Đồ án tốt nghiệp: Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA

XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN

SERRATIA MARCESCENS SH4

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

: TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA

XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN

SERRATIA MARCESCENS SH4

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

: TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn

khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM).

Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của

mình.

TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ

con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc

sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn

nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con

đường học tập.

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài

Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức

bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt

khóa luận tốt nghiệp này.

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên trong

quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm.

Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh,

anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí

nghiệm.

Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ

mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án

trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt

quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn

Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực hiện đồ

án tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn !

TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017

TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................... 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... 4

DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... 5

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... 6

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................. 9

1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học .............................................................. 9

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay ............ 9

1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ........................... 10

1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin ...................................... 10

1.1.4.1 Ưu điểm ............................................................................................. 11

1.1.4.2 Nhược điểm ....................................................................................... 11

1.1.4.3 Cơ chế tác động ................................................................................ 12

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................ 12

1.2.1 Lịch sử phát hiện ...................................................................................... 12

1.2.2 Phân loại .................................................................................................. 13

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens .......................................................... 13

1.2.4 Đặc điểm sinh lí ....................................................................................... 14

1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 15

1.1.3.2 Đặc điểm phân bố ............................................................................. 16

1.2 Giới thiệu về Prodigiosin ................................................................................ 17

1.3.1 Khái niệm về prodigiosin ......................................................................... 17

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin ..................................................... 17

1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin .......................................................... 20

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens ........................... 20

1.4 Enzyme ............................................................................................................ 25

1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens ......................................................... 25

1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới ...................................................................... 26

1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens .............................................. 26

1

Đồ án tốt nghiệp

1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin ........................................................... 27

1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh ........................................................ 27

1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp ................................................................... 27

1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp ........................................................................ 28

1.6.3.3 Nấm Trichoderma ............................................................................. 28

1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus ..................................................................... 29

1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella ............................................................ 29

1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học ................................................................... 29

1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại ........................................................ 30

1.7.3 Biện pháp phòng trừ ................................................................................. 30

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 32

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 32

2.1.1 Thời gian .................................................................................................. 32

2.1.2 Địa điểm ................................................................................................... 32

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị ............................................................................... 32

2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens ....................................................... 32

2.2.2 Nguồn nấm ............................................................................................... 32

2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii .............................................................. 32

2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia. ...................................................... 32

2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate ..................................................... 32

2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất ............................................................. 32

2.2.7 Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 33

2.3 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 34

2.4 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 34

2.5 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................. 34

2.5.1 Phương pháp luận .................................................................................... 34

2.5.2 Bố trí thí nghiệm....................................................................................... 35

2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm .................................................. 36

2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ...................................... 36

2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens ......................... 37

2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học ................................................ 37

2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme ............................................................. 37

2

Đồ án tốt nghiệp

2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm ........................................ 42

2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá ......................... 44

2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........................................................................................................................... 45

2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia ......................................................................................................... 47

2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu ................... 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 51

3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ..................................................................... 51

3.2 Hoạt tính kháng nấm ....................................................................................... 52

3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm ......................................................................... 55

3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........ 57

3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia ............... 58

3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata ............. 61

1.Kết luận .............................................................................................................. 65

2. Kiến nghị ........................................................................................................... 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 67

PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG .............................................. 71

PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH ........................................................................................ 74

PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ ............................................................................................ 86

PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ....................................................................... 89

3

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Artemia nauplii : A.nauplii

Brassica integrifolia : B. integrifolia

Serratia mascescens : S.mascescens

Plutella xylostella : P.xylostella

Pepton glycerol : PG

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam.

BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.

4

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) .............................................................................................................. 14 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ........ 14 Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) ................................................. 18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ......................................... 18 Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................. 21 Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. ......... 24 Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella ..................................................... 30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. ......................................................................................................................... 36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein ......... 38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit ......................... 40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin ......... 41 Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................ 43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). ................................................................................. 45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). ..................................................... 56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml). ..................................................................................................................... 58 Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm ........ 59 Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm .......... 60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 ........................................................................................................ 63

5

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ................................................................................................................................... 19 Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. ............ 52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 ............................................... 52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. .................................................................. 53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp.............................................................. 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. ........................................................... 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. ....................................................................... 56 Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm. ....... 61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. .................................................. 62

6

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng

hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài

vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng

hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề

trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại.

Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây

trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá mức cho

phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở

nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella xylostella là

loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu hết các loại

rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng thuốc hóa học

nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy,

xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì

tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con người, đồng

thời không gây ô nhiễm môi trường.

Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn

Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo

chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt

Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có

nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên

cứu nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ

sở đó mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử

nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia

marcescens SH4”

2. Mục đích nghiên cứu

7

Đồ án tốt nghiệp

Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

Serratia marcescens SH4.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4

Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn

sinh học của chế phẩm.

Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện

là cá bảy màu

4. Kết quả cần đạt được

Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi

khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy.

Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu

tơ.

Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii.

Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài

thực tế.

8

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học

1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học.

Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn,

virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất kháng sinh),

các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật).

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay

1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc

chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên

các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV

có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ

cần hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha.

2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000

IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu

thuộc họ Leptidopera.

3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium

anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên

đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa

và cây ăn quả đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria

chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu

diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể

sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”.

4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá,

đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được

đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung

hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá).

9

Đồ án tốt nghiệp

5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu

đạt 45- 50%.

6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn

quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004)

1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học

Ưu điểm

 Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân

bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình

trạng bùng phát dịch côn trùng.

 Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên

nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông

sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè…

 Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất

phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng... Chi phí sản xuất khi tự

làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ

tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao.

Hạn chế

 Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với

thuốc hóa học.

 Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều

kiện cũng chặt chẽ hơn.

1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin

Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin

B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi

khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên nhiều

loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa.

Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương

phẩm, gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8

EC; Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC…) và 240 thuốc thương phẩm

10

Đồ án tốt nghiệp

dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC),

Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC),

Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper

24.5EC), Bacillus thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP …)

1.1.4.1 Ưu điểm

- Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác

động của điều kiện thời tiết.

- Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng.

- Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc

bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ,

nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau họ thập tự,

họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè…), lúa.

1.1.4.2 Nhược điểm

- Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 300

mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách

ly ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày.

- Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so

với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như

Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85).

- Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ

ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn

nhưng độc đối với cá và ong.

Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng Abamectin

không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa chọn để sử

dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số 580/BVTV-

QLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật).

11

Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.3 Cơ chế tác động

Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA)

tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ

trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày.

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens

1.2.1 Lịch sử phát hiện

Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ

6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh

mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội

Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có

“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy

máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.

Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ

diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã

phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như vậy

được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.

Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử

dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều

này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép

lạ (Gillen và Gibbs, 2011).

Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên

Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang

màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở

nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi sinh

vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo

tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên loài

marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân

hủy rất nhanh bánh mì và polenta.

12

Đồ án tốt nghiệp

Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy những

đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học

đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

1.2.2 Phân loại

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan

với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là

Serratia marcescens.

Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gramma proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Serratia

Loài: Serratia marcescens

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia

marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –

2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có

thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

13

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)

1.2.4 Đặc điểm sinh lí Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính

là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường

bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch,

tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 –

30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

14

Đồ án tốt nghiệp

1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí. Chủ

yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ có các

enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản

ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ

Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri

và cộng sự, 2004).

Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di

động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi

và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia

marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat

và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá

vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens

STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả

+ 1 Di động

- 2 Indole

- 3 Methyl Red

+ 4 Voges Proskauer

+ 5 Citrate

+ 6 Dnase

+ 7 Catalase

- 8 Oxidase

- 9 Urease

+ 10 Gelatinase

+ 11 Chitinase

15

Đồ án tốt nghiệp

Triple sugar iron Môi trường chuyển sang 12

không sinh khí và không

sinh H2S

Hydrogen sulphide 13 -

Lysine decarboxylase 14 +

Ornithine decarboxylase 15 +

Lên men glucose 16 +

Lên men sucrose 17 +

Lên men sorbitol 18 +

Lên men fructose 19 -

Lên men xylose 20 -

Lên men rhaminose 21 -

Lên men lactose 22 -

Lên men arabinose 23 -

1.1.3.2 Đặc điểm phân bố

Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông

và Serratia marcescens chiếm 75%.

Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn

trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế.

Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối

với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau

khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006).

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm,

nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng

của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).

Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các

loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới

16

Đồ án tốt nghiệp

nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia

marcescens với Steinernema carpocapsae.

1.2 Giới thiệu về Prodigiosin

1.3.1 Khái niệm về prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ

“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở dạng

túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào

(Kobayashi và Ichikawa, 1991).

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn

Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:

prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,

metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn

dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin

hydrochloride (cPrG–HCI).

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-

methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng

lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;

Williamson và cộng sự, 2006).

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole

tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp

với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và

17

Đồ án tốt nghiệp

Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được

miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

Hình 1.4 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)

Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

Các sắc tố màu đỏ của S. marcescens đã được phân lập là đặt tên là

“prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của

prodigiosin tổng hợp bởi S. marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden,

1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những

năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều

mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau

(Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thường gắn trở lại để tạo thành vòng

tròn hoặc macrocycles. Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù

hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Được phân lập là đặt

tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin

có thể tan tương đối trong alcohol và ether. Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,

methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự,

2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bước sóng nhất định và sự

biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.

18

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài Tên sắc tố Danh pháp Trọng

prodigiosin lượng phân

tử và công

thức

Serratia Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da

marcescens methoxy-prodigiosene C20H25N3O

Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da

marcescens hydroxy-prodigiosene C10H23N3O

Serratia Dipyrrolyldipyrromelh 2-(2-pyrryl)-4,6- 334,4 Da

marcescens enr prodigiosin dimethoxypyprodigiosen C19H18N4O2

e

Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da

(Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N3O

Nocardia Cyclononylprodigiosin 2,10-Nonano-6- 265,5 Da

(Actinomadura) melhoxy-prodigiosene C23H33N3O

Nocardia Methylcyclode 2,10-Nonano-6- 391,5 Da

(Actinomadura) cylprodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O

Streptomyces Undccyl- prodigiosin 2-Undecyl-6- 393,6 Da

Rnethoxyprodigiosene C25H35N3 Longisporusr

uber O

Streplonlyces Metacycloprodigiosin 2,4-(9-Ethylnonano) -6- 391,6 Da

methoxyprodigiosene C25H33N3 longisporusr

uber O

19

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn

(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng

thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme như DNA gyrase,

topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn

(Ramina và Samira,2009).

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể

kháng một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,

Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus

mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni

và cộng sự, 2012).

Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của

hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất màu

có khả năng kháng một số loài nấm men như Candida albicans, Candida parapsilosis

và Cryptococcus sp.

Prodigiosin khi được đưa vào cơ thể sâu sẽ thấm vào tế bào và ức chế quá trình

phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của sâu Spodoptera litura (Nguyễn

Hiếu Dân, 2013)

Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả năng chống ung thư (Pandey và

cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi ̃as, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng

sự 2007)

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.

Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006

(Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã được

báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serratia marcescens sản xuất sắc

tố thông qua con đường ngưng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme

4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole,

20

Đồ án tốt nghiệp

được gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và

Qadri, 1980). Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập được một chủng Serratia

marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên,

không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này được báo cáo.

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện

trong Erwinia carotovora subsp. carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử

nghiệm). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định bởi nhiều

yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và

SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản

xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy

thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu

khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).

Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và

Streptomyces coelicolor và được bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene tổng

hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô tả ở hình 2.18.

Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)

21

Đồ án tốt nghiệp

Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL)

tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự gene

của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích thước và

trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001).

Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tương

đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ được hiển thị trong màu đen, chịu trách

nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân nửa

monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp được thể hiện

qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp được thể hiện

qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu đỏ.

Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là

PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai

gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một pig

operon trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép

dưới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater et al.,

2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đƣợc sao chép dưới dạng

polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và

pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy

khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai

bên của khoảng cách này đã chứng minh là tương tự như trong nghiên cứu dùng lacZ

hợp với pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng cách 64 bp

giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách này không

có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản

ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng hợp bởi

Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004).

Mười hai gene được lưu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đường tổng

hợp cho ra các sản phẩm tương tự. Tuy nhiên, định hướng và điều tiết của nó có sự

thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene

tương đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tương tự đặt ra câu hỏi về

22

Đồ án tốt nghiệp

nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn

Gram dương và Gram âm. Vẫn chưa rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò

quan trọng ảnh hưởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự khác

biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác

biệt trong phương thức sản xuất và con đường tổng hợp sinh hóa. PigD và pigE là hai

pig gene không có sự tương đồng trong cụm màu đỏ. Tương tự như vậy, pdtorfL và

pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon

tetrachloride) như pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri

(Lewis và cộng sự, 2000). PdtorfL và pdtorfM nằm cạnh nhau, giống như pigD và

pigE trong cụm pig. PigE tương tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ

Streptomyces coelicolor A3(2), được mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm

màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ

Sma 274; cả hai đều là 50% tương đương 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa

protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có thể

không được liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không được mã hóa

tương đồng bởi cụm pig, nhưng chúng được cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ ba

nguyên tử carbon của vòng pyrrolr và chuổi bên undecyl của undecylprodigiosin

(Cerdeno và cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tương đồng tương ứng có thể có mặt

tại một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai

trò xúc tác cần thiết trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia.

Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia

coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tương ứng của Escherichia

coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme được mã hóa bởi

các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004)

23

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.

Đề xuất này cũng tương tự như đề xuất đối với undecylprodigiosin (Cerdeno

cộng sự, 2001) Mười hai

Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là enzyme prodigiosin) có kích

thước tương tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ là PigB (670 aa) tương đồng

với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều (146 aa) và tương tự gắn vào

cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với các amine oxidase. Các protein

PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tương đồng với RedX (Harris và cộng sự, 2004).

PigA là trình tự tổng hợp một loạt các acyl-CoA dehydrogenases. Chuỗi liên kết với

human isovaleryl-CoA dehydrogenases, cấu trúc tinh thể trong đó đã được xác định,

cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl

moiety của CoA được bảo vệ nhưng các acid amin tham gia vào liên kết các nhóm

adenisyl của CoA không được bảo vệ (Tiffany và cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ

cho ý kiến cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolyl-CoA .

24

Đồ án tốt nghiệp

1.4 Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase,

DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa

chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh học

đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và cộng sự, 1989).

Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme chitinase

(ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding (CBP21)

(Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự, 1988;

Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự, 1996;

Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998), chúng

có khối lượng phân tử lần lượt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt động

chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986).

1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens

Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các

tác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh

sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trưởng phát triển, gây ảnh hưởng đến vật chủ, mà

phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss và

Hewlett, 1986).

Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã được nghiên cứu, bao gồm

sự bám dính, tính kị nước, mannose - resistant, mannose - sensitive,

LipoPolySaccharide (LPS). Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình

tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.

Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là các adhesion, chúng có thể

có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất

polypeptide thì được chia thành hai nhóm là nhóm có khuẩn mao và nhóm không

có khuẩn mao. Mà các vi khuẩn Gram âm, như là Serratia marcescens, thường

bám dính nhờ các khuẩn mao này.

25

Đồ án tốt nghiệp

Các khuẩn mao là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông

trên bề mặt vi khuẩn. Các khuẩn mao được cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với

nhau tạo nên hình dạng giống như trụ xoắn ốc. Thường thì chỉ có một loại protein

là cấu trúc chính của một phân nhóm khuẩn mao tuy nhiên các protein phụ trợ khác

cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc khuẩn mao. Đỉnh của các

khuẩn mao có chức năng gắn với tế bào vật chủ.

Bên cạnh đó, LPS hay còn được gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lưỡng

tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide

liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS được coi như nội độc tố, bảo vệ

màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O –

antigen, lõi oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của

phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.

Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng được xem như

một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cả

protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).

Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào

cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm

lành vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng tằm silkworm larvae.

1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới

1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens

Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của S.

marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của S. marcescens lên

thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh.

Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát Pyricularia

oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng S. marcescens.

Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S.

marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria

mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng.

26

Đồ án tốt nghiệp

1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất

prodigiosin bởi S. marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của

prodigiosin. Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả

vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.

Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng

khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như Candida

albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp..

Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệt

côn trùng.

Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận

từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas

sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng

độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự

cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50

khoảng 50 g/ml.

1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh

1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp

Theo Claridge, Dawah, Wilson (1997) cũng đã chỉ ra rằng các dòng Fusarium

tìm thấy từ cây đại kích là nguyên nhân gây hại kinh tế (làm mất năng suất lên tới

92%) ở vùng cỏ ở Bắc Mỹ, bằng chứng chứng minh rằng các loài Fusarium có khả

năng xuất hiện và phát triển ở các vùng đất không canh tác.

Các loài Fusarium phân bố rộng khắp ở hầu hết các vùng địa lý khác nhau trên

thế giới. Chi nấm Fusarium bao gồm các loài hoại sinh, nội ký sinh và cả các loài ký

sinh gây hại thực vật. Cũng một nghiên cứu khác của Burgess et al (1994) cho thấy

chúng là nguyên nhân gây ra rất nhiều loại bệnh cây trong đó có thối rễ, cổ rễ, thân,

sẹo, cháy bông, thối bắp và các bệnh héo

Theo tác giả Moore et al (2001) thì các bệnh héo do các dạng chuyên hoá thuộc

loài Fusarium oxysporum gây ra trên rất nhiều loài thực vật thuộc nhiều họ khác nhau.

27

Đồ án tốt nghiệp

Ví dụ: Bệnh Panama trên chuối do Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. Cubense (E.

F. Smith) Snyd. & Hans và héo trên bông do Fusarium oxysporum f. sp vasinfectum

(Atk.) Snyd. & Hans đã gây thiệt hại to lớn cho ngành công nghiệp bông ở Australia.

1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp.

Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả

ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Ngoài ra, có thể tìm thấy loài nấm

này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010). Chúng hiện diện ở những nơi khá

ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên.

Ở Mỹ, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sử dụng nấm

Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây,

bông, lúa mì đậu đỗ và ngô (Campell và CS., 1985; Hajek và CS., 1987; Anderson

và CS., 1988; Quintela và CS., 1990; Bing, 1991) (theo Nguyễn Thị Lộc, 2009)

Ở Canada đã nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces farinosus để phòng trừ

châu chấu hại lúa (Khachatourians G. G., 1992)

Hiện nay trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm

sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây

trồng quan trọng như sâu tơ (Plutella xyllostella) (Yin Fei và CS., 2010), sâu khoang

(Spodoptera litura) hại rau thập tự (Ma J. và CS., 2007; Hu Q. B. và CS.,2007) và các

loài bọ phấn (Bemisiamtabaci, Bemisia argentifolii) hại cây trồng (Wraight S. P. và

CS., 1998; Huang Zhen và CS., 2004).

1.6.3.3 Nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma sp. có khu vực phân bố rất rộng chúng hiện diện khắp nơi

trong đất, trên bề mặt rễ, trên vỏ cây mục nát. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm

của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma (Klein và

Eveleigh, 1998). Các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng

đất trung tính hoặc kiềm (Papavizas, 1985).

Nấm Trichoderma có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào như

chitinase, 1-3-glucanse đây là 2 loại enzyme quan trọng trong quá trình ký sinh lên

nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003).

28

Đồ án tốt nghiệp

Trichoderma sp ký sinh lên sợi nấm R. solani và làm chết sợi nấm là do tác

dụng của enzyme ngoại bào làm phá hủy màng tế bào của nấm bệnh (Phạm Văn Kim,

2000).

1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus

Nấm Aspergillus flavus tồn tại tự nhiên trong không khí và đất. Trong thời kỳ

hạn hán, nấm này mọc trên các cây trồng còn xanh như lạc, ngũ cốc, ngô và ớt.

Nấm CDP1 sinh độc tố Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng, lây nhiễm trên

nhiều loại nông sản.

Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật,

trong đó có con người và vật nuôi. Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và

cây đậu. Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được. Các

bệnh nhân nhiễm nấm A. flavus thường là suy giảm miễn dịch.

Những nghiên cứu của Ablas K và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm Aflatoxin

trên ngô do nấm A.flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng trồng ngô của

đồng bằng Missisipi của Mỹ.

1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella

Sâu tơ (Plutella xylostella ) là loài bướm đêm có nguồn gốc từ Địa Trung Hải.

Có vòng đời ngắn khoảng 14 ngày, chúng có thể di cư với cự li khá xa. Sâu tơ là một

trong những loài gây hại nhiều nhất trên thực vật thuộc họ Cải, chủ yếu là những cây

sinh glucosinolat.

1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học

Sâu tơ trưởng thành dài 6 -7 mm, có hai cánh. Cánh trước có thể xòe rộng 13

– 16 mm, màu nâu có những sọc dọc màu sáng. Cánh sau có màu xám, mép ngoài có

lông.

Sâu tơ sinh trưởng từ trứng, mỗi con cái đẻ từ 50 – 400 trứng. Trứng sâu hình

bầu dục dài từ 0.3 – 0.5 mm, màu trắng ngà. Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân

chính và nở trong vòng 3 – 4 ngày.

Ấu trùng màu xanh lục, mình nở to chính giữa, 2 đầu nhọn, thân chia đốt rõ

ràng và có 3 cặp chân giả từ đốt bụng thứ 5.

29

Đồ án tốt nghiệp

Sâu có 4 tuổi với thời gian phát triển lâu từ 7 – 10 ngày.

Thời gian làm nhộng từ 4 – 7 ngày. Khi mới hình thành nhộng có màu xanh

nhạt, khoảng 2 ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ 5 – 7 mm, chung

quanh nhộng có kén bằng tơ bao phủ.

Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella

1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Sâu non mới nở bò lên bề mặt lá gặm biểu bì tạo thành những rảnh nhỏ ngoằn

ngoèo. Từ tuổi 2, sâu ăn thịt lá để lại lớp biểu bì tạo thành những vết trong mờ.

Sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì lá làm lá thủng lỗ, giảm năng suất và chất lượng

rau. Khi mật độ sâu cao, ruộng rau bị hại xơ xác, chỉ còn trơ lại gân lá.

Khi bị động đến sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên còn được gọi là

“ sâu đù”.

1.7.3 Biện pháp phòng trừ

Thường xuyên vệ sinh đồng ruộng, tỉa bỏ các lá già, làm cỏ.

30

Đồ án tốt nghiệp

Bố trí mùa vụ thích hợp, vụ đông xuân ít sâu hơn vụ hè. Luân canh với cây

không cùng ký chủ, dùng bẫy dính màu vàng theo dõi bướm sâu tơ, trồng xen với cây

họ cà sẽ đuổi được bướm của sâu tơ.

Dùng lưới cao 2m bao xung quanh để hạn chế bướm sâu tơ từ bên ngoài bay

vào đẻ trứng.

Kết hợp thuốc BT với thuốc hóa học như MATCH 050EC, SUCCESS 25EC

và tạo điều kiện cho thiên địch phát triển.

Sử dụng chế phẩm nấm diệt bướm của sâu tơ.

31

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 21/12/2016 đến ngày 31/07/2017.

2.1.2 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học, trường Đại học

Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị

2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens

Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH4 được phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê

Quốc Vũ (2015), lưu trữ tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.

2.2.2 Nguồn nấm

Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces sp, Aspergillus flavus CDP1, Fusarium sp. do

cô Nguyễn Thị Hai cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.

2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii

Trứng bào xác A.nauplii được cung cấp tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ

Chí Minh.

2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia.

Hạt cải ngọt thương phẩm được cung cấp bởi công ty TNHH Hạt giống Thuận Điền

địa chỉ 588/50A tỉnh lộ 10, phường Bình Trị Đông quận Bình Tân TP.HCM.

2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate

Cá được thu mua ở cửa hàng cá cảnh số 217 Lê Văn Quới phường Bình Trị Đông

quận Bình Tân thành phố Hồ Chí Minh.

2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất

a. Môi trường (Thành phần môi trường xem phụ lục 1)

 Môi trường Peptone glycerone agar (PGA)

 Môi trường Peptone glycerone broth (PG)

 Môi trường lipid

 Môi trường Casein

32

Đồ án tốt nghiệp

 Môi trường huyền phù Chitin

b. Hóa chất sử dụng

 Cồn 70, cồn 96

 NaCl

 HCl, NaOH

 Petroleum ether

 N- Hexan

 Nước muối bão hòa

 Ethyl acetate, Acetone

2.2.7 Dụng cụ, thiết bị

a. Dụng cụ

 Phễu chiết

 Ống nghiệm

 Đĩa petri

 Erlen 50ml, 100 ml, 250ml

 Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml

 Pipetman 100μl, 1000μl.

 Đầu típ

 Đũa thủy tinh

 Bao hấp, giấy gói, thun

 Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng

 Bông không thấm, bông thấm

 Chai syrum 100ml.

b. Thiết bị

 Tủ cấy vi sinh

 Tủ lạnh

 Cân phân tích

 Bếp từ

33

Đồ án tốt nghiệp

 Máy nước cất

 Autoclave

 Tủ hút

 Máy ly tâm

 Máy cô quay

 Bể điều nhiệt

2.3 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ của chế phẩm và ảnh hưởng của chế phẩm lên

cây cải ngọt, nấm gây bệnh, nấm có lợi và thủy sinh: A.nauplii, cá bảy màu.

2.4 Nội dung nghiên cứu

Định tính enzyme protease, lipase, chitinase của dịch nuôi cấy sau xử lý acid.

Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên các chế phẩm sinh học diệt sâu bệnh (

nấm Trichoderma sp., nấm Paecilomyces sp.) và nấm bệnh Aspergillus flavus CDP1

và nấm Fusarium sp.).

Khảo sát hoạt lực diệt sâu tơ Plutella xylostella của chế phẩm chứa

prodigiosin.

Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm lên cây cải ngọt Brassica integrifolia.

Thử nghiệm độc lực của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii, cá bảy màu

Poecilia reticulata.

2.5 Phương pháp thí nghiệm

2.5.1 Phương pháp luận

Các nghiên cứu trước đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens (phân

lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế phẩm

diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trình downtream processing đối với dịch nuôi

cấy lên men vi khuẩn. Vì vậy việc sử dụng phương pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào

S. marcescens SH4 và sau đó làm chế phẩm mang lại hiểu quả cao, giữ lại phần lớn

các hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hưởng đến prodigiosin trong

dịch nuôi cấy vi khuẩn. (Lê Thị Ngọc Dung, Tạo chế phẩm diệt sâu khoang từ dịch

nuôi cấy vi khuẩn Serratia marces SH1 2016)

34

Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát hoạt tính kháng nấm được sử dụng có ý nghĩa thăm dò khả năng kháng

nấm của dịch nuôi cấy S. marcescens SH4 có khả năng kháng nấm khi sử dụng chế

phẩm đồng thời với chế phẩm từ nấm trên đồng ruộng hay không. Hoạt tính diệt sâu

được thử nghiệm trên sâu tơ Plutella xylostella. Chế phẩm được sản xuất bằng cách

bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ

kết dính, rỉ đường kích thích sâu ăn tăng hiệu lực diệt sâu.

Bên cạnh đó đề tài khảo sát khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy lên tác nhân

diệt bệnh như Trichoderma sp. và diệt sâu hại như Paecilomyces sp. cũng được đề

cập. Qua đó khẳng định chế phẩm diệt sâu có khả năng sử dụng đồng thời với hai chế

phẩm sinh học diệt trừ bệnh và sâu hại cho cây khi sử dụng đồng thời hai loại chế

phẩm sinh học này cùng với chế phẩm diệt sâu tơ Plulella xylostella hay không.

Tính an toàn sinh học cũng được chú trọng và được khảo sát qua thí nghiệm thử

độc tính trên cây cải ngọt Brassica integrifolia, ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh

đại diện là cá bảy màu Poecilia reticulate cũng được quan tâm đến trong bài nghiên

cứu này.

2.5.2 Bố trí thí nghiệm

Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ

35

Đồ án tốt nghiệp

Giống vi khuẩn S.marcescens

Tăng sinh 48 giờ, lắc 150

vòng /phút

Xử lý acid HCl pH 2, 4giờ

Trung hòa NaOH về pH 7

Khảo sát hoạt tính Kháng nấm Enzyme

Chuẩn bị dịch

Thử nghiệm khả năng diệt sâu

Thử độc tính

Khảo sát độc tính trên Khảo sát độc tính trên cây Khảo sát độc tính trên cá

ấu trùng A.nauplii cải ngọt B.integrifolia bảy màu P.reticulata

Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm.

2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm

2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm

Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu tơ phát triển

25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%.

Sâu tơ Plutella xylostella được thu mẫu từ vườn cải ngọt tại huyện hóc môn,

Tp.HCM, sâu tơ ngoài đồng mang về nuôi được tính là sâu thế hệ P.

36

Đồ án tốt nghiệp

Thế hệ P được nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi hóa

nhộng.

Khi sâu vào giai đoạn hóa nhộng, lót khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng

lá cải ngọt cho tới khi 4 - 7 ngày hóa nhộng trong hộp.

Sau khi vũ hóa, ngài thuộc thế hệ P được ghép cặp với nhau trong các hộp

nhựa được lót lá cải ngọt và cung cấp thức ăn dưới dạng lỏng là nước đường pha loãng

(tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày.

Thu lá cải ngọt khoảng 2 ngày 1 lần để thu trứng từ thế hệ P đã được ghép cặp.

Tiếp tục cho lá cải ngọt mới vào hộp để tạo diều kiện cho ngài đẻ trứng.

Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non được nuôi với thức ăn là lá cải

ngọt.

Nhân nuôi sâu tơ Plutella xylostella cho đến khi đủ số lượng để tiến hành thí

nghiệm.

2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trường

peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ

phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ.

Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lí với acid

HCl 1N. Với mục đích đưa môi trường về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng

pipetman hút 450 𝜇𝑙 dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên men. Lắc

150 vòng / phút, ủ trong tối trong 4 giờ. Sau đó, đưa môi trường về pH = 7 với 450

𝜇𝑙 dung dịch NaOH 1N. (Lê Thị Ngọc Dung, 2016 Tạo chế phẩm diệt sâu khoang

Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia mascescens SH1, Đồ án tốt

nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM)

2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme

Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trong

môi trường PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ.

Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí:

37

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường PG broth vô trùng, dùng pipetman

hút 450 𝜇𝑙 HCl 1N cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 4 giờ.

Tiến hành thêm 450 𝜇𝑙 NaOH 1N để đưa dịch nuôi cấy về pH = 7.

Hút 20 𝜇l Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã được xử lý acid.

Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 𝜇l Tween 80 cho vào lần lượt các dịch pha

loãng với thể tích 10 ml.

Thử nghiệm hoạt tính protease

Pha môi trường casein agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến

khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường,

đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).

Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 𝜇𝑙 dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn thử

nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đường kính vòng phân giải.

Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh

10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ

pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 𝜇𝑙 ở các nồng độ pha loãng cho

vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính casein, như hình 2.3

ĐC

Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.

Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein

38

Đồ án tốt nghiệp

Đọc kết quả:

Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trường:

Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh

giếng thạch.

Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng trong suốt

xung quanh giếng thạch.

Khả năng phân giải casein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng

lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn.

Trong đó :

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính giếng thạch (mm)

Thử nghiệm hoạt tính enzyme Lipase

Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi

trường nguội đến khoảng 650C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa

agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).

Đối chứng dương: Hút 20 𝜇𝑙 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào

giữa đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24

giờ. Đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường.

Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh

10 ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng

độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipet man hút 20 𝜇𝑙 ở các nồng độ pha loãng

cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.2

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

39

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit

Đọc kết quả:

Nếu dịch nuôi cấy có enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng

thạch.

Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung

quanh giếng thạch

Khả năng phân giải lipit được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng

lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn.

Trong đó :

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính giếng thạch (mm)

Thử nghiệm hoạt tính Chitinase

Pha môi trường thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để

môi trường nguội đến khoảng 65oC, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi

đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d).

Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử

nghiệm vào đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng

trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đường kính vòng phân giải trên bề mặt môi trường.

40

Đồ án tốt nghiệp

Các thử nghiệm: Canh trường vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10

ml, tiến hành pha loãng canh trường lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ

phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho

vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.4

ĐC

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin

Đọc kết quả:

Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trường:

Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh

giếng thạch.

Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong

suốt xung quanh giếng thạch.

Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng

lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn.

Trong đó :

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính giếng thạch (mm)

41

Đồ án tốt nghiệp

2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm

Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đục giếng thạch dựa vào khả

năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trường thạch.

Phương pháp này được thực hiện như sau:

Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Aspergillus flavus

CDP1, Fusarium sp.

Pha môi trường PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng

que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ môi trường thạch nghiêng sang môi

trường PDA có bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục

thạch có đường kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng

sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng.

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính

enzyme như mục 2.6.3.1.

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16,

32 và 64. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng.

Pha loãng dịch nuôi cấy đã xử lý acid thêm 20 𝜇𝑙 Tween 80 vô trùng vào 10 ml

dịch. Chuẩn bị 10 ml môi trường PG vô trùng thêm 20 𝜇𝑙 Tween 80 vào các môi

trường PG pha loãng vô trùng để đạt nồng độ Tween 80 0,02% ở dãy các nồng độ

pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64.

Đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng đã bổ sung Tween 80 0,02%.

Đối chứng dương : Chế phẩm Carbenzim hút 0,15 ml pha loãng với 100 ml

nước cất vô trùng.

Tiến hành kháng nấm:

Chuẩn bị môi trường PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 5mm. Vô trùng

cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đường kính 5mm có sinh khối nấm từ đĩa

PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA như hình 2.3

Hút 20 𝜇l dịch nuôi cấy đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào giếng

thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày.

42

Đồ án tốt nghiệp

Nấm

Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.

Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA

Đọc kết quả thí nghiệm:

Nếu xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ

bị ức chế và đường kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đường kính của nấm ở đĩa

đối chứng

Nếu không xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí

nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thường như nấm ở đĩa đối chứng.

Tỷ lệ ức chế được đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)

 Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy

𝐷−𝑋

 Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức:

𝐷

U = x100

Trong đó:

 U: % khuẩn lạc bị ức chế.

 D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng.

 X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc.

43

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó: đường kính khuẩn lạc bằng đường kính sau khi đo trừ đi đường kính

khối thạch

Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ

(Hassan, 1989):

 Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )

 Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)

 Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)

+ Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%)

2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá

Sâu thí nghiệm – sâu tơ Plutela xylostella

Sâu tơ đầu tuổi 3 được chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lượng cả 30 con rồi

cho vào hộp có thể tích 950ml. Các hộp nuôi sâu đã được thanh trùng. Lặp lại 24 hộp

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính

enzyme như mục 2.6.3.1.

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn

bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây

là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử

lý acid pha loãng với 18 ml PG vô trùng. Hút 9 ml dịch pha loãng ở các nồng độ rồi

tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Sau đó, hút 1 ml phụ gia có chứa Tween

80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào 9 ml dịch pha loãng còn lại.

Tiến hành thí nghiệm.

Phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012) phương pháp này mô phỏng

gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng

diệt sâu qua đường tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng SH4.

Lá cải ngọt được rửa sạch và để ráo nước, cắt với diện tích 15 × 10 (cm2). Hút

100 𝜇l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng

độ pha loãng lên lá cải ngọt. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lượng sâu

44

Đồ án tốt nghiệp

chết và trọng lượng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72

giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm được bố trí như hình 2.6

Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012).

Ở hộp đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá cải ngọt được trang đều

100 𝜇𝑙 PG vô trùng được bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450 𝜇𝑙 NaOH 1N. Hút 1ml phụ gia

chứa Tween 80 0,02%, rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào 9ml dịch trên.

Ở hộp đối chứng dương: tiến hành cho sâu tơ ăn lá cải ngọt được trang đều

100 𝜇𝑙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC (abamectin) đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5

ng/cm2.

Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Đọc kết quả kháng sâu:

Dựa vào số lượng sâu tơ P. xylostella chết ở từng mốc thời gian để đánh giá

hiệu quả diệt sâu của chế phẩm. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott (1925).

2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii

Ấu trùng thử nghiệm: Artemia nauplii.

45

Đồ án tốt nghiệp

Trứng bào xác Artemia nauplii được ấp nở bằng nước biển có độ mặn 30‰, pH

7,5 – 8,5. Tỷ lệ trứng là 0,5g – 1g/ lít nước biển. Quá trình ấp nở trứng để nơi thoáng

mát, có ánh sáng, nhiệt độ 26 – 300C sục khí liên tục. Trứng nở sau 20 - 35 giờ.

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính

enzyme như mục 2.6.3.1.

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn

bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây

là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử

lý acid pha loãng với 18 ml nước muối 30‰ vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2,

10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Sau đó, hút 2 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường

1%, dịch CMC 1% cho vào các dịch pha loãng trên.

Tiến hành thí nghiệm

Đếm chính xác 30 ấu trùng A.nauplii cho vào cốc nhựa đã kẻ vạch 20 ml đã

chuẩn bị.

Cho dịch pha loãng ở các nồng độ vào các cốc có chứa ấu trùng A.nauplii, tiếp

tục cho các dịch pha loãng theo dãy các nồng độ.

Cốc đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng có bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450

𝜇𝑙 NaOH 1N. Hút 2 ml dịch PG có bổ sung 450 𝜇𝑙 HCl 1N, 450 𝜇𝑙 NaOH 1N cho

vào 18 ml nước muối 30‰ vô trùng. Thêm 2 ml phụ gia vào dịch trên rồi cho vào

cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii.

Cốc đối chứng dương : hút 100 𝜇𝑙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã được pha

loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2 cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Định mức thể

tích ở cốc đối chứng dương sao cho đạt cốc đạt 20 ml.

Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với thể tích thực của cốc là 20 ml.

Đọc kết quả thử độc tính từ ấu trùng A.nauplii

Đếm số lượng ấu trùng A.nauplii sống sau 4 giờ. Tính LC50, LC90

46

Đồ án tốt nghiệp

2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia

Hạt cải ngọt - Brassica integrifolia

Hạt cải ngọt Brassica integrifolia thời vụ quanh năm, chu kì sinh trưởng từ 32

- 35 ngày sau khi gieo độ sạch ≥ 98%, độ nảy mầm ≥85%, độ ẩm ≤10%.

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính

enzyme như mục 2.6.3.1.

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn

bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây

là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 4 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử

4, 10-5 và 10-6. Hút 4 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC

lý acid pha loãng với 36 ml nước cất vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-

1% vào các dịch pha loãng.

Đối chứng âm : Chuẩn bị 40 ml PG vô trùng hút 900 𝜇𝑙 HCl 1N và 900 𝜇𝑙

NaOH 1N. Hút bỏ 4 ml PG dịch trên rồi thêm 4 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % ,

rỉ đường 1%, dịch CMC 1%.

Đối chứng dương: Hút 0,75 m𝑙 Reagants 3.6EC pha loãng vào 100ml nước cất

vô trùng.

Tiến hành thí nghiệm

Đếm chính xác 40 hạt cải ngọt thương phẩm cho vào ống nghiệm. Hút 1 ml dịch

pha các nồng độ thí nghiệm ngâm hạt cải trong 2 giờ, pha nước ấm với tỉ lệ nước 3

sôi : 2 lạnh ở 20 – 350C.

Cân 1 kg đất trồng cho vào các hộp nhựa diện tích 15 x 21cm. Dùng thun chia

hộp thành 3 lô với diện tích mỗi lô là 7 x 15 cm với mỗi lô gieo 40 hạt cải ngọt.

Dùng giấy thấm khô hạt và gieo hạt đã ngâm vào các hộp đất đã chuẩn bị.

Dùng bình xịt phun 1ml các nồng độ thí nghiệm khi cây ra lá sau 3 ngày ngâm.

Phun chế phẩm định kì sau 3, 6, 9 ngày theo dõi. Chỉ phun 1 lần trong các ngày theo

dõi.

47

Đồ án tốt nghiệp

Quan sát cây, tưới nước 2 ngày một lần vào buổi sáng sớm và lúc chiều tối cho

các nghiệm thức.

Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần.

Đọc kết quả thí nghiệm:

Đếm số lượng hạt nảy mầm sau khi gieo. Tỉ lệ nảy mầm được tính theo công

thức

( ) × 100 Tổng số hạt nảy mầm sau khi gieo Tổng số hạt ban đầu trước khi gieo

Đọc kết quả thử độc tính ở cải ngọt sau 3 ngày phun. Tỉ lệ chết của cây được

tính theo công thức Abbott (1925), theo dõi biểu hiện của cây sau khi phun chế phẩm.

Nếu cây có biểu hiện ngộ độc như cháy, vàng lá, héo, chết cây… thì ước lượng

độ độc theo thang đánh giá như sau:

Phân cấp mức độ độc của thuốc khảo nghiệm đối với cây trồng

Cấp Triệu chứng nhiễm độc.

Cây chưa có biểu hiện ngộ độc. 1

Ngộ độc nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 2

Có triệu chứng ngộ độc nhẹ nhìn thấy bằng mắt. 3

Triệu chứng ngộ độc như (mất diệp lục) nhưng chưa ảnh hưởng 4

đến năng suất.

Cành lá biến màu hoặc cháy, thuốc gây ảnh hưởng đến năng suất. 5

Thuốc làm giảm năng suất ít. 6

Thuốc gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất. 7

Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây. 8

Cây bị chết hoàn toàn. 9

QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT

2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu

Cá bảy màu - Poecilia reticulate

48

Đồ án tốt nghiệp

Tuyển chọn cá mái, chiều dài 2,0 ± 1,0 cm, bơi nhanh linh hoạt, không bị dị tật

ở vây, đuôi… Chọn cá hoàn toàn khỏe mạnh sạch bệnh.

Pha môi trường nước nuôi cá thử nghiệm theo tiêu chuẩn (ISO 6341 – 1982).

Nước có độ cứng với tổng nồng độ ion Ca và Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca :

Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l (Fish, Acute Toxicity

Test, 1992).

Thiết lập hệ thông bán tĩnh thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước. Tỉ lệ nước

và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày.

Cá được nuôi trong môi trường nước thử nghiệm trong 7 ngày để cá thích nghi,

nhiệt độ duy trì ở 21 - 250C, lượng oxi hòa tan ≥ 60%.

Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng

lượng cá thí nghiệm

Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens

Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính

enzyme như mục 2.6.3.1.

Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn

bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây

là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3,

10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử

lý acid pha loãng với 9 ml PG vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.

Hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các

dịch pha loãng.

Ở các nồng độ thí nghiệm pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 hút 1,7 ml mẫu

cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng

thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy

mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ.

Đối chứng âm : Chuẩn bị 20 ml PG vô trùng hút 450 𝜇𝑙 HCl 1N và 450 𝜇𝑙

NaOH 1N. Hút 9 ml PG rồi thêm 1 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%,

dịch CMC 1%. Hút 1,7 ml đối chứng âm cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3

49

Đồ án tốt nghiệp

ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp

tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ.

Tiến hành thí nghiệm

Thiết lập hệ thống thử nghiệm bán tĩnh, thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng

nước thí nghiệm cá. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12

giờ/ngày.

Đếm chính xác 10 con cá bảy màu mái, tuyển chọn cá không dị tật ở vây, đuôi,

mang… Cá có chiều dài 2,0 ± 1,0 cm cho vào các hộp chứa nước thử nghiệm chuẩn

bị sẳn.

Sục khí liên tục tạo lượng oxi hòa tan trong nước ≥ 60%. Nhiệt độ thích hợp thử

nghiệm cho cá trong khoảng 21 - 250C

Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng

lượng cá thí nghiệm.

Theo dõi cá thí nghiệm theo các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ.

Mỗi nghiệm thức lập lại 2 lần.

Đọc kết quả thí nghiệm :

Đọc kết quả thử nghiệm độc tính của chế phẩm trên cá sau 5 ngày theo dõi. Tỉ

lệ chết của cá thử nghiệm được tính theo công thức Abbott (1925).

Theo dõi biểu hiện của cá sau khi ăn thức ăn có chế phẩm theo dãy nồng độ thí

nghiệm. Quan sát tất cả biểu hiện trên cơ thể cá, dị tật, hành vi bơi.

50

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Ngoài prodigiosin là tác nhân gây chết côn trùng thì enzyme Serralysin

metalloprotease cũng được coi là yếu tố độc lực của S. marcescens trên sâu vì vậy

dịch nuôi cấy phải thể hiện hoạt tính này.

Thử nghiệm hoạt tính protease

Sau quá trình ủ, khả năng phân giải casein của vi sinh vật bằng trichloroacetic

acid (TCA). Casein sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục do

enzyme protease có mặt trong canh trường lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải

casein trong môi trường nên TCA tạo phức với casein.Vùng có sự phân giải casein sẽ

trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa casein với TCA 10%

Kết quả khi tiến hành trên môi trường casein thì tất cả các nồng độ đều có

khả năng phân giải casein. Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA 10% –

casein trắng đục dễ dàng nhận thấy.

Thử nghiệm hoạt tính Chitinase

Tiến hành thí nghiệm trên môi trường huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy

khi hạ pH môi trường về pH 2 để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hưởng đến enzyme

chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin

trong môi trường.

Thử nghiệm hoạt tính lipase

Enzyme lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo

ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi

trường đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi

trường tạo ra các acid béo, các acid béo được giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium

trong môi trường. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trường xung quanh

điểm cấy. Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase không có thấy sự hiện

diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm.

51

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid.

Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi trường tương ứng Stt Hệ số pha loãng Tween 80 agar Chitin agar

1 21 Casein agar 12 ± 0,1b 0 0

2 22 11,3 ± 0,1b 0 0

3 23 11,3 ± 0,6b 0 0

4 24 10 ± 0,1bc 0 0

5 0 0

6 25 26 10,0 ± 0,2bc 7,3 ± 0,6c 0 0

Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm:

lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH môi trường từ

trung tính (pH 7) về acid pH 2 không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

protease. Enzyme chitinase và lipase của vi khuẩn bị bất hoạt. Tóm lại, enzyme ngoại

bào là protease đã giữ được hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N.

3.2 Hoạt tính kháng nấm

Nấm Aspergillus flavus CDP1 và nấm Fusarium sp được xem là loài nấm gây

bệnh, sinh ra độc tố gây hại cho cây trồng. Vì vậy thử nghiệm khảo sát khả năng

kháng nấm bệnh để đánh giá khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử

lý acid.

Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1

Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1

Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%)

21 30,0 ± 2,6 17,1 ± 2,8bc

22 29,6 ± 4,1 10,8 ± 4,8cd

23 28,0 ± 1,0 19,0 ± 1,6bc

24 19,0 ± 10,0bc 28,0 ± 3,6

25 27,3 ± 2,5 24,4 ± 3,6b

52

Đồ án tốt nghiệp

28,6 ± 1,5 26 18,4 ± 4,3bc

31,0 ± 4,0 Đối chứng 0

0 Carbenzim 100a

Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp.

Khả năng kháng nấm Fusarium sp.

Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%)

25 ± 0,2 21 26,6 ± 3,3bc

25,6 ± 1,5 22 25,1 ± 2,0bc

29,0 ± 2,6 23 19,0 ± 5,9c

25,6 ± 6,6 24 29,8 ± 2,7b

28,3 ± 1,1 25 19,7 ± 3,1c

26,6 ± 0,6 26 24,1 ± 1,5bc

32,6 ± 2,5 Đối chứng 0

0 Carbenzim 100a

Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ

(Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm

Aspergillus flavus CDP1 cao nhất ở hệ số pha loãng 25 là 24,4 ± 3,6b (%) ≤ 50 (%) ở

cấp độ 1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Fusarium sp. 29,8 ± 2,7b (%)

≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng.

Ở thí nghiệm kháng nấm Trichoderma sp. cho thấy enzyme protease vốn có của

vi khuẩn trong dịch nuôi cấy đã xử lí, vẫn còn khả năng ức chế việc phát tiển của tơ

nấm Trichoderma sp. nhưng không cao. Điều này chứng tỏ chế phẩm từ dịch nuôi

cấy vi khuẩn S. marcescens có thể được sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học

từ nấm Trichoderma sp., nấm có lợi trong việc hổ trợ sự phát triển của cây trồng và

tăng khả năng diệt trừ các loại côn trùng gây hại, cạnh tranh với các loại nấm gây hại

cây trồng. Tuy nhiên chế phẩm này có thể ức chế nấm Pacelopmyces sp. ở nồng độ

pha loãng 24 với tỷ lệ kháng là 34,8 ± 11,5 %.

53

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp.

Khả năng kháng nấm Trichoderma sp.

Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%)

9,5 ± 0,7bc 69,6 ± 0,5b 21

4,3 ± 4,6bc 73,6 ± 3,5b 22

4,3 ± 3,9bc 73,6 ± 3,0b 23

62,6 ± 10,6a 24 18,6 ± 13,8b

8,6 ± 0,7bc 70,3 ± 0,5ab 25

11,2 ± 3,2bc 68,3 ± 2,5ab 26

0 73,6 ± 3,0b Đối chứng

100 0 Carbenzim

Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp.

Khả năng kháng nấm Paecilomyces sp.

Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%)

13,0 ± 4,3cd 20,0 ± 1,0 21

11,6 ± 2,5cd 20,3 ± 0,5 22

33,3± 14,0bc 15,3 ± 3,2 23

15,0 ± 2,6 24 34,8 ±11,5b

28,3 ± 7,8bc 16,0 ± 2,6 25

17,4 ± 19,2bcd 20,3 ± 2,5 26

0 23,0 ± 0,4 Đối chứng

100a 0 Carbenzim

Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. cao nhất ở hệ số

pha loãng 24 là 34,8 ± 11,5 (%), với đường kính vòng nấm 15,0 ± 2,6 (mm)

Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ

(Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm

54

Đồ án tốt nghiệp

Trichoderma sp. cao nhất ở hệ số pha loãng 24 là 18,6 ± 13,8 (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ

1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Paecilomyces sp. dịch nuôi cấy sau

xử lý acid kháng nấm ở hệ số pha loãng 24 là 34,8 ± 11,8 ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 là không

kháng.

3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm

Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu được thực hiện bằng phương pháp quét lá với các

nồng độ theo hệ số pha loãng để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất.

Tiến hành thử nghiệm với 1 đối chứng dương là thuốc trừ sâu sinh học Reasgant

3.6EC và 1 đối chứng âm là môi trường PG broth vô trùng có bổ sung Tween 80

0,02%, rỉ đường 1 % và CMC 1 % , cùng 6 nghiệm thức chế phẩm ở nồng độ pha

loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 , theo dõi số lượng sâu chết mỗi 24 tiếng

trong vòng 6 ngày.

Ngoài hoạt chất diệt sâu là prodigiosin thì chế phẩm được bổng sung phụ gia

trong đó có rỉ đường, CMC và Tween 80 giúp nâng cao khả năng kháng sâu tơ. Bổ

sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát

prodigiosin. Bên cạnh đó, rỉ đường kích thích khẩu vị của sâu giúp sâu ăn ngon miệng

nên sâu ăn nhiều hấp thu lượng prodigiosin lớn trên bề mặt lá. Đồng thời rỉ đường

còn là chất che giúp bảo vệ prodigiosin dưới tác dộng của ánh sáng, đây là một trong

những nguyên nhân hàng đầu dễ gây biến tính prodigion ngoài tự nhiên. Khi sâu tơ

tiêu hóa chế phẩm, lượng Tween 80 bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin

khuếch tán tốt vào cơ thể sâu, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào như protease,

lipase giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn.

55

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3.

Tỉ lệ chết (%)

Nồng độ pha loãng 0h 24h 48h 72h 96h 120h

Đối chứng âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

10-1 0,0 18,9 51,1 61,8 69,3 83,7

10-2 0,0 22.2 60,0 60,0 84,1 91,9

10-3 0,0 26,7 52,2 73,0 85,2 95,3

0,0 10-4 48,9 70,0 86,5 100,0 100,0

10-5 0,0 27,8 55,6 73,0 85,2 91,9

10-6 0,0 55,6 73,3 78,7 86,4 91,9

Reagant 3.6 EC 0,0 43,3 78,9 88,8 100,0 100,0

KHẢ NĂNG DIỆT SÂU CỦA CHẾ PHẨM

120,0

100,0

)

%

80,0

(

60,0

Reagants 3.6 EC 7,5 ng/cm2

2607,89 ng/cm2

1491,34 ng/cm2

40,0

149,13 ng/cm2

T Ế H C Ệ L Ỉ T

14,91 ng/cm2

1,49 ng/cm2

20,0

0,15 ng/cm2

Đối chứng âm 0 ng/cm2

0,0

2 4

4 8

7 2

9 6

1 2 0

0

THỜI GIAN (GIỜ)

Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925).

56

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả cho thấy, hệ số pha loãng 10-4 có nồng độ prodigiosin 14.91 ng/cm2 cho

kết quả kháng sâu là tốt nhất, kết quả này tương tự như kết quả của Lê Thị Ngọc Dung

(2016). Tương đương với khả năng diệt sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant.

Trong 24 giờ đầu, so với thuốc trừ sâu Reasgant chỉ đạt 43,3%, tỉ lệ chết của sâu tơ

đạt giá trị 48,9% ở nồng độ pha loãng 10-4, cao gấp 1,13 lần đối chứng Reasgant.

Song hiệu lực cao nhất trong 24 giờ đầu lại là nồng độ pha loãng 10-6 cao gấp 1,28

lần đối chứng Reasgant. Xuyên suốt quá trình theo dõi tỉ lệ chết của sâu tơ theo thời

gian thì nồng độ pha loãng 10-4 đã chứng tỏ hiệu lực diệt sâu cao tương đương đối

chứng dương (Reasgant).

Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100% cho kết quả tương đương với đối chứng

Reasgant 3.6EC. Điều đó cũng khẳng định rằng nồng độ pha loãng 10-4 thích hợp cho

việc chọn làm nó làm thông số kĩ thuật khi sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học

từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4

3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii

Thử nghiệm khảo sát khả năng ảnh hưởng của chế phẩm khi sử dụng có ảnh

hưởng đến các sinh vật phiêu sinh đại diện là ấu trùng Artemia nauplli hay không ?

Chúng được biết đến là nguồn thức ăn của các sinh vật khác trong nước, đóng vai trò

khá quan trọng trong chuỗi thức ăn của hệ sinh thái tự nhiên. Vì vậy cần đánh giá

mức độ an toàn để hệ sinh thái trong nước nói riêng cũng như môi trường nói chung

là cần thiết.

57

Đồ án tốt nghiệp

100

90

80

)

70

%

60

50

a

40

b

( t ế h c ệ l ỉ

T

30

d

cd

20

10

0 -3,6074

-2,6074

-1,6074

-0,6074

0,3926

1,3926

log nồng độ prodigiosin (mg/ml)

c cd

Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin

(mg/ml).

Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm có độc tính khá cao ở nồng độ đậm

đặc tuy nhiên nồng độ thích hợp diệt sâu ở độ pha loãng 10-4 cho tỉ lệ ấu trùng chết

khá thấp so với đối chứng dương là Reagants 3.6EC và nồng độ pha loãng 10-1 lần

lượt là 100a và 93,3a ± 8,8.

Liều gây chết 50% số ấu trùng A. nauplli của chế phẩm IC50 = 0,2587 ± 0,1065

(mg/L).

3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia

Hạt nảy mầm sau khi ngâm ngập trong chế phẩm 2 giờ với khoảng nhiệt 20 –

350C không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, trong khi đó chế phẩm Reasgant với

nồng độ khuyến cáo lại ảnh hưởng đến tỉ lệ nảy mầm.

58

Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt Brassica integrifolia sau khi ngâm chế phẩm

Đồ án tốt nghiệp

100

a

a a a a a a aa

)

90

%

80

(

70

60

50

40

b

m ầ m y ả n ệ l ỉ

T

30

20

10

0

Reagants 3.6EC

2607,89 ng/cm2

1491,34 ng/cm2

149,13 ng/cm2

14,91 ng/cm2

1,49 ng/cm2

0,15 ng/cm2

Đối chứng nước

Đối chứng âm

Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm

Tỉ lệ nảy mầm của hạt cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm ở các nồng độ thử

nghiệm được xử lý thống kê là không khác nhau ở các nồng độ, tương đương với đối

chứng nước. Nồng độ cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao nhất là nồng độ pha loãng 10-5 là

94,16a ± 1,44 tương đương với nước 95,00a ± 2,00. Tỉ lệ nẩy mầm ở các nồng độ cao

hơn so với đối chứng Reagants 3.6EC

59

80

Đồ án tốt nghiệp

TỈ LỆ CHẾT CỦA CÂY SAU KHI PHUN CHẾ PHẨM

Reagants 3.6 EC 7,5 ng/cm2

2607,89 ng/cm2

70

1491,34 ng/cm2

149,13 ng/cm2

60

)

14,91 ng/cm2

%

(

50

1,49 ng/cm2

0,15 ng/cm2

40

Đối chứng âm 0ng/cm2

30

T Ế H C Ệ L Ỉ T

20

10

0

0 N G À Y

3 N G À Y

6 N G À Y

9 N G À Y

THỜI GIAN (NGÀY)

Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm

Tuy nhiên nồng độ pha loãng 10-4 cho kết quả diệt sâu cao nhất, diệt 100% số

sâu thí nghiệm trong 3 ngày tương đương với đối chứng Reagants 3.6EC nên khả

năng ưu tiên cho việc chọn nồng độ này làm nồng độ diệt sâu tối ưu cho chế phẩm là

hợp lý nhất.

Vì vậy nếu chọn nồng độ này làm nồng độ tối ưu cho chế phẩm thì có thể ngâm

hạt trong chế phẩm để kích thích hạt nảy mầm nhưng tỉ lệ nảy mầm hạt không cao

chỉ đạt 86,66a ± 2,69. Xong về mặt thống kê thì giữa các nồng độ và đối chứng nước

là như nhau.

Tỉ lệ chết của cây được theo dõi sau 3 lần phun với chế độ chỉ phun 1 lần trong

ngày theo chu kì cách 3 ngày phun 1 lần. Tỉ lệ chết của cây được tính theo công thức

Abbott (1925).

Các nghiệm thức ở các nồng độ theo dõi theo hầu hết cho tỉ lệ chết ở cây không

quá 10% số cây non. Thấp nhất là nồng độ pha loãng 10-6 với tỉ lệ chết 4,16 ± 3,81.

60

Đồ án tốt nghiệp

Cao nhất là nồng độ pha loãng 10 lần với tỉ lệ chết ở cây non là 10,83 ± 3,81 sau

khoảng thời gian 3 ngày phun chế phẩm.

Độ độc của chế phẩm được đánh giá như bản theo QCVN 01 – 143 :

2013/BNNVPTNT như bảng 3.6

Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm.

Nồng độ pha loãng thử nghiệm Số lô thử

nghiệm ĐC âm 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Reasgant

1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7

2 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7

3 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 7

Theo dõi thí nghiệm sau 9 ngày, ở nồng độ pha loãng 10-5 với nồng độ

prodigiosin 1,49 ng/cm2 có tỉ lệ cây chết cao nhất trong các nồng độ thí nghiệm 11,40

± 5,48 và thấp nhất ở nồng độ pha loãng 10-2 với nồng độ prodigiosin 149,13 ng/cm2

với tỉ lệ chết thất nhất 7,02 ± 3,03. Dựa trên thang đánh giá độ độc thì chế phẩm ở

cáp độ 1 và Reasgant 3.6EC ở cấp độ 7 theo QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT.

Kết quả khảo sát độc tính của chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi

cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 trên cây cải ngọt B.integrifolia nồng độ pha loãng

10-4 cho kết quả triển vọng sẽ được chọn làm hệ số pha loãng trong sản xuất trong

tương lai.

3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata

Cá bảy màu - Poecilia reticulata, thuộc họ Cá khổng tước Poeciliidae. Đây là

giống cá dễ nuôi, sinh trưởng mạnh, sinh sản nhanh, đa dạng và phong phú. Cá bảy

màu còn được biết đến là loài cá được ứng dụng trong các công trình nghiên cứu, thử

độc tính chế phẩm thuốc trừ sâu…

Sau ngày thứ 3 theo dõi, xuất hiện cá chết ở nồng độ 10-3 và 10-4 tương ứng

với nồng độ prodigiosin 149,13 ng/cm2 và 14,9 ng/cm2 ở thí nghiệm diệt sâu tơ. Tỉ lệ

cá chết là 10 % trên tổng số cá ở cả hai nồng độ trên.

Thử nghiệm độc tính bằng phương pháp phối trộn chế phẩm thuốc trừ sâu sinh

học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 vào thức ăn nuôi cá bảy màu P.

61

Đồ án tốt nghiệp

reticulata, sau 5 ngày quan sát, biểu hiện ở cá bình thường, hành vi bơi và khả năng

linh hoạt không thay đổi. Cá không xuất hiện dị tật, các bệnh khác trên cơ thể…

Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm.

Nồng độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Đối chứng PG 0h 0 0 0 0 0 0 Tỉ lệ chết (%) 48h 0 0 0 0 0 0 72h 0 0 5,5 5,5 0 0 24h 0 0 0 0 0 0 96h 0 0 5,5 5,5 0 0 120h 0 0 5,5 5,5 0 0

Cá bảy màu sau thử nghiệm cho ăn thức ăn có phối trộn chế phẩm ở các nồng

độ thử nghiệm. chỉ có 2 trường hợp chết ở hai nồng độ 10-3 và 10-4 trên tổng số 10

con trong mỗi trường hợp. Hai nồng dộ gây cá chết trùng với nồng độ hiệu lực diệt

sâu lớn nhất tuy nhiên tỉ lệ chết là không đáng kể.

Như vậy, dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens sau xử lý acid với pH 2 sau 4

giờ có hiệu lực diệt sâu cao nhưng không ảnh hưởng đến các tác nhân sinh học diệt

nấm, không tác động tiêu cực đến cây, sự nảy mầm của hạt hay trạng thái cây trồng.

So với abamectin thì chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens ít ảnh

hưởng lên nảy mầm hạt giống và cây con hơn. Thí nghiệm trên A. nauplii cho thấy

avermectin B1 và B2 (các chất tương tự abamectin) có IC100 rất nhỏ, 155-277 ng/mL

tương ứng; trong khi trong thí nghiệm của đề tài, IC50 là 0,2587 ± 0,1065 mg/L Chế

phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 còn thể hiện độc tính yếu trên cá

bảy màu khi cho ăn, cụ thể là tỉ lệ chết rất nhỏ sau 3 ngày, trong khi đó abamectin

được báo cáo là rất độc trên cá.

Ngoài ra chế phẩm từ dịch nuôi cấy S. marcescens SH4 chứa hoạt chất chủ

yếu là prodigiosin - một hợp chất kị nước nên khó có thể gây ô nhiễm muôi trường

nước.

62

Đồ án tốt nghiệp

Bước đầu hoàn thiện sơ đồ quy trình công nghệ để sản xuất chế phẩm thuốc

trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 được thiết lập như sơ

đồ như hình 3.5.

Vi khuẩn Serrastia marcescens

Nuôi cấy trong PG, lắc 150 vòng/phút ở 250C, 48 giờ

Xử lý acid HCl pH 2,4 giờ

Trung hòa về HCl pH 7

Điều chỉnh về OD 499 vào khoảng 0,924

10 ml pha loãng 100 lần với PG tiệt trùng

Phối trộn và tiệt trùng phụ gia (Tween 80, rỉ đường, dịch CMC)

Chế phẩm Phối trộn

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4

250C, 150 vòng/phút để tạo độ khuếch tán oxi tốt cho vi khuẩn phát triển sinh tổng hợp

prodigiosin trong 48 giờ. Tiến hành xử lý acid đưa về pH 2 để diệt tế bào hoàn toàn vì lý do

an toàn sinh học.

Điều chỉnh dịch nuôi cấy sau xử lý acid ở OD 499 vào khoảng 0,924, tiến hành pha

loãng 10 lần rồi phối trộn với phụ gia.

Vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 được nuôi cấy trong môi trường PG ở nhiệt độ

63

Chế phẩm thu được có khối lượng là 1500g khi sử dụng cần pha loãng 100 lần để

nồng độ prodigiosin đạt hiệu lực diệt sâu cực đại (14,9 ng/cm2) và tỉ lệ các thành phần

Đồ án tốt nghiệp

Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%.

64

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1.Kết luận

Dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens đã xử lí acid vẫn thể hiện hoạt tính

protease, một trong những yếu tố độc lực của vi khuẩn S. marcescens.

Dịch nuôi cấy từ vi khuẩn đã xử lý acid đều không có khả năng kháng tất cả các

chủng nấm khảo sát: dịch có khả năng kháng cao nhất là 34,8 % đối với nấm

Pacelopmyces sp., thấp nhất là 18,6 % đối với Trichoderma sp., chứng tỏ có thể sử

dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 có thể được sử dụng đồng thời cùng

chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp. và Pacelopmyces sp.

Hiệu quả diệt sâu của dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 xử lý acid có

bổ sung phụ gia rỉ đường 0,02 % Tween 80 0,004 %và CMC 0,02 % và chế phẩm

sinh học diệt sâu tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104 dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 có

nồng độ prodigiosin 14,9 ng/cm2 . Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100 % cho kết quả

tương đương với đối chứng Reasgant 3.6EC.

Kết quả thử nghiệm trên A. nauplii cho thấy tỉ lệ chết cao nhất ở nồng độ đậm

đặc pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 tuy nhiên nồng độ thích hợp diệt

sâu ở độ pha loãng 10-4 cho tỉ lệ ấu trùng chết khá thấp so với đối chứng dương là

Reagants 3.6EC

Khi xử lý hạt giống bằng chế phẩm từ dịch vi khuẩn đã qua xử lý cho thấy không

ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt giống và ảnh hưởng đến sự phát triển của

cây. Các nghiệm thức ở các nồng độ theo dõi theo hầu hết cho tỉ lệ chết ở cây non,

cao nhất là (10,83 ± 3,81) % ở nồng độ pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 =

0,924 sau 3 ngày phun chế phẩm.

Kết quả thử nghiệm cá cho thấy Khảo sát độc tính trên cá cho tỉ lệ chết không

cao ở hệ số pha loãng 10-4 và 10-3 với tỉ lệ chết ko quá 10% trên số cá thí nghiệm.

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp không tan nên khó có khả năng gây ô nghiễm môi

trường.

65

Đồ án tốt nghiệp

2. Kiến nghị

- Khảo sát độc tính trên chuột thí nghiệm, thiên địch của sâu như: ong kí sinh,

bọ rùa…

- Khảo sát thời gian và hiệu lực bảo quản của chế phẩm để bảo quản chế phẩm

lâu dài.

- Thay đổi thành phần phụ gia nâng cao hoạt tính của chế phẩm.

- Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu: sâu xám, sâu xanh, sâu

cuốn lá…

- Mở rộng thí nghiệm trên qui mô lớn, thí nghiệm trên đồng ruộng.

66

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Lê Thị Ngọc Dung (2016) Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ

dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1, đồ án tốt nghiệp, trường Đại học

Công nghệ TP.HCM.

Nguyễn Hoài Hương, Nguyễn Hoàng Anh Kha(2015) Khả năng diệt sâu khoang

Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và

hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18.

Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng

hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trường Đại học

Công nghệ TP. HCM.

Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội:

Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

Tài liệu nước ngoài

Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and

production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC

Microbiology 2004, 4:11.

Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006),

Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of

Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. (2000). High

production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol, Biotechnol Lett, 22:

1761-1765.

Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006.

Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial

Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49-61.

Giri, A. V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G. and Pennathur, G. (2004).

A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin

from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology 4: 1- 10.

67

Đồ án tốt nghiệp

Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K.1982a. Biochemical characterization

of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia

grimesiisp. nov.Current Microbiology 7:69–74.

Grimont, P.A.D., Grimont, F., Lysenko, O. 1979b. Species and biotype

identification of Serratiastrainsassociated with insects.Current Microbiology 2:139–

Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G.,

Brenner, D.J. 1978a. Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and

other Serratia specieswith a description of Serratia odorifera sp.

142.

Hejazi, A. and Falkiner, F. R. (1997). Serratia marcescens. Journal of

Medical Microbiology 46, 903-912.

Hubbard, R. and Rimington, C. (1950). The biosynthesis of prodigiosin, the,

tripyrrylmethene pigment from Bacillus prodigiosus (Serratia marcescens).

Biochemical Journal 46: 220-225.

Helvia W. Casullo de Araújo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki

(2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using

RenewableResources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940.

Hyung Wook Jeong, Hye Yeon Mun, Hyung Keun Oh, Seung Bum Kim,

Kwang Yeol Yang, Iksoo Kim, and Hyang Burm Lee, Evalutation Evaluation of

Insecticidal Activity of a Bacterial Strain, Serratia sp. EML-SE1 against

Diamondback Moth, 2010, Vol. 48, No. 4, pp. 541-545

Jatala, P.1986. Biological control of plant parasitic nematodes. -

Ann.Rev.Phytopath. 24: 453-489.

Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia

marcescens strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF

Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin,

pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13.

ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012.

68

Đồ án tốt nghiệp

Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashi Hara, Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa

Sekimizu (2014), Identification of a Serratia marcescens virulence factor that

promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, Journal of

Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD

dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin

University of Science and Technology, Kerala, India.

Invertebrate Pathology 117 (2014) 61–67.

Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of

Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid

Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol.

Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine sources,

Appl Microbiol, 12: 13-17.

7 (2), pp. 32-38.

Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced by

Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal of Duhok

University12: 268-274.

OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS, Fish Acute Toxicity

Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis after

Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl.

Microbiol, 23: 704-709.

Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia

marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268-

274.

Test 203, 1992.

SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in

Mycology, 1 –199.

Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia

marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of

Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88.

69

Đồ án tốt nghiệp

Zong Qi Liang , Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005).Studies on

the genus Paecilomyces in China.

70

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG

Môi trường Peptone glycerone agar

Peptone 5,00 gram/lít

Glycerone 10,00 ml/lít

Agar 18,00 gram/lít

Môi trường Peptone glycerone broth

Peptone 5,00 gram/lít

Glycerone 10,00 ml/lít

Môi trường Potato dextro agar

Khoai tây 200,00 gram/lít

Glucose 20,00 ml/lít

Agar 20,00 gram/lít

Môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase (gram/lit)

Glucose 1,00

Yeast extract 3,6

Tween 80 30,00 ml

5,00 NH4Cl

0,10 K2HPO4

0,01 MgCl2

0.444 CaCl2

pH cuối ở 250C là 7,0 ± 0,2

Thành phần môi trường casein (gram/lít)

10,00 Casein

15,00 Agar

Thành phần môi trường thạch huyền phù chitin

100ml Dịch huyền phù chitin 1%

1,50g Agar

Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phương pháp của Dai et al., (2011)

71

Đồ án tốt nghiệp

Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt

tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin.

Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở 40C qua

đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua

đêm.

Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc hoặc ly tâm (4000 vòng/phút trong

20 phút). Huyền phù này được được rửa với nước cất nhiều lần cho đến khi pH trung

tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền

phù.

Thức ăn cho cá được sản xuất tại công ty Cao Quý 2 số 122/5A ấp 5 xã Xuân

Thới Thượng, Hóc Môn.

Thành phần dinh dưỡng Phần trăm (%)

Protein 38

Chất béo 5

Chất tro 10

Chất xơ 4

Thành phần khác 43

Thành phần môi trường nước trong 1 lít nước nuôi cá thử nghiệm độc tính:

CaCl2.2H20

Dung dịch stock Caxi (gram/lít)

11,76 g

Nước cất 1 lít

Dung dịch stock Magie (gram/lít)

MgSO4.7H20 4,93 g

Nước cất 1 lít

NaHCO3

Dung dịch stock Natri (gram/lít)

2,59 g

72

Đồ án tốt nghiệp

Nước cất 1 lít

KCl

Dung dịch stock Kali (gram/lít)

0,23 g

Nước cất 1 lít

Với mối dung dịch stock muối tan, hút 25 ml của từng dung dịch stock định

mức tới 1000 ml nước không có khoáng. Sao cho tổng nồng độ ion Ca : Mg trong

nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca : Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là

0,8mmol/l theo tiêu chuẩn ISO 6341-1982 (Fish, Acute Toxicity Test, 1992).

73

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH

A1 A3 A2

Khả năng phân giải enzyme Protease

A6 A5 A4

Hình 1.1: Khả năng phân giải Protein. A1, A2, A3, A4, A5, A6: Khả năng phân

giải Casein theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25, 26

B2 B3 B1

B4 B5 B6

Hình 1.2: Khả năng phân giải chitin. B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả năng phân giải

Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26

74

Đồ án tốt nghiệp

C2 C1 C3

C4 C5 C6

Hình 1.3: Khả năng phân giải lipit của enzyme lipase B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả

năng phân giải Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26

75

Đồ án tốt nghiệp

C2 C3 C1

C5 C6 C4

C7 C8

Hình 2.1: Khả năng kháng nấm Trichoderma sp. của canh trường đã xử lí acid.

C1, C2, C3, C4, C5, C6: Tương ứng với các nồng độ pha loãng 21, 22, 23, 24, 25, 26

C7, C8: đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim.

76

Đồ án tốt nghiệp

D1 D2 D3

D4 D5 D6

D7 D8

Hình 2.2: Khả năng kháng nấm Paecilomyces sp. của canh trường đã xử lí acid.

D1, D2, D3, D4, D5, D6: Tương ứng với các nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25, 26

D7, D8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim

77

Đồ án tốt nghiệp

E3 E1 E2

E6 E5 E4

E7 E8

Hình 2.3: Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1 của canh trường đã xử lí

acid.

E1, E2, E3, E4, E5, E6: Kháng nấm theo nồng độ pha loãng 21, 22, 23, 24, 25, 26

E7, E8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim

78

Đồ án tốt nghiệp

F1 F3 F2

F4 F5 F6

Khả năng kháng nấm Fusarium của canh trường đã xử lí acid

C5 C6 C4

F7 F8

C7 C8

Hình 2.4: Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trường đã xử lí acid. F1, F2, F3, F4, F5, F6: Kháng nấm theo nồng độ pha loãng 21, 22, 23, 24, 25, 26 F7, F8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim

79

Đồ án tốt nghiệp

G1 G2

Hình 3.1 : Sâu tơ Plutella xylostella ở tuổi 3

G1: sâu tở ở tuổi 3

G2: sâu tơ ăn chế phẩm sau 3 ngày

G4 G3

Hình 3.2 : Nhộng chết sau khăn chế phẩm 4 ngày.

G3: Nhộng chết chuyển màu nâu đen ở nồng độ pha loãng 106

G4: Nhộng chết hóa đỏ tím ở nồng độ pha loãng 105

80

Đồ án tốt nghiệp

G1 G1

Hình 3.3 : Sâu sau khi ăn lá có quét chế phẩm hóa nhộng chết chuyển sang màu đỏ đến đỏ nâu.

G3 G4

Hình 3.4. Bướm sâu khi vũ hóa bị dị tật ở cá bộ phận như: cánh, chân, bụng, cánh

biến dạng mất khả năng bay.

81

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.1: Ấu trùng khi bổ sung chế phẩm với các nồng độ tương ứng

Hình 5.1: Nồng độ pha loãng của chế phẩm thử nghiệm trên cây

82

Đồ án tốt nghiệp

H1 H2

H4 H3

H5 H6

H7 H8

Hình 5.2 : Cây sau khi phun lần 3 sau 9 ngày thử nghiệm.

, 10-3,

H1, H2, H3, H4, H5, H6: Phun chế phẩm ở nồng độ pha loãng tương ứng: 10-1, 10-2

10-4, 10-5, 10-6

H7, H8: phun nước, phun thuốc trừ sâu sinh học Reasgant

83

Đồ án tốt nghiệp

Hình 6.1 : Cá chết sau 3 ngày cho ăn thức ăn có phối trộn chế phẩm.

I1 I2

84

Đồ án tốt nghiệp

I4 I3

I5 I6

Hình 6.2: Khảo sát độc tính trên cá bảy màu sau 5 ngày thử nghiệm.

, 10-3, 10-4, 10-5.

I1, I2, I3, I4, I5: nồng độ pha loãng tương ứng: 10-1, 10-2

I6: Đối chứng âm PG

85

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ

Đường chuẩn Prodigiosin

y = 0,0029x + 0,0071 R² = 0,984

0,030

0,025

0,020

l

0,015

m / g m

0,010

0,005

0,000

0,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

OD 499

Biểu đồ 1: Đường chuẩn prodigiosin, OD 499nm

a

100

90

80

Tỉ lệ kháng nấm Aspergillus flavus CDP1

)

70

%

(

60

50

40

g n á h k ệ l ỉ

b

b

T

30

b

b

b

c

20

10

d

0

2 lan

4 lan

8 lan

16 lan

32 lan

Carbenzim

64 lan Đối chứng

âm

Biểu đồ 1: Tỉ lệ kháng nấm Aspergillus flavus CDP1của dịch nuôi cấy vi khuẩn

S.marcescens SH4 sau xử lí acid

86

Đồ án tốt nghiệp

a

100

90

80

Tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp.

)

70

%

(

60

50

40

b

bc

g n á h k ệ l ỉ

bc

T

30

c

bc

c

20

10

d

0

2 lan

4 lan

8 lan

16 lan

32 lan

Carbenzim

64 lan Đối chứng

âm

Biểu đồ 2: Tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp. của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens

SH4 sau xử lí acid

Tỉ lệ kháng nấm Trichoderma sp.

a

100

90

80

)

70

%

(

60

50

40

g n á h k ệ l ỉ

30

T

b

20

bc

c

cd

cd

10

cd

d

0

2 lan

4 lan

8 lan

16 lan

32 lan

Carbenzim

64 lan Đối chứng

âm

Biểu đồ 3:Tỉ lệ kháng nấm Trichoderma sp của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid

87

Đồ án tốt nghiệp

a

100

90

80

Tỉ lệ kháng nấm Pacelomyces sp.

)

70

%

(

60

c

b

50

bc

c

40

g n á h k ệ l ỉ

T

30

bc

20

bc

10

d

0

2 lan

4 lan

8 lan

16 lan

32 lan

64 lan

Carbenzim

Đối chứng âm

Biểu đồ 4: Tỉ lệ kháng nấm Paecilomyces sp của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid

88

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ

‘KHA NANG PHAN GIAI PROTEIN.’ The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tilekhang

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

6

1.68000000

0.28000000

13.67 <.0001

Model

14

0.28666667

0.02047619

Error

1.96666667

Corrected Total 20

R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean

0.854237 12.62603

0.143095

1.133333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

6 1.68000000

13.67 <.0001

nongdo

0.28000000 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang

0.05

Alpha

14

Error Degrees of Freedom

0.020476

Error Mean Square

Critical Value of Studentized Range 4.82904

0.399

Minimum Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N nongdo

A

1.7333 3 vksong

B

1.2000 3 2lan

B

B

1.1333 3 4lan

B

89

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N nongdo

B

1.1333 3 8lan

B

C

B

1.0000 3 16lan

C

B

C

B

1.0000 3 32lan

C

C

0.7333 3 64lan

‘TY LE KHANG NAM FUSARIUM SP.’ The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tilekhang

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

18287.04408

2612.43487 316.25 <.0001

Model

16

132.17040

8.26065

Error

18419.21447

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean

0.992824 9.409962

2.874135

30.54353

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 18287.04408

2612.43487 316.25 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

8.26065

Error Mean Square

Critical Value of Studentized Range 4.89622

8.1247

Minimum Significant Difference

90

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N nongdo

100.000 3 carbenzi

A

B

29.841 3 16lan

B

C

B

26.888 3 4lan

C

B

C

B

24.762 3 2lan

C

B

C

B

24.127 3 64lan

C

C

19.683 3 32lan

C

C

19.048 3 8lan

D

0.000 3 Dcam

‘TY LE KHANG NAM CDP1.’ The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tilekhang

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

19854.72405

2836.38915 136.70 <.0001

Model

16

331.97290

20.74831

Error

20186.69695

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean

0.983555 17.44480

4.555031

26.11111

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 19854.72405

2836.38915 136.70 <.0001

nongdo

91

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang 0.05 Alpha

16

Error Degrees of Freedom

20.74831

Error Mean Square

Critical Value of Studentized Range 4.89622

12.876

Minimum Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N nongdo

100.000 3 carbenzi

A

B

24.444 3 32lan

B

C

B

19.048 3 8lan

C

B

C

B

19.048 3 16lan

C

B

C

B

18.413 3 64lan

C

B

C

B

17.143 3 2lan

C

C

D

10.794 3 4lan

D

D

0.000 3 Dcam

TY LE KHANG NAM TRICHODERMA SP The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tilekhang

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

22819.75611

3259.96516 108.13 <.0001

Model

92

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

16

482.37461

30.14841

Error

23302.13072

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean

0.979299 28.03016

5.490757

19.58874

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 22819.75611

3259.96516 108.13 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tilekhang

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

30.14841

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

9.5039

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

100.000 3 carbenzi

A

B

18.615 3 16lan

B

C

B

11.255 3 64lan

C

B

C

B

9.524 3 2lan

C

C

D

8.658 3 32lan

C

D

C

D

4.329 3 8lan

93

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

C

D

C

D

4.329 3 4lan

D

D

0.000 3 Dcam

‘TY LE KHANG NAM PAECILOMYCES SP.’ The ANOVA Procedure

Dependent Variable: tilekhang

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

19865.65647

2837.95092

27.96 <.0001

Model

16

1623.96269

101.49767

Error

21489.61916

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean

0.924430 33.80277

10.07461

29.80408

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 19865.65647

2837.95092

27.96 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tilekhang

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

101.4977

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

17.438

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

A

100.000 3 carbenzi

94

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

B

34.783 3 16lan

B

B

33.333 3 8lan

B

C B

28.288 3 32lan

C B

C B D

17.391 3 64lan

C

D

C

D

13.043 3 2lan

C

D

C

D

11.594 3 4lan

D

D

0.000 3 Dcam

‘TI LE CHET SAU 1 NGAY The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

6858.796296

979.828042

10.74 <.0001

Model

16

1459.259259

91.203704

Error

8318.055556

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.824567 31.39747

9.550063

30.41667

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

95

0.05

Đồ án tốt nghiệp

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

91.2037

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

16.53

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

55.556 3 10^-6

A

A

A

48.889 3 10^-4

A

B

A

43.333 3 Reasgant

B

B

C

27.778 3 10^-5

C

C

26.667 3 10^-3

C

C

22.222 3 10^-2

C

C

18.889 3 10^-1

D

0.000 3 Dcam

‘TI LE CHET SAU 2 NGAY The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

13198.14815

1885.44974

45.25 <.0001

Model

16

666.66667

41.66667

Error

96

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

13864.81481

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.951917 11.33556

6.454972

56.94444

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 13198.14815

1885.44974

45.25 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

41.66667

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

11.173

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

78.889 3 Reasgant

A

A

A

73.333 3 10^-6

A

B

A

70.000 3 10^-5

B

A

B

A

70.000 3 10^-4

B

B

C

60.000 3 10^-2

C

C

52.222 3 10^-3

C

97

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

C

51.111 3 10^-1

D

0.000 3 Dcam

TI LE CHET SAU 3 NGAY

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

16351.38889

2335.91270

34.56 <.0001

Model

16

1081.48148

67.59259

Error

17432.87037

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.937963 12.35795

8.221471

66.52778

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 16351.38889

2335.91270

34.56 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

67.59259

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

14.231

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

A

88.889 3 Reasgant

A

98

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

B A

86.667 3 10^-4

B A

B A C

78.889 3 10^-6

B

C

B D C

73.333 3 10^-3

B D C

B D C

73.333 3 10^-5

D C

D C

67.778 3 10^-2

D

D

62.222 3 10^-1

E

1.111 3 Dcam

‘TI LE CHET SAU 4 NGAY The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

20981.01852

2997.28836 124.50 <.0001

Model

16

385.18519

24.07407

Error

21366.20370

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.981972 6.388254

4.906534

76.80556

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 20981.01852

2997.28836 124.50 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

99

0.05

Đồ án tốt nghiệp

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

24.07407

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

8.4927

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

100.000 3 10^-4

A

A

A

100.000 3 Reasgant

B

86.667 3 10^-6

B

B

85.556 3 10^-5

B

B

85.556 3 10^-3

B

B

84.444 3 10^-2

C

70.000 3 10^-1

D

2.222 3 Dcam

‘TI LE CHET SAU 5 NGAY The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

21488.42593

3069.77513 245.58 <.0001

Model

100

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

16

200.00000

12.50000

Error

21688.42593

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.990778 4.278293

3.535534

82.63889

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 21488.42593

nongdo

3069.77513 245.58 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

12.5

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

Least Significant Difference 6.1196

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

100.000 3 10^-4

A

A

A

100.000 3 Reasgant

A

B

A

95.556 3 10^-3

B

B

92.222 3 10^-6

B

B

92.222 3 10^-5

B

B

92.222 3 10^-2

101

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

C

84.444 3 10^-1

D

4.444 3 Dcam

TI LE CHET ARTEMIA 4h The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TILECHET

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

6

2361.238095

393.539683 137.74 <.0001

Model

14

40.000000

2.857143

Error

2401.238095

Corrected Total 20

R-Square Coeff Var Root MSE TILECHET Mean

0.983342 13.49676

1.690309

12.52381

Source

DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

6 2361.238095

393.539683 137.74 <.0001

NONGDO

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILECHET

0.05

Alpha

14

Error Degrees of Freedom

2.857143

Error Mean Square

2.14479

Critical Value of t

2.9601

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NONGDO

A

30.000 3 Reagants

A

102

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NONGDO

28.000 3 10lan

A

B

9.667 3 100lan

C

6.667 3 100000la

C

D

C

6.000 3 10000lan

D

C

D

C

4.000 3 1000lan

D

D

3.333 3 1000000l

TI LE CHET CAI 3 NGAY The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

1212.239583

173.177083

10.08 <.0001

Model

16

275.000000

17.187500

Error

1487.239583

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.815094 46.82294

4.145781

8.854167

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 1212.239583

173.177083

10.08 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

103

16

Đồ án tốt nghiệp

Error Degrees of Freedom

17.1875

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

Least Significant Difference 7.1759

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

25.833 3 Reasgant

A

B

10.833 3 10^-1

B

B

8.333 3 10^-2

B

B

8.333 3 10^-4

B

B

7.500 3 10^-3

B

C

B

5.833 3 10^-5

C

B

C

B

4.167 3 10^-6

C

C

0.000 3 Dcam

Dependent Variable: Tilechet

TI LE CHET CAI 5 NGAY The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

3308.072917

472.581845

24.52 <.0001

Model

16

308.333333

19.270833

Error

3616.406250

Corrected Total 23

104

Đồ án tốt nghiệp

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.914740 36.01933

4.389856

12.18750

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 3308.072917

472.581845

24.52 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

19.27083

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

7.5984

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

42.500 3 Reasgant

A

B

10.833 3 10^-1

B

B

10.000 3 10^-4

B

C

B

8.333 3 10^-3

C

B

C

B

8.333 3 10^-2

C

B

C

B

8.333 3 10^-6

C

B

C

B

7.500 3 10^-5

C

C

1.667 3 Dcam

105

TI LE CHET CAI 9 NGAY

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: Tilechet

Đồ án tốt nghiệp

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

7

7241.406250 1034.486607

57.57 <.0001

Model

16

287.500000

17.968750

Error

7528.906250

Corrected Total 23

R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean

0.961814 24.66302

4.238956

17.18750

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

7 7241.406250 1034.486607

57.57 <.0001

nongdo

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet

0.05

Alpha

16

Error Degrees of Freedom

17.96875

Error Mean Square

2.11991

Critical Value of t

7.3372

Least Significant Difference

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

62.500 3 Reasgant

A

B

15.833 3 10^-5

B

C

B

11.667 3 10^-3

C

B

C

B

11.667 3 10^-6

106

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N nongdo

C

B

C

B

11.667 3 10^-4

C

B

C

B

10.833 3 10^-2

C

C

8.333 3 10^-1

C

C

5.000 3 Dcam

107