 1,47 6,3 3,11

5,24 6,64 3,73 6,24 4,37 2,3 5,58 7,3 5,04 5,4 4,91 9,79 7,18 4,51 7,21 7,14 5,17 6,1 5,64 6,71 5,91

2,68 2,26 1,74 2,62 2,75 2,49 2,57 4,02 2 2,75 2,96 3,47 2,69 4,25 4,6 2,63 3,9 3,39 3,01 2,34 3,18

1,94 0,14 0,97 0,84 2,65 3,36 0,32 4,43 1,13 1,87 1 2,48 2,43 1,8 3,47 5,21 2,42 2,29 1,74 1,27 1,96

1,84 0,73 1,11 1,07 3,78 1,94 0,22 3,67 0,51 1,35 1,89 2,13 3,19 2,41 3,32 6,72 4,16 0,87 0,66 0,96 1,82

5,55 4,71 3,75 6,47 4,11 3,15 4,02 7,19 5,63 7,69 5,94 8,03 7,49 4,86 5,82 6,27 5,39 8,23 4,61 5,46 7,52

2,44 2,9 1,6 4,4 2,58 2,46 2,26 4,63 2,37 2,3 2,5 3,41 2,84 2,74 3,23 3,12 4,35 3,55 3,19 2,76 3,05

17

A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29

HT 4.2 HT 4.3 HT 5.1 HT 5.2 HT 6.1 HT 6.3 HT 7.2 HT 7.3

2,62 3,1 6,22 2,09 4,17 2,85 2,06 1,81

3,95 3,39 6,25 1,93 3,82 3,34 2,02 2,46

2,95 3,3 6,43 2,3 3,79 2,89 2,89 2,52

5,87 6,41 6,94 4,99 6,31 7,05 4,64 5,27

6,2 6,52 7,01 5,93 3,92 7,57 5,1 4,81

3,21 2,83 8,82 1,02 1,09 2,16 5,15 1,95

2,12 2,03 8,54 1,31 2,81 3,12 4,92 2,7

2,75 1,68 8,68 0,75 2,21 3,08 5,55 2,69

7,17 5,98 6,86 5,52 5,1 7,51 3,82 5,04

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất chitin theo thời gian

A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô.

B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ

AB: Tên chủng theo thời gian

Class Level Information Class Levels Values A 29 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 4 5 6 7 8 9 B 3 1 2 3 Number of Observations Read 261 Number of Observations Used 261 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.935368 16.78441 0.626882 3.734904 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 28 264.8224115 9.4579433 24.07 <.0001 B 2 548.1312927 274.0656464 697.40 <.0001 A*B 56 176.6286184 3.1540825 8.03 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.5833 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 7.4622 9 24 B 5.1767 9 16 B C B 4.9789 9 8 C B C B D 4.6000 9 12 C D C E D 4.3967 9 27 E D F E D 4.2589 9 17 F E D F G E D 4.1833 9 15 F G E D F G E D 4.1722 9 13 F G E D F G E D 4.1122 9 18 F G E D

18

F G E D 4.0933 9 22 F G E F G E H 4.0167 9 28 F G E H F G E H 3.9156 9 23 F G H F G I H 3.8133 9 21 F G I H J F G I H 3.6911 9 26 J G I H J G I H 3.6656 9 4 J I H J K I H 3.4611 9 5 J K I H J K L I H 3.4400 9 10 J K L I J K L I M 3.2500 9 29 J K L M J K L M 3.2233 9 11 J K L M J K L N M 3.2000 9 1 J K L N M J K L N M 3.1711 9 14 J K L N M J K L N M O 3.1156 9 19 J K L N M O J K L N M O 3.1133 9 20 K L N M O K L N M O 2.8967 9 2 L N M O L N M O 2.8711 9 25 N M O P N M O 2.6789 9 9 P N O P N O 2.6400 9 6 P O P O 2.5378 9 7 P P 2.1767 9 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 0.1876 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 5.75793 87 2 B 3.00747 87 1 C 2.43931 87 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 174 Error Mean Square 0.39298 Critical Value of t 1.97369 Least Significant Difference 1.0102 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 9.1500 3 A24B3 A B A 8.2133 3 A12B2 B B C 7.3767 3 A27B2 C D C 7.1833 3 A18B2 D C D C E 6.9767 3 A16B2 D C E D C E 6.9367 3 A24B2 D C E D C E 6.9067 3 A8B2 D C E

Đồ án tốt nghiệp

19

D C E 6.8833 3 A13B2 D C E D F C E 6.5767 3 A21B2 D F C E G D F C E 6.4133 3 A22B2 G D F E G D F H E 6.3567 3 A10B2 G D F H E G D F H E I 6.3033 3 A23B2 G D F H E I G D F H E I 6.3000 3 A24B1 G F H E I G J F H E I 6.1700 3 A15B2 G J F H E I G J F H K E I 6.0967 3 A4B2 G J F H K I G J F H K L I 5.7100 3 A16B3 G J F H K L I G J F M H K L I 5.5767 3 A20B2 G J M H K L I G J N M H K L I 5.4800 3 A25B2 G J N M H K L I G J N M H K L I 5.4433 3 A9B2 J N M H K L I J N M H K L I 5.3600 3 A2B2 J N M K L I J N M K L I 5.3300 3 A17B2 J N M K L I J N M K L I 5.2933 3 A1B2 J N M K L J N M K L 5.2067 3 A28B3 N M K L N M O K L 5.1100 3 A26B2 N M O L N M O L 5.0400 3 A29B2 N M O L N M O L 5.0233 3 A19B2 N M O L N M O L 5.0167 3 A11B2 N M O L P N M O L 4.8167 3 A7B2 P N M O L P N M O L 4.7100 3 A14B2 P N M O P N M O Q 4.5967 3 A5B2 P N O Q R P N O Q 4.5200 3 A28B2 R P O Q R P S O Q 4.1533 3 A8B3 R P S Q R P S T Q 3.9267 3 A26B1 R P S T Q R P S T Q 3.8900 3 A17B1 R P S T Q R P S T Q 3.8767 3 A8B1 R P S T Q R P S T Q U 3.8133 3 A3B2 R S T Q U R V S T Q U 3.6267 3 A15B1 R V S T Q U R V S T W Q U 3.5933 3 A4B1 R V S T W U R V S T W X U 3.5567 3 A17B3 V S T W X U Y V S T W X U 3.4567 3 A6B2 Y V S T W X U Y V S T W X U 3.3700 3 A18B1 Y V S T W X U Y V S Z T W X U 3.3333 3 A12B1 Y V S Z T W X U

Đồ án tốt nghiệp

20

Y V A S Z T W X U 3.2633 3 A23B1 Y V A S Z T W X U Y V A S Z T W X U 3.2367 3 A19B1 Y V A S Z T W X U Y V A S Z T W X U 3.2300 3 A5B3 Y V A S Z T W X U Y B V A S Z T W X U 3.1733 3 A22B1 Y B V A Z T W X U Y B V A C Z T W X U 3.1133 3 A21B1 Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U 3.0267 3 A27B1 D Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U 3.0033 3 A14B1 D Y B V A C Z T W X U D Y B V A C Z T W X U E 2.9500 3 A13B1 D Y B V A C Z W X U E D Y B V A C Z W X U E 2.8433 3 A16B1 D Y B V A C Z W X E D Y B V A C Z F W X E 2.7867 3 A27B3 D Y B V A C Z F W X E D Y B V A C Z F W X G E 2.7533 3 A15B3 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X G E 2.6933 3 A22B3 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X G E 2.6933 3 A20B1 D Y B V A C Z F W X G E D Y B V A C Z F W X H G E 2.6833 3 A13B3 D Y B V A C Z F W X H G E D Y B V A C Z F W X H G E 2.6767 3 A11B1 D Y B A C Z F W X H G E D Y B A C Z F W X H G E 2.6000 3 A10B1 D Y B A C Z F X H G E D Y B A C Z F X H G E 2.5567 3 A5B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.5367 3 A1B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.5267 3 A7B1 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.4467 3 A29B3 D Y B A C Z F H G E D Y B A C Z F H G E 2.4467 3 A2B1 D B A C Z F H G E D B I A C Z F H G E 2.3267 3 A6B1 D B I A C Z F H G E D B I A C Z F H G E 2.3233 3 A28B1 D B I A C F H G E D B I A C F J H G E 2.2633 3 A29B1 D B I A C F J H G E D B I A C F J H G E 2.2533 3 A12B3 D B I C F J H G E D B I C F J H G E 2.1800 3 A23B3 D I C F J H G E D I C F J H G E 2.1367 3 A6B3 D I C F J H G E D I C F J H G E 2.1067 3 A25B1 D I F J H G E D I K F J H G E 2.0367 3 A26B3 I K F J H G E I K F J H G E 1.9767 3 A11B3 I K F J H G E I K F J H G E 1.9533 3 A9B1 I K F J H G L I K F J H G 1.8000 3 A14B3 L I K F J H G L I K F J H G 1.7833 3 A18B3 L I K J H G L I K J H G 1.7700 3 A1B3 L I K J H G L I K J H G 1.7500 3 A21B3 L I K J H

Đồ án tốt nghiệp

21

Đồ án tốt nghiệp

L I K J H 1.6800 3 A3B1 L I K J L I K M J 1.3633 3 A10B3 L K M J L K M J 1.3067 3 A4B3 L K M L N K M 1.0867 3 A19B3 L N K M L N K M 1.0700 3 A20B3 L N K M L N K M 1.0367 3 A3B3 L N K M L N K M 1.0267 3 A25B3 L N M L N M 0.8833 3 A2B3 N M N M 0.6400 3 A9B3 N N 0.2700 3 A7B3 PHỤ LỤC B: KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA CÁC CHỦNG NẤM P. lilacinum

Phụ lục B.1: Khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm P. lilacinum

Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) khối trứng

9 50

11 59

6 43

5 30

13 65

23

27

17

12

32

6

13

16

10

21

9 20

7 17

5 13

3 10

12 25

1 3

5 13

4 10

2 5

3 8

15 70 38 25 14 30 6 15 47

17 77 43 29 16 31 8 19 51

42

28

23

33

37

PB 1.1 PB 1.3 PB 1.10 PB 2.10 PB 3.3 KL 5.3 KL 6.2 HT 3.3 HT 5.1

TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN KHỐI TRỨNG (%) STT Chủng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 STT Chủng Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

61 100 73 70 34 48 23 41 81

68 98 70 68 30 46 20 37 77

33 91 53 51 21 36 15 27 65

20 83 48 35 20 33 10 21 56

79 99 71 69 33 47 21 39 79

56 97 68 65 26 45 19 35 75

48 95 64 61 24 40 17 33 70

PB 1.1 PB 1.3 PB 1.10 PB 2.10 PB 3.3 KL 5.3 KL 6.2 HT 3.3 HT 5.1

22

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh khối trứng theo từng ngày

T: Tên chủng.

Ngày 1

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.600108 42.96735 1.130651 2.631418

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 34.53159433 4.31644929 3.38 0.0152

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 1.278371

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 1.9395

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 4.8512 3 9

A

B A 3.9737 3 2

B A

B A C 3.3865 3 4

B C

B C 2.7265 3 3

B C

B C 2.2190 3 5

C

C 1.7743 3 8

C

C 1.6410 3 1

C

23

C 1.5589 3 7

C

C 1.5515 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 2

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.577918 43.09221 1.341674 3.113495

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 44.36450181 5.54556273 3.08 0.0226

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 1.800088

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.3015

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 5.384 3 9

A

B A 4.966 3 2

B A

B A C 3.894 3 4

B A C

B A C 3.246 3 3

B C

B C 2.667 3 5

C

C 2.112 3 8

C

C 2.091 3 7

C

24

C 1.965 3 1

C

C 1.696 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 3

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.549684 40.48484 1.441738 3.561180

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 45.67104899 5.70888112 2.75 0.0358

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.078608

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.4732

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 5.778 3 9

A

B A 5.480 3 2

B A

B A C 4.460 3 4

B A C

B A C 3.631 3 3

B C

B C 3.075 3 5

C

C 2.735 3 8

C

25

C 2.467 3 1

C

C 2.386 3 7

C

C 2.038 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 4

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.562841 36.30116 1.443183 3.975582

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 48.26821376 6.03352672 2.90 0.0290

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.082776

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.4756

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 6.190 3 9

A

A 6.020 3 2

A

B A 4.886 3 4

B A

B A 4.057 3 3

B

B 3.508 3 5

B

B 3.132 3 8

B

26

B 2.781 3 1

B

B 2.762 3 7

B

B 2.445 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 5

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.567719 34.15480 1.489029 4.359649

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 52.41375770 6.55171971 2.95 0.0268

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.217208

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.5543

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 6.615 3 9

A

B A 6.472 3 2

B A

B A C 5.383 3 4

B A C

B A C 4.441 3 3

B C

B C 4.007 3 5

C

C 3.431 3 8

C

27

C 3.062 3 1

C

C 2.992 3 7

C

C 2.834 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 6

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.591563 31.77370 1.495283 4.706041

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 58.29018811 7.28627351 3.26 0.0178

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.235873

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.565

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 7.063 3 9

A

A 6.930 3 2

A

B A 5.821 3 4

B A

B A C 4.813 3 3

B C

B C 4.319 3 5

B C

B C 3.712 3 8

B C

28

B C 3.319 3 1

C

C 3.205 3 7

C

C 3.172 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 7

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.586999 30.11390 1.517992 5.040836

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 58.95195928 7.36899491 3.20 0.0193

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.3043

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.604

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 7.338 3 9

A

B A 7.279 3 2

B A

B A C 6.206 3 4

B A C

B D A C 5.154 3 3

B D C

B D C 4.708 3 5

D C

D C 4.175 3 8

D

29

D 3.591 3 7

D

D 3.557 3 1

D

D 3.360 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 8

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.604516 27.88746 1.503353 5.390786

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 62.18321375 7.77290172 3.44 0.0140

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.260071

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.5788

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 7.726 3 9

A

B A 7.639 3 2

B A

B A C 6.679 3 4

B A C

B D A C 5.472 3 3

B D C

B D C 5.140 3 5

D C

D C 4.409 3 8

D

30

D 3.990 3 1

D

D 3.902 3 7

D

D 3.561 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 9

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.596759 24.30553 1.472320 6.057552

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 57.74447379 7.21805922 3.33 0.0162

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.167727

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.5256

Means with the same letter are not significantly different

t Grouping Mean N T

A 8.227 3 9

A

B A 8.002 3 2

B A

B A C 7.649 3 4

B A C

B D A C 6.089 3 3

B D C

B D C 5.694 3 5

D C

D C 5.242 3 8

D

31

D 4.869 3 7

D

D 4.789 3 1

D

D 3.957 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 10

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.601380 22.93560 1.506581 6.568742

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 61.63771251 7.70471406 3.39 0.0149

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.269785

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.5844

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 8.594 3 4

A

A 8.488 3 2

A

A 8.488 3 9

A

B A 6.674 3 3

B A

B A 6.017 3 5

B

B 5.786 3 8

B

32

B 5.563 3 1

B

B 5.279 3 7

B

B 4.229 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 11

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.598860 21.12193 1.451977 6.874265

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 56.65271159 7.08158895 3.36 0.0156

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.108238

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.4907

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 8.768 3 4

A

A 8.755 3 2

A

B A 8.724 3 9

B A

B A C 6.968 3 3

B C

B C 6.240 3 5

C

C 6.190 3 1

C

33

C 5.957 3 8

C

C 5.662 3 7

C

C 4.605 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 12

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.590240 20.43370 1.442771 7.060741

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 53.97176831 6.74647104 3.24 0.0182

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.081588

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.4749

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 8.910 3 9

A

A 8.880 3 2

A

A 8.866 3 4

A

B A 7.068 3 3

B A

B A 6.563 3 1

B A

B A 6.468 3 5

B

34

B 6.150 3 8

B

B 5.830 3 7

B

B 4.812 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 13

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.578880 20.27613 1.459256 7.196917

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 52.68881498 6.58610187 3.09 0.0222

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.129428

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.5032

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 9.059 3 9

A

A 8.978 3 2

A

A 8.922 3 4

A

B A 7.147 3 3

B A

B A 6.835 3 1

B A

B A 6.655 3 5

B

35

B 6.285 3 8

B

B 5.968 3 7

B

B 4.922 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 14

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.575967 19.56663 1.429798 7.307326

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 49.98272883 6.24784110 3.06 0.0233

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 2.044321

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 2.4527

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 9.150 3 9

A

A 9.008 3 2

A

A 8.978 3 4

A

B A 7.264 3 3

B A

B A 6.962 3 1

B A

B A 6.780 3 5

B

36

B 6.442 3 8

B

B 6.113 3 7

B

B 5.070 3 6

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục B.2: Khả năng ký sinh con cái của các chủng nấm P. lilacinum

Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) con cái

TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN CON CÁI (%)

STT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

Ngày 1 75 72 79 76 75 77 86 87 82

Ngày 2 88 81 86 84 83 82 91 95 89

Ngày 3 90 85 89 87 88 86 95 98 90

Ngày 4 91 87 91 90 90 89 97 100 91

Chủng PB 1.1 PB 1.3 PB 1.10 PB 2.10 PB 3.3 KL 5.3 KL 6.2 HT 3.3 HT 5.1

Kết quả xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh con cái theo từng ngày

T: Tên chủng.

Ngày 1

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.570649 11.09364 5.398902 48.66667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 697.3333333 87.1666667 2.99 0.0255

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 29.14815

37

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 9.2613

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 54.333 3 4

A

A 53.000 3 7

A

B A 52.333 3 9

B A

B A 51.333 3 2

B A

B A 50.667 3 3

B A

B A 49.333 3 1

B A

B A C 46.000 3 8

B C

B C 43.333 3 6

C

C 37.667 3 5

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 2

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.551855 5.294351 4.176655 78.88889

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 386.6666667 48.3333333 2.77 0.0346

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 17.44444

38

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 7.1646

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 83.000 3 4

A

B A 82.333 3 7

B A

B A 82.000 3 9

B A

B A 82.000 3 8

B A

B A C 81.333 3 3

B A C

B D A C 76.667 3 2

B D C

B D C 75.667 3 6

D C

D C 74.333 3 5

D

D 72.667 3 1

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 3

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.410708 5.273746 4.574486 86.74074

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 262.5185185 32.8148148 1.57 0.2033

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 20.92593

39

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 7.8471

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 90.667 3 4

A

B A 89.667 3 8

B A

B A C 88.333 3 9

B A C

B A C 88.333 3 3

B A C

B A C 88.000 3 2

B A C

B A C 87.667 3 7

B A C

B A C 84.667 3 1

B C

B C 82.000 3 6

C

C 81.333 3 5

Đồ án tốt nghiệp

Ngày 4

Class Level Information

Class Levels Values

T 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

R-Square Coeff Var Root MSE N Mean

0.367475 4.853367 4.371626 90.07407

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

T 8 199.8518519 24.9814815 1.31 0.3010

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 18

Error Mean Square 19.11111

40

Critical Value of t 2.10092

Least Significant Difference 7.4991

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N T

A 93.333 3 4

A

B A 92.667 3 8

B A

B A 92.000 3 7

B A

B A 91.333 3 2

B A

B A 91.000 3 9

B A

B A 91.000 3 3

B A

B A 87.667 3 1

B A

B A 86.333 3 6

B

B 85.333 3 5

Đồ án tốt nghiệp

41