Đồ án tốt nghiệp: So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Corynebacterium diphtheriae gây bệnh bạch hầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR

PHÁT HIỆN VI KHUẨN

CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE

GÂY BỆNH BẠCH HẦU

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH

BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ

MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN

CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE

GÂY BỆNH BẠCH HẦU

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH

BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ

MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự

hƣớng dẫn khoa học của THS. Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc

Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn

dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh)

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng

đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về

khóa luận tốt nghiệp của mình.

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng

dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hƣớng và

ủng hộ con đƣờng học tập của em.

Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã

tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện

khóa luận.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ

Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời luôn nhiệt tình giúp

đỡ em, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em,

ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.

Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn

Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy

Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp,

cảm ơn tất cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá

trình làm thí nghiệm.

Em xin chân thành cảm ơn !

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vii

Phần I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu .................................................................................... 3

2.1.1 Tác nhân gây bệnh ......................................................................................... 3

2.1.2 Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 4

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới ............................................................ 5

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh ............................................................................... 8

2.2 Corynebacterium Diphtheriae ............................................................................ 10

2.2.1Hình thái và cấu trúc ..................................................................................... 10

2.2.2Tính chất nuôi cấy ......................................................................................... 11

2.2.3Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................... 12

Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................... 16

3.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 16

3.1.1Dụng cụ cần thiết .......................................................................................... 16

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19

3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR ......................... 21

3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR .................... 22

3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR . 22

3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR ................... 23

PHẦN IV: KẾT QUẢ .................................................................................................. 24

4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: ...................... 24

4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: ........................................................ 25

4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR ....................................... 26

4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR ............................................ 27

4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR ................................................... 27

iii

4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR ......................................................... 28

PHẦN V: KẾT LUẬN ................................................................................................ 31

Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32

PHẦN VII: PHỤ LỤC ................................................................................................. 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Elution buffer

Lysis buffer

AW1

Wash buffer 1

AW2

Wash buffer 2

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium Bromide

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Real Time - Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris-Borate EDTA

µL

Microlitter

µM

Micromole

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884

(bên trái) ................................................................................................................... 11

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 ....... 14

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 ....... 15

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới ..................................................... 15

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015........................ 16

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm

Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) ................................. 18

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public

health image library-PHLI) ....................................................................................... 18

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc

trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) ........... 19

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek ...................................................................................... 21

Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi

DT1, DT2 .................................................................................................................. 32

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2

không bổ sung MgCl2 ................................................................................................................................................ 32

Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi

Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 ........................................................................................................................... 33

Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi

DT1, DT2 .................................................................................................................. 33

Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR ................................ 34

Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR .......................... 35

Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. trong Realtime PCR ............................... 35

Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR ...................................... 36

Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. trong Realtime PCR ................ 36

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu ................... 19

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype ...................................................... 20

Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR ........... 25

Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR

................................................................................................................................. 26

Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu .................. 26

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 ...................................... 28

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 .................................... 28

Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 ................................................. 29

Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 ............................................... 29

Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR ......................................... 30

Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR .............................. 30

Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu ..................................................................... 37

vii

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

Bệnh bạch hầu do khuẩn C. Diphtheriae gây ra. Biểu hiện lâm sàng thông

thƣờng nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả

xuất hiện ở nơi nhiễm trùng. Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm

độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm cơ tim, viêm dây

thần kinh, viêm thận... trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao. Trong thế chiến

thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm

bệnh tăng lên đến 50000 ca [3]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin

bạch hầu trong Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu

thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ

dân cƣ cao. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở

Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm

2000. Nhƣng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca

dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phƣớc phát

hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15].

Phƣơng pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm

tuy nhiên phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật

sống cũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu.

Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phƣơng

pháp nuôi cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau

đến 95% axit amin và nucleotic . Thử nghiệm Elek cũng là một trong những

phƣơng pháp phát hiện đƣợc độc tố bạch hầu. Nhƣng vì tình hình bệnh ngày càng ít

đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại

không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít đƣợc dùng đến hơn [13].

Sự phát triển của sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc

nghiên cứu, chữa trị cũng nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu. Ƣu điểm của phƣơng pháp

PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian

ngắn, độ đặc hiệu cao. Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị,

Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực

hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đƣợc

bƣớc điện di sản phẩm của PCR chuẩn. Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc

đƣợc kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc. Trên cơ sở đó, đề tài “ So

sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch

hầu ” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phƣơng pháp PCR phù hợp với

điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn

dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái)

2.1.1 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh C. diphtheriae, đƣợc Klebs tìm thấy và Loeffler phân

lập. C. diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, không có vỏ, không có

lông và không có nha bào, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những

hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phƣơng pháp đặt biệt nhƣ Albert hoặc Neisser.Vi

khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 12-

18 giờ, vƣợt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo. Dựa trên hình

thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả

năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu đƣợc chia làm 4 biotype: mitis, intermedius,

gravis và belfanti [1].

Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn. Trên các đồ vật, trực

khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (đƣợc chất nhày

trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống đƣợc vài tuần. Trên đồ vải vi khuẩn sống đƣợc

40-50 ngày,trên cát sống đƣợc đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng

sống đƣợc 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy

trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1].

Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh

sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày. Ở nhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dƣới tác dụng của dung dịch clorua thủy

2.1.2 Cơ chế gây bệnh

ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1].

Ngƣời là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu. Bệnh lây lan chủ yếu

qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc ngƣời mang vi trùng qua các chất

tiết đƣờng hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thƣơng ngoài da có chứa vi

trùng gây bệnh, và trong rất ít trƣờng hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ

em [4].

Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc khả năng xâm nhập vào hệ thống

đƣờng hô hấp trên hoặc qua da và khả năng sinh ngoại độc tố bạch hầu. Trong

đó khả năng sinh ngoại độc tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh

[4].

Tại họng, độc tố vi khuẩn giải phóng gây phản ứng viêm nhiễm dẫn đến hình

thành các giả mạc. Các giả mạc bao gồm khối sợi huyết, bạch cầu, hồng cầu,

các tế bào biểu mô bị hoại tử ở đƣờng hô hấp và vi khuẩn. Giả mạc có thể ở tại

chỗ (amidan, họng, mũi) hoặc lan rộng xuống thanh, khí phế quản gây tắc

nghẽn khí đạo, phù nề mô mềm. Màng giả gây bít tắc chính là nguyên nhân

thƣờng gây tử vong nhất ở ngƣời lớn và trẻ em. Hiện tƣợng mang vi trùng ở

vùng cổ họng là nguồn truyền lây nhiễm quan trọng để duy trì và lan truyền

bệnh trong cộng đồng [5].

Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hƣởng lên

tất cả toàn tế bào cơ thể nhƣng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và

trên thận. Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới

cảm [5].

Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thƣờng xảy ra ở

phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông ngƣời dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh

và cơ sở vật chất. Môi trƣờng sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho

các bệnh về hô hấp phát triển, ngƣời dân đa phần không đƣợc dùng vắc xin.

Bệnh cũng thƣờng xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ƣớt dễ dàng cho sự phát triển

bạch hầu da [3].

Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết ngƣời hàng đầu trên

thế giới. Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ

em ở trẻ sơ sinh đã đƣợc loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nƣớc

công nghiệp hóa. Ở các nƣớc đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ

sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt đƣợc sau khi

thực hiện Chƣơng trình Mở rộng Chƣơng trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế

giới (WHO) vào những năm 1970 [12].

Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh

bạch hầu ở ngƣời nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82%. Ngƣời lớn 40-49

tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này

chiếm gần một nửa số ngƣời chết. Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học

cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga. Tuy nhiên, những

nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ

em không đƣợc tiêm vắc xin đầy đủ. Tại Moldova, các nƣớc thuộc khu vực

Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan,

Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ ngƣời lớn bị bệnh dao động

từ 38% đến 59% [12].

Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở

ngƣời lớn. Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối

năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc

gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội

Chủ nghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch. Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào

năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh

cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995. Từ năm 1990 đến năm

1998, 1157.000 trƣờng hợp và 5000 trƣờng hợp tử vong đƣợc công bố ở các

quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở

ngƣời. Ba phần tƣ các trƣờng hợp đƣợc công bố từ Liên bang Nga. Đây là vụ

dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng

bạch hầu mở rộng [12].

Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca. Năm 1990 dịch xảy ra ở

Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về ngƣời. Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15

quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong,

nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của ngƣời dân không

đƣợc bảo đảm, vắc xin chƣa đƣợc phổ cập rộng rãi [12].

Diphtheria - United States 1940-1980

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010

(http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/dip.html)

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới.

2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam

Trƣớc khi có chƣơng trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em,

thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ

mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống

0,14/100.000 dân năm 2000 [15].

Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai

ca dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phƣớc 5

ca đƣợc xác định, 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae.

40

30

20

Số ca BH

10

Số ca chết

0

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh

Đối với ngƣời nhiễm bệnh:

Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ. Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với

bệnh càng giảm. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch

hầu [3]. Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4

tuổi). Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định

chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ

an toàn. Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp. Phải dùng

huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trƣớc ngày thứ

6).

Những ngƣời mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể

và sinh hoạt nhƣ bình thƣờng. Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát

bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho ngƣời bệnh. Trƣớc đây,

ngƣời ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis,

sulfamide) nhƣng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn

hàng tháng. Hiện nay ngƣời ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt

hơn. Chất tyrotrixin không tan trong nƣớc, cho nên thƣờng dùng với nƣớc,

trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6]. Phải khử

trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa

bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rƣỡi.( Ramon,

1944).

Đối với ngƣời tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh:

Tất cả những ngƣời tiếp xúc với ngƣời bệnh đều phải xét nghiệm 2

lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trƣớc khi dùng thuốc súc miệng. Nếu

xét nghiệm có kết quả dƣơng tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì

phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đƣa ngƣời vào bệnh viện [6].

Tiêm ngừa phòng bệnh

Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ

em. Ngày nay ngƣời ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch

hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thƣơng hàn, hay là

vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà. Trong chƣơng trình tiêm chủng

mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm

2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân.

2.2 Corynebacterium Diphtheriae

Phân loại khoa học

Giới (regnum)

Bacteria

Ngành (phylum)

Actinobacteria

Bộ (ordo)

Actinomycetales

Họ (familia)

Corynebacteriaceae

Chi (genus)

Corynebacterium

Loài (species)

C. diphtheriae

2.2.1Hình thái và cấu trúc

C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ

1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơng C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm

Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI)

có vỏ, không có nha bào.

Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hình

hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nhƣ hình hàng rào.

Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu

đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm.

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert

(Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.2Tính chất nuôi cấy

Trực khuẩn Bạch hầu ƣa các môi trƣờng có máu, huyết thanh đông và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trƣờng là 370C vì

vậy các môi trƣờng nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên. Trên môi

trƣờng thạch máu thƣờng, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan

sát đƣợc tan huyết. Môi trƣờng chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trƣờng thạch máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ. Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen.

C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trƣờng huyết thanh đông Loffle, ở điều kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn). Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục,

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI)

đƣờng kính 1-2 mm, dễ tan trong nƣớc muối đẳng trƣơng

2.2.3Đặc điểm sinh hóa

Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại

đƣờng glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5].

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu

Chủng vi khuẩn

Glucose

Sacarose

Tan hồng cầu cừu

C.diptheriae C.hoffmanni C.cutis

+ + -

- + -

+hoặc- - -

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype

C.diphtheriae

Gravis Intermedius Mitis

Tan máu tế bào hồng cầu bò - - +

Tan máu tế bào hồng cầu thỏ + - +

Tính chất lên men đƣờng + - -

2.2.4 Độc tố vi khuẩn

C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố,

B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào. Sau khi B bám vào tế bào, quá

trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó

ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein.

Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có

nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các

ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin.

Độc tố này đƣợc mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào

trong DNA của vi khuẩn. Độc tố là một protein [6].

Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lƣợng

phân tử 62kDa. Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn

thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +). Nó tác động lên tế bào vật

chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố. Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ

thể vật chủ thiếu yếu tố sắt.

Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố do

vậy không có khả năng gây bệnh. Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi

bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải.

Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản

ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5]. Thử nghiệm này dựa trên sự

khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trƣờng thạch.

Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu đƣợc đặc trong môi

trƣờng nuôi cấy. Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đƣờng thẳng vuông góc

90 ° với dải kháng độc. Toxigenic C.diphtheriae đƣợc phát hiện bởi vì độc tố

tiết ra từ khu vực tăng trƣởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek

dòng precipitin

Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhƣng độc tố gây ra các triệu chứng

lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh. Điều trị và phòng bệnh đều phụ

thuộc vào việc trung hòa độc tố. Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch

hầu, cần dùng kháng độc tố. Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm và

nhanh kể trƣớc khi có xét nghiệm [6].

2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện

bệnh bạch hầu

Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae

và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu. Tuy nhiên, do

quá trình bảo quản và vận chuyển số lƣợng vi khuẩn còn sống không phải lúc

nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thƣờng nằm dƣới mức giới hạn phát

hiện. Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu

đang là phƣơng pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch

hầu [8]. PCR chuẩn phát hiện đƣợc C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi

khuẩn trong bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít. Các nghiên cứu

trƣớc đó không đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt

đầu đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp này sau khi vận chuyển và lƣu trữ

các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng). Ở Indonesia

một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng đã

đƣợc chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dƣơng tính với C.diphtheriae sau khi

chúng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10]. Tỉ lệ tử vong do

nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy ngƣời dùng cặp mồi

DT1 Fw 5’- CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev 5’-

CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc

tố. Nhƣng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến

95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân

biệt đƣợc 2 chủng vi khuẩn này [14].

So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm

PCR thƣờng, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện đƣợc các nồng độ

DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn. Với sự xuất hiện của

công nghệ khuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phƣơng pháp này đã có thể

cải thiện đáng kể hơn phƣơng pháp PCR chuẩn. Mƣời lăm DNA chiết xuất từ

các mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, đƣợc lƣu trữ

ở -70 ° C kể từ thời điểm thu thập ban đầu (24 đến 36 tháng), đƣợc xác định

là dƣơng tính theo PCR chuẩn (bốn là dƣơng tính yếu) Một hoặc cả hai tiểu

đơn vị tox khi đƣợc kiểm tra tại thời điểm thu mẫu. Hai năm sau, trong

nghiên cứu này, PCR chuẩn đƣợc lặp lại trên 15 chiết xuất này, và gen độc tố

đƣợc phát hiện chỉ trong hai mẫu. Khi phân tích bằng Realtime PCR, 13

trong số 15 mẫu dƣơng tính đối với một hoặc cả hai tiểu đơn vị của gen độc

tố [8].

Trong phƣơng pháp pha loãng Realtime PCR phát hiện thấy gen độc

tố chỉ với 2 CFU nhạy hơn rất nhiều so với 1.500 CFU đƣợc phát hiện bởi

PCR chuẩn. Bằng cách này, Realtime PCR có độ nhạy cảm gấp 10 lần so với

các kết quả PCR truyền thống đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của Nakao và

Popovic [8]. Real time PCR cho phép xác định độc tính trong mẫu bệnh

phẩm khi PCR tiêu chuẩn tỏ ra không thích hợp. Realtime PCR có độ nhạy

cao hơn, cụ thể, nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Các nghiên

cứu trƣơc chỉ ra rằng, mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ

DNA nhƣng Realtime PCR có thể phát hiện đƣợc độc tố khi có tới hai đến ba

bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là

loại bỏ đƣợc bƣớc điện di, chụp hình kết quả điện di và dễ dàng đọc đƣợc kết

quả sau khi phản ứng kết thúc. Realtime PCR là sự cải tiến đáng kể so với

các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố. Do đó có thể cung

cấp những kiên thức dịch tễ học quan trọng để phát hiện nhanh chóng các

trƣờng hợp nhiễm bệnh trong nƣớc và nhập cƣ cũng nhƣ kiểm soát đƣợc tình

hình cấp bách của bệnh bạch hầu trên toàn thế giới [8].

CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1Dụng cụ cần thiết

- Kính hiển vi điện tử

- Máy ly tâm

- Máy PCR

- Máy điện di

- Tủ chụp UV sản phẩm điện di

- Máy RT-PCR

- Tủ âm 80oC, âm 20oC

- Tủ mát

- Tủ an toàn sinh học

- Bình ủ CO2, tủ ấm 37oC

- Pipet vi lƣợng các loại

3.1.2 Môi trường, sinh hóa phẩm

- Đĩa petri đƣờng kính 90mm

- Bộ nhuộm Gram

- Thuốc nhuộm Albert’A

Toludine blue 0.15gr

Malachite green 0.20gr

Glacial acetic acid 1ml

Alcohol (95% ethanol) 2ml

- Thuốc nhuộm Albert’B

Iodine 2gr

Potassium iodide (KI) 3gr

Môi trƣờng phân lập:

Môi trƣờng Tellurite

Canh thang não tim-BHI 200ml

Máu cừu đã loại bỏ tơ huyết 20ml

Dung dịch Kali tellurite 4% 1.5ml

- QIAamp DNA mini Kit

- H2O

- TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1nM)

- Tris-Borate-EDTA buffer, BioReagent

- Ethidium Bromide

- Gel loading buffer bromophenol

- Ladder 100bp

- Nƣớc cất pha tiêm

- Mutanolysin từ S.globisporus ATCC

- Lyzosyme

- QIAGEN proteinase K (10mL)

Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR [7][11]

Tên

Trình tự nucleotide (từ 5’-3’)

Kích thƣớc sản

phẩm

CGGGGATGGTGCTTCGCG

910bp

Mồi DT1

CGCGATTGGAAGCGGGGT

Mồi DT2

248bp

Mồi Tox1 ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTA

Mồi Tox2 GAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA

Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR [9]

Kích thƣớc sản phẩm

Tên

Trình tự nucleotide (từ 5’-3’)

CTTGCTCCATCAACGGTTCA

Mồi ToxA-R

GGCGTGGTCAAAGTGACGTA

117bp

Mồi ToxA-F

Đầu dò ToxA-Prb FAM-CCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACT-

TAMRA

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng chứng dƣơng C.diphtheriae phân lập tại Việt Nam

- Chủng vi khuẩn xác định độ đặc hiệu.

- Mẫu: 40 mẫu ngoáy họng từ các ca có triệu chứng lâm sàng bạch hầu, mẫu ngoáy họng các ca tiếp xúc gần với ca nhiễm bệnh từ đợt dịch Bình Phƣớc năm 2016

Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu.

Số TT Tên chủng Nguồn

1 Haemophilus influenzae ATCC 49247

2 Staphylococcus aureus ATCC 25923

3 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

4 Neisseria meningitidis ATCC 35561

5 Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426

6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

7 Escherichia coli ATCC 25922

8 Bacillus Subtilis ATCC 11774

9 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49917

10 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

11 Bacillus paralicheniformis ATCC12759

12 Enterobacter cloacae Viện Pasteur TP.HCM

13 Neisseria lactamica ATCC 49142

14 Neisseria meningitidis Viện Pasteur TP.HCM

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách DNA từ mẫu

Rửa.thêm 500µl buffer AW1

Rửa.thêm 500µl buffer AW2

Dung dịch DNA

Dung giải.thêm 200µl buffer AE, ủ 5p,25 độ C

Ly tâm 8000 rpm/60s

100µ buffer Lysis+ 20µl protein K + 200µL buffer AL + 260µl Ethanol 99%

Ly tâm 14000 rpm/3p. Bỏ dịch nổi, ly tâm 14000 rpm/1p

Sơ đồ tách chiếc DNA theo bộ QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN của Đức

3.2.2 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) phản ứng PCR

Các bƣớc tách chiếc thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO

Cấy khuẩn C.diphtheriae trên đĩa môi trƣờng BA sau 24h lấy khuẩn

lạc tăng sinh trong 2mL BHI broth, sau đó hút 1ml dịch tăng sinh ly tâm

10000 vòng /5 phút thu cặn, tiến hành tách DNA theo quy trình ở mục 3.2.1. 1ml dịch tăng sinh còn lại tiến hành pha loãng từ nồng độ 10-1-10-8 CFU/mL. Chọn hai nồng độ là 10-6 và 10-7 hút 100µL dung dịch cấy trải trên đĩa môi

trƣờng BA mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa, 24h sau đếm số khuẩn lạc thu đƣợc

trên mỗi đĩa.

Dựa vào nồng độ mồi đƣợc đƣa ra trên các bài báo khoa học trƣớc đây

để tìm ra ngƣỡng phát hiện của phản ứng PCR mới thiết lập, quy trình đƣợc

kiểm tra trên một dải nồng độ chứng dƣơng vi khuẩn C.diphtheriae nồng độ từ 10-1-10-8CFU/mL thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi nghiệm thức với 2 cặp

mồi DT1, DT2 và Tox1, Tox2.

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2

Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút

Master Mix 2X 1X 12.5µL

Mồi DT1 10µM 0.4µM 1µL

Mồi DT2 10µM 0.4µM 1µL

DNA khuôn mẫu 2µL

Hút vô cho đủ 25µL Nƣớc

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2

Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút

Master Mix 2X 1X 12.5µL

Mồi Tox1 10µM 0.8µM 2µL

Mồi Tox2 10µM 0.8µM 2µL

1µL MgCl2

DNA khuôn mẫu 2µL

Nƣớc Thêm cho đủ 25µL

Kĩ thuật PCR khuếch đại các phân đoạn gene của C.diphtheriae đƣợc thực hiện

theo trình trình sau:

- Lau tủ an toàn sinh học bằng cồn 70%, bật UV trong 30 phút

- Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất cần thiết và tiến hành pha trộn hỗn hợp phản

ứng theo thành phần định sẵn theo bảng trên, ngoại trừ DNA.

- Chia đều các hỗn hợp phản ứng cho các tube .

- Chuyển sang các tube phản ứng sang phòng mix DNA và thêm DNA của

từng chủng vào các tube đã đƣợc chú thích trƣớc.

- Đặt các tube phản ứng vào máy PCR đã cài đặt chu trình nhiệt thích hợp và

- Spin down các tube.

tiến hành phản ứng khuếch đại gene

Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2

Chu trình nhiệt

30X

940C trong 2 phút 940C trong 20 giây 620C trong 30 giây 720C trong 30 giây 720C trong 5 phút 100C đến ∞

Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2

Chu trình nhiệt

35X

3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR

950C trong 2 phút 950C trong 30 giây 550C trong 30 giây 720C trong 1 phút 720C trong 10 phút 100C đến ∞

Mục đích là để tìm ra nồng độ thích hợp của cặp mồi ToxA-R, ToxA-F nhằm

tiết kiệm đƣợc sinh phẩm mà vẫn cho ra đƣợc kết quả tốt nhất. Nghiệm thức đƣợc

thực hiện trên 1 dải nồng độ mồi: 0.8µM, 0.6µM, 0.4µM, 0.2µM, 0.1µM, lặp lại 3

lần cho mỗi nồng độ mồi.

Theo nghiên cứu của Elizabeth A. Mothershed và cộng sự, nghiên cứu năm 2002 báo cáo rằng những tín hiệu huỳnh quang có giá trị Ct dƣới 35 thì cho kết quả dƣơng tính

Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR

Chu trình nhiệt

1X 500C trong 2 phút

1X 950C trong 10 phút

45X 950C trong 15 giây

600C trong 1 phút

Sau khi kết thúc giai đoạn 600C trong 1 phút, tiến hành đọc kết quả.

Bảng 3.9: Thành phần phản ứng của phản ứng Realtime PCR

Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Thành phần phản ứng

Master Mix 2X 1X 12.5µL

Mồi ToxA-R 10µM 1.2µM 3µL

Mồi ToxA-F 10µM 1.2µM 3µL

Rox 0.2µl/100µL super mix

Probe 2µL 1.25µM 0.1µM

DNA khuôn mẫu 2µL

3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR

Nƣớc Thêm cho đủ 25µL

Sử dụng nồng độ mồi đã chọn ở thí nghiệm 3.2.4, khảo sát qua các nồng độ

3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR Tiến hành cấy vi khuẩn C.diphtheriae trên mồi trƣờng BA sau đó thực hiên tách chiết và cấy đếm tƣơng tự ở mục 3.2.2

mẫu dò 0.2 µM, 0.1µM, 0.05µM, lặp lại 2 lần cho mỗi nồng độ.

Sau khi tìm ra đƣợc nồng độ mồi thích hợp tiến hành thực hiện thí nghiệm

khảo sát độ nhạy của mồi trên dải nồng độ DNA là 10-1- 10 -7, thí nghiệm đƣợc thực

3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR

hiện với nồng độ mồi 1.2µM

Độ đặc hiệu của quy trình PCR mới đƣợc thiết lập sẽ đƣợc kiểm tra bằng các

chủng vi khuẩn đƣợc liệt kê ở bảng 3.3 với nồng độ mồi 1.2 µM và nồng độ mẫu

dò là 0.1µM

Tiến hành áp dụng quy trình PCR, Realtime PCR chạy trên 40 mẫu ngoáy

họng có các triệu chứng lâm sàn và các mẫu ngoáy họng tiếp xúc với ca nhiễm

bệnh:

Quy trình PCR (mồi DT1, DT2): nồng độ mồi 0.4µM. Tiến hành điện di sản

phẩm PCR trong 35 phút, điện thế 100V

Quy trình PCR (mồi Tox1, Tox2): nồng độ mồi 0.8µM, bổ sung 1µL MgCl2.

Tiến hành điện đi sản phẩm PCR trong 30 phút, điện thế 100V

Quy trình Realtime PCR (mồi ToxA-R, ToxA-F): nồng độ mồi 1.2µM, nồng

độ mẫu dò 0.1µM

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ

4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR:

Lad 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 _

Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR

sử dụng cặp mồi DT1, DT2.

Theo hình 4.1: Trong thí nghiệm này sử dụng cặp mồi DT1, DT2 để khảo sát độ nhạy của phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10-1-10-9. Nồng độ 0.4µM mồi phát hiện gen độc tố trong khoảng nồng độ DNA từ 10-4, nghiã là với 2180CFU quy trình PCR có thể phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae.

Lad + 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 -

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2

Theo hình 4.2: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung thêm MgCl2 để khảo sát độ nhạy phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10-1-10-7 , Ở nồng độ 0.8µM, mồi bắt đƣợc gen độc tố gây bệnh ở ngƣỡng 10-4. Nghĩa là với 2180CFU thì quy tình PCR có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Kết quả trên gel điện di cho thấy trong thành phần phản ứng có bổ sung MgCl2 (hình 4.3) cho kết quả rõ hơn, hình chụp sáng màu hơn so với khi không bổ sung MgCl2 (hình 4.2)

Lad + 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 -

Hình 4.3:Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2

4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR:

Lad + 13 14

Lad + 1 2 3 4 5 6

Lad + 7 8 9 10 11 12

Hình 4.4

Hình 4.5

Hình 4.6

Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 trong phản ứng PCR. Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitidis

Theo hình 4.4, 4.5, 4.6: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi DT1, DT2 và các

chủng vi khuẩn khác để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae.

Lad + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 _

14 -

Hình 4.7: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu của mồi Tox1, Tox2. Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitides; (-)= đối chứng âm.

Theo hình 4.7: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 và các chủng vi khuẩn để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae mà không phát hiện thêm bất kì một chủng vi khuẩn nào khác.

4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR

Hình 4.7: Kết quả khảo sát nồng độ mồi

Với các nồng độ mồi khác nhau đƣợc khảo sát, 6 nồng độ mồi sau 3 lần lăp

lại đều cho tín hiệu vƣợt qua tín hiệu nền, kết quả rõ ràng nên chọ nồng độ.

Với ba lần lặp lại ở 3 nồng độ mẫu dò, cả 3 nồng độ đều cho tín hiệu vƣợt

4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR lên cao khỏi tín hiệu nền, nên chọn nồng độ thấp nhất 0.1µM để sử dụng trong phản ứng Realtime PCR

Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò

4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR Cặp mồi- mẫu dò dùng để kiểm tra độ đặc hiệu cho đối chứng dƣơng C.diphtheriae vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, trong khi không phát tín hiệu huỳnh quang với các ống chứa DNA của các chủng vi khuẩn đối chiếu.

Kết quả này khẳng định độ tin cậy của cặp mồi và mẫu dò này trong phản

ứng Realtime PCR chuẩn đoán C.diphtheriae.

1

2

3

Hình 4.9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. (1) đƣờng biểu diễn đối chứng dƣơng.

(2) đƣờng nền, (3) đƣờng biểu diễn những vi khuẩn khác

Thí nghiệm khảo sát độ nhạy trên dãy nồng độ DNA vi khuẩn từ 10-1-10-9,

4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR kết quả cho thấy cặp mồi- mẫu dò phát hiện đƣợc vi khuẩn ở ngƣỡng nồng độ 10-5 , đồng nghĩa chỉ với 124 CFU thì quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae.

Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ nhạy

3

Hình 4.11: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. (1) đƣờng biểu diễn chứng

dƣơng. (2) mẫu 16-389CD. (3) mẫu 16-393CD.(4) mẫu 16-386CD.(5) đƣờng nền

Bảng 4.1:Kết quả chạy trên 40 mẫu

Tên chủng

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Nuôi cấy (+) X X X X X

PCR2 ( mồi Tox)(+) X X X X X

Realtime-PCR (+) X X X X X X

PCR1 (mồi DT)(+) X X X

16-373CD 16-377CD 16-378CD 16-379CD 16-380CD 16-381CD 16-382CD 16-383CD 16-384CD 16-385CD 16-386CD 16-387CD 16-388CD 16-389CD 16-390CD 16-391CD 16-392CD 16-393CD 16-394CD 16-395CD 16-396CD 16-397CD 16-398CD 16-399CD 16-400CD 16-401CD 16-402CD 16-403CD 16-404CD 16-405CD 16-406CD 16-407CD 16-408CD 16-409CD 16-410CD 16-411CD 16-412CD 16-417CD 16-418CD 16-419CD

Qua bảng thống kê số liệu kết quả 2 quy trình PCR và Realtime PCR ta thấy

đƣợc quy trình PCR1 phát hiện đƣợc 3 mẫu dƣơng tính/ 5 mẫu nuôi cấy dƣơng tính

hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình PCR2 phát hiện 5 mẫu dƣơng

tính trong đó 2 mẫu 16-393 CD và 16-418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết

quả nuôi cấy âm tính, hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình Realtime

PCR phát hiện đƣợc 6 mẫu dƣơng tính trong đó có 2 mẫu là 16-393CD và 16-

418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy là âm tính, hiệu suất quy

trình này đạt khoảng 80%.

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN

Bài nghiên cứu so sánh ba phƣơng pháp PCR1, PCR2 và Realtime PCR :

PCR1 sử dụng cặp mồi DT1, DT2; PCR2 sử dụng cặp mồi Tox1, Tox 2 và Real

time PCR sử dụng mồi ToxA-R, ToxA-F. Trong phƣơng pháp PCR2 ở thí

nghiệm khảo sát độ nhạy ta thấy đƣợc cặp mồi Tox1, Tox2 cho kết quả rõ ràng

và chính xác hơn khi bổ sung MgCl2. Quy trình PCR1, PCR2 đƣợc thiết lập để có độ đặc hiệu tối ƣu và độ nhạy phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-4

nghĩa là với 2180CFU quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh. Quy trình

Real time PCR đƣợc khảo sát cho độ đặc hiệu cao ở nồng độ mồi 0.4µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM quy trình phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-5. Nghĩa là

chỉ với 124CFU thì quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh.

Realtime PCR có độ nhạy cao, cho kết quả cụ thể và nhanh chóng và làm

giảm nhu cầu sử dụng PCR. Mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ

DNA, Realtime PCR có thể phát hiện ra độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của

gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là có thể loại cung

cấp thông tin khi phản ứng vừa kết thúc, điều này rất quan trọng trong trƣờng hợp

xảy ra sự cố. Realtime PCR cung cấp sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm

PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố, do đó có thể rất hữu ích trong việc nghiên

cứu, dự đoán và phòng chóng dịch bệnh.

Tuy nhiên bài nghiên cứu chƣa thực hiện khảo sát nồng độ mồi cho hai quy

trình PCR1, PCR2. Cần phải thực hiện thêm thí nghiệm này để hoàn thiện hơn 2

quy trình này. Trong thí nghiệm pha loãng nồng độ, chỉ thực hiện pha loãng bậc 10

nên tiến hành thêm pha loãng bậc 2 để nâng cao độ chính xác cho quy trình.

CHƢƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang 209-214

[2]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang212-214

[3]PGS. TS. Lê Văn Phùng. Vi Khuẩn Y Học. Vụ Khoa học và Đào tạo, 2009, trang 126

Tài liệu Tiếng Việt

[5] Xét nghiệm và chuẩn đoán vi khuẩn, NXB y học, 2012, trang105-107

[6]Vi sinh vật gây nhiễm trùng cơ quan (Sách đào tạo Bác sĩ chuyên khoa I dịch tễ học thực địa), NXB Y học, 2012, trang 12

[4]PGS.TS Lê Văn Phủng. Vi sinh Y học. Vụ khoa học và đào tạo. 2009, trang 130

Tài liệu nƣớc ngoài:

[7] DANIEL HAUSER, MICHEL R. POPOFF, MARTINE KIREDJIAN,

PATRICE BOQUET AND FRANOIS BIMET. Polymerase Chain Reaction Assay

for Diagnosis of Potentially Toxinogenic Corynebacterium diphtheriae Strains:

Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay., Journal of Clinical

Microbiology OCt. 1993, p. 2720-2723

[8] Espy, M. J., et al. "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for

routine laboratory testing." Clinical microbiology reviews 19.1 (2006): 165-256.

[9] Hiroshi Nakao, Tanja Popovic . Development of a Direct PCR Assay for

Detection of the Diphtheria Toxin Gene. Journal of Clinical Microbiology. , July

1997, p. 1651–1655. 0095-1137/97/$04.0010

[10]Kobaidze, Ketevan, et al. "Direct polymerase chain reaction for detection of

toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains from the Republic of Georgia after

prolonged storage." Journal of Infectious Diseases 181.Supplement_1 (2000):

[11] Mancini, Fabiola, et al. "Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays." Diagnostic microbiology and infectious disease 73.2 (2012): 111-120.

S152-S155.

[12] Young, T. Kue. Population health: concepts and methods. Oxford University Press,

USA, 2005

[13]Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U. Rapid Detection and Molecular Differentiation of Toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR . Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(7):2485-2489. doi:10.1128/JCM.00452-11

[14]Sing A, Hogardt M, Bierschenk S, Heesemann J. Detection of Differences in

the Nucleotide and Amino Acid Sequences of Diphtheria Toxin

from Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Causing

Extrapharyngeal Infections. Journal of Clinical Microbiology. 2003;41(10):4848-

4851. doi:10.1128/JCM.41.10.4848-4851.2003.

[15] http://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1084/benh-bach-hau

Tài liệu từ internet

CHƢƠNG 7: PHỤ LỤC

Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi DT1, DT2

Lad 373 377 378 379 380 381 + _

- 382 383 384 385 386 387 + lad 388 389 390 391 392 393 + - __ -

- 394 395 396 397 398 399 + lad + 400 401 402 403 404 405 -

Lad 406 407 408 409 410 411 412 + -

418 419 + lad

Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi Tox1, Tox2

lad + 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 -

Lad + 412 417 418 419 -

378

Chứng dương

Kết quả chạy Realtime PCR trên mẫu:

Chứng dương

389

393

386

Hình chạy mẫu 16-373CD, 16-377CD, 16-378CD, 16-379CD, 16-380CD, 16- 381CD

Hình chạy mẫu 16-382CD, 16-383CD, 16-384CD, 16-385CD, 16-386CD, 16- 387CD, 16-388CD, 16-389CD, 16-390CD, 16-391CD, 5616-392CD, 16-393CD, 16-394CD

Chứng dương

418

419

Hình chạy mẫu 16-405CD, 16-406CD, 16-407CD, 16-408CD, 16-409CD,

Hình chạy mẫu 16-394CD, 16-395CD, 16-396CD, 16-397CD, 16-398CD, 16- 399CD, 16-400CD, 16-401CD, 16-402CD, 16-403CD, 16-404CD

16-410CD, 16-418CD, 16-419CD