Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ

Sinh viên thực hiện

: TẠ THANH THẾ

MSSV: 1151110518 Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình

ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin

chịu hoàn toàn trách nhiệm.

TP. HCM, ngày … tháng … năm 2015

Sinh viên,

iii

Tạ Thanh Thế

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô trong Khoa Công

Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy và truyền đạt

kiến thức cho em trong những năm học qua. Những kiến thức mà em nhận được

trên giảng đường đại học không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn tốt

nghiệp này mà còn là hành trang quý báu giúp em vững bước trong tương lai.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng

Thủy Sản II và Ths. Bùi Thị Liên Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm

và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó,

em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Ngọc Thùy Trang cùng các bạn sinh viên tại

phòng thí nghiệm Di Truyền Phân Tử đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và động viên em

trong suốt thời gian qua.

Đồng thời, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã là chỗ

dựa vững chắc và cùng sát cánh bên nhau trong suốt những năm học qua.

Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ đã động viên và giúp đỡ

con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và trong quá trình học tập.

TP. HCM, ngày … tháng … năm 2015

Sinh viên,

Tạ Thanh Thế

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ ix

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... xi

DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... xii

MỞ ĐẦU……… ........................................................................................................ 1

1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3

1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) .............................. 3

1.1.1. Hệ thống phân loại .............................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 4

1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái ............................................................ 6

1.1.3.1. Đặc điểm phân bố ............................................................................ 6

1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản ............................................................................ 7

1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long .................... 8

1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long ............................. 8

1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8

1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra ......................... 9

1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống ................................ 10

1.3.1. Phân loại ............................................................................................ 10

1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) ........................ 11

1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP) ........................ 12

Đồ án tốt nghiệp

1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) ............ 13

1.3.5. Microsatellite (SSR) .......................................................................... 13

1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền ................... 14

1.4.1. Khái niệm về Microsatellite .............................................................. 14

1.4.2. Tính chất ............................................................................................ 15

1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite ............................................. 16

1.4.4. Giới hạn của Microsatellite ............................................................... 16

1.4.5. Các loại Microsatellite ....................................................................... 18

1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite ....................................................... 18

1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite ........... 19

1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite ................................................ 21

1.4.8.1. Ưu điểm ......................................................................................... 21

1.4.8.2. Nhược điểm ................................................................................... 21

1.4.9. Vai trò của microsatellite .................................................................. 22

1.4.10. Ứng dụng của microsatellite.............................................................. 23

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 24

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 24

2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 24

2.2.1. Nguồn mẫu ........................................................................................ 24

2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ............................................................. 24

2.2.2.1. Mồi ................................................................................................. 24

2.2.2.2. Thang ............................................................................................. 25

2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA ................................. 26

2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR ......................................................... 26

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose ........................................ 27

2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 27

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 27

2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu ................................................... 27

2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA ............................................................ 28

2.3.2.1. Quy trình ........................................................................................ 28

2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết ................................... 28

2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................. 29

2.3.3.1. Khái niệm ....................................................................................... 29

2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................... 29

2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR ................................... 31

2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR ............................................... 33

2.3.3.5. Ứng dụng ....................................................................................... 33

2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose .............................................. 33

2.3.4.1. Nguyên tắc ..................................................................................... 34

2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng .................................................................... 35

2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 37

2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA .......................................................... 38

2.4.1.1. Tách chiết DNA ............................................................................. 38

2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết ............................................................... 38

2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR ........................................... 39

2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi

microsatellite ................................................................................................. 39

vii

2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2 ...................................... 42

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase ............. 42

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi

microsatellite. .................................................................................................... 43

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 45

3.1. Kết quả tách chiết DNA ............................................................................ 45

3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR ........................................................... 46

3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite ................. 46

3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 ................................................................... 53

3.2.3. Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase .......................................... 57

3.3. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite ........................ 58

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 60

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 60

4.2. Đề nghị ........................................................................................................ 60

viii

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 61

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

µg : Microgram

µl : Microlite

µM : Micromol/lite

mM : Milimolar (milimol/lite)

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

ALP : Amplicon Length Polymorphism

AP-PCR : Arbitrary Primer-PCR

bp : Base pair

DAF : DNA Amplification Fingerprinting

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

EBV : Estimated Breeding Value

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

g : Gram

ha : Hecta

kb : kilobases

kg : Kilogram

M : Ladder DNA

mA : Miliampe

mM : Milimolar (milimol/lite)

nu : Nucleotide

PCR : Polymerase chain reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

RE : Restriction enzyme

RFLP : RestrictionFragment Length Polymorphism

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism

Đồ án tốt nghiệp

: Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSR

STR : short tandem repeats

STS : Sequence-Taqged Sites

Ta : Annealing temperature

Taq DNA polymerase: Thermos aquaticus DNA polymerase

TBE : Tris Borate EDTA

UV : Ultra Violet - tia cực tím

V : Vôn

VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). ......... 11

Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu. .................. 24

Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose. .......................................... 36

Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite. ............................... 40

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19.

................................................................................................................................... 40

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593.

................................................................................................................................... 41

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25. ............................ 41

Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03. ................................................. 41

Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite. ..................... 42

Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát. ................................................ 42

Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq

polymerase cho một phản ứng PCR. ......................................................................... 43

Bảng 3.1. Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu. ..................... 52

Bảng 3.2. Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi. ............................... 56

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991).

..................................................................................................................................... 5

Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). .................................................. 5

Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1

đôi râu hàm dưới ngắn. ............................................................................................... 5

Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra. ........................................... 6

Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)........ 6

Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân. ....................................................... 18

Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã. ................................................... 19

Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. ................................................. 20

Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. ...................... 20

Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp. ................................................................................ 26

Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988). ............. 28

Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR. ....................................................... 30

Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel. ................ 35

Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại

mạch thẳng ở bên phải. ............................................................................................. 36

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. ............................................................................ 37

Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi

microsatellite. ............................................................................................................ 44

Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần

đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001. ........................................................ 45

Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12................................. 46

Hình 3.3. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB13................................. 47

Hình 3.4. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14................................ 47

Hình 3.5. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB15................................. 48

xii

Hình 3.6. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB18................................. 48

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.7. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB19................................. 49

Hình 3.8. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01. ............................... 50

Hình 3.9. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03. ............................... 50

Hình 3.10. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7. ............................... 51

Hình 3.11. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21. ............................. 51

Hình 3.12. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579. ..................... 52

Hình 3.13. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13. ............................. 52

Hình 3.14. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB14. .......................... 54

Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB15. ........................... 54

Hình 3.16. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB12. .......................... 55

Hình 3.17. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB13. .......................... 55

Hình 3.18. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB18. .......................... 55

Hình 3.19. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB19 ........................... 55

Hình 3.20. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy01. .......................... 55

Hình 3.21. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy03. .......................... 56

Hình 3.22. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-7. ............................. 56

Hình 3.23. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-21. ........................... 56

Hình 3.24. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi PSP-G579. ................... 56

Hình 3.25. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Pg–13. .......................... 56

Hình 3.26. Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose

2,5 %.......................................................................................................................... 57

Hình 3.27. Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra. ....................... 59

Hình 3.28. Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14,

xiii

CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra. ........................................................... 59

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi

trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề

phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.

Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt bản địa của Việt

Nam và được biết phổ biến như là một biểu tượng thương mại của ngành nuôi trồng

thủy sản nói riêng, đóng vai trò chủ chốt trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản của

Việt Nam.

Hiện nay, nghề nuôi cá Tra sản xuất ngày càng phát triển và mở rộng dẫn đến

nhu cầu con giống cá Tra càng tăng cao. Tuy nhiên, việc sản xuất và cung ứng

giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chủ yếu do người dân tự phát, tự

cân đối nên chưa có sự phát triển đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng con

giống. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm trở lại đây

với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và tỷ lệ sống

thấp. Giá cá bột không có sự khác biệt giữa cá có cải thiện di truyền và cá tại địa

phương. Từ đó ảnh hưởng tới vệc nuôi trồng và sản xuất của các hộ nuôi cá tra

thương phẩm cũng như ảnh hưởng tới việc xuất khầu cá tra ra thị trường nước

ngoài.

Trước tình hình như vậy bên cạnh việc ban hành các thông tư và nghị định về

nuôi chế biến và sản xuất cá tra thì hỗ trợ những trang thiết bị, máy móc cần thiết để

phục vụ cho công tác kiểm soát chất lượng con giống, kiểm soát môi trường nuôi,

đào tạo nghiệp vụ cho các cơ quan quản lý địa phương nhằm chủ động hơn trong

nhiệm vụ quản lý cá tra giống là việc rất cần thiết.

Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiền đề tài “Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di

truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)”. Nghiên cứu này được hy vọng sẽ

tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo trong việc phân tích đa dạng di truyền cá Tra

Đồ án tốt nghiệp

nhằm góp phần vực dậy chất lượng con giống tra, nâng cao năng suất, tạo ra những

sản phẩm có chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường trong và

ngoài nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện

Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tối ưu hóa và tuyển chọn các cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao từ 16

cặp mồi microsatellite.

3. Nội dung nghiên cứu

 Tách chiết DNA mẫu cá Tra từ 4 quần đàn khác nhau.

 Tối ưu hóa phản ứng PCR.

 Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)

Bộ Siluriformes gồm có 36 họ, 477 giống, 3088 loài cá phân bố rộng khắp trên

toàn thế giới. Trong 36 họ cá đã nêu có một số họ cá có giá trị kinh tế được nuôi và

khai thác phổ biến như các họ: Ariidae (cá Úc), Bagridae (cá Chốt), Clariidae (cá

Trê), Ictaluriidae (cá Nheo), Pangasiidae (cá Trơn), Plotosidae (cá Ngát),

Silurudae (cá Leo) và Sisoridae (cá Chiên)…(Carl và ctv, 2007).

Cá Tra là loài cá kinh tế phổ biến ở khu vực châu Á và là một trong 30 loài cá

thuộc họ Pangasiidae (http://www.fishbase.org). Pangasiidae được phát hiện đầu

tiên trong thủy vực nước ngọt ở các quốc gia phụ cận khu vực hạ lưu của Ấn Độ

Dương; sự đa dạng thành phần loài của họ cá này tập trung chủ yếu ở khu vực Đông

Nam châu Á (Roberts và Vithayanon, 1991). Cá Tra có nguồn gốc từ Cambodia,

Lào, Thái Lan và Việt Nam (www.fishbase.org). Ngoài ra, cá Tra còn được đưa vào

nuôi rộng rãi khắp các nước Đông Nam Á.

Kiến thức về sinh học và sinh thái học của loài này trong tự nhiên còn hạn chế

(Hung và ctv, 2003). Cá Tra có tính ăn tạp và thức ăn chủ yếu là thực vật và một số

loài động vật thân mềm (Vithayanon, 1993).

Cá Tra phân bố tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mekong bao gồm các nước:

Cambodia, Lào, Thái Lan, Việt Nam và chúng cũng được phát hiện ở sông Chao

Praya – Thái Lan.

1.1.1. Hệ thống phân loại

Theo hệ thống phân loại Roberts và Vidohayanon (1991) cá Tra thuộc :

Giới: Animalia Linnaeus

Ngành: Chordata Bateson

Ngành phụ: Vertebrata Cuvier

Tổng lớp: Osteichthyes Huxley

Lớp: Actinopterygii Huxley

Lớp phụ: Neopterygii Infraclass: Teleostei

Đồ án tốt nghiệp

Tổng bộ: Ostaryphysi

Bộ: Siluriformes

Họ: Pangasiidae Bleeker

Giống (chi): Pangasius

Loài: Pangasius hypophthalmus

Các đồng danh của loài cá Tra :

 Helicophagus hypophthalmus

 Pangasianodon hypophthalmus

 Pangasius hypophthalmus

 Pangasius pangasius

 Pangasius pleurotaenia

 Pangasius sutchi

Tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử dụng lần đầu vào

năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng

phổ biến đến nay. Tuy nhiên tên khoa học Pangasius sutchi thì không còn sử dụng

nữa. Tên đặt cho loài này khác nhau theo các nước trong vùng nó phân bố. Ở

Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, Pa suay, Thái là Pla saa

wha, Pla suey và Việt Nam là Cá Tra (Nguyễn Văn Thường, 2008).

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) cá Tra được mô tả

như sau:

 Đầu rộng, dẹp bằng. Mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm tròn.

 Miệng trước, rộng ngang, không co duỗi được có dạng hình vòng cung và

nằm trên mặt phẳng ngang.

 Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng, nằm trên

đường vòng cung, đôi khi bị che lấp bởi nếp da vòm miệng (Hình 1.1).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991).

 Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi

trước đến cạnh trên của mắt.

 Có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vi ngực, râu cằm ngắn

hơn.

 Thân thon dài, phần sau dẹp bên. Đường bên hoàn toàn và phân nhánh, bắt

đầu từ mép trên của lỗ mang đến điểm giữa gốc vi đuôi. Mặt sau của vi

lưng, vi ngực có răng cưa hướng xuống gốc vi. Vi bụng kéo dài chưa chạm

đến khởi điểm của gốc vi hậu môn.

Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus).

Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1

đôi râu hàm dưới ngắn.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra.

Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus).

1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái

1.1.3.1. Đặc điểm phân bố

Vùng phân bố tự nhiên của cá Tra giới hạn trong hạ lưu sông Mekong, bao

gồm Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam, kể cả sông Chao Praya ở Thái Lan

(Roberts và Vidthayanon, 1991; Poulsen và ctv, 2004).

Theo Nguyễn Thị Thu Thủy (2009) có ít nhất hai quần thể lớn khác nhau được

tìm thấy ở khu vực hạ lưu sông Mekong:

Một quần thể ở khu thượng nguồn sông Mekong (Thái Lan, Lào). Quần thể này có

thể mở rộng từ cửa sông Loei đi ngược lên biên giới Myanmar và Trung Quốc.

Đồ án tốt nghiệp

 Quần thể hạ nguồn là quần thể trội hơn, và chiếm ưu thế trong khắp khu

vực phân bố của chúng, kéo dài từ đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam,

trong hệ thống hồ lớn Campuchia và ngược lên Khone Falls (Campuchia).

Cũng có thể có một quần thể nhỏ hơn ở khu vục sông Xe Bang Fai và sông

Songkhram. Quần thể này có thể trùng lặp một phần với quần thể nói trên

do sự di cư chậm về phương diện không gian lẫn di truyền.

1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản

Cá Tra là loài cá di cư sinh sản, ngược dòng Mekong từ một vùng chưa rõ vào

tháng 5 – 7 và quay lại dòng chính khi nước sông đổ về dâng ngập vào tháng 9 – 12.

Ở phía Nam thác Khône, sự di cư ngược dòng của cá Tra xảy ra từ tháng 10 – 2

năm sau, cao điểm vào tháng 11 – 12. Sự di cư này xảy ra khi nước rút và xuất hiện

rải rác theo sau đó là các hoạt động di cư theo chiều ngang của cá từ các vùng ngập

nước trở về dòng Mekong vào cuối thới kỳ mùa lũ.

Hoạt động di cư xuôi dòng của cá xảy ra vào tháng 5 – 8 từ Stung Treng đến

Kandal ở Cambodia và sau đó đến hạ lưu sông Mekong ở Việt Nam. Trứng cá xuất

hiện vào tháng 3 – 8 từ Stung Treng đến Kandal, cho thấy rằng sự di cư xuôi dòng

của cá bao gồm cả hai hoạt động: di cư sinh sản và di cư dinh dưỡng và cuối cùng

cá di chuyển đến các cánh đồng ngập nước ở Cambodia và Việt Nam trong mùa lũ.

Ở Việt Nam, cá Tra thuộc đàn cá hạ lưu, phân bố rộng khắp trên sông Tiền và

sông Hậu. Vào mùa mưa (tháng 5 – 6) cá Tra bột trôi theo dòng nước từ bãi đẻ ở

đoạn giữa Kra – chê và thác Khône. Khi chúng đến biên giới giữa Cambodia và

Việt Nam, cá sẽ dạt vào các vùng ngập nước ở đây. Sông Tonle Sap chảy theo chiều

nguợc lại giúp cho cá bột có thể đi sâu vào vùng ngập thuộc hệ thống này.

Sức sinh sản của cá tra là 120.000 – 145.700 trứng/kg cá cái (Huỳnh Quốc

Khanh, 2009).

Đồ án tốt nghiệp

1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long

1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi

trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề

phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là

loài cá nước ngọt bản địa của Việt Nam thường được nuôi trong ao hoặc trong lồng

bè và xu hướng hiện nay chủ yếu là nuôi trong ao.

Theo Tổng cục Thủy sản: ước tính tổng diện tích thả nuôi cá tra tháng 1/2015

là 1.701 ha, tăng nhẹ 3,5 % so với cùng kì năm 2014. Trong đó tỉnh Đồng Tháp có

diện tích nuôi cá tra đạt 1.072 ha chiếm 63% diện tích nuôi cá tra, tăng 10,7% so

với năm 2014. Sản lượng thu hoạch lũy kế tính ước tính đạt 73 nghìn tấn, năng suất

bình quân đạt 300 tấn/ha, tăng 1,6 lần so với năng suất bình quân năm 2014, trong

đó tỉnh Đồng Tháp có năng suất cao nhất đạt 410 tấn/ha và năng suất thấp nhất của

Bến Tre đạt 205,2 tấn/ha.

Đến đầu năm 2015, giá cá tra nguyên liệu tăng thêm 500 đồng/kg so với cuối

tháng 12 năm 2014, phổ biến ở mức 24.000 – 25.000 đồng/kg tùy theo địa phương,

doanh nghiệp và thời điểm. Sau khi trừ chi phí sản xuất, người nuôi có thể thu lãi từ

2.000 – 2.500 đồng/kg, tương đương lợi nhuận 600 – 900 triệu đồng/ha. Với mức

giá này, khả năng diện tích nuôi cá tra thâm canh sẽ gia tăng trong thời gian tới.

1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long

Chất lượng cá tra giống là một trong những yếu tố quan trọng để nâng cao

hiệu quả nghề nuôi cá tra thâm canh, từ đó góp phần phát triển bền vững nghề nuôi

và chế biến cá tra xuất khẩu. Tuy nhiên, hiện nay cá tra giống vẫn chưa đạt yêu cầu

về chất lượng mặc dù ngành chức năng các cấp đã có nhiều nỗ lực.

Việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

phần lớn do người dân tự phát, tự cân đối nên phát triển chưa đồng bộ giữa số lượng

cũng như chất lượng. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những

năm gần đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và

tỷ lệ sống thấp.

Đồ án tốt nghiệp

Năm 2014, cả nước có 230 cơ sở sản xuất giống cá tra, trên 4.000 hộ ương

dưỡng cá giống trên diện tích 2.250 ha, sản xuất được hơn 2 tỷ con cá tra giống. Sản

lượng cá tra giống tập trung nhiều nhất ở Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tiền

Giang. Tuy nhiên, tỷ lệ sống trong ương dưỡng khá thấp, tỷ lệ ương từ cá bột lên cá

hương chỉ đạt 20 – 24 % và từ cá hương lên cá giống trung bình chỉ 21 %

(http://www. http://thuysanvietnam.com.vn).

1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra

Chương trình nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá tra được bắt đầu từ năm 1978

với sự tham gia của nhiều Viện và trường Đại học trong khu vực (Đại học Nông

Lâm, Viện NCNTTS II, Đại học Cần Thơ, tổ chức CIRAD (Pháp)).

Thông qua sự tài trợ của SUFA_Bộ Thuỷ sản trong 5 năm (2001 – 2005),

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống về

tính trạng tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (2001 – 2004). Ba quần

đàn gốc cho chọn giống năm 2001, 2002 (chọn theo tăng trưởng) và 2003 (chọn

theo tỷ lệ philê) đã được hình thành. Hiệu quả của chọn lọc thực tế đã được tính

toán trong năm 2006 – 2008.

Các nghiên cứu thăm dò về sinh học phân tử nhằm đánh giá biến dị di truyền

của cá tra cũng đã được tiến hành. Kỹ thuật microsatellite với 10 primer đặc hiệu

cho cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long được phát triển bởi BIOTEC_Thái Lan để

đánh giá biến dị cá đã được thực hiện trong năm 2004. Các primer đều cho kết quả

đa hình, đặc biệt primer 10 cho kết quả đa hình rất cao. Kết quả này mở ra triển

vọng sử dụng những primer để đánh giá biến dị di truyền và tìm ra chỉ thị liên kết

với tính trạng có ý nghĩa về mặt kinh tế trên cá tra bằng kỹ thuật microsatellite.

Đề tài ‘‘Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cá tra thương phẩm đạt tiêu chuẩn thịt trắng

phục vụ xuất khẩu (2001 – 2003)”.

Dự án sản xuất thử “Nuôi cá tra thâm canh đạt tiêu chuẩn xuất khẩu và giảm ô

nhiễm môi trường” được thực hiện bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

năm 2006 – 2007.

Đồ án tốt nghiệp

Dự án ‘‘Thử nghiệm mô hình nuôi cá tra thương phẩm phục vụ xuất khẩu và

hạn chế ô nhiễm môi trường, 2007 – 2008’’.

Dự án “Xây dựng qui phạm thực hành nuôi cá tra tốt hơn (BMP) ở đồng

bằng sông Cửu Long, Việt Nam” đã bắt đầu thực hiện từ năm 2007.

1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống

Di truyền phân tử là một lĩnh vực được quan tâm và được ứng dụng rộng rãi

trong nghiên cứu.

Các kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng gồm các kỹ thuật về DNA, các

kỹ thuật về tách dòng gene, về biểu hiện gene, về RNA và chủ yếu là RNA thông

tin, về enzyme …

Các kỹ thuật về DNA hiện được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài đoạn cắt

giới hạn (RestrictionFragment Lenth Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa

vào chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) như: đa hình các đoạn

DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphim DNA – RADP), đa hình

độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Frangment Length Polymorphism –

AFLP), Microsatellite.

1.3.1. Phân loại

Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai

dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem như một DNA marker. Những

marker có tính chất như vậy rất cần thiết vì số lượng của chúng lớn hơn rất nhiều so

với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và

Nguyễn Thị Lang, 2005).

Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Phạm

Thành Hổ, 2005):

 Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP.

 Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR,

SSCP, RAPD.

Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (Phạm Thành Hổ,

2005):

Đồ án tốt nghiệp

 Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử

và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP.

 Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử

và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP.

Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).

Chỉ thị (marker) Tên đây đủ

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

AP-PCR Arbitrary Primer-PCR

DAF DNA Amplification Fingerprinting

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

ALP Amplicon Length Polymorphism

SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

RFLP RestrictionFragment Length Polymorphism

SNP Single Nucleotide Polymorphism

STS Sequence-Taqged Sites

1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP)

Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh

giá đa dạng di truyền. RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân

đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra

khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) khi có sự

thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell

và ctv,1996).

Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ

biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt

Đồ án tốt nghiệp

giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ

được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua

màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một

locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt

khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996).

RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng

hợp và dị hợp. Do kích thước khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo

ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp,

nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh

dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.

Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn.

Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát,

sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các Restriction enzyme, điện di

và phân tích trên gel nhuộm Ethidium bromide hoặc bạc. PCR – RFLP bỏ qua bước

lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.

1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết

hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử

dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có

thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng

gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi

của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt (

Povvell và ctv, 1996; Winfield và ctv, 1998).

Thông thường, trong AFLP sử dụng một cặp Restriction enzyme gồm một

enzyme cắt thường xuyên và một enzyme cắt không thường xuyên. Enzyme cắt

thường xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thường xuyên sẽ hạn

chế số lượng các đoạn cắt. Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – Msel.

Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn

vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần

Đồ án tốt nghiệp

trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR

được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài

nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự

nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự

xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích (Matthes và ctv, 1998;

Karp và ctv, 1997).

AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ

gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền

phải được biết rõ để chuẩn bị primer tương ứng, và AFLP là một marker trội, điều

này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.

1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi

thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà

không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp,

đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại

các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các

đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thước khác

nhau được nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa

các cá thể và các đoạn đa hình có thể được dùng như những marker để xác định sự

đa dạng di truyền. RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA

nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên

thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy

PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí

nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình

cao (Harris, 1999).

1.3.5. Microsatellite (SSR)

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene Eukaryote là những vùng có tính

biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable

number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trưng bởi số

Đồ án tốt nghiệp

lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n,

(TAT)n, (TCT)n, (CAG)n ... Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở

mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao.

Dựa trên trình tự DNA, microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho

phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene,

trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thước các

đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 – 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA

có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide.

1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.4.1. Khái niệm về Microsatellite

Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of

tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên

trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005), là một

đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ

một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn

(gọi là đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở

khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một

vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles

có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện

bởi PCR , sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia

của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alleles được ghi

nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại, …

Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng

PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của

genome. Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau.

Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu

tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short

tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward, 1991).

Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus

Đồ án tốt nghiệp

là 20 – 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở

những cơ thể sống có bộ gene lớn và phân bố đều trên genome.

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-alleles hay alleles

đồng trội (bao gồm 2 loại: alleles đồng hợp và alleles dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 – 5x106, tuân theo định luật

Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR

từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có

thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng.

1.4.2. Tính chất

Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình,

đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự được lặp lại thường đơn

giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri-, và

tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide

CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người và các loài khác, và được hiện

diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Như vậy có sự xuất hiện thường xuyên của

nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ

thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ

dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc,

nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng

để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn.

Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung

tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai

trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing – sự giữ không đúng mục tiêu) trong

suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra

suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được

sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không

được sửa chữa. Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự

lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã

trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến,

Đồ án tốt nghiệp

có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tương tự này

thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu

sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác

của microsatellites có thể được khuếch đại.

1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite

Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một

đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này được chèn vào plasmid

hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau

đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu

huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên

đoạn DNA. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được

đọc trình tự và primers PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác

định vị trí đặc trưng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi

trình tự lặp lại của microsatellites phải được dự đoán trước và primers được thu

nhận ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite

được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung

của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch

đại thông qua PCR.

Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở

những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài.

Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng

flanking – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer – được bảo

tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát

hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.

1.4.4. Giới hạn của Microsatellite

Microsatellite là marker phân tử hữu hiệu và đặc biệt trong nghiên cứu quần

thể. Thế nhưng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite được phát triển

cho những chủng đặc trưng, có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng

Đồ án tốt nghiệp

có mối quan hệ họ hàng gần nhau. Tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được

khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền.

Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn

đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể

đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên

kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài

bắt đầu. Sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên

của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ

phận không có giá trị) (Hayden và Sharp, 2001). Sự thất bại của phản ứng PCR có

thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại.

Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết

giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alleles không giá trị

do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thước

alleles cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm

vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều

dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số

vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng

hoặc sự cố trong vùng exon của gene dưới sự chọn lọc.

Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng

khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công

trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các

loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong

trường hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được

dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm

tăng kích thước, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi

mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước; sự ép buộc này

đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt. Nếu có một sự khác

biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền

vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân.

Đồ án tốt nghiệp

Trong tế bào khối u – nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy,

microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong

mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc

điểm khác biệt di truyền.

1.4.5. Các loại Microsatellite

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) có :

Mononucleotide SSR (A)

AAAAAAAAAAA

Dinucleotide SSR (GT) 6

GTGTGTGTGTGT

Trinucleotide SSR (CTG) 4

CTGCTGCTGCTG

Tetranucleotide SSR (ACTC) 4

ACTCACTCACTCACTC

Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và

tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv, 1996).

1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite

Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách

đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện

và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau:

 Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over

during meiosis). Quá trình này được mô tả trong hình 1.6.

Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân.

Đồ án tốt nghiệp

 Quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage).

Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã.

Hình 1.7 mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage). Đây

được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand).

Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử

DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được. Sự trượt

lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc

là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn.

1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite

Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite

đặc trưng cho một locus trong bộ gene. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp

dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước

khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số.

Hình 1.8 hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo

toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm

PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR

chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự

microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm

PCR là 116 bp)

Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite.

Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở

những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài.

Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng

flanking (vùng sườn – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi)

được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp

phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.

Đồ án tốt nghiệp

Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel. Thông thường sản

phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp (Murray

và ctv, 1993). Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA

polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích

thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một

dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách này

thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được

số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alleles.

1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite

1.4.8.1. Ưu điểm

 Microsatellite có số đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6bp, số lần lặp lại của

microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là

khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng kỹ thuật này là

rất cao.

 Microsatellite có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus

được kiểm tra nên kỹ thuật này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng

chảy gene và phân tích mối quan hệ huyết thống.

 Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác

định. Tính đồng trội của microsatllite gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác

của những phép tính toán di truyền quần thể so với những marker khác như:

AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho

những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gene trở nên dễ dàng hơn.

1.4.8.2. Nhược điểm

 Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất

quan trọng trong kỹ thuậtnnày. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải

nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình.

 Không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có

quan hệ di truyền xa nhau.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.9. Vai trò của microsatellite

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu

sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá. Chức năng rõ

rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy

chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền.

Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền

quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gene. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho

rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều

hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của

vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. số lượng

khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự

biểu hiện của gene và chức năng của gene.

Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của

microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của

microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi.

Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá

trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng

của gene.

Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức

năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này được giải

phóng thì gene được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt

động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao

mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh

hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của

các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự

mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác

nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác

nhau về chức năng của protein và hoạt động của gene, do đó có thể ảnh hưởng đến

chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể.

Đồ án tốt nghiệp

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác

nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng

kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gene. Những tính chất đặc biệt của

microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite

có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình

tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv, 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi

phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động

như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gene đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh

chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King

và ctv, 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên

cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa.

1.4.10. Ứng dụng của microsatellite

Trong việc xác định cấu trúc quần thể (đặc biệt là các quần thể tự nhiên) từ các

loài khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật có vú, côn trùng,chim … Đặc biệt

là việc xác định cấu trúc xã hội và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các

loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần

thể.

Trong chuẩn đoán bệnh: vì DNA microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự

phát triển của một số bệnh ung thư. Nên chúng là những marker rất hữu ích trong

việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm. Tính đa hình của microsatellite hữu ích trong

nghiên cứu các liên kết để định vị những gene chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật

tự di truyền học.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền

Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình

Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh).

 Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 04/2015 đến tháng

07/2015.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguồn mẫu

Mẫu vây đuôi cá Tra sử dụng trong nghiên được cung cấp bởi Trung tâm quốc

gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ tại xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh

Tiền Giang.

2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.2.1. Mồi

Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê dưới bảng sau:

Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu.

Sequencing 5’-3’ Size range Ta (0C) Loci

R 5’ATCTGGGTCAAAATGATTGGAAC 3’ 300 52,1 CB12 F 5’ GCGATAQAGACAGAGAGTCATGG 3’

R 5’ CTCCATTTACAGACCATCCGTAQ 3’ 300 57,2 CB13 F 5’ GTGTGTCAAGTTGGGATCATGG3’

R 5’ GGAAGAAAATCATCTGACTGCAC3’ 250 52,1 CB14 F 5’ ATACAAACCTCTGAAATGGGTTC 3’

R 5’ CCCTTAQTCCGAATTACTGGAAGC3’ 250 57,8 CB15 F 5’CGGGGGAGTGTTGTCTGTCAG 3’

R 5’TATACCTGCTGGGAGAATGGATG3’ 350 52,5 CB18 F 5’AGAAGGAACGCTGGACTGAGG3’

Đồ án tốt nghiệp

R 5’CAGACATGAGGAGGATGAAGACG3’ 250 52,1 CB19 F 5’TCGAGAGTCTGAAGCACAAACC 3’

F-5’-GTAAACAGAGCCACCTGCGG-3’ 154 - 160 66 Phy01 R-5’-CAGATCCACACCCACAACACC-3’

F-5’-TAQGAGTCAGGAGTCGC-3’ 166 - 194 54 Phy03 R-5’-TGCAACGGTAACAAACC-3’

F-5’-GGAGGAGCAGCTTCAGAGTC-3’ 153 57,1 Ph-7 R-5’-AGCGTGTCATGAAGAGGGTG-3’

F-5’-TTGCGTGATGACTTTGCGTG-3’ 175 61 Ph-9 R-5’-ACGATGGCTTCAGTTACGCATC-3’

F-5’-CGATGAGCAGGAACGACATG-3’ 115 57,1 Ph-21 R-5’-AGCACTCTGTCCATCCATCC-3’

F-5’-GGTGAAGAGGCTCCATGAAG-3’ 133 59,1 Ph-25 R-5’-TGTACCCAGAGTCATCAGATCC-3’

F-5’-GAGAGGGGGTGAAATAATGATAQG-3’ 300 54,3 PSP-G579 R-5’-ATGGTTCTCCTGCAAGCAATGTCT-3’

F-5’-ACCGGGTTTTAQAGTGACG-3’ 250 52 PSP-G565 R-5’-GTGGGACAAAGGGAAAAGTG-3’

F-5’-ATTGTCTATTGCTGCTGGATACCA-3’ 250 50 PSP-G593 R-5’-GATTTTTGCCTTTGTTCTCCTGAG-3’

F-5’-GTTTTCCATCCAGGTTGTTTTCC-3’ 350 54,3 Pg-13 R-5’-TAAGTCCATGTGGGTTTCCTCTG-3’

2.2.2.2. Thang

Thang DNA được để xác định kích thước DNA các mẫu cá Tra. Kích thước

thang sử dụng trong nghiên cứu là 100 bp.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp.

2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA

 Dung dịch tách chiết 1 (Solution 1): 50 mM Tris – HCl pH 8; 20 mM

EDTA pH 8; 2 % SDS.

 Dung dịch tách chiết 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M.

 Proteinase K.

 Ethanol 70 %.

 Ethanol tuyệt đối.

2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR

 10X PCR buffer (Fermentas).

 25 mM MgCl2 (Fermentas).

 10 mM dNTP mix (Fermentas).

 Taq DNA polymerase 5 U/l (Fermentas).

 Primer 100M (Sigma).

 DNA mẫu (tách chiết từ mẫu vây).

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose

 Agarose (Bio basic).

 TBE 1X.

 6X DNA Loading Dye (Promega).

 100 bp DNA Ladder (Promega).

2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị

 Kéo, kẹp cắt mẫu.  Bể điều nhiệt.

 Đèn cồn.  Máy ủ.

 Cốc thủy tinh 100 ml, 1000  Máy cất nước siêu sạch.

ml.  Micropipet các loại: 100 –

 Eppendorf 0,2 ml; 1,5 ml; 2 1000 µl; 0,5 – 10 µl; 10 – 100

ml. µl; …(Bio – Rad).

 Đầu tip các loại.  Máy ly tâm lạnh.

 Máy vortex.  Máy PCR (Bio – Rad).

 Cân điện tử MS 204.  Máy điện di (Bio – Rad).

 Trip 8, 12.  Máy chụp ảnh điện di (Bio –

Rad).  Plates 96 well PCR.

 Lò vi sóng (Electrolux – Thụy  Lò viba.

Điển).  Máy hút và tủ cấy vô trùng

 Tủ mát (40C), tủ âm (-250C) (Astec Microflow).

(Sanyo – Nhật).  Máy khuấy từ gia nhiệt.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Mẫu vây đuôi của cá được cắt, rửa bằng cồn 96 % và được bảo quản trong cồn

70 % (mẫu luôn ngập trong cồn), riêng biệt trong từng eppendorf 1,5 ml (đã được hấp vô trùng). Mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ 40C cho đến khi tiến hành tách chiết

DNA và được tiến hành thay cồn định kỳ 3 tháng/lần.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA

2.3.2.1. Quy trình

Tách chiết DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction

(Miller và ctv, 1988).

Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988).

2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết

Tiến hành điện di mẫu DNA tách chiết trên gel Agarose 1 %, trong dung dịch

đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng diện 400 mA trong 30 phút.

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi chạy điện di xong, đưa gel vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV,

Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch

trên gel.

Dựa vào khoảng cách 2 vạch, có thể ước tính được khối lượng. Độ tinh sạch

của DNA tách chiết được tính bằng cách tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm. Nếu tỷ lệ

này nằm trong khoảng 1,7 – 2,2 thì mẫu tách chiết được xem là sạch. Nếu tỷ lệ <1,7

là mẫu nhiễm nhiều protein.

2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.3.3.1. Khái niệm

Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction), được

Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phát minh này nhận được giải Nobel

về hóa học vào năm 1993.

PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, độ chính

xác cao và được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). Nhờ kỹ thuật

PCR mà với lượng nhỏ DNA mẫu ban đầu ta có thể thu được đủ lượng DNA cần

thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA. Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là

phương pháp nền tảng quan trọng của công nghệ di truyền (Hồ Huỳnh Thùy Dương,

2003).

Mục đích của việc sử dụng phương pháp PCR trong nghiên cứu này là để

khuếch đại sản phẩm đặc hiệu từ các chỉ thị microsatellite khác nhau, nhầm chọn ra

những cặp mồi tốt nhất.

2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản

của sao chép DNA trong cơ thể. Tuy nhiên, PCR dùng nhiệt độ cao (94°C) để tháo

xoắn DNA, kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt

thích hợp cho từng giai đoạn của phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn primer được

thiết kế chủ động (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).

Đồ án tốt nghiệp

PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (25 – 35 chu kỳ) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ

gồm 3 bước:

 Bước 1: Biến tính (denaturing): 60 giây(thời gian có thể dài hoặc ngắn

hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Nhiệt độ 94 – 950C, trong, DNA mẫu bị

biến tính từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ.

 Bước 2: Gắn primer (annealing): 30 giây. Nhiệt độ 50 – 600C (tùy thuộc

vào độ dài của cặp primer). Ở bước này cặp primer gắn chuyên biệt vào sợi

DNA đích (sợi đơn).

 Bước 3: Kéo dài (extending): 30 giâyNhiệt độ 720C, là nhiệt độ thích hợp

cho Taq polymerase hoạt động giúp tổng hợp sợi DNA mới từ primer (Bùi

Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).

Sau 25 – 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 720C trong 5 – 20 phút để

hoàn thiện các sản phẩm PCR.

Kết quả cuối cùng là đoạn DNA khuôn mẫu được khuếch đại lên gấp nhiều lần (xem hình 2.3) với tổng số DNA khuếch đại là mx2n (với m là số DNA đích ban đầu

và n là số chu kỳ) (Trịnh Đình Đạt, 2006).

Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Theo Trịnh Đình Đạt (2006) thì cần lưu ý các chỉ tiêu:

 Mẫu DNA

 Mẫu DNA sẽ được tách chiết từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng

nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau.

 Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng nhiều kỹ

thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA lấy trực tiếp từ dịch

chiết tế bào. PCR còn cho phép khuếch đại những mẫu DNA không được

bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như: vết máu để lâu, tinh dịch đã

khô, hóa thạch...

 Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 – 10 ng.

 Taq polymerase

 Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm

DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900C ở

giai đoạn biến tính tách hai sơi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq

polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt,

được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Với

enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được.

 Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn vị/100

µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong

muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ

không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn.

 Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một

nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan

trọng trong việc tạo dòng (TA – cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn

kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể

làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với

một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu, …

Đồ án tốt nghiệp

Theo Trần Thị Thu Hương (2007):

 Primer và nhiệt đô lai: Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt sự khuếch

đại đặc trưng và hiệu quả cao. Việc chọn primer phải tuân thủ một số

nguyên tắc sau:

 Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp giữa primer “xuôi”

và “ngược”, không xuất hiện cấu trúc “kẹp tóc” (các phần khác nhau của

một primer bắt cặp với nhau).

 Tm của primer xuôi và ngược không cách biệt quá xa, tránh các cặp G – C

lặp lại nhiều lần.

 Primer đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng các trình tự

lặp lại trên gene.

 Trình tự khuếch đại không quá lớn (< 1 kb).

 Số lương chu kỳ của phản ứng PCR: số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc

lượng mẫu ban đầu. số chu kỳ không quá 40 chu kỳ. Nếu vượt quá, hiệu

quả khuếch đại giảm hẳn do:

 Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.

 Xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.

 Các bản sao vừa được tổng hợp bắt cặp với nhau

 Các thảnh phần khác

 Nồng độ bốn loại dNTP không quá 20 – 200 µM/ mỗi loại nu. Nồng độ cao

hơn dễ dẫn đến hiện tượng “kí sinh”. Sự mất cân bằng thành phần các Nu

làm tăng lỗi sao chép của polymerase.

 Dung dịch buffer: tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt

động.

cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình PCR, Mg2+ cần cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg2+ thấp thì không được hoạt hóa thành công, nồng độ Mg2+

cao làm phản ứng

 Ion kim loại Mg2+: nồng độ Mg2+

PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm tạo ra. Không có quy luật

Đồ án tốt nghiệp

chung cho nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR. Do đó, nồng độ Mg2+ phải

được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm.

2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR

 Ưu điểm: Cho kết quả chính xác, nhanh, khếch đại lượng đủ DNA cần thiết

cần cho các thí nghiệm chỉ từ một lượng nhỏ DNA.

 Nhược điểm: có thể cho kết quả dương tính giả: trong một số trường hợp vi

sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR

vẫn cho kết quả dương tính.

2.3.3.5. Ứng dụng

Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) và Nguyễn Thị Lang (2002), PCR được

sử dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực sinh học với các ứng dụng như:

 Sản xuất mẫu dò.

 Tách nhanh chóng, chính xác từng gene, từng đoạn DNA riêng biệt

 Là kỹ thuật nền cho các nghiên cứu di truyền phân tà như: xác định trình tự

gene, đa hình DNA, xác định marker phân tử cho chọn giống, phát hiện đột

biến gene.

 Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng (virus, vi

khuẩn, nấm...).

 Xác định giới tính động vật ở giai đoạn phôi thai.

 Khôi phục gene của các sinh vật cổ cách đây hàng triệu năm.

Xác định nguồn gốc hài cốt, quan hệ họ hàng, xác định cá thể dùng trong

việc xác định huyết thống, trong khoa học hình sự.

2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose

Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần

chính của agar chiếm khoảng 70 %, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30 %.

Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ

nhau là D–galactose và 3,6–anhydro–L–galactose.

Đồ án tốt nghiệp

Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40 – 45oC. Bản chất quá trình đông lại của

agarose là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt

độ. Các

chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích

thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá.

2.3.4.1. Nguyên tắc

Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra

khi di chuyển từ cực âm sang cực dượng của hệ điện di trong một điên trường có

điện thế và cường độ thích hợp . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ

thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường...

Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel

được nhuốm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide

(EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

Điện di trên gel agarose được xem là phượng pháp tối ưu nhất dùng để phân

tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel.

2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng

Theo Mạc Văn Trọng (2007), cần lưu ý một số yếu tố sau:

 Kích thước của phân tử: các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối

lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA

mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc đố tỷ lệ nghịch với hàm log10

của khối lượng phân tử của chúng.

 Nồng đô agarose: Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở

các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose.

Kích thước đoạn DNA (kb) sử dụng có Hàm lượng agarose trong gel (%) hiệu quả

0,5  0,8 1  10

0,9  2,0 0,5  5

2,1  2,5 0,1  0,5

 Cấu hình DNA

 Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối

lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên gel agarose ở các tốc độ khác nhau.

 DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid

cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.

Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại

mạch thẳng ở bên phải.

 Thành phần base và nhiệt độ: điện di DNA trên gel agarose không bị ảnh

hưởng rõ bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ.

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Bố trí thí nghiệm

Nguồn mẫu

Tách chiết DNA

Tối ưu hóa phản ứng PCR

Khảo sát nhiệt Khảo sát nồng Khảo nồng độ độ bắt cặp của Taq DNA độ MgCl2 các cặp mồi polymerase microsatellite

Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite.

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA

2.4.1.1. Tách chiết DNA

Cách tiến hành:

- Mẫu vây đuôi cá được cắt nhỏ cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl

dung dịch solution 1,5 µl proteinase K rồi votex nhanh.

- Ủ các eppendorf trên ở 550C trong 2 giờ (hoặc qua đêm).

- Sau khi ủ tiến hành chuyển các eppendorf sang đá đã chuẩn bị sẵn để trên đá

10 phút.

- Thêm 250µl dung dịch solution 2, trộn đều và để trên đá 5 phút. - Tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút và cẩn thận hút 300µl

dịch nổi vào các eppendorf mới.

- Thêm 600µl ethanol 100 % lạnh và tiến hành ủ ở 550C trong 2 giờ rồi tiến

hành ly tâm 11000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút.

- Loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf bằng 500 µl ethanol 70 % và

ly tâm 11000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút.

- Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô các eppendorf bằng máy gia nhiệt ở

550C hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng.

- Thêm 100µl TE và bảo quản ở –250C.

2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết

 Chuẩn bị gel agarose 1%

Cân 1,5g agarose cho vào 150 ml dung dịch TBE 1X, lắc đều và đun nhiều lần

bằng lo vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn (nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 150 ml). Để nguội đến 50 – 600C rồi tiến hành

thêm 7,5 µl Ethidimum bromide, lắc đều và đổ gel vào khuôn đã cài lượt sẵn

(không để có bọt khí). Đợi 15 – 20 phút để gel đông hoàn toàn, tháo lượt và cho gel

vào bồn điện di (để gel ngập trong dung dịch đệm TBE 1X).

 Nạp mẫu

Đồ án tốt nghiệp

Dùng micropipette hút 3 µl dung dịch nạp mẫu (Bromophenol blue) trộn

với 7 µl sản phẩm PCR rồi bơm vào giếng trên bản gel. Bơm thang chuẩn vào

bản giếng. Chạy ở điện thế 100 V trong 30 phút.

 Phát hiện vạch DNA sản phẩm

Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA đã được nhuộm bởi Ethium

Bromide. Bản gel được cho vào máy chụp UV và hình ảnh sẽ hiển thị trên màn

hình máy vi tính, sản phẩm DNA là những vạch trắng.

2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR

2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite

Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA

khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt

cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của

mồi là cần thiết để phản ứng PCR.

Sử dụng 3 mẫu DNA tách chiết tốt nhất trong phần tách chiết để thực hiện thí

nghiệm này. Đối với mỗi mồi, thực hiện phản ứng PCR 8 mẫu với gradian nhiệt độ

bắt mồi trong Bảng 2.4, dao động điều chỉnh theo nhiệt độ bắt cặp của các mồi theo

lý thuyết.

Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V,

cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt

nhất.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite.

Dãy nhiệt độ

khảo sát 1 2 3 4 5 6 7 8

Mồi

500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C CB12, CB14,

CB18, CB19 CB13, CB15 550C 56,40C 57,90C 59,30C 60,70C 62,10C 63,60C 650C

550C 56,40C 57,90C 59,30C 60,70C 62,10C 63,60C 650C Ph–7, Ph–9,

Ph–21, Ph–

600C 61,40C 62,90C 64,30C 65,70C 67,10C 68,60C 700C Phy01

500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C Phy03

500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C Pg–13, PSP–

565, PSP–

G579, PSP–

G593

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19.

Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

95 4 phút 1

95 30 giây

Ta 30 giây 30

72 30 giây

72 5 phút 1

8 ∞ 1

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593.

Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 5 phút 94

40 giây 94

34 30 giây Ta

1 phút 20 giây 72

1 20 phút 72

1 ∞ 8

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25.

Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 3 phút 94

30 giây 94

30 30 giây Ta

30 giây 72

1 2 phút 72

1 ∞ 8

Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03.

Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 4 phút 95

45 giây 95

30 30 giây Ta

30 giây 72

1 10 phút 72

1 ∞ 8

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2

Sử dụng mẫu DNA tách chiết tốt nhất ở phần tách chiết để thực hiện thí

nghiệm này.

Đối với mỗi mồi thực hiện 5 phản ứng PCR với thể tích MgCl2 (25 mM) thay

đổi lần lượt là 1 – 1,5 – 2 – 2,5 – 3 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp

phản ứng PCR là: 1,25 – 1,875 – 2,5 – 3,125 – 3,75 mM và nhiệt độ Ta là nhiệt độ

thích hợp nhất cho quá trình bắt mồi đã được xác định ở thí nghiệm trên (vì tổng thể

tích phản ứng PCR luôn là 20 µl nên thể tích của nước cất cho mỗi mẫu lần lượt là

11,75 – 11,25 – 10,75 – 10,25 – 9,75 µl).

Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V,

cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt

nhất.

Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite.

Phản ứng 1 2 3 4 5

1 1,5 2 2,5 3 Thể tích MgCl2 (µl)

1,875 2,5 3,125 3,75 Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25

11,75 11,25 10,75 10,25 9,75 Thể tích H2O (µl)

2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase

Nếu nồng độ Taq DNA polymerase quá cao, những sản phẩm không mong

muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ

lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Vì vậy cần tiến

hành khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase để phản ứng PCR được tối ưu.

Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát.

Phản ứng 1 2 3 4

0,25 0,3 0,35 0.4 Thể tích Taq DNA polymerase (µl)

1,25 1,5 1,75 2 Nồng độ Taq DNA polymerase (U)

Đồ án tốt nghiệp

Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad ) đã được cài

đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể

tích Taq DNA polymerase. Thể tích của mỗi phản ứng là 20 µl.

Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu

điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể

tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với

thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh

DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV.

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite

Sau khi đã có kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi, nồng độ Mg2+ tối

ưu và hàm lượng DNA tối ưu cho mỗi cặp mồi của phản ứng PCR, tiếp tục thực

hiện phản ứng PCR của các cặp mồi microsatellite đặc trưng cho cá Tra trên 10 mẫu

DNA thuộc 4 quần đàn (G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001), nhằm tiếp tục

kiểm tra độ hoạt động của primer microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng

sau khi đã tối ưu hóa.

Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên thiết bị luân nhiệt PCR

iCycle (Bio – rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 µl, bao gồm các thành

phần : buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn, nồng độ và thể

tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.11.

Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq

polymerase cho một phản ứng PCR.

Thành phần Thể tích (µl)

PCR buffer 10 X 2,5

dNTP 10 mM 1

Nồng độ tối ưu MgCl2 25 mM

Forward Primer 10 µM 0,2

Đồ án tốt nghiệp

Reverse Primer 10 µM 0,2

Taq polymerase 5 U/µl Nồng độ tối ưu

1 DNA khuôn 50 ng/µl

Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR iCycle (Bio – rad)

với chu kỳ nhiệt.

Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi

microsatellite.

Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu

điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể

tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với

thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh

DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết DNA

Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự

thành công cho phản ứng PCR sau này.

Sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel Agarose 1% cho thấy nồng

độ DNA tách chiết tương đối cao với kích thước khá đồng đều. Các vạch điện di

khá rõ nét, sản phẩm DNA ít bị đứt gãy trong quá trình tách chiết (Hình 3.1).

Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần

đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001.

Kết quả hình ảnh 3.1 cho thấy sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel

agarose 1 % cho vạch DNA đều, nồng độ DNA khá cao. Sản phẩm DNA tách chiết

ít bị đứt, gãy và các DNA cùng kích thước.

Quy trình tách chiết DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng protinase K và dung dịch

1(Solution 1) có vai trò như một dung dịch đệm gồm Tris, EDTA, phá vỡ màng tế

bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết

với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70 % và 100 % cho hiệu quả rửa

giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ

đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra.

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR

3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite

Tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite theo

gradient nhiệt độ ở bảng 2.4 (bảng gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi

microsatellite).

Sau khi thực hiện khảo sát nhiệt độ bắt cặp của 16 cặp mồi microsatallite thì

có 12 cặp mồi có thể bắt mồi và hoạt động ở các nhiệt độ lai của nó, sản phẩm PCR

của các cặp mồi khá rõ ràng, ít sản phẩm không đặc hiệu. Trong 16 cặp mồi có 4

cặp mồi không thể bắt mồi và hoạt động ở nhiệt độ lai, sản phẩm khếch đại mờ dù

đã tối ưu: Ph–9, Ph–25, PSP – G579, PSP – G593. Hình minh họa phản ứng PCR

gradient nhiệt độ của các cặp mồi trên mẫu DNA cá tra có chất lượng DNA tinh

sạch tốt.

Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12.

Từ kết quả hình 3.2 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Vạch sản phẩm đậm, rõ nét dần từ nhiệt độ 500C đến 57,10C. Tuy nhiên khi nhiệt độ lên đến 58,60C và 600C thì vạch sản phẩm bắt đầu mờ. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ quá thấp hay

quá cao ảnh hưởng đến kết quả PCR của mồi CB12. Giếng số 5 ứng với nhiệt độ 55,70C cho vạch sản phẩm rõ, lượng sản phẩm nhiều nhất nên được chọn là nhiệt độ

bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB12, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52,10C.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB13.

Từ kết quả hình 3.3 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm tương đối đều ở các nhiệt độ bắt mồi. Sản phẩm khếch đại DNA nhiều, vạch sản phẩm đậm. Tuy nhiên ở nhiệt độ 62,10C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. 62,10C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB13, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,20C.

Hình 3.4. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14.

Từ kết quả hình 3.4 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Các giếng từ 3 – 7 sản phẩm PCR có nhiệt độ bắt mồi từ 52,9 – 58,60C cho vạch sản phẩm khá rõ, lượng

sản phẩm nhiều. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiên, ứng với giếng số 4 là nhiệt độ 54,30C cho vạch

Đồ án tốt nghiệp

sản phẩm rõ, lượng sản phẩm nhiều nhất. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi

tốt nhất đối với mồi CB14, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 52,10C.

Hình 3.5. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB15.

Từ kết quả hình 3.5 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

vạch sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 5 ứng với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản

phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 60,70C được chọn là nhiệt độ

bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB15, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,80C.

Hình 3.6. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB18.

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả hình 3.6 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Vạch sản phẩm khá mờ ở các nhiệt độ đầu và cuối của dãy gradian nhiệt độ (50, 51,4, 57,1, 600C). Riêng số 4 với nhiệt độ 54,30C cho vạch sản phẩm khếch đại khá đậm và rõ nét. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB18, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 52,50C.

Hình 3.7. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB19.

Từ kết quả hình 3.7 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm có vạch không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 2 ứng với nhiệt độ 51,40C cho vạch sản

phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 51,40C được chọn là nhiệt độ

bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB19, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52,10C.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01.

Từ kết quả hình 3.8 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm có cùng kích thước. Vạch sản đậm dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ

giữa và mờ dần từ nhiệt độ giữa tới cuối dãy gradian. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp có giếng số 4 ứng với nhiệt độ 64,30C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 64,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Phy01, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 660C.

Hình 3.9. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03.

Từ kết quả hình 3.9 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá

mờ có thể do điều kiện tối ưu chưa phù hợp. Vạch sản mờ dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ cuối dãy gradian. Riêng giếng số 7 và 8 ứng với nhiệt độ 58,60C và 600C không xuất hiện vạch sản phẩm. Giếng số 3 ứng với nhiệt độ 52,90C vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 52,90C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt

nhất đối với mồi Phy03, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 540C.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.10. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7.

Từ kết quả hình 3.10 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá đậm. Vạch sản phẩm đậm dần từ giếng 1(550C) đến giếng 8(650C). Riêng giếng số 5 với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ và ít sản phẩm đặc hiệu nhất. Nên 60,7oC được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Ph–7, nhiệt độ này chênh lệch hơi lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,10C.

Hình 3.11. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21.

Từ kết quả hình 3.11 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá mờ ở tất cả các nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiên với giếng 5 với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ và ít sản phẩm đặc hiệu nhất. Nên 60,70C được chọn là nhiệt

độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Ph–21, nhiệt độ này chênh lệch hơi lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,10C.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.12. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579.

Từ kết quả hình 3.12 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm tương đối đều ở các nhiệt độ bắt mồi. Sản phẩm khếch đại DNA nhiều, vạch sản phẩm đậm. Tuy nhiên giếng số 3 ứng với nhiệt độ 52,90C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 52,90C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi PSP–G579, nhiệt độ này gần với nhiệt độ Ta chuẩn là 54,30C.

Hình 3.13. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13.

Từ kết quả hình 3.13 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho

sản phẩm không đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Sản phẩm khếch đại DNA có vạch đậm và nhiều. Tuy nhiên giếng số 4 ứng với nhiệt độ 54,30C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Pg–13, nhiệt độ này đúng với nhiệt độ Ta chuẩn là 54,30C.

Bảng 3.1. Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu.

Đồ án tốt nghiệp

Ph-

PSP-

Pg-

Mồi

CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19 Phy01 Phy03

7

21 G579

13

52,1

57,2

52,1

57,8

52,5

52,1

57,1 57,1 54,3 54,3

Ta chuẩn (0C)

55,7

62,1

54,3

60,7

54,3

51,4

64,3

52,9

60,7 60,7 52,9 54,3

Ta thực tế (0C)

Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite

theo gradient nhiệt độ. Nhiệt độ khảo sát trong nghiên cứu này không chênh lệch ở

mức cho phép so với nhiệt độ khảo sát của các tác giả đã công bố, điều này chứng

tỏ nhiệt độ mà nghiên cứu này khảo sát được là tối ưu cho từng cặp mồi phù hợp

với điều kiện thiết bị và hóa chất tại nơi nghiên cứu.

3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2

Theo kết quả từ nghiên cứu “Nghiên cứu chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) xác

định huyết thống cá tra (Pagasius hypophthalmus)” của tác giả Nguyễn Hữu Ninh

và Lưu Thị Hương Giang, năm 2012 ; và nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật di truyền phân tử trong tạo giống thủy sản có giá trị kinh tế cao” của tác giả

Phạm Anh Tuấn, năm 2005 cho thấy rằng nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng đến phản

ứng PCR. Nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 để tìm ra nồng

độ xúc tác tốt nhất.

Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.1 (Bảng

nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu), tiếp tục tối ưu hóa nồng

độ MgCl2 cho 12 cặp mồi microsatellite.

Như vậy dựa vào bảng 2.9 (Bảng nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi

microsatellite) thay vì tối ưu hóa nồng độ xúc tác của MgCl2 thì tối ưu hóa thể tích

xúc tác của MgCl2 sau đó suy ra nồng độ tương ứng.

Kết quả tối ưu cho thấy ở các thể tích khác nhau thì MgCl2 đều có khả năng

xúc tác cho phản ứng PCR với các mồi để tạo ra sản phẩm. Các kết quả được chọn

sau 3 lần lặp lại phản ứng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi CB14. MgCl2 của cặp mồi CB15.

Hình 3.14 và 3.15 là hai hình minh họa cho phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2

của hai cặp mồi CB14 và CB15.

Ở hình số 3.14, các vạch sản phẩm ở 3 giếng ứng với thể tích MgCl2: 1, 2; 2,5

µl tương đối đều nhau nhưng không rõ nét, còn giếng ứng với thể tích 1,5 và 3 µl

thì không có vạch sản phẩm khếch đại, chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu.

Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi

microsatellite CB14. Trong 3 giếng có vạch sản phẩm khếch đại thì giếng có thể

tích MgCl2 1 µl ứng với nồng độ là 1,25 mM đậm hơn chứng tỏ nồng độ MgCl2

1,25 mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite CB14.

Ở hình 3.15, giếng số 3, 4 và 5 không có vạch sản phẩm khếch đại nên thể tích

và nồng độ MgCl2 ứng với 3 giếng trên không tối ưu lắm. Vạch sản phẩm khếch đại

ở giếng số 1 khá rõ nét nên thể tích MgCl2 là 1 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 là

1,25 mM thích hợp cho mồi CB15.

Tương tự, thực hiện phản ứng cho các mồi còn lại được kết quả nồng độ

MgCl2 tối ưu và hình minh họa như sau:

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.16. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.17. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi CB12. MgCl2 của cặp mồi CB13.

Hình 3.18. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.19. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi CB18. MgCl2 của cặp mồi CB19

Hình 3.20. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi Phy01.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.21. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi Phy03.

Hình 3.22. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.23. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi Ph-7. MgCl2 của cặp mồi Ph-21.

Hình 3.24. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.25. Phản ứng tối ưu nồng độ

MgCl2 của cặp mồi PSP-G579. MgCl2 của cặp mồi Pg–13.

Bảng 3.2. Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi.

Đồ án tốt nghiệp

PSP-

Phy0

Ph-

Pg-

Mồi

CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19

Ph-7

G57

1

3

21

13

9 Thể tích MgCl2

2,.5

1,5

1.5

1,5

(µl)/ 20 µl

Nồng độ xúc tác

3,125 1.875

1,25

1,875

1,875 1,25

1,25

(mM)

3.2.3. Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase

Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.1 (Bảng

nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu) và kết quả nồng độ MgCl2

tối ưu đã được xác định ở bảng 3.2 (Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp

mồi), tiếp tục tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase để nồng độ xúc tác tốt nhất

cho phản ứng PCR.

Tiến hành phản ứng tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase theo các nồng

độ dựa vào bảng 2.10 (Bảng nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát) được kết quả

minh họa ở hình 3.26.

Hình 3.26. Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose

2,5 %.

Ở nồng độ Taq 1,25 U (giếng 1) cho tín hiệu khuếch đại rất yếu, có những lần

không cho kểt quả. Lượng enzyme cần thiết phụ thuộc vào hàm lượng bản mẫu

Đồ án tốt nghiệp

DNA và kích thước vạch sản phẩm PCR. Trên thực tế thành phần này rất ít khi hiệu

chỉnh. Nhưng vì ở đây sử dụng nồng độ thấp nhất (1,25 U) của nhà sản xuất mà

không cho kết quả như mong muốn nên băt buộc phải tăng nồng độ enzyme lên.

Khi tăng nồng độ Taq DNA polymerase lên 1,5 U (giếng 2) thì sản phẩm khếch đại

rất tốt. Tiếp tục tăng lên 1,75 U (giếng 3) hay 2 U (giếng 4) thì sản phẩm khếch đại

vẫn không thay đổi so với 1,5 U (giếng 2). Đê tiết kiệm hóa chất mà vẫn đạt được

hiệu suất phản ứng PCR cao thì nồng độ 1,5 U Taq DNA polymerase được cho là

tối ưu. Theo một số nghiên cứu như nghiên cứu của Kainz (2000) cho rằng khi số

phần tử DNA tổng số vượt gấp 30 lần số phần tư DNA polymerase là thời điểm xảy

ra sự bảo hòa sản phẩm khếch đại của phản ứng PCR. Vì vậy khuyến cáo không nên

tăng nồng độ enzyme DNA polymerase quá cao vì các chất trong dung dịch bảo

quản enzyme có thể gây ức chế phản ứng PCR hoặc là sẽ tạo ra lượng lớn sản phẩm

không đặc hiệu khác nhau. Tuy nhiên cũng tùy thuộc vào đặc tính enzyme của hãng

sản xuất. Cụ thể đối với nhà sản xuất Bioline với hướng dẫn đi kèm hóa chất, lượng

enzyme được khuyến cáo có thể tăng giảm nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U

đến 2 U mà không ảnh hưởng đến phán ứng PCR.

3.3. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite

Sau khi có kết quả nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và nồng độ Taq tối ưu cho

mỗi cặp mồi microsatellite, thực hiện phản ứng PCR với các mẫu DNA tách chiết từ

mẫu vây cá Tra được lựa chọn ngẫu nhiên. Mục đích của việc thực hiện phản ứng

PCR này nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của từng cặp mồi microsatellite, đồng

thời kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa để làm nền tảng cho

khảo sát các tham số di truyền trên các quần thể cá tra thu thập tích hợp cho

chương trình chọn giống.

Sau khi thực hiện các phản ứng kiểm tra độ hoạt động của từng cặp mồi

microsatellite và kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa chọn

được 6 cặp mồi có độ hoạt động tốt nhất từ 12 cặp mồi đã tối ưu: CB13, CB14,

CB15, CB19, Pg–13 và Ph–7. Hình 3.27, 3.28 là các hình ảnh đại diện minh họa

Đồ án tốt nghiệp

cho kết quả phản ứng PCR kiểm tra tính ổn định và đa hình của 4 mẫu cá tra đại

diện của các cặp mồi.

Hình 3.27. Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra.

Hình 3.28. Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14,

CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra.

Tất cả các cặp mồi microsatellite đều hoạt động tốt trên hầu hết các mẫu cá tra

phân tích (Hình 3.28). Quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR đạt kết quả cao, lượng

sản phẩm PCR lớn, các vạch sản phẩm rõ nét và không tạo smear nhiều. Đa số các

vạch DNA giữa các các mồi có sự đa hình,và nội bộ các vạch DNA trong cùng một

mồi cũng có sự đa hình. Nghĩa là các mồi này có tính đa hình phù hợp ứng dụng

cho nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền vật liệu cá tra trong các nghiên cứu tiếp

theo.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

 Quá trình tách chiết DNA của cá Tra với quy trình tham khảo đạt hiệu quả

cao. Lượng DNA mẫu thu được khá nhiều, ít bị đứt gãy và không lẫn nhiều

tạp chất.

 Kết quả tối ưu hóa đạt hiệu quả cao, các phản ứng PCR với những yếu tố đã

tối ưu hóa tạo ra lượng sản phẩm PCR nhiều hơn hẳn quy trình chuẩn. Vạch

sản phẩm PCR rõ nét và không có nhiều sản phẩm tạp.

 Chọn được 12 cặp mồi microsatellite được chọn ra từ 16 cặp mồi đều hoạt

động tốt trên số lượng mẫu lớn. Sản phẩm PCR tạo ra nhiều và ít sản phẩm

không đặc hiệu.

 Chọn được 6 cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao cho các nghiên cứu

tiếp theo.

4.2. Đề nghị

 Microsatellite (SSR) là chỉ thị phân tử triển vọng để phân tích đa dạng di

truyền. Tuy nhiên, trong phạm vi của đề tài sử dụng số lượng các cặp mồi

microsatellite còn hạn chế. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển thêm

nhiều cặp mồi microsatellite hơn nữa để đánh giá đa dạng di truyền với độ

tin cậy cao hơn, phục vụ cho công tác chọn giống.

 Cần tiến hành thí nghiệm trên một số lượng mẫu lớn, khảo sát và kết hợp

thêm một số cặp mồi microsatellite để có kết quả chính xác về mức độ đa

dạng di truyền của cá Tra thu thập trong chương trình chọn giống.

 Kết quả phân tích của các bước sau cần được thực hiện trên hệ thống

điện di mao quản để tăng hiệu quả phân tách các phân đoạn DNA

microsatellite.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999). Di truyền phân tử - Những nguyên

tắc căn bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ

Chí Minh.

2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2005). Sinh học phân tử: Giới thiệu phương

pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

3. Bùi Thị Liên Hà (2004). Bước đầu thăm dò ứng dụng một số chỉ thị DNA

phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Đề tài

tập sự, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.

4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục,

TP. Hồ Chí Minh.

5. Huỳnh Quốc Khanh (2009). Thực nghiệm ương cá Tra giống

(Pangasianodon Hypophthalmus) tại trung tâm giống thủy sản tỉnh An

Giang. Trường Đại Học Thủy Sản Cần Thơ.

6. Nguyễn Thị Lang (2002). Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ

sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Văn Sáng, Phạm Đình Khôi, Đinh Hùng, Vũ Hải

Định (2005). Chọn giống cá tra nhằm nâng cao tỷ lệ philê: Các thông số di

truyền. Tuyển tập báo cáo hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng

khoa học công nghệ vào nuôi trồng thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng

Thuỷ sản II: 359 – 368.

8. Nguyễn Văn Thường (2008). Tổng quan dẫn liệu về định loài cá Tra

(Pangasianodon hypophthalmus) phân bố ở vùng hạ lưu sông Mê Kong, Tạp

chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ(1): 84 – 89.

9. Phạm Thành Hổ (2005). Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí

Minh.

10. Phạm Thành Hổ (2005). Nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Giáo

Dục, TP. Hồ Chí Minh.

Đồ án tốt nghiệp

11. Trịnh Đình Đạt (2006). Công nghệ sinh học tập 4: “Công nghệ Di truyền”.

Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh.

12. Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương (1993). Định loại cá nước ngọt

vùng đồng bằng sông Cửu Long. Khoa thủy sản trường đại học Cần Thơ.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

13. Ferraris C.J. (2007). Checklist of Catfishes, recent and fossil (Osteichthyes,

2007 Magnolis Press.

14. Hayden M.J., Sharp P.J. (2001). Targeted development of informative

microsatellite (SSR) marker, Nucleic Acid Research, 29: e44.

15. Hung L.T., Lazard J., Mariojoul C., Moreau Y. (2003). Comparison of starch

utilization in fingerlings of two Asian catfishes from the Mekong River

(Pangasius bocourti) Sauvage, 1980,( Pangasius hypophthalmus) Sauvage,

1878. Aquaculture Nutrition 9: 215 – 222.

16. Kashi Y., Hallerman E. M., Soller M. (1990). Marker-assisted selection of

candidate bulls for progeny testing programs. Animal Production 51: 63 –

74.

17. Kottelat M., Vidthayanon C. (1993). Boraras micros, a new genus and

species of minute freshwater fish from Thailand (Teleostei: Cyprinidae).

Ichthyological Exploration Freshwater 4 (2): 161 – 176.

18. Murray P.R., Jones R.N., Allen S.D. (1993). Multilaboratoey evaluation of

the in vitro activity of 13 beta-lactam antibioties against 1471 clinical

isolatoes of aerobic and anaerobic bacteria. Diagnostic Microbiology and

Infectious Disease 16: 191 – 203.

19. Poulsen A.F., Hortle K. G., Valbo-Jorgensen, Chan J.S., Chhuon C.K.,

Viravong S., Bouakhamvongsa K., Suntornratana U., Yoorong N., Nguyen

T.T., Tran B.Q. (2004). Distribution and ecology of some important riverine

fish species of the Mekong River Basin. MRC Technical Paper No. 10.

Đồ án tốt nghiệp

20. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S.,

Rafalski A. (2004). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR

(Microsatellite) markers for germplasm analysis. Genetics and Molecular

Biology 27 (4): 579 – 588.

21. Rainboth W.J. (1996). Fishes of the Cambodian Mekong. FAO species

identification sheets for fishery purposes. Food and Agriculture

Organization, Rome. 265p.

22. Roberts T.R., Vidthayanon C. (1991). Systematic revision of the asian catfish

family Pangasiidae with biological observations and descriptions of three

new species. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of

Philadelphia 143: 97 – 144.

23. Tautz D. (1984). Hypervariability of simple sequences as a general source of

polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 12: 4127 – 4138.

24. Vidthayanon C. (1993). Taxonomic revision of the Catfish family

Pangasiidae. The sis sumitted to Tokyo University of Fisheries, Laboratory

Aquactic Biology, Department of Aquatic Biosciences, Tokyo University of

Fisheries.

THAM KHẢO TỪ INTERNET

25. Trí Quang, Vực dậy chất lượng cá tra giống, 7/2015

http://www.thuysanvietnam.com.vn/vuc-day-chat-luong-ca-tra-giong-article-

11276.tsvn

26. Lạc Long VCCI Cần Thơ, Phát triển cá Tra phải đầu tư từ giống, 7/2015

http://vnpangasius.com.vn/thong-tin/chi-tiet/308/phat-trien-ca-tra-phai-dau-tu-

tu-giong/

27. Thành Công, Cần nhiều ñ lực để nâng cao chất lượng cá tra giống, 7/2015

http://snnptnt.tiengiang.gov.vn/SNN/42/668/1125/81383/Tin-tuc----su-kien/Can-

nhieu-no-luc-de-nang-cao-chat-luong-ca-tra-giong.aspx

28. Tình hình sản xuất, tiêu thụ thủy sản tháng 1 năm 2015, 7/2015

Đồ án tốt nghiệp

http://www.fistenet.gov.vn/thong-tin-huu-ich/thong-tin-thong-ke/thong-ke-

1/tinh-hinh-san-xuat-tieu-thu-thuy-san-thang-1-nam-2015/

29. Phạm Tiến Thành, Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá Tra

(Pangasianodon hypophthalmus) có nguồn gốc tự nhiên, từ các trại giống và

từ chương trình chọn giống ở Việt Nam, 7/2015

http://aquanetviet.org/post/264675/b-c-u-nh-gi-a-d-ng-di-truy-n-qu-n-n-c-tra-

pangasianodon-hypophth

30. Nguyễn Văn Sáng, Viện nghiên cưu nuôi trồng thủy sản II, Đánh giá hiệu

quả chọn giống cá tra, 7/2015

http://vienthuysan2.org.vn/index.php/vi/hoat-dong-nckh/Chon-giong-san-xuat-

giong/Danh-gia-hieu-qua-chon-giong-ca-tra-28/

31. http://blogtiengviet.net/media/usersd/domboy909/307.pdf

Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ

Sinh viên thực hiện

: TẠ THANH THẾ

MSSV: 1151110518 Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

MỞ ĐẦU

Ph-

Ph-

PSP-

Pg-

Mồi

CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19 Phy01 Phy03

7

21

G579

13

Ta chuẩn (0C)

Ta thực tế (0C)

PSP-

Phy0

Phy0

Ph-

Pg-

Mồi

CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19

Ph-7

G57

1

3

21

13

9

Thể tích MgCl2

(µl)/ 20 µl

Nồng độ xúc tác

(mM)

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok