Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

tên đề tài.txt

c Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai SV: Huỳnh Phương Thảo Lớp: 13DSH03 MSSV: 1311100669

Page 1

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn

của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi

trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt

nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án

tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án

của mình.

TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Phương Thảo

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của

Thầy Cô, gia đình và bạn bè.

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai đã luôn tận tình

quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập cho đến khi xây

dựng đề cương và hoàn thành đồ án này.

Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực

phẩm - Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt kiến

thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại đây.

Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình đã luôn đã chăm sóc,dạy dỗ và hỗ trợ em

cũng như luôn bên cạnh và làm chỗ dựa tinh thần cho em.

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các anh chị và bạn bè cùng thực hiện đề

tài trong phòng thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ với em khi thực

hiện đồ án tốt nghiệp này.

Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện

đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Với điều kiện thời gian cũng như kinh

nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu

sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để em

có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, nhằm phục vụ tốt hơn công tác

thực tế sau này.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Em xin chân thành cám ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Phương Thảo

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................ vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1

1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................................1

2. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................................2

2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước..................................................... 2

2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước .................................................... 2

2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi sinh. ........................................................................................................................................... 4

2.4. Tình hình chất thải thực phẩm thừa. .............................................................................. 6

3. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................................7

4. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................................8

4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu ...................................................................................... 8

4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu.......................................................................... 8

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................................8

6. Kết quả đạt được ..................................................................................................................8

7. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................................9

8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................................9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 10

1.1.Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa .................................. 10

1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................... 10

1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus........................................................................ 15

1.2. Tổng quan về enzyme.................................................................................................... 20

1.2.1. Enzyme protease ......................................................................................................... 20

1.2.2. Enzyme amylase .......................................................................................................... 24

1.2.3. Enzyme cellulase ......................................................................................................... 28

1.3.Tổng quan về phân bón .................................................................................................. 30

Đồ án tốt nghiệp

1.3.1.Khái niệm ...................................................................................................................... 30

1.3.2. Phân loại ...................................................................................................................... 31

1.3.3. Thành phần dinh dưỡng ............................................................................................. 33

1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ .................................................................................. 33

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 334

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................................ 34

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................................. 34

2.1.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................. 34

2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 34

2.2.1. Nguồn vi sinh vật ........................................................................................................ 34

2.2.2. Hóa chất và môi trường ............................................................................................. 35

2.3.Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................................... 36

2.3.1. Thiết bị ......................................................................................................................... 36

2.3.2. Dụng cụ ........................................................................................................................ 36

2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung.............................................................................................. 37

2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết ............................................................................................ 38

2.5. Phương pháp nghiên c ứu............................................................................................... 52

2.5.1. Phương pháp tăng sinh .............................................................................................. 52

2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................................... 52

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc............................................................. 53

2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào ................................................................... 54

2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .................................................... 55

2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch......................................................................................... 56

2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose. ........ 57

2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu .......................................................................................... 58

2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV ...................................................................................... 58

2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. .................................................................................................................... 59

2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ....................................................................................................................... 60

Đồ án tốt nghiệp

2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn. ....................................................................... 61

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 63

3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh, cellulse và protein của các chủng BM13 và BDH ........................................................................................................... 63

3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 65

3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 65

3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 67

3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4 ................................. 63

3.2.1. Kết quả nhuộm Gram ................................................................................................. 70

3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử ................................................................................................ 70

3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2 ........................................ 71

3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 .................................................................................................................... 73

3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau ...................................................... 74

3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4. 75

3.6.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 75

3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4. .......................................................................................................................... 77

3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2. .......... 78

3.7.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 78

3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 80

3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4.................................................................................................................... 82

3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng L2 ........................................................................................................................ 827

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 92

iii

Đồ án tốt nghiệp

1. Kết luận .............................................................................................................................. 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 93

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...................................................................................................... 93

TÀI LIỆU TIẾNG ANH ....................................................................................................... 97

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) ........... 13

Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát ........... 34

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các

chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 63

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của

các chủng vi khuẩn BM và BDH ......................................................................................... 65

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các

chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 67

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

BDH4 ...................................................................................................................................... 75

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh

trưởng của chủng BDH4 ....................................................................................................... 77

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 78

Bảng 3.7. Khảo sát pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng của chủng vi

khuẩn L2 ................................................................................................................................. 80

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng

sinh enzyme của chủng BDH4............................................................................................. 82

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh

enzyme của chủng L2 ........................................................................................................... 87

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................. 11

Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus .................... 17

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm ............................................... 37

Hình 2.2. Sơ đồ quy làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 ................................... 40

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng

BM và BDH ...................................................................................................................... 42

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng

BM và BDH ...................................................................................................................... 44

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi

khuẩn BM và BDH ........................................................................................................... 46

Hình 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để

phối trộn vào thức ăn thừa. .............................................................................................. 48

Hình 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng

Bacillus subtilis được tuyển chọn ................................................................................... 50

Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của các chủng BM và BDH ............................... 64

Hình 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase của

các chủng vi khuẩn BM và BDH .................................................................................... 64

Hình 3.3. Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các chủng BM và

BDH ................................................................................................................................... 65

Hình 3.4. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của 65

chủng vi khuẩn BM và BDH........................................................................................... 66

Hình 3.5. Vòng phân giải CMC của các chủng BM và BDH sau 48 giờ ................. 67

Hình 3.6. Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2 ngày nuôi

cấy ................................................................................................................................... 68

Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus subtilis BDH4

nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 .............................................................................. 70

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 ......................................... 71

Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm Gram trên

kính hiển vi x100 .............................................................................................................. 72

Hình 3.10. Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2

................................................................................................................................... 73

Hình 3.11. Khả năng sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng vi khuẩn BDH4 và L2 .

................................................................................................................................... 74

Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy................................................................................... 77

Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2 ............................................................................................................ 79

Hình 3.16. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng và khả năng sinh

enzyme amylase của chủng BDH4................................................................................. 83

Hình 3.17. Môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 .............................. 83

Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi cấy trên từng loại môi trường

… ............................................................................................................................... 84

Hình 3.19. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase của

chủng vi khuẩn BDH4 ..................................................................................................... 85

Hình 3.20. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của

chủng vi khuẩn BHD4 ..................................................................................................... 86

Hình 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh

enzyme protease của chủng L2 ....................................................................................... 88

Hình 3.22. Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 .......................... 88

Hình 3.23. Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi trường.... 89

Hình 3.24. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của chủng L2 được nuôi cấy

trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90

Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 được nuôi cấy

trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Food and Agriculture Organization of FAO the United Nations

MĐVSV Mật độ vi sinh vật

NA Nutrient agar

NB Nutient broth

ĐKVPG Đường kính vòng phân giải

VSV Vi sinh vật

viii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho

cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống

mở rộng. Hàng ngày, một lượng lớn thức ăn thừa được thải bỏ từ các nhà hàng,

khách sạn dịch vụ ăn uống. Việc gia tăng lượng thức ăn thừa đang là vấn nạn trên

phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015). Ở Việt Nam, chỉ một lượng nhỏ

thức ăn thừa được thu hồi để làm thức ăn chăn nuôi. Đa phần, thức ăn thừa được đổ

bỏ theo rác sinh hoạt. Thức ăn thừa là nguồn rác thải thải giàu chất hữu cơ nên việc

đổ thức ăn thừa theo rác thải thường tạo ra mùi hôi, là nơi trú ẩn của côn trùng và vi

sinh vật có hại đến sức khỏe con người (Jayathilakan et al , 2012). Ngoài ra,việc

phân hủy thức ăn thừa tại các bãi rác tạo ra một lượng không nhỏ CH4 và CO2 tác

nhân gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, Syeda Azeem Unnisa, (2015) cho rằng, việc xử

lý thức ăn thừa tại các bãi rác là không tốt cho môi trường và kém bền vững. Các

tác giả cho biết, sử dụng các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Lactobacillus spp. để

phân hủy thức ăn thừa trong điều kiện thiếu oxy, tạo phân bón dạng lỏng là một

hướng đi đầy triển vọng vừa làm giảm ô nhiễm môi trường, vừa tạo được phân bón

hữu cơ thay thế cho phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp. Trong số các

chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi

sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus

(Ieshita et al. 2011, Syeda Azeem Unnisa, 2015). Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có

nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng

lỏng. Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên

cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy

thức ăn thừa tạo phân bón lá”.

Đồ án tốt nghiệp

2. Tình hình nghiên cứu

2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước

Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), đã tuyển chọn từ 70 chủng vi khuẩn

phân giải protein (phân lập từ ao nuôi tôm) hai chủng có hoạt tính protease mạnh là

P42 và P62. Đã khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease

của chúng. Kết quả cho thấy, trong môi trường Vinogradski dịch thể cả hai chủng vi

khuẩn đều thích nghi với pH môi trường là 8.0, thời gian nuôi cấy 42 giờ ở nhiệt độ 300C. Chủng P42 thích hợp với nguồn carbon là rỉ đường còn chủng P62 là glucose

và cả hai chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp protease

mạnh nhất với nguồn nitrogen là gelatine. (Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công

Minh, 2005)

Nguyễn Văn Hiếu và ctv (2010), đã tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của

các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease kiềm của chủng B. subtilis HT24

phân lập ở Việt Nam. T9.

Nguyễn Hiền Trang và ctv (2010), cũng tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu

tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn

B.amyloliquefaciens.

Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus

phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.

2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước

Protease chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp sản

xuất enzyme thường sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease bởi chúng có thời gian

sinh trưởng nhanh và chi phí thấp, đem lại lợi ích kinh tế cho việc thương mại hóa

sản phẩm (Lưu Thị Nguyệt Minh, 2007).

Đồ án tốt nghiệp

Naidu K.S và ctv (2005) xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease là 550C ở pH 9 với tỷ lệ giống 4% (w/v) cấy trong môi trường có chứa cám gạo 1%

sau 96 giờ. (Naidu K.S.B., Devi K.L, 2005).

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính

enzyme protease của các chủng Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis. (Đỗ Thị Bích

Thủy, 2012).

Tác giả Kumar và cộng sự (2010) đã cố định tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis

vào các chất mang khác nhau, sau đó đem nuôi cấy để thu enzyme protease có hoạt

độ cao nhất là 10,8 UI/ml trên chất mang gelatin (Kumar R. and Vats R, 2010).

Yang và ctv (2000) đã nghiên cứu khả năng tách protein trong phế thải vỏ

tôm, cua, tôm hùm của chủng vi khuẩn B. subtilis bằng cách lên men trong môi

trường lỏng với các phế thải chưa xử lí. Tác giả cho thấy rằng hiệu quả tách protein

của chủng này khá cao, nó tách protein khỏi vỏ tôm, cua, tôm hùm lần lượt là 88%, 67% và 83% trong điều kiện nuôi cấy ở 30oC, thời gian là 96 giờ (Yang J.K., Shih

I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L, 2000).

Ghafoor và ctv (2008) cùng nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất

protease ngoại bào từ B. subtilis AG-1 và B. subtilis EAG-1. Kết quả pH môi trường tối ưu lần lượt là 7 và 7,2, nhiệt độ là 35oC và 37oC, thể tích ủ khoảng 1% (v/v).

Thời gian nuôi cấy thích hợp từ 24 - 32 giờ cho cả hai chủng (Ghafoor A., Hasnain

S, 2008).

Das và ctv (2010) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để B. subtilis

sản xuất protease với lượng lớn. Vi khuẩn Bacillus subtilis tăng trưởng tối ưu ở

37ºC trong 48 giờ ở pH 8,0 với nguồn carbon và nitơ thử nghiệm với tối ưu tăng

trưởng trong dextrose và peptone tương ứng sản xuất protease tốt nhất, được ứng

dụng rộng rãi trong công nghiệp.

Đồ án tốt nghiệp

Hindhumathi và ctv (2011) đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp

protease ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus GPA4. Trong môi trường nuôi cấy

có bổ sung 0,1% casein, với nguồn carbon là glucose, nguồn nitrogen là bột đậu

nành, pH 8,0, thời gian nuôi cấy 24-36 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme với hoạt độ protease mạnh nhất

(Hindhumathi M., Vijayalakshmi S., Thankamani V, 2011).

2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân

bón vi sinh.

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.

Phạm Văn Toản đã nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc

sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông

nghiệp bền vững. (Phạm Văn Toản , 2002).

Lê Thị Thanh Thủy đã chọn được chủng Bacillus velezensis (kí hiệu M),

Bacillus subtilis (kí hiệu Ba51), chủng Bacillus polymyxa (kí hiệu B14) và chủng

Lactobacillus farraginis (kí hiệu L15) được phân lập từ các vùng trồng ớt và các

cây họ cà, các chế phẩm sinh học và sản phẩm lên men truyền thống trong việc tạo

chế phẩm VSV hỗn hợp để nâng cao năng suất , chất lượng và hiệu quả trồng trọt

của ớt cay và ớt ngọt thông qua việc ứng dụng chế phẩm làm tăng hiệu quả sử dụng

dinh dưỡng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây trồng (Lê Thị Thanh Thủy,

2010).

Nguyễn Văn Thao và ctv,đã sử dụng hỗn hợp các chế phẩn VSV gồm:

CPVSV1 ( Penicillum sp, Aspergillus sp., Psendomonas sp., Saccharomyces sp,

Bacillus sp, Streptomyces sp); CPVSV2 (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis;

Bacillus mycodes; Streptomyces sp. F; Saccharomyces cerevisiae);

CPVSV3(Bacillus subtilis, Streptomyces sp. F, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces

marxianus, Trichoderma spp) để sản xuất phân hữu cơ sinh học từ bã nấm và phân

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Rengathavasi và ctv (2011) đã phân lập được chủng Lactobacillus delbrueckii

từ bánh dầu có khả năng phân giải dầu thô một cách tự nhiên và dùng bổ sung trong

xử lý phân giải sinh học đồng thời phối trộn vào phân bón cho hiệu quả cao.

Kengo Yamada và Hui-Lian Xu (2008) đã chứng minh được tác động có lợi

trực tiếp của phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật như Lactobacillus spp, nấm

actinomycetes và nấm men cũng như tác động gián tiếp của các sản phẩm chuyển

hóa

2.3.3. Tình hình sử dụng phân bón VSV ở Việt Nam

Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định

nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh

trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển

hoá chất hữu cơ.

Theo số liệu của Hiệp hội Phân bón Việt Nam (FAV), nhu cầu phân bón ở

Việt Nam hiện nay vào khoảng trên 10 triệu tấn các loại. Trong đó, Urea khoảng 2

triệu tấn, DAP khoảng 900.000 tấn, SA 850.000 tấn, Kali 950.000 tấn, phân Lân

trên 1,8 triệu tấn, phân NPK khoảng 3,8 triệu tấn, ngoài ra còn có nhu cầu khoảng

400.000 - 500.000 tấn phân bón các loại là vi sinh, phân bón lá.Tuy nhiên, theo

thông tin thực tế thì hiệu suất sử dụng phân bón hiện nay mới chỉ đạt 40-45% với

phân đạm, 25-30% với phân lân và khoảng 55-60% với phân kali. Như vậy, nếu ước

tính hiệu suất sử dụng các loại phân bón trung bình khoảng 45-50%, có nghĩa lượng

phân bón bị thất thoát ra môi trường hoặc bị cố định trong đất, cây trồng không sử

dụng được chiếm 50-55% (tương đương trên 5 triệu tấn) thì mỗi năm ngành nông

nghiệp đã lãng phí khoảng 40-44 nghìn tỷ đồ.(Tập đoàn hoá chất Việt Nam,

http://vinachem.com.vn).

2.3.4. Một số chế phẩm sinh học được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus và Lactic

Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm VSV hữu hiệu bao

gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế

Đồ án tốt nghiệp

phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi

trường.

Chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều nhờ lợi ích

từ sản phẩm này đối với sức khỏe con người và vật nuôi, tổng hợp vitamin, sinh

chất diệt khuẩn, acid lactic.

2.4. Tình hình chất thải từ lượng thực phẩm thừa

2.4.1. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trong nước

Theo Tổ chức Nông-Lương Liên Hợp Quốc (FAO), mỗi năm có 1,3 tỉ tấn

lương thực bị lãng phí. Khối lượng này tương đương với giá trị sản xuất được của

khu vực Châu Phi cận Sahara. Đồng thời, cứ 7 người trên thế giới có 1 người đói và

hơn 20.000 trẻ em dưới 5 tuổi chết mỗi ngày vì đói.

Với nỗ lực duy trì sự sống cho 7 tỉ người trên toàn thế giới, FAO ước tính

khoảng 1/3 sản lượng thực phẩm toàn cầu hoặc là bị lãng phí hoặc bị mất mát.

Trong đó, chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên

nhiên và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường. Và theo đó, tác động ngược lại

đến chính sức khỏe của người dân như đối mặt với nguồn nước ô nhiễm, không khí

ô nhiễm và cả không gian ô nhiễm cũng không là ngoại lệ (Dương Hà - Phạm Ngọc,

2017).

2.4.2. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trên thế giới

Các phương pháp xử lí thường tạo ra mùi hôi do các hợp chất nitơ và lưu

huỳnh thoát ra trong quá trình xử lí. Phần lớn chi phí cho việc xử lí chất thải của

thành phố dao động từ 75% đến 80% ngân sách của thành phố và thêm 30% chi phí

cho việc đổ rác (Arvanitoyannis, 2008 ).

Năm 2012 có khoảng 9.278 tấn chất thải rắn đô thị đã được xử lý tại các bãi

rác mỗi ngày, trong đó khoảng 3.337 tấn là chất thải thực phẩm. Gần 809 tấn chất

thải thực phẩm được tạo ra từ nhà hàng, khách sạn, chợ ướt, sản xuất và chế biến

Đồ án tốt nghiệp

thực phẩm. Chất thải thực phẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao, nhưng thực tiễn cho

thấy việc xử lý rác thải thực phẩm ở bãi chôn lấp không thân thiện và bền vững, làm

giảm diện tích đất, tạo ra mùi khó chịu (Birdie và ctv, 2014).

Tại Hàn Quốc đã tăng 8% mỗi năm nhưng đạt đến đỉnh điểm vào năm 1991 và

giảm sau đó. Tuy nhiên, chất thải thực phẩm vẫn duy trì tỷ lệ cao (31,6%) và thành

phần chất thải dự kiến khoảng 41% tổng lượng chất thải rắn đô thị (Ministry of

Environment, 1996 và Environmental Newspaper, 1996).

Tại Ấn Độ, gần 700 triệu tấn chất thải hữu cơ được tạo ra hàng năm, dẫn đến

những thách thức đối với việc xử lý chất thải an toàn, với chất thải thường được

đem đi đốt hoặc đổ đầy tại các bãi chôn lấp (Bhiday 1994, Nagavallemma và cộng

sự 2006, Zeinhom và cộng sự 2010)

Tại EU, ước tính khoảng 88 triệu tấn thực phẩm bị lãng phí hàng năm, khoảng

20% lương thực,thực phẩm được sản xuất và 95-115 kilogam thực phẩm / người

mỗi năm. EU đang nỗ lực để giảm tác động đến môi trường của chất thải thông qua

chiến lược kinh tế bằng cách duy trì giá trị của nguyên vật liệu trong nền kinh tế

càng lâu càng tốt và để giảm lượng rác thải đặc biệt là chất thải thực phẩm thừa (

Stoknes và ctv, 2016).

Sự sản xuất thực phẩm ở Mỹ sử dụng khoảng 50% diện tích đất của họ, và sử

dụng 80% tổng lượng nước sạch được tiêu thụ. Tuy nhiên, khoảng 40% tổng sản

lượng lương thực là chất thải tương đương với 165 tỷ USD mỗi năm (Gunders,

2012). Ngược lại, hiện nay hơn một tỷ người bị suy dinh dưỡng mãn tính (Foley và

ctv 2011). Về lý thuyết, tổng lượng chất thải thực phẩm sản xuất ở Bắc Mỹ và Châu

Âu có thể có khả năng giảm tình trạng đói nghèo trên thế giới ba lần (Stuart, 2009).

3. Mục đích nghiên cứu

Nhân sinh khối được chủng Bacillus subtilis và Lactobacillus để tăng cường

quá trình thủy phân thức ăn thừa tạo ra được phân bón dạng lỏng.

Đồ án tốt nghiệp

4. Phương pháp nghiên cứu

4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu

Nghiên cứu thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài.

Tổng hợp lựa chọn các đề tài liên quan đến mục tiêu đề tài

4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu

+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.

+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS).

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng:

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập từ ruột cá bởi

Hồng Sêch Hếnh (2016) và chủng Lactobacillus L2 đã được phân lập bởi và

Nguyễn Thị Phương Vy (2015).

Phạm vi nghiên cứu

+ Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải enzyme ngoại bào tốt nhất để phối

trộn vào thức ăn thừa trong việc tạo chế phẩm phân bón lá.

+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh

trưởng và khả năng sinh enzyme protease và amylase cho 2 chủng vi khuẩn được

tuyển chọn.

6. Kết quả đạt được

Tuyển chọn được 1 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại

bào cao nhất trong 6 chủng khảo sát. Hoạt hóa lại chủng Lactobacillus L2

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn đã được tuyển

chọn.

Đồ án tốt nghiệp

Xác đinh được tỷ lệ phối trộn của 2 chủng vào thức ăn thừa để tạo phân bón

dạng lỏng.

Đánh giá được chất lượng của phân bón được tạo thành thông qua các việc

đánh giá sự có mặt của vi khuẩn Coliform, Salmonella, khả năng kích thích sinh

trưởng của hạt, của cây trồng.

7. Ý nghĩa đề tài

+ Ý nghĩa khoa học: Tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis có khả năng

phân hủy protein, tinh bột và cellulose tốt nhất và khả năng sinh acid lactic của

chủng Lactobacillus sp tốt nhất . Đồng thời khảo sát khả năng thủy phân protein khi

phối trộn 2 chủng vi khuẩn này lại với nhau. Bên cạnh đó có thể xác định được hình

thái khuẩn lạc, điều kiện nuôi cấy, yếu tố môi trường và môi trường nhân sinh khối

tối ưu cho các chủng vi khuẩn.

+ Ý nghĩa thực tiễn: Việc phân hủy thức ăn thừa để tạo chế phẩm phân bón sẽ

giảm ô nhiễm môi trường, cung cấp phân bón sạch cho nền nông nghiệp hữu cơ,

giảm tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập phân bón từ nước ngoài.

8. Kết cấu đồ án

Phần mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ , thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận biện chứng cho kết quả thu được.

Phần kết luận và đề nghị: nội dung tóm tắt lại những kết quả mà đề tai đạt

được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa

1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis

1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion

Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm

sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,

Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là

Bacillus subtilis. (Lý Kim Hữu, 2005)

Năm 1941 Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học

Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ

Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng

thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử

dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời (Lý Kim Hữu,

2005).

1.1.1.2. Đặc điểm phân loại Bacillus subtilis

- Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Bacillaceae

Giống (Genus): Bacillus

Đồ án tốt nghiệp

Loài (Species): Bacillus subtilis

Hì nh 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis

http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma/bacillus-subtilis

1.1.1.3. Đặc điểm phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.

(Cohn, 1872). Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú

trong đất, đường tiêu hóa của động vật nhai lại và của con người (theo Nguyễn Đức

Duy Anh, 2005). Bacillus subtilis thường được tìm thấy trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 –

100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện

của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như

bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào

tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương và chao. Bacillus subtilis đóng

vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học

(Vũ Thị Thứ, 1996).

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong

khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu

cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus

popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát

Đồ án tốt nghiệp

triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA),

Nutrient Broth (NB)( theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita ,1991).

1.1.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase

dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt.

Bacillus subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di

chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5-

0,8µm × 1,8-3 µm . Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử

để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ

nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis

có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt

chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm theo (Hong và ctv, 2009).

1.1.1.5. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau: lên men nhưng không

sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylos; Indol (-); VP

(+); nitrate (+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+);

có khả năng di động và hiếu khí. (Lý Kim Hữu, 2005)

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Catalase +

Indol -

MR +

VP +

Citrate +

Nitrate +

Gelatin +

Di động +

Amylase +

Đồ án tốt nghiệp

Arabinose +

Xylose +

Saccharose +

Mannitol +

Glucose +

Lactose -

Maltose +

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992)

1.1.1.6. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử

a) Đặc điểm tế bào

Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng

sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt

như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa

học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng

vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào (McKenney và ctv , 2013).

b) Cấu tạo bào tử

Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang

của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử (Ngô Tự

Thành và ctv, 2009).

Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong

một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi

trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi

khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium (Ngô Tự

Thành và ctv 2009).

Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005),

bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó

là lớp vỏ của tế bào mẹ,ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp

Đồ án tốt nghiệp

protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào

tử (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).

Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu

nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách

bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng

bất hoạt (McKenney và ctv, 2013).

c) Đặc điểm của bào tử

Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà

chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại

qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong

những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất

lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm

hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống (Ngô Tự Thành và ctv,

2009).

Nhiệt độ 1000C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 -

20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn

cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng. Quá trình

hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc

có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử.Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+

(Ngô Tự Thành và ctv, 2009)

d) Sự nảy mầm của bào tử

Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được

gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy

mầm và sinh trưởng. Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong

những đặc điểm quan trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong

những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay

khi gặp điều kiện bất lợi (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).

Đồ án tốt nghiệp

Theo Bùi Thị Phi (2007) sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến

8 giờ để hoàn tất.

e) Ứng dụng của Bacillus subtilis trong sản xuất và đời sống ( Nguyễn Thị Trần

Thụy, 2009)

Trong nông nghiệp, Nhật Bản có sản phẩm EM dùng sản xuất phân bón hữu

cơ.

1983 viện vaxcin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất Biosubtyl dạng bột khô rất thuận

tiện cho người sử dụng.

Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội

đã sản xuất chế phẩm subtin từ Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa

furnacalis trên bắp.

1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ

Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm

Aspergillus Flavus, A. paraciticus.

1977, Nguyễn Vĩnh Phước, Bacillus subtilis tạo kháng sinh subtilin và

Bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr-.

1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus

1.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus.

Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài

khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như

Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei),

Lactobacillus fermentum (L.fermentum), Lactobacillus plantarum (L.plantarum),

Lactobacillus brevis (L.brevis) hay Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus)

(M.Champ và ctv, 1983).

Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và

trong âm đạo. Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic,

ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng

Đồ án tốt nghiệp

khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở

các vi khuẩn gây bệnh. Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về probiotic

cho con người vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm, kháng các

vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư …mang nhiều lợi

ích đối với sức khỏe con người. Ngoài ra Lactobacillus còn điều hòa các miễn dịch

không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và

giảm cytokine. (Lee và Seppo, 2009)

Bên cạnh đó Lactobacillus từ lâu đã được ứng dụng trong thương mại đặc biệt

là trong lĩnh vực thực phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên

men chua như sữa chua, phô mai, bắp cải muối, dưa chua, bia, rượu vang, rượu táo,

kim chi, hoặc trong lĩnh vực y học một số chủng đáng chú ý được biết đến như

Lactobacillus acidophilus sản xuất niacin, acid folic và pyridoxine, một nhóm các

hợp chất chung được gọi là vitamin B hay chủng Lactobacillus GG được phân lập

từ người trong những năm 1980 bởi tiến sĩ Sherwood Gorbach và Barry Goldin

(Kandler và ctv 1984).

Lactobacillus GG là một hứa hẹn tuyệt vời do chúng có thể sống trong đường

ruột, ở đó các vi khuẩn tạo ra một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp duy trì hệ

vi sinh đường ruột khỏi vi khuẩn xâm nhập.

1.1.2.2. Phân loại vi khuẩn Lactobacillus

Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s (Kandler và ctv 1984).

Lactobacillus được phân loại như sau :

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Lactobacillales

Họ (Family): Lactobacillaceae

Chi (Genus): Lactobacillus

Đồ án tốt nghiệp

Loài (Species): Lactobacillus spp.

1.1.2.3. Đặc điểm phân bố

Phần lớn các loài Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày –

ruột người, âm đạo. Chúng thường phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có

nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trong hầu hết các thực

phẩm lên men như sữa chua, kim chi, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy

sản và trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người (Kandler và ctv,

1984).

1.1.2.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp.

Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật. Chúng là những

vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các

loài không di động, không sinh bào tử, hình dạng thay đổi: dạng que thẳng dài, que

hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng

rẽ (Cintas và ctv, 2001).

Hì nh 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus

1.1.2.5. Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp.

Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có

nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic (Mair và ctv 1986). Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 30 – 450 C, pH tối ưu là 5,5

Đồ án tốt nghiệp

– 6,8. Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản

phẩm của quá trình chuyển hóa glucose. Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến

dưỡng để phân chia các loài Lactobacillus chia thành 2 nhóm: lên men đồng hình và

lên men dị hình (Nguyễn Lân Dũng, 2000; Nguyễn Đức Lương, 2006; Đồng Thị

Thanh Thu, 2003).

+ Nhóm lên men lactic đồng hình (điển hình): là quá trình lên men trong đó

các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một

lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…

Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

2CH3CHOHCOOH

+ 21,8 x 104J C6H12O6

Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường

Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid

pyruvic không bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một

phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên.

Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất

acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất

sữa chua, phomai.

Các chủng vi khuẩn tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống:

Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum,…) và

Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris,…)

+ Nhóm lên men lactic dị hình: là quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng,

ngoài acid lactic còn hàng loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic

40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20%

Phương trình chung biểu diễn cho quá trình lên men

CH3CHOHCOOH + HOOC(CH)2COOH + CH3COOH +

C6H12O6

C2H5OH + CO2

Đồ án tốt nghiệp

Theo giả thuyết hiện nay, trong hệ vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme

chủ yếu của con đường Embden – Mayerhoff đó là aldolase, triosephosphate

isomerase. Vì thế giai đoạn đầu của sự phân giải glucose xảy ra theo con đường

pentosephosphate, tạo ra sản phẩm trung gian là xilulose-5-phosphate, sau đó nó bị

phân hủy thành andehit photphoglycerinic và acetyl photphat tiếp tục chuyển hóa

theo 2 hướng để tạo etanol và acid acetic. Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản

phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém. Tuy nhiên quá

trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm.

vi khuẩn lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng

hơn

Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng

sữa có bờ đều, láng và lồi, mờ đục. Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường

nuôi cấy thông thường (Sharpe và ctv, 1966).

1.1.2.6. Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus.

Đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein.

Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bulgaricus, L. casein, L.

paracasein, L. fermentum và L. plantarum. Hệ enzyme phân giải protein của nhiều

loài Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có

tính đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất.Hoạt

tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn dinh

dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón.

1.1.2.7. .Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây

bệnh

Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ

(acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đ ặc biệt

là bacteriocin. (Nguyễn Thế Trang, 2011; Ouwehand và ctv, 1999) Nhiều vi khuẩn

Gram (+), Gram (-) bị ức chế bởi hydrogen peroxide. (Nguyễn Thế Trang , 2011;

Hollang và ctv, 1987).

Đồ án tốt nghiệp

Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo

một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do

đó lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại

cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột.

Những vi khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase,

azoreductase và nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình

thành và phát triển khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid

không thuận lợi (Ivanova và ctv 2000) Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất

của vi khuẩn trong ruột điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già.

(Muralihara và ctv, 1977; Gilliland và ctv, 1980).

Ngoài ra còn phải đặc biệt kể đến các bacteriocin, đây là các hợp chất không

có tính kháng sinh điển hình tức chỉ kìm hãm mà không tiêu diệt vi sinh vật. Điển

hình như plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantaru (Joerger và ctv, 2000).

1.2. Tổng quan về enzyme

1.2.1. Enzyme protease

Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide [-CO-NH-], giữa

các loại acid amin trong phân tử protein để tạo thành acid amin.

1.2.1.1. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu protease

Từ trước thế kỷ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các quy trình enzyme

vào hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia rượu… , nhưng việc ứng dụng trong

giai đoạn này hoàn toàn mang tính chất kinh nghiệm.

Từ thế kỷ 18, các nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã

phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt. Năm

1936, Schawm đã quan sát được hoạt dộng phân giải protein của dịch vị. Năm 1937,

Covisar đã tách được Trypsin từ dịch tụy và cũng là protein đầu tiên nhận được

dưới dạng chế phẩm dù vẫn chưa được tinh sạch.

- 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin .

Đồ án tốt nghiệp

- 1879, Wutz tách thành công protein từ thực vật, bằng phương pháp tủa cồn

lạnh ông đã thu nhận được papain từ cây đu đủ.

- 1918-1919, Waksman đã phát hiện ra khả năng phân giải protein của xạ

khuẩn.

- Từ năm 1950 protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu và có một số

công trình nghiên cứu như:

- Subtilizin A từ Bacillus subtilis của Guntelberg và Ottensen,1950

- Peptidase A từ Streptococcus của Elliot, 1950.

- Protein kiềm từ Aspergillus oryzae của Crewther và Lennox, 1950.

- Aspergillopeptidase từ Aspergillus satoi của Yoshida, 1956.

- Protease kiềm từ Pseudomonas aeruginosa của Morihara, 1957.

- Subtilopeptidase từ Bacillus amyloliquefaciens của Hagihara cùng cộng sự,

1958.

- Keratinase từ Streptomyces fradiae của Nickerson và Durand, 1963. (Nguyễn

Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).

1.2.1.2. Phân loại

Có thể phân loại protease thành các dạng sau (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015)

- Endopeptidase: cắt ngẫu nhiên nội phân tử sợi polypeptide hay còn gọi là

proteinase.

- Exopeptidase cắt liên kết peptide ở đầu N (aminopeptidase) hoặc đầu C

(carboxypeptidase)

Protease là nhóm enzyme phân giải protein mà phần lớn được tế bào tiết ra bên

ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào là chủ yếu. Protease có chức năng sinh học

rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở

sinh vật sống (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).

Protease là nhóm enzyme phân giải protein gồm các enzyme phân giải như

trypsin (là endopeptidase tác động lên liên kết nội phân tử từ protein của amino acid

có tính kiềm như Agr, His, Lys), pepsin (là endopeptidase tác động lên liên kết

Đồ án tốt nghiệp

peptide nội phân tử protein của aminoacid có vòng thơm như Phe, Tyr, Trp),

chymotrypsin là nhóm endopeptidase tác động lên liên kết peptide nội phân tử mà

nhóm carboxyl thuộc về một amino acid có vòng thơm, aminopeptidase là

exopeptidase tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu N của sợi

polypeptide, carboxypeptidase là exopeptide tác động lên liên kết peptide của amino

acid ở đầu C của sợi polypeptide.

Theo phân loại quốc tế thì protease được chia làm 4 phân nhóm phụ:

Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Dipeptihydrolase, Proteinase. Nếu phân loại

theo trung tâm hoạt dộng thì protease được chia làm 4 nhóm nhỏ (Barret, 1984):

Protease serine (EC 3.4.21.) Là protease có nhóm (-OH) của serin trong trung

tâm hoạt động, các protease nay thường hoạt động trong vùng pH kiềm và tính đặc

hiệu tương đối rộng.

Protease cysteine (EC 3.4.22.) Là nhóm protease có nhóm thiol c ủa acid amin

cysteine trong trung tâm hoạt động, nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung

tâm enzyme vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa

học. Protease aspatic (EC 3.4.23.) là nhóm protease có nhóm (-COOH) trong trung

tâm hoạt động. nhóm protease này hoạt động mạnh ở vùng pH acid.

Protease kim loại (EC 3.4.24.) Là những enzyme mà trung tâm hoạt dộng của

nó có những ion kim loại, nhóm này thường hoạt động ở vùng pH trung tính.

Theo nồng độ pH thì protease được chia làm 3 nhóm: protease acid, trung tính

và kiềm (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Cơ chế xúc tác phản ứng

thủy phân liên kết peptide theo cơ chế chung như sau:

E+S →E-S→E-S*+P1 → E+ P2.

Trong đó:

E là enzyme, S là cơ chất.

E-S là phức chất enzyme-cơ chất

E-S* là phức chất trung gian enzyme- cơ chất hóa

P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng

P2 là sản phẩm thứ 2 của phản ứng

Đồ án tốt nghiệp

1.2.1.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật

Vi sinh vật có protease ngoại bào và nội bào, mỗi loại có một vai trò khác nhau

đối với hoạt động sống của vi sinh vật.

Protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong

nhiều dung dịch thành các phân tử thấp để vi sinh vật hấp thụ.

Protease nội bào phân giải các peptide được đưa từ bên ngoài vào thành các

acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.

Tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme và việc này có thể

có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật, chúng còn có

thể phân hủy các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến hoặc tham gia vào quá

trình sinh trưởng của vi sinh vật. (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009)

1.2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật

Quá trình tổng hợp enzyme protease chịu nhiều tác động của các yếu tố vật lý

môi trường khác nhau như nhiệt độ, độ pH, nồng độ oxy, thành phần môi trường…

Mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng nhiệt độ khác nhau tối ưu cho loài, và cho

từng chủng loài, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ và hoạt tính của enzyme được tổng

hợp, như ở loài Bacillus subtilis thì ngưỡng nhiệt độ tối ưu cho loài này phát triển và sinh enzyme là 370C. pH của môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình lên

men của vi sinh vật.

Thành phần môi trường cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh

tổng hợp enzyme, để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C,N

thích hợp. Đối với chủng Bacillus subtilis thì khi môi trường nuôi cấy tăng sinh có

bổ sung thêm rỉ đường nồng độ 2% thì hiệu quả sinh tổng hợp protease sẽ là tốt nhất

(Cohn, 1872), trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme protease cần phải

có chất cảm ứng và các nguồn nitơ hữu cơ (Nakano và ctv, 1998).

1.2.1.5. Ứng dụng

Protease từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và dược phẩm

như công nghiệp chế biến thực phẩm (chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì…hay sản

Đồ án tốt nghiệp

xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa

do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme (Nakano và ctv,

1998)

Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi dưới dạng phối

trộn hoặc probiotic như: enzymebiosub của công ty vaxcin và sinh phẩm số 2,

Baciflora for Shrimp, VIME…..

1.2.2. Enzyme amylase

Amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và

các polysaccharide tương tự diễn ra nhanh hơn, theo tính chất và tính đặc hiệu với

liên kết glucoside, amylase được chia làm ba loại là α-amylase, β-amylase và

glucoamylase (γ- amylase), tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng

tổng hợp được α-amylase mà không tổng hợp được β-amylase và glucose amylase.

Trong số khoảng 100 enzyme công nghiệp thì có hơn một nửa là có nguồn gốc từ

nấm mốc và 1/3 từ vi khuẩn. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được ưa chuộng

hơn so với từ những nguồn khác vì chúng rẻ hơn, dễ kiểm soát, nguyên liệu dễ tìm

và khả năng thu hồi và tinh sạch đơn giản hơn do chúng không chứa các hợp chất

không mong muốn như phenol (ở thực vật) và chất ức chế enzyme (ở động vật)

(Nguyễn Hoài Hương, 2015).

Tuy nhiên trên thực tế thì phần lớn enzyme được sản xuất từ một số nhỏ chi

như Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces…

1.2.2.1. Lịch sử phát hiện

Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm

1811-1814. Những nghiên cứu này do nhà bác học người Nga – viện sĩ K.S Kirhof

thực hiện nhằm nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết

dại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải

tinh bột thành đường.

Amylase thường được tìm thấy trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và

động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2.2. Cấu tạo enzyme và cơ chế hoạt động

α-amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4

glucozid nội mạch ở trong phân tử tinh bột được diễn ra có cơ chất là amylose.

α-amylase cho ra sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và một ít

glucose với cơ chất là amylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 mà không

thủy phân được liên kết 1,6 trong phân tử tinh bột. và theo Nguyễn Thị Trần Thụy

thì trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao

nhưng lại sinh ra α-amylase chịu nhiệt cao (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn,

2013).

1.2.2.3. Vi sinh vật tiết enzyme amylase

Các vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất và thu enzyme

amylase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.

Các chủng nấm mốc hay được sử dụng như: Aspergillus, Rhizopus.

Các chủng nấm men hay được sử dụng như: Candida, Saccharomyces,

Endomycospsis, Endomyces.

Các chủng vi khuẩn hay được sử dụng như: Bacillus mesentericus, Bacillus

subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus macecassavarum, Clostridium

acetobutylium…. Và các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh,

phát triển tốt và ít bị nhiễm các vi sinh vật khác khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ cao.

Bacillus subtilis là vi khuẩn ưa ấm sinh amylase mạnh được nghiên cứu sử

dụng rộng rãi nhất. Theo Bùi Thị Phi, riêng ở Nhật, hằng năm sản xuất tới hàng

chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài Bacillus subtilis này.(Bùi Thị

Phi, 2007).

1.2.2.4. Đặc tính của enzyme amylase

α-amylase phân giải các liên kết α-1,4 glucoside ở giữa chuỗi mạch

polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo-amylase” tạo thành các phân tử dextrin

phân tử thấp.(Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015)

Đồ án tốt nghiệp

α-amylase không chỉ thủy phân được hồ tinh bột mà nó còn có khả năng thủy

phân được cả hạt tinh bột còn nguyên nhưng tốc độ lại rất chậm. Dưới tác dụng của

amylase thì độ nhớt của dung dịch giảm mạnh do tinh bột đã bị α-amylase thủy

phân thành các phân tử dextrin phân tử thấp, maltose, glucose….

α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. α-amylase

bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả enzyme α-amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+ , Hg2+. Có một đặc điểm của enzyme từ vi

khuẩn là enzyme α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa trội hơn hoạt lực

đường hóa so với α-amylase của nấm mốc.

Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên nhanh hơn 2-2,5

lần so với α-amylase của nấm mốc (Bùi Thị Phi, 2007)

pH tối ưu của enzyme α-amylase thu được từ vi khuẩn là 5,8 – 6,0 và vùng

hoạt động tốt là khoảng pH từ 5,8 – 7,0.

α-amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với enzyme này thu được từ nấm mốc ( khoảng 920C so với 700C ở nấm mốc) (Nguyễn Xuân Hòa và

Phạm Hồng Sơn, 2013).

β-amylase xúc tác các phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside kể từ

đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn. (Nguyễn Xuân

Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).

β-amylase không thủy phân hạt tinh bột mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, β-

amylase chỉ phổ biến ở loài thực vật (hạt đang nảy mầm) mà không có ở vi khuẩn

(Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).

Glucose amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6

glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tạo ra sản phẩm

chủ yếu được tạo thành gồm glucose và dextrin (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015).

Loại enzyme này có tính chất acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme amylase và các yếu tố ảnh hưởng

Amylase ở vi khuẩn được có thể được sinh ra trong quá trình phát triển tăng

sinh khối của vi sinh vật hoặc chúng có thể được tích trữ dần trong quá trình sinh

trưởng và phát triển của mình trong tế bào hay trong môi trường.

Riêng đối với chủng Bacillus subtilis thì chỉ tìm thấy được amylase khi vi khuẩn đã

hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng vì amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế

bào đang chuyển qua thời kỳ tự phân (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013).

+ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase.

Ảnh hưởng của nguồn carbon dinh dưỡng: các nguồn carbon và nguồn năng

lượng dễ hấp thu có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp amylase. (Nguyễn Xuân Hòa

và Phạm Hồng Sơn, 2013)

Môi trường nuôi cấy dùng để thu amylase từ vi khuẩn có thể dùng tinh bột,

maltose, saccharose…và nếu như bổ sung CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và

pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp 2 lần vì trong thành phần môi trường có Ca2+ có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có

tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (VASEP, 2015).

Để tổng hợp α-amylase thì môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme này

cần có các dạng muối magie, phosphor, Kali , Mangan, kẽm… nồng độ muối

MnSO4 thích hợp để vi sinh vật tổng hợp α-amylase là 0,05%, thiếu muối thì α-

amylase không được hình thành.

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và sự thông khí cũng ảnh hưởng rất lớn

đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật (Nakano và ctv 1998)

1.2.2.6. Ứng dụng của enzyme amylase

Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

như công nghiệp bia (thay thế một phần đại mạch), công nghiệp nước chấm, công

nghiệp sản xuất glucose, công nghiệp sản xuất bánh mỳ (nâng cao chất lượng bánh),

Đồ án tốt nghiệp

công nghiệp chế biến rau quả, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp

giấy, công nghiệp sợi…

1.2.3. Enzyme Cellulase

Enzyme Cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose

thông qua phân cắt liên kết 1,4-D – glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose

cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh

vật.

Hệ cellulase gồm:

+ endo -(1,4) –β-D-glucanase (EC.3.2.1.4)

+ exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91)

+ β-glucosidases (EC.3.2.1.21)

Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose (Nguyễn Thị Cúc,

2014).

1.2.3.1. Cơ chế tác động của enzyme cellulase

Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm

cuối cùng là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu:

Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân của môi trường làm

thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể

thành dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ

dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide),

cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các

cellulose hòa tan.

Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose

(disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase.

Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các

đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất

đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. (Trần Đông Bách, 2008).

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3.2. Phân loại và đặc điểm của enzyme cellulase

Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức

năng thành 3 nhóm:

Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase).

Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase).

β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase).

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng

từ 40- 600C, pH nằm tong khoảng 4 – 7.

Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C (Trần Đông Bách, 2008).

Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa

học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase

kiểu II.

Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy

Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là

4,4(PI =4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose

kết tinh. Nhưng chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl

cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside

hay β-glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid (Trần Đông Bách,

2008).

Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không

tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả

cellulose không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid.

Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của

Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid.

Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disufide nằm trong trung tâm hoạt

động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động.

Đồ án tốt nghiệp

Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 – 75.000

Da.

Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà

khoa học chia chúng thành hai loại endoglucaase kiểu I và endogglucanase kiểu II.

Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da.

Edoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các

enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao . Ngoài ea endoglucanase còn được

tìm thấy ở Clostridium themocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác.

Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều.

β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động

trong pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI

(isoeletric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Β-glucosidase của

Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da.

Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. β-

glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại β-glucosidase A

và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.82 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5 và ở nhiệt độ 60oC. Chúng

tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Trần Đông Bách,

2008).

1.3. Tổng quan về phân bón

1.3.1. Khái niệm

Phân bón là những chất hoặc hợp chất có chứa một hay nhiều chất dinh dưỡng

thiết yếu đối với cây trồng, giúp cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt cho năng suất

và chất lượng cao hoặc làm tăng độ phì nhiêu của đất. Trong phân bón có chứa

nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Thiếu phân cây sẽ

không thể sinh trưởng, phát triển và cho năng suất, phẩm chất cao.

Các loại phân bón hữu cơ và một số loại phân bón khai thác vô cơ đã được sử

dụng trong nhiều thế kỷ, trong khi các loại phân bón hoá học tổng hợp vô cơ chỉ

Đồ án tốt nghiệp

được phát triển mạnh từ thời cách mạng công nghiệp. Sự hiểu biết và sử dụng tốt

các loại phân bón là những thành phần quan trọng của cuộc Cách mạng Nông

nghiệp Anh (tiền công nghiệp) và cuộc cách mạng xanh (công nghiệp) ở thế kỷ 20

(Phan Phát, 2013).

1.3.2. Phân loại

1.3.2.1. Theo nguồn gốc

a) Phân hữu cơ

Là loại phân bao gồm phế phụ phẩm của cây trồng và gia súc ở các giai đoạn

khác nhau của quá trình phân giải và được bón vào đất nhằm cung cấp dinh dưỡng

cho cây trồng và cải thiện tính chất đất. Phân hữu cơ bao gồm phế phụ phẩm của

trồng trọt, lâm nghiệp, rác thải từ các ngành sản xuất như nghành sản xuất giấy,

đường, bùn cống rãnh và phế phụ phẩm từ các ngành chế biến nông sản (Phan Phát,

2013.

b) Phân vô cơ (phân khoáng, phân hóa học)

Là loại phân bón được sản xuất theo qui trình công nghiệp. Trong quá trình

sản xuất có sử dụng một số nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp. Tùy thuộc vào

nguyên tố dinh dưỡng có chứa trong phân bón, phân hóa học có thể là phân đạm,

lân, kali, canxi, lưu huỳnh… Phân hóa học có thể là phân đơn (chứa 1 nguyên tố

dinh dưỡng), phân đa nguyên tố (chứa 2 hoặc nhiều nguyên tố dinh dưỡng) (Phan

Phát, 2013)

c) Phân vi sinh

Phân có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có ích, với mật độ phù hợp

với tiêu chuẩn đã ban hành. Thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các

chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe...) hay các hoạt

chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản. Phân vi sinh phải

bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh

thái và chất lượng nông sản (theo TCVN 6169-1996) (Phan Phát, 2013)

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2.2. Theo chức năng

a) Phân bón gốc

Là các loại phân bón được bón trực tiếp vào đất để cung cấp chất dinh dưỡng

cho cây trồng thông qua bộ rễ.

b) Phân bón lá

Là các hợp chất dinh dưỡng hòa tan trong nước được phun lên lá để cây hấp

thụ, thông qua hệ thống khí khổng ở bề mặt lá.

1.3.2.3. Theo thành phần dinh dưỡng

a) Phân bón đa lượng

Phân có chứa trong thành phần từ 2 hoặc nhiều hơn các nguyên tố dinh dưỡng

cần thiết cho cây trồng.

b) Phân bón trung lượng

Phân có chứa một loại chất dinh dưỡng trung lượng như: Mg, S, Ca,... Các loại

chất dinh dưỡng này cây cần với một lượng trung bình nhưng rất cần thiết cho sự

sinh trưởng, phát triển của cây trồng.

c) Phân bón vi lượng

Phân có chứa một yếu tố dinh dưỡng vi lượng như: Cu, Fe, Zn, Mo,... Các loại

chất dinh dưỡng này cây trồng cần một lượng rất nhỏ nhưng nó lại ảnh hưởng rất

lớn đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như chất lượng của nông sản phẩm.

1.3.2.4. Theo dạng

a) Phân bón dạng rắn

Các chất dinh dưỡng và chất mang của phân được để ở dạng rắn, dùng để bón

gốc, bón lót

Đồ án tốt nghiệp

b) Phân bón dạng lỏng

Các chất dinh dưỡng dưới dạng hoà tan, sử dụng để phun vào lá, gốc

1.3.3. Thành phần dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng trong phân bón thường có:

- Chất đa lượng: đạm (N), lân (P), kali (K)

- Chất trung lượng: canxi (Ca), lưu Huỳnh (S), magiê (Mg),...

- Chất vi lượng: sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn), Bo (B), đồng (Cu), Clo

(Cl), Molypden (Mo) theo (Glass và Anthony, 2003).

1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ

Phân hữu cơ nói chung có ưu điểm là chứa đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng đa, trung và vi lượng mà không một loại phân khoáng nào có được. Ngoài ra, phân hữu cơ cung cấp chất mùn làm kết cấu của đất tốt lên, tơi xốp hơn, bộ rễ phát triển mạnh, hạn chế mất nước trong quá trình bốc hơi từ mặt đất, chống được hạn, chống xói mòn (Bùi Huy Hiền,2014)

Bón phân hữu cơ làm tăng năng suất cây trồng. Kết quả nghiên cứu khoa học trong rất nhiều năm của các viện, trường, cũng như kết quả điều tra kinh nghiệm của các hộ nông dân cho thấy, năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế cao, ổn định ở những nơi có bón tỷ lệ N hữu cơ và N vô cơ cân đối với tỷ lệ N tính từ hữu cơ chiếm khoảng 25-30% tổng nhu cầu của cây trồng. Ước tính do bón phân hữu cơ năng suất cây trồng đã tăng được 10-20%. Nếu tính riêng về thóc do bón phân hữu cơ (chủ yếu là phân chuồng) đã đạt khoảng 2,5-3,0 triệu tấn thóc/năm. (Bùi Huy Hiền, 2014).

Bón phân hữu cơ còn làm giảm bớt lượng phân khoáng cần bón do phân hữu cơ có chứa các nguyên tố di dưỡng đa lượng, trung lượng và vi lượng. Kết quả nghiên cứu và điều tra cho thấy nếu bón 10 tấn phân chuồng/ha có thể giảm bớt được 40-50% lượng phân kali cần bón.heo Bùi Huy Hiền (2014).

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh

học - Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí

Minh.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập bởi Hồng

Sêch Hếnh (2015).

Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát

Chủng VSV STT

BM13 1

BDH1 2

BDH2 3

BDH3 4

BDH4 5

BDH5 6

- Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ bởi Nguyễn Đình Phương Vy

(2015).

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Hóa chất và môi trường

2.2.2.1. Hóa chất

Pepton Cao thịt

Cao nấm men Lugol

NaCl Malachite Green 5%

Casein CuSO4 20%

Tinh bột tan K2HPO4

Gelatin NaOH 1N

Glycerol HCl 1N

Cồn TCA 10%

Thuốc thử Kovac’s Nước cất

Thuốc thử Griess A, Griess B Thuốc thử Methylred

Glucose KH2PO4

Mangiesium sulfate Sodium acetat

Amonium citrate Manganese sulfate

KI Rỉ đường

2.2.2.2. Môi trường

 Môi trường Nutrient Broth (NB)

 Môi trường Nutrient Agar (NA).

 Môi trường MRS

 Môi trường thu enzyme.

 Môi trường Casein

 Môi trường CMC

 Môi trường Starch agar.

Đồ án tốt nghiệp

 Môi trường MRT

 Môi trường HI

 Môi trường LBS

2.3.Thiết bị và dụng cụ

2.3.1. Thiết bị

- Tủ lạnh - Tủ cấy vi sinh

- Bếp từ - Tủ ấm

- Nồi hấp - Máy quang phổ

- Autoclave

- Máy lắc - Bể điều nhiệt

- Kính hiển vi - Máy ly tâm

- Thùng chụp hình đĩa petri - Cân phân tích

2.3.2. Dụng cụ

- Đèn cồn - Ống nghiệm.

- Dụng cụ đục lỗ thạch - Đĩa petri

- Bông thấm nước - Đũa thủy tinh

- Bông không thấm - Ống ly tâm

- Cốc thủy tinh các loại - Giấy đo pH

- Ống đong các loại

- Pipette thủy tinh 1ml, 5 ml, 10 ml - Chai thủy tinh

- Erlen 100 ml, 250ml - Dây cấy vòng

- Chai đun môi trường 200 ml, 500 ml - Dây cấy thẳng

- Micropipette 100µl, 1000µl - Que cấy trang

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Bố trí thí nghiệm

2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung

VSV

Giữ giống

Hoạt hóa

Chủng thuần khiết

Khảo sát khả năng sinh enzyme của các chủng Bacillus subtilis

Nhuộm Gram Nhuộm bào tử

Chọn chủng vi khuẩn BDH4

Khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng

Khảo sát tính đối kháng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của hai chủng BDH4 và L2 được tuyển chọn

sinh trưởng của chủng vi khuẩn BDH4 và L2

Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của hai chủng BDH4 và L2

Khảo sát pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự

Hì nh 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết

2.4.2.1. Làm thuần các chủng Bacillus subtilis BM và BDH

Các chủng BM và BDH

Tăng sinh trong môi trường NB

Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ

Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ

Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường NA

Nhuộm gram

Nhuộm bào tử

Chọn khuẩn lạc rời rạc

Chủng thuần khiết

Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào

Giữ giống trong eppendoff cùng glycerol 40%

Hì nh 2.2 . Sơ đồ quy trình làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

BM và BDH

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

VSV được lấy từ các chủng được phân lập từ mẫu ruột cá, đã được định danh

sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng và khảo sát pH thích hợp đến khả

năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH tại

phòng thí nghiệm Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. VSV được giữ trong

eppendorf , quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu.

Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn

nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị

chảy ra ngoài.

Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường NB (không chọn lọc) đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình

môi trường chứa 19 ml môi trường NB (không chọn lọc) vô trùng với tỉ lệ cấy giống

5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn côn trong điểu kiện vô

trùng.

Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy môi trường chuyển sang

đục và có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo.

Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh để pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó.

Tiến hành đỗ đĩa môi trường NA đã được hấp khử trùng, dùng micropipette

hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường NA và tiến hành cấy trang đến khi

mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết

quả.

Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của

Bacillus subtilis bắt đầu mọc.

Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách

nhuộm gram và nhuộm bào tử.

Sau khi xác định đó là chủng Bacillus subtilis thì từng chủng vi khuẩn được

test định tính khả năng sinh enzyme protease trên môi trường đĩa thạch casein 1% ;

khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường đĩa thạch tinh bột 1%; khả năng

Đồ án tốt nghiệp

sinh enzyme cellulase trên môi trường đĩa thạch CMC 1%, tiến hành giữ giống

trong eppendorf trong glycerol 40 % những chủng có khả năng sinh enzyme mạnh

để bảo quản .

Chủng L2

2.4.2.2. Làm thuần chủng Lactobacillus L2

Tăng sinh trong môi trường MRS broth

Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ

Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường MRS - agar

Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ

Chọn khuẩn lạc rời rạc

Chủng thuần khiết

Khảo sát khả năng sinh acid lactid

Nhuộm gram Nhuộm bào tử

Giữ giống trong eppendorf cùng glycerol 40%

Hì nh 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ cơm mẻ đã được xác định có khả

năng kháng tốt đối với VSV gây bệnh nhưng không kháng với Bacillus subtilis

(Nguyễn Thị Phương Vy, 2015). Chủng VSV được giữ trong eppendorf được quấn

kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu.

Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn

nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị

chảy ra ngoài.

Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường MRS đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình môi trường

chứa 19 ml môi trường MRS vô trùng với tỉ lệ cấy giống 5% . Thí nghiệm thực hiện

trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn cồn trong điều kiện vô trùng.

Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy có sinh khối bám trên

thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo.

Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh

đem pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó

Tiến hành đỗ đĩa môi trường MRS - agar đã được hấp khử trùng, dùng

micropipette hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường MRS - agar và tiến hành

cấy trang đến khi mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa

để đảm bảo kết quả.

Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của

Lactobacillus sp bắt đầu mọc.

Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách

nhuộm gram.

Sau khi xác định đó là chủng Lactobacillus sp thì chủng vi khuẩn được định

tính khả năng sinh acid lactid trên môi trường thạch MRS có chứa 5 g/l CaCO3, tiến

hành giữ giống trong eppendorf với glycerol 40 % và tiến hành các thí nghiệm nhân

sinh khối.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn BM và

BDH

a) Khảo sát khả năng sinh enzyme protease

Tăng sinh trong môi trường NB pH 7, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ

Các chủng thuần khiết

Cặn

Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất casein 1%

Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất casein 1%

Đỗ đĩa Đục lỗ thạch

Chọn đường kình vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính cho hoạt tính enzyme protease cao nhất

Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải

Hì nh 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease c ủa

các chủng BM và BDH

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Từ kết quả phân lập đã được thực hiện bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã chọn ra

5 chủng có khả năng sinh enzyme cao nhất để đưa vào khảo sát : BM13, BDH1,

BDH2, BDH3, BDH4, BDH5.

Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong

eppendorf với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19

ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường

được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí

nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi

ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi

khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này.

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất casein 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử

trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20ml.

Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng.

Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm

vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ

phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải casein bằng cách

nhỏ thuốc thử TCA 10% vào và quan sát vòng phân giải quanh giếng thạch.

Đồ án tốt nghiệp

b) Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase các của chủng BM và BDH

Tăng sinh trong môi trường NB pH = 7, lắc 150 vòng /phút trong 24 giờ

Cặn

Các chủng thuần khiết

Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất tinh bột 1%

Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất tinh bột 1% Đỗ đĩa Đục lỗ thạch

Chọn đường kính vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính enzyme amylase cao nhất

Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải

Hì nh 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase c ủa

các chủng BM và BDH

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Theo nghiên cứu bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã đưa ra 5 chủng có triển vọng

là : BM13, BDH1. BDH2, BDH3, BDH4, BDH5. Cả 5 chủng được đưa vào khảo

sát để chọn ra chủng có khả năng cho sinh khối cao sinh enzyme amylase tốt nhất

nhằm tăng cường phân hủy thức ăn thừa.

Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong

eppendort với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19

ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường

được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí

nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi

ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi

khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này.

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất tinh bột 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp

khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20ml.

Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng.

Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm

vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ

phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải tinh bột bằng cách

nhỏ lugol vào nhằm làm vòng phân giải tinh bột hiện rõ để có thể đo được đường

kính vòng phân giải xung quanh giếng.

Đồ án tốt nghiệp

Các chủng thuần khiết

c) Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH

Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô

Tăng sinh trong môi trường NB pH7, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất CMC 1%

Cặn

Đỗ đĩa Đục lỗ thạch

Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải

Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất CMC 1%

Chọn đường kình vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính cho hoạt tính enzyme cellulase cao nhất

Hì nh 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase c ủa

các chủng vi khuẩn BM và BDH

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Tương tự như đối với các khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase

của các chủng BM và BDH được tuyển chọn thì ở khảo sát khả năng sinh enzyme

cellulase sinh viên cũng tiến hành thực hiện như sau :

Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong

eppendort với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19

ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường

được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí

nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi

ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi

khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này.

Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất CMC 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử

trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20 ml.

Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng.

Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm

vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ

phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải CMC bằng cách nhỏ

lugol vào nhằm làm vòng phân giải CMC hiện rõ để có thể đo được đường kính

vòng phân giải xung quanh giếng.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.4. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn được dùng để

Chủng Bacilus subtilis

phối trộn vào thức ăn thừa.

Tăng sinh trong môi trường NB

Vi khuẩn Lactobacillus L2 được tuyển chọn

Lắc 150 vòng/phút ở 300C,

Tăng sinh trong MRS broth

24 - 48 giờ. 24 - 48 giờ.

- Pha loãng đến nồng độ 10-6

- Điều chỉnh pH =7 bằng NaOH

- Ly tâm 10000 vòng trong 5 phút để loại bớt sinh khối

Đục lỗ thạch

Đĩa môi trường MRS - agar

- Tiến hành cấy trang trên đĩa môi trường MRS - agar

Hút 0,1 ml dịch nổi cho vào lỗ thạch

Ủ ở 370C trong 48 giờ

Kiểm tra khả năng đối kháng của hai chủng VSV

Hì nh 2.7 . Khảo sát tính đ ối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn

dùng để phối trộn vào thức ăn thừa.

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 đã được tuyển chọn được tăng sinh trong 19

ml môi trường NB đã được hấp khử trùng đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ

phòng trong 24 - 48 giờ. Tương tự tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus L2 trong 19 ml

môi trường MRS broth rồi đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Sau khi tăng sinh pha loãng dịch vi khuẩn Lactobacillus L2 đến nồng độ pha loãng 10-6.

Đổ môi trường MRS - agar trên đĩa petri để khảo sát khả năng đối kháng, sau

khi môi trường đã đông cứng tiến hành hút 0,1ml dịch pha loãng của vi khuẩn chỉ

thị cấy trang lên bề mặt thạch MRS - agar. Tiếp theo đục 3 lỗ thạch đường kính 6

mm lên đĩa thạch rồi nhỏ 0,1ml dịch trong (dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis

BDH4 đã li tâm 10.000 vòng trong 5 phút) vào các giếng thạch đã đục.

Ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó quan sát sự tạo vòng kháng khuẩn và đo đường

kính vòng phân giải.

Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng

đường kính vòng kháng khuẩn ∆D (Schillinger và ctv, 1989).

∆D = D-d (mm)

Trong đó:

D: đường kính vòng vô khuẩn (mm);

d: đường kính lỗ thạch (mm)

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng

Chủng thuần khiết

Tăng sinh trong môi trường NB pH = 7, lắc 150 vòng/ phút/ 24 giờ

Bacillus subtilis BDH4.

Quan sát và ghi nhận sự tăng trưởng của các chủng thử nghiệm

Cấy giống : hút 1ml dịch tăng sinh cấy vào môi trường NB có bổ sung rỉ đường 2%, điều chỉnh pH về mức pH 3 ,4, 5, 6, 7, 8 lắc 150vòng/phút/24 giờ

Cặn

Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô

Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải

Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch casein đã điều chỉnh pH về pH4, 5, 6, 7, 8.

Chọn giá trị pH tối ưu cho hoạt tính enzyme cao nhất

Hì nh 2.8 . Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease c ủa

chủng Bacillus subtilis được tuyển chọn

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm sẽ được tăng

sinh trong chai NB vô trùng, pH = 7 lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút

trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Sau 24 giờ nuôi cấy, sử dụng dịch tăng sinh này để làm giống cấy vào môi

trường NB có bổ sung 2 % rỉ đường đã vô trùng, hút 1ml dịch tăng sinh cấy vào mỗi

chai thủy tinh 100 ml chứa sẵn 20 ml dịch môi trường nuôi cấy có bổ sung 2% rỉ

đường đã tiệt trùng và đã điều chỉnh pH về các mức 4, 5, 6, 7, 8 bằng dung dịch

HCl 1N và NaOH 1 N nhằm mục đích thu dịch enzyme thô của vi khuẩn dưới ảnh

hưởng của các nồng độ pH khác nhau từ acid đến base.

Với tỷ lệ cấy giống là 5%, các chai môi trường được đặt vào máy lắc và lắc

150 vòng / phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối

chứng âm cho thử nghiệm này.

Sau khi lắc được 24 giờ, hút 1 ml dịch nuôi cấy từ mỗi chai môi trường cho

vào eppendoff đem li tâm 10000 vòng/ 15 phút bỏ cặn thu dịch enzyme thô. Dịch

nuôi cấy trước khi ly tâm cần hạ thấp nhiệt độ trước nhằm hạn chế sự gia tăng nhiệt

độ trong quá trình ảnh hưởng đến hoạt tính của protease. Dùng micropipette hút 0,1

ml dịch enzyme thô bơm vào các giếng thạch Casein đã điều chỉnh về pH 4, 5, 6, 7,

8. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường

kính vòng phân giải casein bằng cách nhỏ lugol vào nhằm làm vòng phân giải

Casein hiện rõ để có thể đo được đường kính vòng phân giải để xác định pH tối ưu

ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical

Analysis system phục vụ cho các mục đích thí nghiệm khác liên quan đến khả năng

sinh enzyme và hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn phân lập được.

Đồ án tốt nghiệp

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp tăng sinh

 Mục đích : Phương pháp này nhằm giúp cho vi khuẩn hồi phục khả năng sinh

trưởng để phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy tiếp theo giúp làm ổn

định giống và nâng cao tính chính xác của các thí nghiệm.

 Phương pháp:

 Đối với các chủng Bacillus subtilis

Môi trường NB (không chọn lọc) được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao

tác trong điều kiện vô trùng, cho 1 ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1 ml

dịch nuôi cấy trong môi trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1

khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai môi trường NB, ủ và lắc ở 150 vòng/ phút trong 24

giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính.

 Đối với chủng Lactobacillus L2

Môi trường MRS broth được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác

trong điều kiện vô trùng, cho 1 ml chủng vi khuẩn trong eppendorf hay 1 ml dịch

nuôi cấy trong môi trường tăng sinh trước đó hoặc dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc

riêng rẽ cho vào chai môi trường MRS broth.

2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu

 Mục đích : làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu hay

dịch đồng nhất mẫu giúp cho việc phân lập riêng rẽ từng khuẩn lạc tế bào được dễ

dàng hơn.

 Nguyên tắc : pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhất trong

phương pháp phân tích vi sinh nhưng rất quan trọng, việc pha loãng mẫu ảnh hưởng

trực tiếp đến kết quả thí nghiệm, khi mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp sẽ

thuận lợi cho người phân tích vi sinh đọc kết quả hay thực hiện các phân tích định

lượng một cách dễ dàng nhất có thể.

Đồ án tốt nghiệp

 Phương pháp.

Phương pháp này chỉ dùng trong trường hợp vi sinh vật phân bố nhiều trong

mẫu và để định lượng vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm.

Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý

Chuẩn bị sẵn dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % và chính xác 9 ml vào mỗi

ống nghiệm có nút đậy rồi đem hấp khử trùng.

Dùng micropipette hút 1 ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nước muối

sinh lý đã chuẩn bị vô trùng để pha loãng và tiến hành thao tác pha loãng đến một dãy nồng độ nhất định thích hợp. Dung dịch gốc nồng độ sẽ được ghi nhận là 100,

ống nước muối sinh lý đã hút 1 ml dung dịch cần pha loãng vào sẽ là ống có nồng độ pha loãng là 10-1, pha loãng tiếp sẽ là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,10-6…. (Phạm Minh

Nhựt, 2014)

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc

 Nguyên tắc : VSV khi phát triển trên bề mặt các môi trường đặc trưng sẽ hình

thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng của loài đó. Sử dụng môi trường NB là đặc

trưng cho loài Bacillus subtilis và sử dụng môi trường MRS broth là đặc trưng cho

các loài thuộc chi Lactobacillus.

 Phương pháp.

Đầu tiên tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn đã hoạt hóa từ 24 – 48

giờ, ở các dãy nồng độ 10-3, 10-4, ….

Tiếp đến dùng micropipet hút 0,1 ml dịch nuôi cấy đã pha loãng nhỏ lên bề

môi trường đĩa thạch NA đối với Bacillus subtilis và MRS broth đối với chủng

Lactobacillus spp.

Dùng que trang trang đều khắp bề mặt đĩa thạch. Sau đó đặt trong tủ ủ 370C

trong 2 – 3 ngày.

Quan sát và nhận xét đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước, tính chất bề mặt

của khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào

Các chủng sau khi được làm thuần bằng phương pháp cấy trang được quan sát

hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm gram để xác định từng chủng vi khuẩn

này thuộc nhóm Gram dương hay Gram âm. Chúng được tăng sinh trong môi

trường thích hợp trong 18-24 giờ, lắc 150 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.

(Phạm Minh Nhựt, 2014).

 Kỹ thuật nhuộm Gram

Làm tiêu bản : dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame. Vết bôi sẽ -

được cố định trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 30 giây. -

Rửa nước -

Nhuộm lugol trong 1 phút. -

Rửa nước. -

Tẩy cồn 960 trong 20-30 giây, để nghiêng tiêu bản và nhỏ từng giọt cồn cho -

đến khi tan hết màu.

Rửa nước. -

Nhuộm bổ sung Fushin hoặc Safranin từ 10-30 giây. -

Rửa nước. -

Để khô và quan sát dưới kính hiển vi. -

 Nhuộm bào tử

- Vi sinh vật được nhuộm bào tử để xác định khả năng sinh bào tử của chúng,

nếu chúng có khả năng sinh bào tử chứng tỏ chúng có thể là Bacillus subtilis và

ngược lại thì không.

Cấy ria hoặc trang vi khuẩn từ đĩa khuẩn lạc thuần nhất sang đĩa môi trường NA mới và tiến hành đem ủ ở 370C trong 4 - 5 ngày với mục đích cho vi

khuẩn sinh bào tử.

Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc riêng lẻ để làm

vết bôi trên lame.

Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn.

Đồ án tốt nghiệp

Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun từ từ đến khi đạt khoảng 800C nhằm tăng

độ hấp thụ malachite Green của bào tử rồi đặt một tấm giấy lọc lên miệng cốc.

Đặt lame có vết bôi lên trên tấm giấy lọc và đặt thêm 1 tấm giấy lọc nữa lên vết bôi,

nhỏ từ từ malachite green 5% lên phía trên vết bôi và luôn giữ cho chúng không bị

khô trong vòng 5 phút nhuộm.

Rửa vết bôi bằng nước cất khoảng 30 giây.

Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fushin trong khoảng 60 - 90 giây rồi rửa lại

bằng nước cất.

Thấm khô và quan sát dưới vật kính 100x cùng dầu soi kính (Phạm Minh

Nhựt, 2014).

2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

 Nguyên tắc :

Phải đảm bảo tốt điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi đặc

tính, phẩm chất ban đầu của giống.

Làm chậm quá trình trao đổi chất và hô hấp của vi sinh vật và đồng thời cũng ngăn

cản quá trình sinh sản của chúng.

 Mục đích.

Giữ và bảo quản các chủng phân lập dược nhằm đảm bảo nguồn giống để thực

hiện các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo có liên quan đến chủng vi khuẩn đã phân

lập (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.4.5.1. Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật

Phương pháp cấy chuyền này thực hiện trên môi trường thạch NA đối với vi

khuẩn Bacillus subtilis và môi trường MRS – agar đối với chủng vi khuẩn Lactobacillus. Các môi trường phải được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút

trước khi tiến hành thí nghiệm.

Dùng que cấy vòng vô trùng (hơ trên ngọn lửa đèn cồn) lấy sinh khối VSV cấy

zich zắc trên bề mặt môi trường thạch nghiêng . Đậy nút bông lại , quấn paraffin và

ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ , khi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C để giữ giống. Phương pháp này được thực hiện định kỳ 1-2

Đồ án tốt nghiệp

tháng cấy chuyền một lần, đảm bảo chủng vi khuẩn luôn được chuyển đến môi

trường mới trước khi già và chết và giống không phải hoạt hóa trước khi nhân

giống.

 Ưu điểm

Phương pháp này có thể thực hiện áp dụng cho mọi loài vi sinh vật, ngoài ra

phương pháp này còn đơn giản, dễ thực hiện.

 Khuyết điểm

Thời gian bảo quản ngắn, hao phí môi trường, công sức và thời gian cho công

việc. Nếu không duy trì được điều kiện tối ưu thì khả năng chủng giống sẽ thay đổi

phẩm chất ban đầu mà rất khó xác định được nguyên nhân trong quá trình cấy

chuyền (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch

 Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào

khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải protein của

các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc.

 Enzyme tác động lên cơ chất trong môi trường agar, cơ chất bị phân hủy, độ

đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản

ánh hoạt lực của enzyme.

 Phương pháp : Pha môi trường chứa 1% casein, 1,7% agar, 1000 ml mước cất; chuẩn bị đầu tuýp 1000µl, 100µl, eppendorf đem hấp vô trùng ở 1210C trong 15

phút.

- Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi

trường nuôi cấy thích hợp. Nuôi cấy trong 24 giờ sau đó hút 1 ml cho vào eppendorf

đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút.

- Hút 0,1 ml dịch nổi cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn.

- Ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ , quan sát vòng phân giải.

- Nếu xảy ra hiện tượng phân giải protein thì sẽ hình thành vòng phân giải

trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho TCA 10% vào và ngược lại thì không.

Đồ án tốt nghiệp

- Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng

lớn thì khả năng phân giải protein càng cao.

Trong đó :

- D : là đường kính vòng phân giải (mm)

- d : là đường kính giếng thạch (mm)

2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose.

 Mục đích: để xác định khả năng phân hủy tinh bột, protein, cellulose của các

chủng vi khuẩn, tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch.

 Phương pháp: nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có chứa cơ chất là tinh

bột, casein, CMC ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/ phút. Sau 24 giờ nuôi cấy thu lấy

dịch nuôi trong điều kiện vô trùng, ly tâm 10.000 vòng/phút thu lấy dịch trong.

Tiếp theo, đổ môi trường đĩa thạch có chứa cơ chất tinh bột, casein, CMC vô

trùng vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại tiếp theo đục lỗ thạch

(đường kính 6 -8 mm) thành các giếng.

Dùng micropipette hút 1ml dung dịch thu được sau ly tâm bơm vào các giếng

trong đĩa petri. Ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, quan sát vòng phân giải bằng

thuốc thử. Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt thạch nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng

phân giải xung quanh giếng.

 Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường chứa tinh bột tan

Dùng dung dịch lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh amylase thì

sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng còn vùng chưa bị phân giải thì có màu

tím.

 Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease trên môi trường chứa casein

Dùng thuốc thử TCA 10% đỗ đầy lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh

protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng, do protein bị phân giải

không còn phản ứng kết tủa với TCA. Các vùng không bị phân giải sẽ có màu trắng

đục.

 Kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase trên môi trường chứa CMC

Đồ án tốt nghiệp

Dùng dung dịch lugol đổ lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh cellulase thì

sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng, còn vùng chưa bị phân giải sẽ có

màu tím.

2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu và biểu đồ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

Các số liệu thô được xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV.

Các số liệu sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng

LSD với mức ý nghĩa 0,05.

2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV

Mục đích: Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus để thực

hiện cho các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn

được tuyển chọn chính xác hơn.

Tiến hành:

Tăng sinh chủng Lactobacillus trên môi trường MRS broth và chủng Bacillus

subtilis trên môi trường NB. Ủ ở 37℃ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, ta

tiến hành đo OD600nm và cấy trang ở cùng thời điểm.

 Đo OD600nm: Ta thực hiện pha loãng dịch tăng sinh VSV đã được xác định mật

độ theo hệ số 2𝑛 bằng cách:

+ Hút 2ml nước muối sinh lí đã được khử trùng ở 121℃ trong 15 phút vào 10

ống nghiệm, trong đó gồm 9 ống dùng để pha loãng và 1 ống làm mẫu trắng.

+ Đối với 9 ống nghiệm để pha loãng (tất cả đều được đánh số thứ tự rõ ràng):

+ Hút 2ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất, lắc đều ta được dung dịch pha

loãng 2 lần. Sau đó từ ống thứ nhất hút 2ml sang ống thứ 2, lắc đều ta được dung

dịch pha loãng 4 lần.

+ Tiến hành tương tự ta được chuỗi ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng

theo hệ số 2n: 2 lần, 4 lần, 8 lần, 16 lần, 32 lần, 64 lần, …

+ Đo OD600nm 9 ống chứa dịch đã pha loãng. (Phạm Minh Nhựt, 2014).

Đồ án tốt nghiệp

 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

Pha loãng mẫu:

Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý đã được hấp

khử trùng ở 121℃ trong 30 phút. Đánh số thứ tự từ 1 đến 9 tương ứng với 9 nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-9.

Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống thứ nhất, lắc đều. Sau đó, hút 1ml từ ống thứ

nhất sang ống thứ 2, tương tự thao tác cho đến hết 9 ống.

Cấy trang:

Hút 0.1ml dịch pha loãng ở ống 10−5 vào đĩa petri chứa môi trường MRS agar

đối với chủng Lactobacillus spp và môi trường NA đối với chủng Bacillus subtilis.

Chọn nồng độ từ 10−5đế𝑛 10−9 để cấy trang, mỗi nồng độ lặp lại trên 3 đĩa.

Sau khi trang khô, ta ủ ở nhiệt độ 37℃ trong 24 – 48 giờ cho khuẩn lạc có thể

phát triển thuận lợi để đếm.

Sau khi đếm khuẩn lạc, ta định lượng vi sinh vật bằng công thức

N = ΣC (n1 + 0.1n2)d

 N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu.

 C – số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn (chọn các đĩa có số

khuẩn lạc dao động từ 25 – 250 khuẩn lạc).

 𝑛1,𝑛 2 – số đĩa petri ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn.

 d – hệ số pha loãng mẫu

Từ kết quả đo OD600nm và kết quả đếm khuẩn lạc của 2 chủng vi khuẩn ta tiến

hành dựng đường chuẩn tế bào và có được phương trình đường chuẩn cho các khảo

sát tiếp theo.

2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

được tuyển chọn.

Để xác định thời điểm nuôi cấy thích hợp cho sự sinh truởng của 2 chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis BDH4 và Lactobacillus L2. Sinh viên tiến hành nuôi cấy các

trên môi trường MRS broth.

Đồ án tốt nghiệp

Thu nhận mẫu tại từng thời điểm 0h; 12h; 24h; 36h; 48h; 60h và 72h.

Xác định sự tăng trưởng bằng cách tiến hành đo OD600nm.

Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo sát để xác định mật

độ tế bào VSV nhằm kết luận được thời điểm nuôi cấy thích hợp nhất cho sự sinh

trưởng 2 chủng VSV được tuyển chọn.

2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn

Giá trị của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của VSV. Những biến đổi dù nhỏ của các ion H+ và OH- trong môi trường cũng làm ảnh hưởng đến VSV.

Nguyên tắc: dựa vào khả năng sinh trưởng của VSV trong môi trường thích

hợp với các độ pH khác nhau.

 Cách tiến hành:

Đối với vi khuẩn Bacillus subtilis 

Tiến hành cho 1 ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn vào

trong 19 ml môi trường lỏng NB đã được hấp khử trùng. Với tỉ lệ cấy giống 5%.

Lắc ở 150 vòng/phút từ 24 - 48 giờ.

Sau đó từ bình tăng sinh hút 1ml cấy chuyền sang các bình môi trường NB đã

được điều chỉnh pH 4,5,6,7,8,9 đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.

Đem lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút với thời gian đã xác định ở thí nghiệm

trên.

Đo mật độ quang OD600nm để xem khả năng tăng trưởng đồng thời kiểm tra sự

thay đổi pH môi trường. Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo

sát trước đó để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được pH ban đầu thích

hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng VSV được tuyển chọn.

Đồ án tốt nghiệp

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus

Tiến hành cho 1 ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn vào

trong 19 ml môi trường lỏng MRS broth đã được hấp khử trùng. Với tỉ lệ cấy giống

5%. Lắc ở 150 vòng/phút từ 24 - 48 giờ.

Sau đó từ bình tăng sinh hút 1 ml cấy chuyền sang các bình môi trường MRS broth đã được điều chỉnh pH 5,6,7,8,9,10 đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 15

phút.

Đem lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút với thời gian đã xác định ở thí nghiệm

trên .

Đo mật độ quang OD600nm để xem khả năng tăng trưởng đồng thời kiểm tra sự

thay đổi pH môi trường. Sau đó dựa vào phương trình đường chuẩn đã được khảo

sát trước đó để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được pH ban đầu thích

hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng VSV được tuyển chọn. Xác định pH môi

trường ban đầu tối ưu dựa vào mật độ tế bào log(cfu/ml)

2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh

enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn.

Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và khả năng sinh

enzyme của các chủng VSV. Vì vậy việc tìm môi trường nhân sinh khối thích hợp

sẽ giúp cho việc phối trộn vào thức ăn thừa để tạo phân bón của các chủng vi khuẩn

càng hiệu quả.

 Cách tiến hành:

 Đối với Bacillus subtilis

Tiến hành tăng sinh chủng Bacillus subtilis trên môi trường NB đã được hấp

khử trùng, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ

Sau đó tiến hành cấy chuyền sang các môi trường:

1. Môi trường 1 (MT1): NB + 1% tinh bột

2. Môi trường 2 (MT2): NB + 1% glucose

3. Môi trường 3 (MT3): tham khảo dựa trên thành phần môi trường lên men

Bacillus subtilis của tập đoàn ICFOOD cung cấp cho khách hàng

Đồ án tốt nghiệp

4. Môi trường MT4 : NB + 2% rỉ đường

5. Môi trường NB (Đối chứng)

 Đối với Lactobacillus L2

Tiến hành tăng sinh chủng Lactobacillus L2 trên môi trường MRS broth đã

được hấp khử trùng, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ

Sau đó tiến hành cấy chuyền sang các môi trường:

1. Môi trường MRS (Đối chứng)

2. Môi trường HJ

3. Môi trường LBS

4. Môi trường MRT

Đem lắc các chủng VSV trên máy lắc ở 150 vòng/phút với thời gian và pH đã

xác định ở thí nghiệm trên cho mỗi chủng vi khuẩn.

Đo mật độ quang OD600nm để xem khả năng tăng trưởng đồng thời kiểm tra sự

thuần khiết của môi trường bằng cách pha loãng , cấy trang và quan sát khuẩn lạc

Dựa vào giá trị OD600nm đo được sau đó thay vào phương trình đường chuẩn

đã được khảo sát để xác định mật độ tế bào VSV nhằm kết luận được môi trường

nuôi cấy thích hợp nhất cho 2 chủng VSV được tuyển chọn.

Sau thời gian nuôi thích hợp, tiến hành li tâm thu dịch lọc, dùng micropipette

vô trùng hút một lượng dịch enzyme nhất định vào giếng chứa môi trường khảo sát

khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease của từng chủng. Đặt cẩn thận các đĩa petri vào trong tủ ủ ở 370 C trong 24 - 48 giờ. đo kích thước vòng phân giải

tinh bột và protein, mỗi thí nghiệm lặp 3 lần.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase ,

cellulase và protein của các chủng BM13 và BDH

Với mục đích chọn lựa các vi sinh vật để phân hủy thức ăn thừa nên tiêu chí

để lựa chọn các chủng là khả năng sinh enzyme amylase, cellulase và protease để

phân hủy tinh bột, cellulose và protein.

3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng BDH và

BM13.

Kết quả được trình này ở bảng 3.1 và hình 3.1; 3.2 cho thấy, các chủng khảo

sát đều có khả năng sinh enzyme amylase thể hiện ở sự xuất hiện vòng phân giải

tinh bột. Trong đó, nổi trội hơn cả là chủng BDH4 và chủng BM13.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các

chủng vi khuẩn BM13 và BDH

Chủng VSV Đường kính vòng phân giải (D-d) mm

BM13 5,67 ± 0,58a

BDH1 2,33 ± 0,58c

BDH2 5,33 ± 1,15ab

BDH3 3,33 ± 2,31bc

BDH4 6,00 ± 0,00a

BDH5 2,67 ± 1,15c

Đồ án tốt nghiệp

Vòng phân giải tinh bột (D - d) mm

VPG (mm) 7.00

6.00

b c

5.00

4.00

VPG

3.00

2.00

1.00

0.00

BM13

BDH1

BDH2

BDH3

BDH4

BDH5

Chủng VSV

Hì nh 3.1 . Khả năng phân giải tinh bột của các chủng BM13 và BDH

Hì nh 3.2. Vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM13 và BDH

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn

BM13 và BDH.

Thực hiện như mục 2.4.2.3a, ta được kết quả sau:

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của

các chủng vi khuẩn BM và BDH

Chủng VSV Vòng phân giải protein (D-d) mm

10,00 ± 2,00b BM13

6,67 ± 1,15c BDH1

4,67 ± 1,15c BDH2

9,33 ± 2,31b BDH3

14,67 ± 5,77a BDH4

8,00 ± 1,15bc BDH5

Vòng phân giải protein (D - d) mm

VPG (mm)

18.00

16.00

14.00

12.00

VPG

10.00

8.00

6.00

4.00

2.00

0.00

BM13

BDH1

BDH2

BDH3

BDH4

BDH5 Chủng VSV

Hì nh 3.3 . Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các

chủng BM và BDH

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.4. Vòng phân giải protein của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH

Qua kết quả được trình bày ở hình 3.3; 3.4 và bảng 3.2 sinh viên thấy rằng các

chủng vi khuẩn phân lập được đem thử nghiệm đều có khả năng sinh enzyme

protease. Trong đó chủng BDH4 cho kích thước vòng phân giải to nhất với đường

kính vòng phân giải (D – d ≥ 10 mm). Hai chủng BDH1 và BDH2 có kích thước

vòng phân giải nhỏ hơn.

Đồ án tốt nghiệp

3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM13

và BDH.

Tiến hành thực hiện như mục 2.4.2.3c. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và

hình 3.5 và 3.6

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các

chủng vi khuẩn BM13 và BDH

Chủng VSV Đường kính vòng phân giải (D-d) mm

8,67 ± 1,15b BM13

8,67 ± 1,15b BDH1

9.33 ± 1,15ab BDH2

11.33 ± 2,31a BDH3

10.00 ± 0,00ab BDH4

9.33 ± 1,15ab BDH5

Vòng phân giải CMC (D - d) mm

VPG (mm) 14.00

12.00

10.00

8.00

VPG

6.00

4.00

2.00

0.00

BM13

BDH1

BDH2

BDH3

BDH4

BDH5

Chủng VSV

Hì nh 3.5 . Vòng phân giải CMC của các chủng BM13 và BDH sau 48 giờ

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.6 . Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2

ngày nuôi c ấy.

 Qua kết quả ở hình 3.5, hình 3.6 và bảng 3.3 sinh viên thấy rằng các chủng vi

khuẩn phân lập được đem thử nghiệm có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân

CMC. Vòng phân giải cao nhất thuộc về chủng BDH3, nhưng không sai khác so với

chủng BDH2, BDH4 và BDH5.

Như vậy, các chủng vi khuẩn BDH và BM13 đều có khả năng sinh enzyme

amylase, cellulose và protein, phân giải tinh bột, CMC và casein. Vi khuẩn tiết

Đồ án tốt nghiệp

enzyme để thủy phân các đại phân tử lớn như: enzyme protease thủy phân protein,

enzyme cellulase thủy phân CMC. Các enzyme này thủy phân protein, tinh bột,

cellulose, hình thành các amino acid và monosaccharide sau đó vận chuyển vào tế

bào giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra. So với nghiên cứu của Ngô Tự Thành

(2007) trên 236 chủng Bacillus chỉ có 2 chủng T20 và M27 thể hiện đầy đủ các hoạt

tính như phân hủy cả gelatine và chất béo trong sữa,các chủng còn lại đều chỉ thể

hiện tính năng phân hủy protein hay tinh bột. Như vậy, có thể thấy rằng tất cả các

chủng BM và BDH được tuyển chọn đem thử hoạt tính enzyme đều có khả năng

sinh enzyme ngoại bào khá cao. Trong đó thì chủng BDH4 có khả năng tiết enzyme

ngoại bào tốt nhất.

Theo công bố trong quyển Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

của Bergey và Holt (1994) cho rằng, các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh

enzyme amylase nên có khả năng phân hủy tinh bột và phân giải casein nhờ khả

năng sinh enzyme protease.

Trên cơ sở đó từ kết quả phân lập và khảo sát khả năng sinh enzyme của 6

chủng vi khuẩn BM và BDH cho thấy rằng cả 6 chủng đều mang một trong những

đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis.

Trong đó chủng BDH4 có khả năng thủy phân tinh bột và protein lớn nhất với

đường kính vòng phân giải amylase (D - d ≥ 6 mm) và đường kính vòng phân giải

protease (D – d ≥ 10 mm).

Đối với khả thủy phân CMC thì chủng BDH4 là một trong hai chủng có khả

năng thủy phân CMC cao nhất. với đường kính vòng phân giải (D – d ≥ 10 mm).

Từ các kết quả trên nên sinh viên chọn chủng BDH4 vào các thử nghiệm tiếp

theo.

3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4

Chủng BDH4 được cấy trang trên môi trường NA, ủ ở 370C quan sát thấy sự

hình thành khuẩn lạc riêng lẻ.

Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn BDH4 có hiện tượng hình thành bào tử phát

triển trên bề mặt môi trường đĩa thạch. Quan sát kết quả nhuộm bào tử trên kính

Đồ án tốt nghiệp

hiển vi cho thấy bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite green và thành tế

bào vi khuẩn bắt màu hồng của Fucshin. Qua kết quả phân tích cho thấy rằng thời

gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càng nhiều. Điều này có thể giải

thích do thời gian nuôi cấy càng lâu dinh dưỡng ngày càng ít, kích thích sự hình

thành bào tử.

3.2.1. Kết quả nhuộm Gram

Hì nh 3.7 . Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus

subtilis BDH4 nhuộm Gram trên kính hi ển vi x100

(A) – Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BDH4, (B) – Hình thái tế bào vi khuẩn BDH4

Từ kết quả hình 3.7 cho thấy rằng khuẩn lạc chủng BDH4 không đồng đều, có

màu trắng xám, bờ răng cưa đều, nhăn có màu trắng xám, rìa khuẩn lạc nhô cao.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử

Hì nh 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4

Sau khi tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram và nhuộm bào tử

cho thấy rằng chủng BDH4 là vi khuẩn Gram dương có hình que, bắt màu tím của

gentian violet mà không có khả năng bắt màu hồng của fushin khi nuôi cấy được 24

- 48 giờ trong môi trường NB. Kết quả này cho thấy rằng chủng vi khuẩn có vách

peptidoglycan dày, bắt màu tốt với gentian violet và iod nên quá trình tẩy màu bằng

cồn không tẩy được hết màu tím khỏi lớp peptidoglycan của chúng nên chúng

không thể tiếp tục bắt màu hồng. Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu ban đầu

của Hồng Sếch Hếnh (2016) khi cho rằng chủng BDH4, có đầy đủ các đặc điểm của

vi khuẩn Bacillus subtilis (vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, có các thử nghiệm

catalase, gelatin dương tính…) dựa theo khóa phân loại Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology của Bergey và Holt (1994).

3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2

Theo kết quả nuôi cấy của Nguyễn Thị Phương Vy (2016). Trong số các

chủng Lactobacillus spp phân lập từ cơm mẻ thì chủng L2 có khả năng sinh trưởng,

sinh acid lactic và khả năng tiết kháng sinh tốt nhất. Vì vậy, sinh viên chọn chủng

này để cho vào nghiên cứu của mình.

Đồ án tốt nghiệp

Sinh viên tiến hành khảo sát đặc điểm hình thái của chủng L2 bằng cách

nhuộm Gram tế bào vi khuẩn sau 24 giờ tăng sinh trong môi trường MRS broth vì

khi tế bào già sẽ cho kết quả âm tính như vi khuẩn gram âm.

Hì nh 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm

Gram trên kính hiển vi x100

(A) – Hình thái khuẩn lạc chủng L2; (B) – Hình thái tế bào

Kết quả quan sát cho thấy, chủng L2, được tuyển chọn là vi khuẩn có hình

que, tế bào dạng đơn hay xếp thành đôi, thành chuỗi ngắn. Là một loài vi khuẩn

Gram +, không di động, không sinh bào tử. Khuẩn lạc tròn, lồi, màu đục sữa, mép

trơn, bóng nhẵn, không có tâm, gò cao. Cộng với kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Thị Phương Vy (2016), sinh viên tạm đạt tên đây là chủng Lactobacillus L2.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với

Lactobacillus L2

Nhằm thực hiện việc phối trộn hai chủng vi khuẩn này vào thức ăn thừa. Sinh

viên tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của hai chủng này khi phối trộn với

nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10:

Hì nh 3.10 . Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với

Lactobacillus L2

Qua kết quả hình 3.10 sinh viên nhận thấy rằng chủng Bacillus subtilis BDH4

và Lactobacillus L2 không ức chế nhau nên có thể phối trộn với nhau để tăng cường

sự phân hủy thức ăn thừa.

Đồ án tốt nghiệp

3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus

subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau

Hì nh 3.11 . Khả năng sinh enzyme protease khi tr ộn 2 chủng vi khuẩn

BDH4 và L2

(A) – Khả năng sinh enzyme protease khi trộn hai chủng BDH4 và L2 lại với nhau.

(B) - Khả năng sinh enzyme protease của chủng BDH4

So sánh khả năng phân giải protein để sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng

vi khuẩn BDH4 + L2 với chủng BDH4 và L2 riêng lẻ, kết quả cho thấy thấy rằng

khả năng sinh enzyme protease khi trộn hai chủng lại với nhau cũng không kém hơn

so với khả năng sinh enzyme protease của chủng BDH4 và chủng L2 riêng lẻ. Kết

quả cho thấy rằng hoàn toàn có thể phối trộn hai chủng này chung với nhau trong

thức ăn thừa để thủy phân protein trong thức ăn.

Đồ án tốt nghiệp

3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis

BDH4

3.6.1. Thời gian nuôi cấy

Tiến hành khảo sát theo mục 2.5.10. sinh viên thu được kết quả như sau:

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

BDH4

Thời gian nuôi cấy (giờ) Log (mật độ)

0 8,75 ± 0,01e

12 10,29 ± 0,08d

24 11,95 ± 0,11ab

36 12,04 ± 0,13a

48 11,82 ± 0,03bc

60 11,69 ± 0,13c

72 11,60 ± 0,03c

Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn BDH4

14.00

12.00

10.00

Log (Mật độ)

8.00

) ộ đ t ậ M

6.00

( g o L

4.00

2.00

0.00

Thời gian (giờ)

Hình 3.12. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng BDH4 được trình bày ở bảng

3.4 và hình 3.12 cho thấy, thời gian nuôi cấy bắt đầu tăng từ 12 giờ. Trong khoảng

thời gian nuôi cấy từ 24 đến 48 giờ quá trình sinh trưởng của chủng BDH4 tăng cao

và đạt cực đại tại 36 giờ với, kết quả này tương đương nhau về mặt ý nghĩa thông kê

(p > 0,01) tức là ngoài khoảng thời gian khảo sát 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ không có

sự tăng trưởng đáng kể trên chủng BDH4. Tại thời điểm 0 giờ mật độ vi khuẩn thấp hơn một cách có ý nghĩa (p < 0,01) với (MĐVSV = 0,94 x 109 cfu/ml) so với tại

thời điểm 36 giờ. Ở tại thời điểm 60 giờ mật độ vi khuẩn chủng BDH4 có chiều

hướng giảm dần và thấp hơn về mặt thống kê (p < 0,01) so với tại thời điểm 36 giờ.

Kết quả nhận thấy pha log của BDH4 kéo dài từ 0 giờ tới 24 giờ kể từ thời

điểm cấy giống, pha cân bằng trong khoảng từ 24 tới 48 giờ và có dấu hiệu bắt bắt

đầu đi vào pha suy vong tại thời điểm 60 giờ tính từ thời điểm nuôi cấy (hình 3.12).

Nhận xét này cũng với kết quả này của các tác giả khác. Korsten và Cook (1996)

khi nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Bacillus subtils đã cho biết, mật độ tế bào cực đại tại thời điểm 32 giờ nuôi cấy với khoảng 19 x107 cfu/ml còn tại thời điểm 48 giờ đã có sự giảm mạnh mật độ vi sinh vật đáng kể từ 19 x107 cfu/ml xuống còn 13 x107 cfu/ml.

Đồ án tốt nghiệp

3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng BDH4.

Tiến hành khảo sát theo mục 2.5.11. sinh viên thu được kết quả như sau:

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh

trưởng của chủng BDH4

pH ban đầu Log (mật độ)

4 10,89 ± 0,40d

5 12,21 ± 0,17c

6 12,82 ± 0,04ab

7 12,88 ± 0,01a

8 12,67 ± 0,04ab

9 12,29 ± 0,20bc

pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4

14.00

12.00

10.00

) ộ đ

8.00

Log (Mật độ)

t ậ M

6.00

( g o L

4.00

2.00

0.00

pH ban đầu

Hì nh 3.13. Ảnh hưởng pH ban đ ầu môi trường nuôi c ấy đến sự sinh

trưởng của chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 3.5, hình 3.13 cho thấy, chủng BDH4

có thể hoạt động trong khoảng pH thử nghiệm từ 4 - 9. Tuy nhiên, vi khuẩn BDH4 phát triển tốt nhất ở pH = 6 và 7 với log mật độ vi khuẩn lần lượt là 12,82 x 109 và 12,88 x 109 và có xu hướng giảm từ pH = 8 và giảm hẳn ở pH= 9. (hình 3.13).Kết

quả này cũng trùng với nhận định của GEM Toulouse (2016) khi nghiên cứu trên

chủng Bacillus Subtilis WT 168. Tác giả cho rằng pH tối ưu của chủng Bacillus

Subtilis WT 168 nằm trong khoảng từ 6,5 đến 8. Như vậy từ kết quả thực nghiệm

cũng như các nghiên cứu trước đó có thể thấy chủng Bacillus subtilis nói chung và

chủng Bacillus subtilis BDH4 nói riêng hoạt động tốt trong khoảng pH trung tính và

tốt nhất khoảng pH = 7, hoạt động kém ở pH thấp và pH trên 8.

3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2.

3.7.1. Thời gian nuôi cấy

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2

Thời gian (giờ) Log (mật độ)

0 8,95 ± 0,08f

12 10,08 ± 0,01e

24 11,55 ± 0,03c

36 11,58 ± 0,10c

48 12,08 ± 0,06a

60 11,85 ± 0,03b

72 11,27 ± 0,03c

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2

14.00

12.00

10.00

) ộ đ

8.00

t ậ M

Log (Mật độ)

6.00

( g o L

4.00

2.00

0.00

Thời gian nuôi cấy

Hì nh 3.14 . Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi c ấy đến sự sinh

trưởng của chủng vi khuẩn L2

Kết quả trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.14 cho thấy, Thời gian nuôi cấy của

chủng L2 bắt đầu tăng từ 12 giờ đến 36 giờ. Trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 36

đến 60 giờ quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 tăng cao và đạt cực đại tại 48 giờ với Log mật độ vi khuẩn = 12,08 x109 Ở tại thời điểm 72 giờ mật độ của

chủng L2 có chiều hướng giảm dần và thấp hơn về mặt thống kê (p < 0,01) so với

tại thời điểm 48 giờ. Như vậy có thể kết luận quá trình sinh trường của chủng vi

khuẩn L2 như sau:

+ Chủng vi khuẩn Lactobacillus L2: pha tiềm phát từ 0 – 12 giờ, pha logarit

bắt đầu từ 36 – 60 giờ và pha suy vong tại thời điểm 60 giờ tính từ thời điểm nuôi

cấy.(hình 3.14).

So với nghiên cứu của Trần Thị Ái Liên (2011). Thời gian thích hợp cho sự

thu nhận sinh khối hiệu quả đối với chủng Lactobacillus PA2 đạt cực đại tại thời

điểm 36 giờ với mật độ tế bào (OD610nm) = 2,482 và ổn định đến 48 giờ sau đó giảm

dần nhưng không đáng kế. Cũng cùng trong nghiên cứu trên đối với chủng

Lactobacillus PP tăng trưởng và đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ với mật độ tế bào

(OD610nm) = 2,382 và giảm dần theo thời gian . Kết quả nghiên cứu trên cũng tương

đồng với thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy tối ưu cho sự tăng sinh khối trên

Đồ án tốt nghiệp

chủng Lactobacillus L2 với thời điểm vi khuẩn đạt mật độ cực đại log (mật độ) = 12,08 x 109 tại thời điểm 48 giờ nuôi cấy.

Như vậy cho thấy rằng thời gian nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng

L2 là tại thời điểm 48 giờ.

3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2

Bảng 3.7. Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh

trưởng của chủng vi khuẩn L2

pH ban đầu Log (mật độ)

5 12,07 ± 0,01a

6 12,12 ± 0,01a

7 11.86 ± 0,03b

8 11,70 ± 0,04c

9 11,50 ± 0,01d

10 11,28 ± 0,09e

Đồ án tốt nghiệp

pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng L2

12.20

12.00

) ộ đ

11.80

t ậ M

Log (Mật độ)

11.60

( g o L

11.40

11.20

11.00

10.80

pH ban đầu

Hình 3.15. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2

Kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.15 cho thấy, chủng L2 có thể hoạt động tốt trong

khỏng pH = 5 và 6 và từ pH = 7 trở đi, sinh khối vi khuẩn giảm hẳn. Như vậy, vi

khuẩn L2 thích hợp với môi trường hơi có tính acid (pH = 5 hoặc 6).

Kết quả phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Ái Liên (2011) nghiên

cứu cho thấy ảnh hưởng pH ban cho sự sinh trưởng của 2 Lactobacillus PA2 và

chủng Lactobacillus PP đều có khả năng phát triển tốt ở khoảng pH = 5,5 đến 7,5.

Cụ thể, ở pH 6,5 mật độ tế bào đạt cao nhất (OD610nm =2,395 đối với chủng

Lactobacillus PA2 và OD610nm = 2,382 đối với chủng Lactobacillus PP). Kết quả

nghiên cứu trên cũng tương đồng với thí nghiệm khảo sát pH ban đầu cho sự tăng

sinh khối trên chủng Lactobacillus L2 với thời điểm vi khuẩn đạt mật độ cực đại log mật độ vi khuẩn = 12,12 x109 tại pH = 6.

Như vậy, pH ban đầu môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng của

chủng L2 là pH= 6.

Đồ án tốt nghiệp

3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh

enzyme của chủng BDH4

Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật.

Kết quả trình bày ở bảng 3.8 cho thấy.

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng

sinh enzyme của chủng BDH4

ĐKVPG tinh bột ĐKVPG casein Môi Log (mật độ) (D-d) mm trường (D-d) mm

MT1 12,40 ± 0,01ab 4,00 ± 0,00c 13,33 ± 1,15b

MT2 12,59 ± 0,05ab 9,83 ± 0,29b 11,33 ± 2,31b

MT3 13,00 ± 0,02a 12,50 ± 0,87a 13,00 ± 3,61b

MT4 12,65 ± 0,53a 12,67 ± 0,58a 22,33 ± 2,89a

MTCB 12,04 ± 0,03b 12,67 ±1,53ab 20,22 ± 1,53a

Ghi chú: ĐKVPG: đường kính vòng phân giải

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4

30.00

)

25.00

m m

(

Log (Mật độ)

20.00

ĐKVPG (Tinh bột)

G P V K D à v

15.00

ab b

) ộ đ

ĐKVPG (casein)

10.00

t ậ M

5.00

( g o L

0.00

MT1

MT2

MT3

MT4

MTCB

Môi trường nuôi cấy

Hì nh 3.16 . Ảnh hưởng môi trường nuôi c ấy cho sự sinh trưởng và khả

năng sinh enzyme amylase của chủng BDH4

Hì nh 3.17 . Môi trường nuôi c ấy chủng Bacillus subtilis BDH4

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.18 . Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi c ấy trên 5 loại môi

trường khác nhau

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.19 . Ảnh hưởng môi trường nuôi c ấy đến khả năng sinh enzyme

amylase của chủng vi khuẩn BDH4

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.20 . Ảnh hưởng môi trường nuôi c ấy đến khả năng sinh enzyme

protease c ủa chủng vi khuẩn BHD4

Đồ án tốt nghiệp

Nhìn chung kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả

năng sinh enzyme ngoại bào cho thấy rằng môi trường MT3 và MT4 cho khả năng

phát triển của vi khuẩn BDH4 là tốt nhất với mật độ vi sinh vật là tương đương

nhau (P > 0,01) và cao hơn so với đối chứng là môi trường NB. Môi trường MT3 và

MT4 tiếp tục cho khả năng khả năng sinh enzyme amylase phân giải tinh bột tốt

nhất lần lượt là 12,50 ± 0,87 mm và 12,67 ± 0,58 mm so với các môi trường khảo

sát còn lại. Điều này có thể giải thích là do trong thành phần của 2 môi trường có

chứa nguồn hydrocarbon là rỉ đường với hàm lượng đường cao, ngoài đường

saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất

kích thích sinh trưởng, trong đó có vitamin H (Biotin). Đối với khả năng tổng hợp

enzyme protease phân giải protein thì môi trường MT4 cho kết quả vòng phân giải tốt nhất (22,33 ± 2,89a mm) tương đương với đối chứng môi trường NB (20,22 ± 1,53a mm). Như vậy, có thể chọn môi trường MT3 hoặc MT4 để nhân sinh khối vi

khuẩn Bacillus subtilis BDH4

3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và

khả năng sinh enzyme của chủng Lactobacillus L2

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh

enzyme của chủng L2

Đường kính vòng phân giải casein Môi trường Log (mật độ)

(D-d) mm

LBS 12,00 ± 0,04a 3,67 ± 0.58c

MRT 12,04 ± 0,04a 19,83 ± 6,81a

MRS 11,84 ± 0,06b 14,33 ± 5,03ab

HI 11,84 ± 0.03b 8,33 ± 4,04bc

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn L2

)

25.00

m m

(

20.00

Log (Mật độ)

ĐKVPG (mm)

15.00

G P V K Đ à v

) ộ đ

10.00

t ậ M

5.00

( g o L

0.00

MTNC

LBS

MRT

MRS

Hì nh 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi c ấy đến sự sinh trưởng và khả

năng sinh enzyme protease c ủa chủng L2

Hì nh 3.22 . Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.23 . Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi

trường

Đồ án tốt nghiệp

Hì nh 3.24 . Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase c ủa chủng L2 được

nuôi cấy trên 4 lo ại môi trường

Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 trên 4 loại môi trường nuôi cấy

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả khảo sát cho thấy môi trường LBS và môi trường MRT cho

mật độ vi khuẩn phát triển tốt nhất và tương đương nhau l ần lượt là 12,00

± 0,04 mm và 12,04 ± 0,04 mm. Môi trường MRS và HI cho mật độ vi

khuẩn phát triển tương đương nhau nhưng thấp hơn hẳn so với môi

trường LSB và MRT.Đối với khả năng thủy phân tinh bột với môi trường

có chứa thuốc thử bromthymol blue cho thấy cả 4 môi trường đều có khả

năng thủy phân tinh bột với dấu hiệu nhận biệt cả 4 môi trường đều

chuyển sang màu vàng. Đối với khả năng sinh enzyme tổng hợp protease,

môi trường MRT cho đường kính vò ng phân giải cao vượt trội so với cả 3

môi trường còn lại (19,83 ± 6,81mm), tiếp theo là môi trường MRS với

đường kính vòng phân giải đo được là ( 14,33 ± 5,03 mm) và môi trường

HI (8,33 ± 4,04 mm). Môi trường LBS cho tuy cho mật độ vi sinh vật

phát triển cao tương đương với môi trường MRT nhưng lại cho khả năng

sinh enzyme là thấp nhất (3,67 ± 0.58 mm) có thể do thành phần môi

trường LBS có những chất làm chậm quá trình sinh tổng h ợp enzyme. Kết

quả trên cho thấy môi trường MRT cho tiềm năng trong sự phát triển của

vi khuẩn đ ặc biệt là tốt cho sự sinh tổng hợp enzyme phân giải protein.

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

- Đã chọn được chủng Bacillus subtilis BDH4 có khả năng sinh enzyme ngoại

bào (amylase, cellulose, protease) cao để sử dụng tang cường phân hủy thức ăn

thừa.

- Chủng Bacillus subtilis BDH4 và Lactobacillus L2 không có biểu hiện đối

kháng và ức chế nhau nên có thể phối trộn được với nhau.

. - Đã xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp đền sự sinh trưởng đối với

chủng Bacillus subtilis BDH4 là:

Thời gian tối ưu để thu sinh khối là 36 giờ 

pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự tăng sinh khối: 6 -7 

 Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào:

NB + 2% rỉ đường.

- Điều kiện nuôi cấy thích hợp đến sự sinh trưởng đối với chủng Lactobacillus

L2 là:

Thời gian tối ưu để thu sinh khối là 48 giờ 

pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự tăng sinh khối:5- 6 

 Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào:

MRT (Murata, A. 1970)

2. Đề nghị

- Định danh đến chủng Bacillus subtilis BDH4 và Lactobacillus L2

- Khảo sát động học trên từng loại môi trường nuôi cấy của hai chủng Bacillus

subtilis và Lactobacillus L2.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Bùi Huy Hiền (2014), Phân hữu cơ trong sản xuất nông nghiệp bền vững ở

Việt Nam

Bùi Thị Phi (2007). Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm

sinh học, Khóa luận tốt nghiệp, Công nghệ sinh học, ĐH Nông Lâm, TPHCM.

Đỗ thị Bích Thủy (2012). “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận

chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1”. Tạp chí khoa học,

Đại học Huế, 71(2).

Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB ĐH Quốc Gia TP. Hồ

Chí Minh, tr 49 - 64.

Lê Gia Hy (2010). Giáo trình Công nghệ vi sinh vật xử lý chất thải, Nxb Giáo

dục Việt Nam.

Lê Thị Thanh Thủy (2010). Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật nhầm

nâng cao nâng suất, chất lượng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây ớt. Viện

khoa học nông nghiệp Việt Nam.

Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), Phân tách Protease của Bacillus Subtilis bằng

hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate . Đồ án tốt nghiệp, ĐH Nông

Lâm TPHCM.

Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm

hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic. Luận

văn tốt nghiệp, Khoa chăn nuôi thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Ngô Kế Sương và Nguyễn Lân Dũng (1997). Sản xuất khí đốt (biogas) bằng

kỹ thuật lên men kỵ khí. Nxb Giáo Dục.

Đồ án tốt nghiệp

Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn, (2009).

“Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập

và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải”. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN.

pp 101-106

Nguyễn Đức Duy Anh ,(2005). Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và

enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus - Thử nghiệm sản

xuất chế phẩm sinh học, Đồ án tốt nghiệp. Đại học Nông Lâm, TP.HCM.

Nguyễn Đức Lượng (2006) Công nghệ vi sinh tập 2 - Vi sinh vật học công

nghiệp, NXB ĐH Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, tr 322 - 336, 39 - 43, 115 – 117.

Nguyễn Hiền Trang, Đỗ Thị Bích Thủy, (2010). “Tuyển chọn và nghiên cứu

một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của

vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens T9”, Tạp chí công nghệ sinh học 8 (3B), 1591-

1600.

Nguyễn Hoài Hương (2015). Công nghệ enzyme. Giáo trình giảng dạy

(memo). ĐH Công nghệ TPHCM.

Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015. Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có

khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản. Đồ án tốt nghiệp,

Công nghệ sinh học, ĐH Công nghệ TPHCM.

Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, tr 221 - 228.

Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo

quản vi sinh vật

Nguyễn Thế Trang (2011). Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm

bảo quản cá. Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Việt Nam.

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Thị Cúc (2014). Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme Cellulase từ chủng

Bacillus subtilis phân lân từ đất vườn. Luận văn tốt nghiệp. ĐH Nông nghiệp Hà

Nội

Nguyễn Thị Trần Thụy, (2009). Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn

Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm. Luận văn sinh học, Vi sinh vật

học, ĐH Sư Phạm, TPHCM.

Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Khuất Hữu Thanh, Lê Gia Hy, (2010).

“Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên khả năng sinh

tổng hợp protease kiềm của chủng Bacillus subtilis HT24 phân lập ở Việt Nam”,

Tạp chí công nghệ sinh học 8 (3B), 1565-1571

Nguyễn Văn Ninh (2011). Kỹ thuật sản xuất phân vi sinh. Sở khoa học công

nghệ. Bến Tre.

Nguyễn Văn Thao, Nguyễn Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Thu Hà,

Đỗ Nguyên Hải, (2015). Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật để sản xuất phân hữu cơ

sinh học từ bã nấm và phân gà. Tạp chí Khoa học và Phát triển 13(8): 1415-1423

Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn (2013). Giáo trình vi sinh đại cương

BSTY. - Khoa Chăn Nuôi –Thú Y-Bộ môn Ký sinh – Truyền nhiễm. Trường Đại

Học Nông Lâm Huế.

Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công Minh, (2005). Ảnh hưởng của một số

điều kiện nuôi cấy đến hoạt động phân giải protein của vi khuẩn phân lập từ ao

nuôi tôm ở Phá Tam Giang-Cầu Hai, tỉnh Thừa Thiên Huế, Những vấn đề nghiên

cứu cơ bản trong khoa học và sự sống, Hội nghị khoa học toàn quốc, NXB Khoa

học và Kỹ thuật, Hà Nội, 957-960.

Phạm Văn Toản (2002), Báo cáo kết quả đề tài KHCN.02.06. Hội nghị tổng

kết các chương trình khoa học và công nghệ cấp Nhà nước giai đoạn 1996-2000,

12/2002. Hà Nội.

Đồ án tốt nghiệp

Phạm Minh Nhựt (2014). Các phương pháp phân tích vi sinh vật. Giáo trình

giảng dạy (memo). ĐH Công nghệ TPHCM.

Phạm Minh Nhựt (2014). Thực hành vi sinh đại cương. Giáo trình giảng dạy

(memo). ĐH Công nghệ TPHCM

Phan Phát (2013). Những Hiểu Biết Cơ Bản Về Phân Bón, Nông nghiệp, Hồ

tiêu bền vững. viewed on 06.may.2015 from

nghiep/29-nhung-hieu-biet-co-ban-ve-phan-bon>.

Tăng Thị Chính (2001). Nghiên cứu các vi sinh vật phân giải xenluloza trong

phân hủy rác thải hiếu khí và ứng dụng,. Luận án tiến sĩ, viện công nghệ sinh học,

Hà Nội.

Tập đoàn hoá chất Việt Nam, (2013). Sản lượng phân bón trong nước đủ nhu

cầu vào năm 2015, from

Trần Đông Bách, (2008). Nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase từ Aspergillus

oryzea. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư, Nông nghiệp và sinh học ứng dụng. ĐH Công

nghiệp Cần Thơ.

Trần Thị Ái Liên, (2011). Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus

acidophilus trong chế phẩm probiotic. Luận văn Thạc sĩ sinh học. Đại học Sư Phạm

TP. HCM.

VASEP (2015). Tổng quan ngành thủy sản Việt Nam. Hiệp hôi chế biến và

xuất khẩu thủy sản Việt Nam, Tổng quan ngành, viewed on 07.may.2016,

from

Vũ Thị Thứ, (1996). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của

một số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận văn tiến sĩ khoa học, sinh

học, Viện sinh học nhiệt đới.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Arvanitoyannis IS (2008), Waste management for the food industries, London:

Academic Press an imprint of Elsevier, 1100.

Ayalon, O., Avnimelech, Y., Shechter, M., (2001). “Solid waste treatment as a

highpriority and low-cost alternative for greenhouse gas mitigation”. Environ

Manage. 27(5):697-704.

Bernstad, A., Malmquist, L., Truedsson, C., Jansen, J.C., (2013). “Need for

improvements in physical pretreatment of source-separated household food waste”.

Waste Manage. 33: 746-754.

Birdie Scott Padam, Hoe Seng Tin, Fook Yee Chye and Mohd Ismail

Abdullah,. (2014). “Banana by-products: an underutilized renewable food biomass

with great potential”, Journal of Food Science and Technology, 51(12), 3527 - 3545.

Bhiday MR. Earthworms in agriculture. Indian Farm.;43:31–34 , 1994.

Champ M, O. Szylit, P. Raibaud, N. AitAbdelkader (1983). “Amylase

production by three Lactobacillus strain isolated from chicken crop”, J. Appl.

Bacteriol. 55, 487

Cintas, L. M.; Herranz, C.; Hernández, P. E.; Casaus, M. P. and Nes, L. F.

(2001). “Review: Bacteriocins of lactic acid bacteria”. Food Sci. Tech. Int., 7, pp.

281-305.

Cohn and ferdinand (1872). Uber Untersuchungen Bacterien. Beitrage zur

Biologie der PFLANZEN 1:127-224.

Dai, X., Duan, N., Dong, B., Dai, L., (2013). “High-solids anaerobic co-

digestion of sewage sludge and food waste comparison with mono digestions:

Stability and performance”. Waste Manage. 33: 308-316.

Đồ án tốt nghiệp

Environmental Newspaper: Symposium on the Recycling of Food Wastes,

pp.34-38 (1996).

Foley, J.A., Ramankutty, N., Brauman, K.A., Cassidy, E.S., Gerber, J.S.,

Johnston, M., Mueller, N.D., O'Connell, C., Ray, D.K., West, P.C., Balzer, C.,

Bennett, E.M., Carpenter, S.R., Hill, J., Monfreda, C., Polasky, S., Rockstrom, J.,

Sheehan, J., Siebart, S., Tilman, D., Zaks, D.P.M., (2011). Solutions for a cultivated

planet. Italy [online) Food and Agriculture Organization (FAO), viewed 15 may

2015. from

Ghafoor A., Hasnain S. (2008). “Production dynamics Bacillus subtilis strains

AG-1 and EAG-2, producing an extracellular alkaline protease”, Afircan Journal of

Microbiology Research. 3(5): 258-263

Gilliland S.E., B.B. Bruce, L.J. Bush, T.E. Stanlet (1980). “Comparison of two

strains of Lactobacillus acidophilus as dietary adjuncts for young calves”, J. Dairy

Sci. 63: pp. 964.

Gunders, D, (2012). Wasted: How Americais losing up to 40 percent of its

food from farm to fork to landfill. Natural Resources Defense Council. [online)

Issuese food and Agriculture, viewed 23 jun 2015

from:

Hiroshi Fujikawa, and Mitsugu Matsushita, (1999). “Bacterial Fractal Growth

in the Concentration Field of Nutrient”. Journal of the Physical Society of Japan.

60(1): 88-94

Hollang K.T., Knapp J.S. and Shoesmith J.G. (1987). Anaerobic Bacteria, 1st

ed; Blackie and Son Ltd, London.

Hong, H. A., Khaneja, R., Tam, N. M. K., Cazzato, A., Tan, S., Urdaci, M., et

al. (2009a). “Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract”.

Reseach in Microbiology, 160(2): 134-143.

Đồ án tốt nghiệp

Ieshita Pan, Bomba Dam, S. K. Sen,. (2011). Composting of common organic

wastes using microbial inoculants. 3 Biotech. 2(2): 127–134.

IGEM Toulouse (2016). Study of the optimum growth conditions of Bacillus

subtilis (strain WT 168), and Pseudomonas fluorescens (strain SBW25).

Ivanova I, Kabadjova P, Pantev A, Danova S, Dousse X (2000). “Detection

Purification and characterization of a noval bacteriocin substance produced by

Lactobacillus lactis subsp lactis B14 isolated from boza-bulgarian traditional cereals

beverage”. Fundamentals & Applications. 41(6):47-53.

Jayathilakan K, Khudsia Sultana, Radhakrishna K and Bawa A.S,. “Utilization

of byproducts and waste materials from meat, poultry and fish processing

industries: A review”, J Food Sci Technol., 49(3), 278–293 (2012)

Joerger RD, Hoover DG (2000). Bacteriocins. In: Barfoor SF, Harmon K M

(eds). Encyclpedia of microbiology. New york, Acadamic press, USA, 383 - 397.

Kandler O., Weiss N. Baltimore M.D., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G,

(1984). “Genus Lactobacillus” Bergey’s Manual of Systematics Bacteriology,

Williams and Wilkins, USA, pp. 1209–1234.

Kengo Yamada and Hui-Lian Xu “Properties and Applications of an Organic

Fertilizer Inoculated with Effective Microorganisms”. Journal of Crop Production.

3(1): 255-268.

Kumar R. and Vats R.,(2010). “Protease production by Basillus subtillis

immobilized on different matrics”. New York Scien Journal. 3(7): 20 -24.

L. Korsten1 N. Cook2 (1996). Optimizing Culturing Conditions for Bacillus

Subtilis.

Lee, Y. K., and Seppo Salminen (2009). Handbook of Probiotics and

Prebiotics. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons

Đồ án tốt nghiệp

Mair S., Holt., Sharpe H and Sneath A. (1986). Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology. Newyork: The AVI Publishing Co. Inc.

McKenney PT, Driks A, Eichenberger P, (2013). “The Bacillus subtilis

endospore: assembly and functions of the multilayered coat”. Nat Rev Microbiol.

11(1):33-44

Ministry of Environment: Environmental Report, pp.275-283 (1996).

Muralihara K.S., G.G. Sheggeby, P.R. Elliker, D.C. England, W.E. Sandine

(1977). “Effect of feeding lactobacilli on the coliform and Lactobacillus flora of

intestinal tissue and feces from piglets”. J. Food Protection. 40: pp. 288.

Nakano, Michiko M, Zuber, Peter (1998). "Anaerobic Growth of A Strict

Aerobe (Bacillus Subtilis)". Annual Review of Microbiology . 52(1): 165-90.

Naidu K.S.B., Devi K.L, (2005). “Optimization of thermostable alkaline

protease production from species of Bacillus using rice bran”. African Journal of

Biotechnology 4(7), 724-726.

Nagavallemma KP, Wani SP, Stephane L, Padmaja VV, Vineela C, Babu Rao

M, Sahrawat KL (2006) Vermicomposting: recycling wastes into valuable organic

fertilizer, vol 2. An open access journal published by ICRISAT. p 16.

Novinsak A, Surette C, Allain C, Filion M. Application of molecular

technologies to monitor the microbial content of biosolids and composted biosolids.

Water Sci Technol. (2008);57:471–477. doi: 10.2166/wst.2008.019.

Ouwehand, A.C., Kirjavainen, P.V., Shortt, C., and Salminen, S. (1999).

“Probiotics: Mechanisms and established effects”. Int. Dairy J. 9: pp. 43-52.

Sharpe, M.E., T.F. Fryer and D.G. Smith (1966). Identification of the lactic

acid bacteria,. In: B.M. Gibbs and P.A. Skinner, (eds), Identification Methods for

Microbiologist: Part A. Academic Press, London. pp. 69- 79.

100

Đồ án tốt nghiệp

Stoknes, K.Scholwin, W Krzesiński, E Wojciechowska, Jasińska A. (2016).

“Efficiency of a novel Food to waste to food system including anaerobic digestion

of food waste and cultivation of vegetables on digestate in a bubbleinsulated

greenhouse”, Waste Management , pp 466-476.

Stuart, T., (2009). Waste: Uncovering the Global Food Scandal. W. W. Norton

& Company, p. 480.

Umsakul K, Dissara Y, Srimuang N. Chemical physical and microbiological

changes during composting of the water hyacinth. Pak J Biol Sci. (2010);13:985–

992. doi: 10.3923/pjbs.2010.985.992.

Quiroga, G., Castrillon, L., Fernandez-Nava, Y., Maranon, E., Negral, L.,

RodriguezIglesias, J., Ormaechea, P., (2014). “Effect of ultrasound pre-treatment in

the ananerobic co-digestion of cattle manure with food waste and sludge”.

Bioresour. Technol. 154:74-9.

Rengathavasi Thavasia, Singaram Jayalakshmib, Ibrahim M. Bana (2011).

“Application of biosurfactant produced from peanut oil cake by Lactobacillus

delbrueckii in biodegradation of crude oil”. Bioresource Technology.102(3):3366-

3372.

Rounsefell, B.D., O'Sullivan, C.A., Chinivasagam, N., Batstone, D., Clarke,

W.P., (2013). “Fate of pathogen indicators in a domestic blend of food waste and

wastewater through a two-stage anaerobic digestion system”. Water Sci. Technol.

67(2):366-73.

Shin, S.G., Han, G., Lim, J., Lee, C., Hwang, S., (2010). “A comprehensive

microbial insight into two-stage anaerobic digestion of food waste-recycling

wastewater”. Water Res. 44: 4838-4849

101

Đồ án tốt nghiệp

VermiCo, (2013). The Single Largest Producer of Vermicompost in the

World. viewed 31 july 2014. From

producer-ofvermicompost-in-the-world/>.

Yang J.K., Shih I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L.(2000), “Production and

purification of proteinase from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean

wasters”. Enzyme and Microbial Technology, (26), 406-413.

Zeinhom EA, Elhadary R, Elashry A. Integrating GIS and MCDM to deal with

landfill site selection. Int J Eng Technol. (2010);10:32–42.

TÀI LIỆU INTERNET

http://www.hotieubenvung.com/nong-nghiep/29-nhung-hieu-biet-co-ban-ve-phan-

bon

http://moitruongsach.vn/ung-dung-cong-nghe-vi-sinh-vat-trong-xu-ly-rac-thai/

http://vinachem.com.vn

102

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI

TRƯỜNG KHẢO SÁT TRONG CÁC THÍ NGHIỆM

A1. Thành phần môi trường tăng sinh Bacillis subtilis - Nutrient broth

(NB)

Peptone .......................................................................................5,0 g/l

Meat Extract................................................................................3,0 g/l

NaCl ....................................... ……………………………. 10 g/l

pH: 7,0 ± 0,2

A2. Thành phần môi trường tăng sinh Lactobacillus (MRS – broth)

Glucose ..................................................................................... 20,0 g/l

Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l

Meat Extract............................................................................. 10,0 g/l

Yeast Extract...............................................................................5,0 g/l

Sodium Acetate ..........................................................................5,0 g/l

Dipotassium Phosphate .............................................................2,0 g/l

Ammonium Citrate ....................................................................2,0 g/l

Tween ® 80.................................................................................1,0 g/l

Magnesium Sulfate ....................................................................0,1 g/l

Manganese Sulfate .................................................................. 0,05 g/l

A3. Thành phần môi trường Nutrient Agar (NA)

Agar ..............................................................................................20 g/l

Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l

Meat Extract............................................................................. 10,0 g/l

NaCl .............................................................................................5,0 g/l

Đồ án tốt nghiệp

A4. Thành phần môi trường khảo sát khả năng sinh acid lactic (Môi

trường MRS bổ sung CaCO3).