BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO Haematococcus pluvialis LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CÁ TRA NUÔI (Pangasianodon hypophthalmus) ĐỐI VỚI BỆNH GAN THẬN MỦ DO VI KHUẨN (Edwardsiella ictaluri)
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : ThS. VÕ MINH SƠN
Sinh viên thực hiện
: NGÔ THANH PHONG
MSSV: 0851110182 Lớp: 08DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là một trong những loài thủy sản
nước ngọt xuất khẩu chiến lược của Việt Nam.Theo Tổng cục Thủy sản năm (2011),
diện tích nuôi cá tra đạt 5.400 ha và sản lượng đạt trên 1,141 triệu tấn trong năm 2010;
diện tích nuôi và sản lượng cá tra ước đạt 6.000 – 6.300 ha và 1,2 – 1,3 triệu tấn năm
2011 (Phạm Thị Kim Oanh, 2011). Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự
suy thoái môi trường do nước thải và bùn ao nuôi cá tra thâm canh, dẫn đến bùng phát
dịch bệnh gây thiệt hai cho người nuôi cá tra. Trong đó bệnh gan thận mủ do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri xảy ra thường xuyên gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi
cá. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của người
nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên việc làm dụng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất
diệt khuẩn đã dẫn đến hệ lụy là tạo ra những chủng vi khuẩn, virus có khả năng kháng
lại kháng sinh, tăng độc lực. Do đó nhiều phương pháp thân thiện với môi trường đã và
đang được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như vaccine, probiotic, chất tăng cường
hệ miễn dịch. Trong đó chất kích thích miễn dịch cũng đang được sử dụng rất rộng rãi
trong nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích tăng cường sức đề kháng thông qua tăng
cường hệ miễn dịch không đặc hiệu, tiết ra các chất kháng khuẩn, kích thích khả năng
sinh trưởng và phát triển. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề
tài “Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng
của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần
Edwardsiella ictaluri” nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của cá tra đối
1
với vi khuẩn gây bệnh.
Đồ án tốt nghiệp
1.2 Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên
của cá tra nuôi kháng bệnh gan thận mủ.
1.3 Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis đến khả năng kháng bệnh
bệnh gan thận mủ của cá tra nuôi.
- Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên
cá tra nuôi thông qua các thông số miễn dịch
- (Superoxide anion production)
Hoạt động thực bào (Phagocyte activity)
Sản sinh O2
2
Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity assay)
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
2.1.1 Giới thiệu chung Cá tra
2.1.1.1 Phân bố
Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị
kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở một số quốc gia như: Việt Nam, Lào, Thái Lan,
Campuchia…Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền
Giang…(Đồng Thanh Hà và ctv, 2009).
2.1.1.2 Phân loại
Giới: Animalia
Ngành: Chordata
Phân ngành: Vertebrata
Lớp: Actinopterygii
Phân lớp: Neopterygii
Liên bộ: Ostariophysi
Bộ: Siluriformes
Hình 2.1: Cá Tra [50]
Họ: Pangasiidae
Loài: Pangasianodon hypophthalmus
(Sauvage, 1878)
2.1.2 Đặc điểm cá Tra
2.1.2.1 Đặc điểm sinh lý
Cá tra có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, miệng rộng và
có 2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới
3
10%0), chịu đựng được nước phèn có pH > 4. Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể
Đồ án tốt nghiệp
sống được trong các ao hồ chật hẹp, thiếu oxi nên nuôi được mật độ rất cao (Phạm Văn
Khánh và ctv, 2011).
2.1.2.2 Đặc điểm sinh học cá tra
Hiện nay đã có 11 loài thuộc họ cá tra được tìm thấy ở Việt Nam. Khi nuôi
trong ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn: mùn bã hữu cơ, cám, rau,
động vật đáy, thức ăn hỗn hợp.
Trong tự nhiên, cá tra có thể sống trên 20 năm. Tuổi thành thục của cá tra từ 3 -
4 năm. Vào mùa thành thục từ tháng 4 trở đi cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm
đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục
và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông MêKông của Việt Nam. Bãi đẻ
của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia trở lên. Tại các bãi đẻ, cá bố
mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy tinh ven bờ. Sau khi nở, cá
bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi dòng
theo sông MêKông về phía Việt Nam (Phạm Văn Khánh và ctv, 2011).
2.1.3 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có hệ thống sông rạch chằng chịt, là điều
kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp và đánh bắt thủy sản. Từ năm 1940 nghề
nuôi cá nước ngọt bắt đầu phổ biến và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) và cá basa (Pangasius bocourti) là loài nuôi trồng thủy sản được nuôi
thông dụng nhất đang đươc phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL (chủ yếu ở
2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp). Đến nay, cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh thành
như Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang
4
(Tạp chí thủy sản, 2012).
Đồ án tốt nghiệp
2.1.4 Một số bệnh thường gặp trên cá tra
Bệnh đốm đỏ
Tác nhân gây bệnh
Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễn trùng máu, bệnh sởi... Là bệnh
do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra. Ngoài ra, một số trường hợp phân lập được
vi khuẩn A. sobria, A. caviae hoặc Pseudomonas sp trên cá bị bệnh đốm đỏ.
Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh đốm đỏ có 4 loại hình biểu hiện qua mức độ và trạng thái bệnh của cá: bệnh
cấp tính, bệnh thứ cấp tính, bệnh ác tính, bệnh mãn tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).
Bệnh nấm thủy mi
Tác nhân gây bệnh
Nguyên nhân gây ra bệnh này là 2 giống nấm thường có trong nước, nhất là nước
bẩn và trong bùn ao là Saprolegnia và Achlya, thuộc họ Saprolegniaceae. Sợi nấm dài
và trong, có phân nhánh hoặc không phân nhánh, không có vách ngăn. Phần dưới cắm
sâu vào tổ chức cơ thể cá, phần trên lơ lửng trong nước trông như bông, vì thế người
nuôi cá miền Nam gọi là bệnh "bệnh bọ gòn".
Dấu hiệu bệnh lý
Khi mới ký sinh, mắt thường khó nhìn thấy, phần cuối sợi nấm đâm sâu vào khe
của tổ chức da và mang của cá. Phần đầu lơ lửng trong nước có màu trắng. Cá có cảm
giác ngứa ngáy, gầy, đen sẫm. Bệnh thường xảy ra ở cá mè, rô phi, tra bị thương... Khi
nấm đã phát triển trong tổ chức của cá, điều kiện phục hồi bệnh này khó khăn. Nấm
ngày càng phát triển lớn hơn. Vi khuẩn có điều kiện xâm nhập vào làm bệnh nặng
thêm. Kết quả dẫn đến sự chết của các tổ chức của cá và làm chúng rời ra khỏi cơ thể,
0
tuy cá còn sống mà trên thân có chỗ chỉ còn xương.
Khi ấp trứng cá gặp thời tiết lạnh, nhiệt độ nước dưới 20 C trong một thời gian
5
ngắn nấm thủy mi phát triển bao phủ toàn bộ trứng. Nấm làm hư trứng vì nấm hút chất
Đồ án tốt nghiệp
dinh dưỡng của trứng và tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng trong nước phát triển trên
bề mặt của vỏ trứng, làm cho trứng bị ung và thối rữa nhanh (Từ Thanh Dung và ctv,
2005).
Bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra
Tác nhân gây bệnh
Tác nhân chính gây bệnh được xác định là Edwardsiella ictaluri (Crumlish và
ctv, 2002).
Dấu hiệu bệnh
Dấu hiệu bên ngoài: Cá bệnh nổi trên mặt nước , bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt
nhạt nhưng chỉ có dấu hiệu giảm ăn trong một thời gian ngắn sau đó ăn trở lại bình
thường. Trên cơ thể có những đốm xuất huyết ở mõm, các gốc vi, nắp mang, hậu môn,
mang màu sắc nhạt, bụng chướng to, đôi khi có những hiện tượng mắt lồi (Nguyễn Thị
Thúy Liễu và ctv, 2008).
Dấu hiệu bên trong: Cá bệnh dạ dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu
sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng hơi đỏ bên trong xoang nội quan. Trên gan, thận, tỳ
tạng có những đốm nhỏ màu trắng đục kích cỡ không đều (đường kính khoảng 1-3
mm). Đôi khi có hiện tượng nhũng thận ở cá bệnh nặng. Cá mới chớm bệnh chỉ thấy
xuất hiện những đốm trắng trên thận (Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv, 2008).
Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006) cá bệnh còn có dấu hiệu bụng trương to, xuất
huyết gốc vây, mắt lồi, xung quanh miệng xuất hiện các đốm xuất huyết.
Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra
Bệnh xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá tra thâm
canh trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó lan rộng ra hầu hết các
tỉnh ĐBSCL trong thời gian gần đây (Từ Thanh Dung và ctv, 2009).
Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá tra, tập trung ở giai
6
đoạn cá giống và cá thịt có khối lượng nhỏ hơn 300 gram. Bệnh có thể gây chết tích
Đồ án tốt nghiệp
lũy 10-90% cá nuôi nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời khi bênh xảy ra (Từ
Thanh Dung và ctv, 2009).
Phòng và trị bệnh E.ictaluri trên cá tra
Trong quá trình nuôi tác phòng ngừa dịch bệnh luôn được xem là quan trọng hơn
chữa trị. Việc phòng ngừa bệnh tốt không những hạn chế sự xuất hiện của dịch bệnh
mà còn là tiêu chí hàng đầu làm tăng giá trị sản phẩm cá tra, giảm chi phí nuôi và tăng
lợi nhuận cho người nuôi. Có thể áp dụng các biện pháp sau để phòng trị bệnh mủ gan
trên cá tra: quản lý tốt môi trường ao nuôi, mật độ thả nuôi thích hợp, chế độ dinh
dưỡng phù hợp, sử dụng chế phẩm vi sinh học, sử dụng vaccine để phòng (Từ Thanh
Dung và ctv, 2005).
2.2 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.2.1 Hệ thống phân loại theo Bergey
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Edwardsilla
Loài: Edwardsiella ictaluri
Hình 2.2: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [48]
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa
Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi, có dạng hình que,
kích thước 1 x 2-3 µm, không sinh bào tử. Trên môi trường Blood agar sau 48 giờ
khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn, bờ đều bóng, đường kính từ 1,5 – 2 mm. Phát triển
tốt trên môi trường thạch máu, BHI, nhiệt độ thích hợp ở 28 - 300C, pH 6 - 7 (Holt và
7
ctv, 1994)
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 2.1: Bảng thử nghiệm sinh hóa của Edwardsiella ictaluri (Holt và ctv, 1994)
Thử nghiệm sinh hóa Kết quả
- Indol
- Methyl red
- Simmons Citrate
- H2S
+ Lysine decarboxylase
D Ornithin decarboxylase
- Motility
- Malonate
D D-Glucose, gas production
Acid production from:
- L-Arabinose
- Lactose
- D-Mannitol
- Melblose
- L-Rhamnose
- D-Sorbitol
- Trehalose
- D-Xylose
- ONPG
8
Chú thích: D (Depend): phụ thuộc tùy từng nơi mà có kết quả dương hoặc âm.
Đồ án tốt nghiệp
2.2.3 Con đường xâm nhiễm của Edwardsiella ictaluri
Từ nguồn nước vi khuẩn có thể xâm nhập vào cá qua 2 con đường:
Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu
giác vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não. Sự truyền nhiễm lan
rộng từ màng não đến sọ và da (thường được gọi là “hole in the head”) (Shotts và ctv,
1986).
E.ictaluri có thể theo đường tiêu hóa và đi vào trong máu xuyên qua ruột dẫn
đến bệnh nhiễm trùng máu. Bằng con đường này, vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến
những mạch mao quản bên trong da, đây là nguyên nhân dẫn đến hoại tử và làm mất
sắc tố của da cá (Shotts và ctv, 1986).
Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau
A
B
khi nhiễm khuẩn.
Hình 2.3: Cá Tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Cá Tra bị bệnh mũ gan thận
9
với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B).
Đồ án tốt nghiệp
2.2.4 Mùa vụ xuất hiện bệnh và mức độ gây thiệt hại
Bệnh thường xuất hiện trên cá tra ở các mô hình nuôi thâm canh trong điều kiện
môi trường bất lợi. Theo Plumb (1999) khả năng gây bệnh của E. ictaluri trên cá nheo
Mỹ tùy theo điều kiện nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 18-
28oC.
Ở nước ta nhiệt độ nước dao động là từ 26-28 oC vì thế đây là điều kiện thuận
lợi cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) bệnh mủ
gan thường xuất hiện vào mùa lũ và cao điểm từ tháng 7, 8. Cũng theo Lê Thị Bé Năm
(2002) bệnh xuất hiện vào mùa lũ trong năm khi nước mang nhiều phù sa, chất lượng
nước biến động, cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm, giảm khả năng đề kháng với bệnh, chính
vì thế bệnh dễ dàng bộc phát. Tuy nhiên trong 2 năm gần đây, bệnh này hầu như xuất
hiện trên cá tra quanh năm. Trong 1 vụ nuôi, bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 – 4 lần.
Tỉ lệ hao hụt từ 10 – 50%, tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và quản lý.
2.3 Tổng quan tảo Haematococcus pluvialis
2.3.1 Phân loại
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
Bộ: Volvocales
Họ: Haematococcaceae
Giống: Haemotococcus
Loài: Pluvialis
(Lorenz và Cysewski, 2000)
10
Hình 2.4: Haematococcus pluvialis [49]
Đồ án tốt nghiệp
2.3.2 Đặc điểm
Haematococcus pluvialis là loài vi tảo nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính
bằng cách nhân đôi. Loài tảo này có vòng đời phức tạp với 2 dạng tế bào. Trong điều
kiện thuận lợi, phần lớn là các tế bào sinh dưỡng màu xanh có hai roi, có thành tế bào,
kích thước từ 10 - 20 µm, có khả năng chuyển động. Khi điều kiện môi trường không
thuận lợi (thiếu dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng cao, nhiệt độ cao…), tế bào tảo
chuyển sang dạng nang bào tử hình cầu, mất roi, không có khả năng chuyển động. Ở
giai đoạn này, đường kính tế bào tảo tăng mạnh từ 10 - 20 µm lên 40 - 50 µm, thành tế
bào dầy và chứa 1 lượng lớn astaxanthin (4 - 6% trọng lượng khô) có thể tích lũy
(Đặng Diễm Hồng và ctv, 2010).
Hình 2.5: Vòng đời tảo Haematococcus pluvialis. (A) Giai đoạn tảo có màu xanh và 2
roi; (B) Giai đoạn trung gian không thể di động; (C) Giai đoạn trung gian tạo một
11
lượng carotenoid; (D) Giai đoạn nang chứa một lượng lớn carotenoid (Kamath, 2007).
Đồ án tốt nghiệp
Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về điều kiện nuôi trồng tảo
H.pluvialis để tách chiết hợp chất astaxanthin đã được công bố. Tuy nhiên ở Việt Nam
vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào nuôi trồng thành công tảo H.pluvialis trong
phòng thí nghiệm lẫn qui mô lớn. Khó khăn lớn nhất khi nuôi trồng loại tảo này là tốc
độ sinh trưởng rất chậm, chu trình sống phức tạp, chuyển qua nhiều giai đoạn khác
nhau, xen kẽ giữa các tế bào chuyển động và không chuyển động…Mặc khác, để sản
xuất astaxanthin một cách có hiệu quả từ tảo H.pluvialis đòi hỏi qui trình công nghệ
nuôi cấy 2 pha: pha đầu tảo được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, các tế bào chủ yếu là
pha sinh dưỡng, có màu xanh. Sau khi đạt mật độ nhất định, tảo được chuyển sang nuôi
cấy ở pha thứ 2 bất lợi về điều kiện môi trường như đói dinh dưỡng (nito hoặc
photpho), nhiệt độ hay cường độ chiếu sáng cao… Lúc này tế bào tảo từ màu xanh
chuyển sang dạng nang bào, màu đỏ chứa chủ yếu astaxanthin (Đặng Diễm Hồng và
ctv, 2010).
2.3.3 Ứng dụng tảo Haematococcus pluvialis
Từ những năm 1930, tảo H.pluvialis đã được biết đến rộng rãi là nguồn cung
cấp astaxanthin tự nhiên. Trong những năm gần đây, loài tảo này lại thu hút sự quan
tâm nghiên cứu do nhu cầu sử dụng astaxanthin ngày càng cao. Nhiều vi sinh vật như
nấm, địa y, vi khuẩn, vi tảo, khác cũng có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm
lượng astaxanthin ở tảo H.pluvialis là cao nhất. Astaxanthin được sử dụng bổ sung vào
thức ăn cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản như cá hồi, tôm hùm… nhằm tăng
chất lượng thịt hoặc tạo màu sắc rực rỡ cho cá cảnh. Astaxanthin được tách chiết từ tảo
còn được bổ sung vào các loại sản phẩm mỹ phẩm, dược phẩm cho con người (Đặng
Diễm Hồng và ctv, 2010).
Tảo H.pluvialis được ứng dụng như một sắc tố ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản. Ngoài ra nó còn có khả năng như một chất chống oxi hóa, tiền vitamin A, tăng
12
cường miễn dịch, tiền thân hormone, sinh sản và phát triển (Lorenz và ctv, 2000).
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4 Astaxanthin
2.3.4.1 Đặc điểm
Astaxanthin là sắc tố thuộc họ xanthophyll (Higuera–ciapara và ctv, 2006), có
nguồn gốc là lycopen (Olaizola, 2003). Astaxanthin tổng hợp keto - carotenoid (3,3’-
dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) phổ biến nhất sắc tố màu hồng đỏ có nhiều ở sinh
vật sông hồ và biển, cá hồi (Dragos và ctv, 2010). Carotenoid là những sắc tố tan trong
lipid, tham gia vào các quá trình của quang hợp của sinh vật. Đến nay có hơn 700
carotenoid trong tự nhiên được xác định. Nó chịu trách nhiệm tạo màu sắc cam và đỏ
cho thực vật và tảo và cho nhiều màu xanh, đỏ, tím ở động vật thủy sản. Chỉ có thực
vật phù du, tảo, một số vi khuẩn và nấm tổng hợp carotenoid. Astaxanthin có mặt nhiều
ở một số loài thủy sản như cá hồi, cá vền biển, tôm và tôm hùm…( Wiener và ctv,
2003).
Bảng 2.2: Nguồn Astaxanthin trong tự nhiên
Nguồn Astaxanthin tự nhiên Nồng độ Astaxanthin
(ppm)
Cá hồi 5
Phiêu sinh vật 60
Nhuyễn thể 120
Tôm Arctic 1.200
Nấm Phaffia 8.000
Haematococcus pluvialis 40.000
Trong tự nhiên, thực vật, nấm, vi khuẩn, tảo đặc biệt sản xuất astaxanthin. Sắc
tố này thông qua chuỗi thức ăn như vi tảo được tiêu thụ bởi động vật phù du và động
vật giáp xác khác sau đó được tiêu thụ bởi cá. Một số loài động vật giáp xác (Penaeus
japonicus và Penaeus monodon) có khả năng tiết ra enzyme để phân giải carotenoid
13
thành astaxanthin (Lorenz và ctv, 2000).
Đồ án tốt nghiệp
Astaxanthin có mối liên hệ chặt chẽ với các carotenoid khác như: β - carotene,
zeaxanthin và lutein. Sự hiện diện của hydroxyl và keto kết thúc trên mỗi vòng ionone
giải thích khả năng este hóa, chống oxi hóa cao hơn, khả năng phân cực cao hơn các
carotenoid khác. Astaxanthin tự do đặc biệt nhạy cảm với quá trình oxy hóa (Guerin
và ctv, 2003).
Astaxanthin rất được quan tâm nghiên cứu bởi nó được phát hiện có hoạt tính
chống oxi hóa mạnh hơn β-caroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Một số nghiên cứu
khác chứng minh astaxanthin còn có khả năng chống oxi hóa mạnh hơn cả tocopherol
(Higuera–ciapara và ctv, 2006). Astaxanthin còn được xem như là chất có khả năng
chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các chất chống oxy hóa khác như zeaxanthin,
lutein, canthaxanthin, β–carotenoid, và gấp 500 lần so với α-tocopherol. Một ứng dụng
khác của astaxanthin là làm tăng hoạt động của các tế bào B và tế bào T–helper để sản
xuất kháng thể như immunoglobulin A, M, G (Cysewski và ctv, 2004).
Do đó astaxanthin đang ngày càng được sử dụng nhiều trong y dược và công
nghệ mỹ phẩm như tạo ra những sản phẩm bảo vệ da tránh tia cực tím (O’Connor và
O’Brien, 1998), chống tác nhân gây ung thư bằng hóa học (Nishino và ctv, 1998), tăng
cường hệ miễn dịch (Jyonouchi và ctv, 1996) và nhiều ứng dụng khác trên lĩnh vực sức
khỏe và dinh dưỡng cho người (Guerin và ctv, 2003).
2.3.4.2 Tính chất hóa học
Astaxanthin là một tetraterpenoids, trong phân tử của chúng có 2 carbon bất đối
xứng ở vị trí 3 và 3’ của vòng bezenoid do đó nó có 4 dạng đồng phân lập thể, cấu trúc
của nó có một số điểm đặc trưng riêng so với một số hợp chất thuộc nhóm carotenoids
khác như -caroten, zeaxanthin, luetin đó là có sự hiện diện nhóm hydroxy và nhóm
keto cuối mạch trên vòng ionone, điều đó cho thấy chúng có khả năng tạo ester hóa và
khả năng chống oxi hóa cao hơn các hợp chất carotenoid khác (Orosa và ctv, 2005;
Zhao và ctv, 2009).
14
Tên hóa học: 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione
Đồ án tốt nghiệp
Công thức phân tử: C40H52O4
Khối lượng phân tử: 596.82
15
Hình 2.6 Cấu hình đồng phân của Astaxanthin (Kamath, 2007)
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4.3 Vai trò Astaxanthin
Chất chống oxy hóa
Carotenoid là chất chống oxy hóa mạnh có thể hấp thụ năng lượng kích thích
oxi nguyên tử vào trong chuỗi carotenoid ngăn chặn các phân tử hoặc các mô bị hư
hỏng. Astaxanthin bảo vệ màng photpholipid và các acid béo chống lại quá trình
peroxy hóa. Đặc tính chống oxi hóa của astaxanthin có một vai trò quan trọng bảo vệ
chống tia cực tím, ung thư, nhiễm trùng Helicobacter pylorri gây viêm loét (Guerin và
ctv, 2003).
Carotenoid là chất chống oxi hóa cực kì hiệu quả, nó có khả năng loại bỏ các
gốc tự do bằng các phản ứng lại với chúng để tạo ra các sản phẩm vô hại hoặc bằng các
phá vỡ các gốc tự do của phản ứng dây chuyền (Dutta và ctv, 2005).
Các chất chống oxi hóa có thể làm giảm nguy cơ gây đột biến còn đối với các tế
bào ung thư thì ngăn chặn các tế bào phân chia liên tục. Trong tế bào người có một
mảng nội sinh chất chống oxi hóa như catalase, superoxide dismutase. Tuy nhiên, các
chất ngoại sinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxi hóa được bổ sung
vào cơ thể thông qua chế độ ăn như ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol (vitamin
E), carotenoid (Dore và ctv, 2008).
Astaxanthin bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxi hóa thông qua cơ chế
Ngăn chặn các oxi nguyên tử và tiêu hao năng lượng dưới dạng nhiệt.
Phá vỡ các phản ứng dây chuyền của peroxide (Lorenz và ctv, 2000).
Tăng cường hệ miễn dịch
Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ sung
vào thức ăn. Astaxanthin không chỉ dùng để cung cấp sắc tố cho cá mà còn giúp tăng
sức đề kháng và khả năng sinh sản (Cysewski and Lorenz, 2004).
Một yếu tố quan trọng khác trong hệ thống miễn dịch chính là T-helper (tế bào
Th) mà chủ yếu là kích hoạt tế bào kháng nguyên. Astaxanthin kích thích việc sản sinh
16
tế bào T-heper kháng thể. Trong các thí nghiệm nuôi cấy tế bào, astaxanthin kích thích
Đồ án tốt nghiệp
sự gia tăng tế bào tuyến ức và tế bào lá lách sản xuất globulin miễn dịch và yếu tố gây
hoại tử Interleukin - 1A. Bên cạnh đó, astaxanthin cũng kích thích kháng nguyên T sản
xuất kháng thể ở loài chuột. Ở người, astaxanthin cũng tăng cường sản xuất ra các
immunoglobulin ở các tế bào đơn nhân ngoại vi để đáp ứng sự gia tăng kháng thể. Tóm
lại, những nghiên cứu về astaxanthin đều có khả năng kích thích miễn dịch cả trong
môi trường in vivo và in vitro (Dore và ctv, 2008).
Astaxanthin kích thích hệ thống miễn dịch mạnh mẽ bởi các nhân tố sau
Kích thích sự sinh sản của tế bào bạch huyết
Tăng số lượng tế bào T
Không gây hại đến DNA
Tăng cường khả năng giết các tế bào gây độc (Capelli và ctv, 2007).
2.3.5 Độ an toàn
Tảo Haematococcus đã được Nhật Bản sử dụng để bổ sung vào thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, Haematococcus cũng được ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản như một sắc tố và nguồn vitamin cho cá hồi, tôm, cá cảnh (Lorenz và ctv, 2000).
Astaxanthin tự nhiên được bổ sung vào chế độ ăn của người với một lượng rất nhỏ
đặc biệt là từ cá hồi và các động vật giáp xác. Astaxanthin được tách chiết và bổ sung
vào thức ăn từ năm 1999. Nguồn astaxanthin được chiết xuất phổ biến nhất là tảo
17
Haematococcus pluvialis (Dore và ctv, 2008).
Đồ án tốt nghiệp
Hình 2.7 Con đường chuyển hóa astaxanthin trong Haematococcus pluvialis
(Kamath, 2007)
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về sự an toàn của astaxanthin vào chế độ ăn nhưng
nó ít được biết về khả năng chuyển hóa carotenoid trong cơ thể con người. Sự chuyển
hóa các carotenoid ở động vật có vú có liên quan đến một vài các yếu tố sau: sự vận
chuyển của các mixen lipid trong ruột non, sự hấp thu bởi các tế bào niên mạc ruột vận
chuyển đến hệ thống bạch huyết và cuối cùng là sự lắng đọng của các carotenoid
chuyển hóa cụ thể đến các mô. Quá trình hấp thụ và chuyển hóa astaxanthin khá tốt
được nghiên cứu nhiều ở chim, cá, động vật giáp xác. Nhưng chỉ có một vài nghiên
18
cứu đề cập đến sự hấp thụ trên người và 1 vài động vật có vú khác. Trong tế bào gan
Đồ án tốt nghiệp
chuột, astaxanthin được chuyển hóa ở 2 dạng hợp chất: 3-hydroxy-4-oxo-β-ionone và
3-hydroxy-4-oxo-7,8-dihydro- β-ionone. (Dore và ctv, 2008).
2.3.6 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản
Astaxanthin hay beta-carotene (100 - 200 mg/kg thức ăn) từ tảo Dunaliella
salina và red yeast Phaffia rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên
của cá hồi rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) (Amar và ctv, 2004). Cùng
tác giả (Amar và ctv 2000, Amar và ctv, 2001) nghiên cứu sử dụng β - carotene và
astaxanthin tổng hợp có khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên trên cá hồi
19
(Rainbout trout).
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 VẬT LIỆU
3.1.1 Mẫu thí nghiệm
3.1.1.1 Mẫu cá dùng cho thí nghiệm thực nghiệm
Cá có trọng lượng 20 g/con (mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam
Bộ), được kiểm tra và xác định không nhiễm E. ictaluri trước khi thí nghiệm.
Cá được thuần dưỡng trong bể compozit 20 m3 trong 4 tuần tại phòng thí nghiệm
ướt của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II.
Trước khi tiến hành thí nghiệm bắt ngẫu nhiên 10 con cá để kiểm tra bằng cách
mổ và cấy trên môi trường thạch máu kiểm tra vi khuẩn. Sau thời gian thuần trong bể
compozit cá được chuyển vào bể kính ít nhất 1 tuần trước khi bố trí thí nghiệm với mật
độ 30 cá/bể. Hệ thống nuôi bán tuần hoàn sử dụng máy lọc khí và có sục khí liên tục.
Cá được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp dạng viên nổi .
Địa điểm nuôi thử nghiệm nuôi trồng thủy sản ở số 139/1552 Lê Đức Thọ
Phường 13 Quận Gò Vấp.
3.1.1.2 Tảo Haematococcus pluvialis khô
Sinh khối tảo Haematococcus pluvialis khô được phòng Công Nghệ Tảo, Viện
Công Nghệ Sinh Học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cấp cho Viện Nuôi
20
Trồng Thủy Sản II (RIA II). Khối lượng : 1,3 kg.
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.1 Thức ăn GP và sinh khối tảo khô Haematococcus pluvialis
3.1.1.3 Vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri Gly09M từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo
Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên
cứu nuôi trồng thùy sản II để làm vật liệu nghiên cứu.
21
Hình 3.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluria trên môi trường thạch máu
Đồ án tốt nghiệp
3.1.2 Môi trường và hóa chất
Môi trường
Blood agar (BA)
Brain Heart Infusion Broth (BHI broth)
Hóa chất
Cồn; NaCl; H2SO4, NaOH, KOH
L-fifteen (Sigma)
Dung dich PBS
Dịch lòng trắng trứng gà
Đệm natriphosphat
Dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus luteus
Dung dịch poly-L-lysine
Zymosan (Sigma)
Nitroblue tretrazolium (NBT)
McHBSS
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Thuốc nhuộm fluorescent latex
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Tủ cấy vô trùng (Microflow).
Máy lắc (Orbital incubator SI 50).
Máy li tâm lạnh (Hermle)
Tủ sấy (Memmert).
Tủ ấm (Memmert).
Tủ lạnh SANYO.
Cân điện tử bốn số lẻ Precise XB 220A.
Nồi hấp vô trùng (HIRAYAMA).
22
Các loại micropipet (20 µl,100-1000 µl, 20-200 µl).
Đồ án tốt nghiệp
Các loại đầu típ.
Erlen loại 1000 ml, 500ml, 250 ml.
Ống đong 100 ml, 1000 ml.
Đĩa petri.
Ống nghiệm, eppendort
Bộ lọc 0,2 µm
Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX 50, Tokyo, Japan
Microrray 96 giếng, 24 giếng, 12 giếng.
Kim tiêm 1ml; 5 ml; 10ml.
Hồ kiếng kích cỡ (0,35m; 0,2m; 0,2m)
Bộ lọc nước, hệ thống cung cấp oxy liên tục.
Máy Elisa.
23
Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy thủy tinh.
Đồ án tốt nghiệp
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
3.2.1.1 Chuẩn bị thức ăn
Chuẩn bị thức ăn cho cá: cân thức ăn Green fish cho vào 4 hủ mỗi hủ 172,8 gam.
Sinh khối tảo đem đi pha loãng ở 2 nồng độ: 100 mg và 200 mg
Bảng 3.1 Mật độ tảo và khối lượng tảo cân trộn vào thức ăn
Nghiệm thức Nồng độ tảo Khối lượng thức ăn Khối lượng tảo
(mg/kg) (gram) (gram)
NT 100 mg/kg 100 170 0.864
NT 200 mg/kg 200 170 1.73
Đối chứng 170 0
Sau khi cân khối lượng tảo cho vào nước muối sinh lý 0.9% pha loãng vortex
đều phối trộn với thức ăn. Trộn đều thức ăn bổ sung thêm dầu mực sấy 30oC trong 15
phút thành phẩm.
24
Hình 3.3 Thức ăn trộn Haematococcus pluvialis
Đồ án tốt nghiệp
3.2.1.2 Chuẩn bị chủng vi khuẩn gây bệnh
Chủng Edwardsiella ictaluri được hoạt hóa trong môi trường Blood agar, ủ ở
28oC – 30oC trong 24 giờ - 36 giờ. Thu sinh khối E .ictaluri trên môi trường thạch
máu. Sau đó huyền phù cho vào dung dịch nước muối đo OD tiến hành xác định mật
độ vi khuẩn.
3.2.1.3 Xác định LD50
Xác định mật độ vi khuẩn gây chết 50% (LD50) dựa trên phương pháp của Reed
and Muench (1938). Khảo sát tỉ lệ chết của cá sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn E.
ictaluri Gly 09M (tiêm vào xoang bụng) với mật độ: 1x103, 1x104, 1x105, 1x106
cfu/ml. Từ đó xác định liều gây chết gấp 2xLD50 cho thí nghiệm cảm nhiễm (Newaj-
Fyzul và ctv, 2007).
25
Bố trí thí nghiệm
Đồ án tốt nghiệp
Cá tra giống 20 gam/con
Thuần trong bể composite 20m3 trong 4 tuần
Cho ăn với thức ăn bình thường
Thử nghiệm 4 nồng độ vi khuẩn E .ictaluri khác nhau. Mỗi bể 15 con cá, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần
106 cfu/ml 103 cfu/ml 104 cfu/ml 105 cfu/ml
26
Đếm số cá chết Tính toán kết quả
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.5 Hệ thống bố trí thí nghiệm thực nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại. Chuẩn bị 12 bể kính mỗi bể 15 con cá có
khối lượng trung bình 20 gam/con.
Thử nghiệm với 4 nồng độ khác nhau: 103 cfu/ml, 104 cfu/ml, 105 cfu/ml, 106
cfu/ml trong 20 lít nước ngâm trong 60 phút sau đó nâng mực nước lên 50 lít.
Theo dõi và ghi nhận cá chết hàng ngày cho đến khi cá không chết liên tục trong 3
ngày thì kết thúc thí nghiệm.
Trong quá trình thí nghiệm, nhiệt độ nước và pH được theo dõi liên tục dao động từ
26 – 28oC, pH dao động từ 6 – 7.
Công thức xác định LD50 của Reed và Muench (1938)
PD =
27
LD50 = 10(lũy thừa gây chết trên 50% cao nhất - PD)
Đồ án tốt nghiệp
3.2.1.4 Hiệu quả kháng bệnh gan thận mủ của tảo Haemtococcus pluvilis bằng
phương pháp gây bệnh thực nghiệm
Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether,
Merck) với nồng độ 0,2 ppt trong 3 – 5 phút. Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex)
với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho cá 10 – 40 g để đảm bảo an toàn cho
cá khi thử nghiệm. Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá ở vị trí giữa hai vây bụng cá tra
và chếch một góc 45o. Thể tích tiêm của mỗi con cá là 0,2 ml.
28
Bố trí thí nghiệm thực nghiệm
Đồ án tốt nghiệp
Cá thuần trong bể compozit trong 30 ngày Khối lượng trung bình mỗi con cá 20 gam/con
Chuyển vào bể kính có sử dụng hệ thống sục khí Mỗi nghiệm thức 30 con cá
Đối chứng dương (thức ăn GF)
NT 1 (thức ăn bổ sung tảo 100mg)
NT 2 (thức ăn bổ sung tảo 200mg)
Đối chứng âm (thức ăn GF)
Cho ăn thức ăn có bổ sung H.pluvialis trong 28 ngày rồi cảm nhiễm
Tiêm 0,2 ml nước muối sinh lý
Tiêm 0.2ml vi khuẩn E.ictaluri 2xLD50
29
Đếm tổng số cá chết Tính toán kết quả
Đồ án tốt nghiệp
Cá có trọng lượng 20 g/con (mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam
Bộ) được thuần 2 tuần trong bể composite 20 m3, cho ăn bằng thức ăn Green Fish. Giai
đoạn cho cá ăn thức ăn bổ sung H.pluvialis trong 28 ngày: Thí nghiệm được tiến hành
trong bể kính 100 lít (dung tích 150 lít), mỗi bể chứa 30 con/bể, mỗi nghiệm thức lập
lại 3 lần. Thí nghiệm bao gồm: nghiệm thức đối chứng dương (thức ăn không bổ sung
H.pluvialis), nghiệm thức bổ sung H.pluvialis (100 mg/kg thức ăn và 200 mg/kg thức
ăn), và nghiệm thức đối chứng âm (thức ăn bổ sung 200mg/kg thức ăn). Cá được cho
ăn theo tỉ lệ 5% trọng lượng thân, cho ăn 2 lần/ngày. Nước thay 20-30%/tuần. Sau 28
ngày cho ăn, cá được phân bổ lại trong bể với 15 con/bể, tiêm 0,2ml dịch vi khuẩn
tương đương với (2xLD50) cho nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm thức thử
nghiệm, riêng nghiệm thức đối chứng âm được tiêm nước muối sinh lý thay cho dịch vi
khuẩn gây bệnh. Hàng ngày đếm số cá chết trong mỗi bể và thu mẫu cá vừa chết kiểm
tra vi khuẩn gây bệnh trong thận và gan. Thí nghiệm kết thúc khi cá trong cá nghiệm
thức không chết trong vòng 3 ngày liên tục.
3.2.2 Phương pháp khảo sát khả năng đề kháng của cá tra
3.2.2.1 Thu nhận mẫu máu cá
Gây mê cá trước khi thu thập máu từ tĩnh mạch đuôi bằng ống kim tiêm 1ml vô
trùng. Mẫu máu thu tại hiện trường, giữ lạnh ở 4oC trước khi đưa về phòng thí nghiệm
để tiến hành ly tâm 1500 vòng/ 10 phút ở 4oC. Huyết thanh được trích lấy từ các mẫu
máu được giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành phân tích các thông số miễn dịch.
Giải phẫu cá thu mẫu thận giữ lạnh 4oC đem về phòng thí nghiệm thu nhận bạch
30
cầu.
Đồ án tốt nghiệp
3.2.2.2 Thu nhận bạch cầu từ thận trước của cá
Thận trước thu nhận từ cá sẽ cắt ra thành những miếng nhỏ và rửa 1ml môi
trường L-15, rửa lặp lại 2 lần, sau đó dung dịch rửa được lọc qua lưới (màng lọc có
đường kính 100 µm và cho thêm 3 ml môi trường L-15. Dịch lọc tiến hành phân lớp
được thực hiện trong ống tube dài 15ml chứa 30/51% Percoll (sigma) nhờ sự khác biệt
tỉ trọng, sau đó ống tube 15ml đem ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở 4oC. Những tế bào
nằm ở dãy band 30/51% Percoll được thu nhận và rửa lại 2 lần với môi trường L-15,
sau đó ly tâm 400 vòng trong 10 phút ở 4oC. Kiểm tra khả năng tồn tại của bạch cầu
với dung dịch 0,1% trypan blue (T6146, Sigma) nếu có sự hiện diện của bạch cầu sẽ bị
mất màu xanh của trypan. Mật độ tế bào được điều chỉnh 1x106 tế bào/ml trong dung
Tế bào bạch cầu Leucocyte
dịch L-15 và được dùng tất cả các thông số đo như hoạt động thực bào, oxy hoạt hóa.
31
Hình 3.4. Thu tế bào bạch cầu nằm xen giữa hai lớp percoll 30% và 51%.
Đồ án tốt nghiệp
3.2.2.3 Hoạt động thực bào
500µl dịch bạch cầu (Mật độ 1x106 trong môi trường L-15) cho vào microarray 12 giếng
Ủ 28oC / 60 phút
Rửa giếng 2 lần với L-15
Thêm 500µl hạt huỳnh quang
Ủ tối 28oC trong 2 giờ
Rửa giếng bằng PBS
Cho 500µl dung dịch formalin để trong tối 30 phút
Nhuộm màu với iot 0.1% trong 10 phút
Rửa giếng 2 lần bằng PBS
Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang đếm tất cả số lượng tế bào trong pham vi 100 tế bào
32
Tính toán kết quả
Đồ án tốt nghiệp
Hoạt động thực bào được xác định dựa trên phương pháp mô tả bởi Yeh và ctv
(2008). Tiến hành lấy 500 µl dịch bạch cầu (bạch cầu từ thận trước cho 2x106 tế bào
trong môi trường L-15) cho vào 12 giếng được đặt vào đĩa vô trùng ủ 60 phút ở 28oC
trong buồng ẩm. Rửa giếng 2 lần với dung dịch L-15. Sau đó thêm 500 µl hạt huỳnh
quang dạng huyền phù cho vào các giếng ủ trong tối 2 giờ ở 28oC, các giếng sẽ được
rửa PBS. Các giếng được cho vào 500 µl dung dịch formalin để trong tối 30 phút, sau
đó nhuộm màu với iot 0.1% trong 10 phút rửa các giếng 2 bằng PBS và để khô ở nhiệt
độ phòng. Nhỏ dầu soi kính lên giếng và đếm số lượng tấ cả tế bào trong phạm vi 100
tế bào (tế bào thực bào và không thực bào) bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus
IX 50, Tokyo, Japan).
Tính toán kết quả
PA =
3.2.2.4 Hoạt tính lysozyme
Hoạt động lysozyme trong huyết thanh được đo theo phương pháp của Ellis
(1990) dựa trên ly giải của vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus (Sigma) nhạy
cảm với lysozyme. Tóm tắt như sau: 10 µl dịch lòng trắng trứng gà (16 µg/ml) được
pha loãng bậc 2 với các nồng độ 0, 2, 4, 8 trong dung dịch đệm natri phosphat tiến
hành đo OD và lập đường chuẩn lysozyme. Thêm vào 10µl huyết thanh cá cho vào 96
giếng. Bổ sung 200µl vi khuẩn Micrococcus luteus dịch huyền phù là 0.2 mg/ml trong
dung dịch đệm cho vào các giếng đem ủ ở 25oC. Sau đó nhanh chóng đo độ đục các
giếng ở bước sóng 530nm trong 1 phút và 6 phút. Một đơn vị lysozyme được định
nghĩa là số lượng enzyme sản xuất giảm trong sự hấp thụ của huyết thanh phút/ml được
33
xác định thông qua đường chuẩn lysozyme.
-
Đồ án tốt nghiệp
3.2.2.5 Hoạt động sản sinh O2
Sử dụng microplate 96 giếng
Bổ sung 100 µl poly-L-lysine (ủ 30 phút)
Sau 1 giờ rửa poly-L-lysine bằng dung dịch L-15 (100 µl)
Bổ sung 100 µl bạch cầu vào giếng (mật độ 1x106 cfu/ml)
ủ 37oC trong 2 giờ
Rửa dịch nổi
Bổ sung 100 µl Zymozan (0,1%) (ủ 30 phút)
Bổ sung 100 µl NBT (0.3%) Ủ 25oC trong 30 phút
Dừng phản ứng với 100 µl methanol 100%
Rửa 3 lần với 100 µl methanol 70%
Bổ sung 120 µl KOH 2M + 140 µl DMSO
34
630nm ELISA
Đồ án tốt nghiệp
Hoạt động oxy hoạt hóa được tạo ra từ tế bào bạch cầu thận trước được phân
-)
tích theo phương pháp của (Cheng và ctv, 2006) bằng cách sử dụng cơ chất nitroblue
tretrazolium (NBT) tạo thành formazan dùng để đo việc sản sinh oxy hoạt hóa (O2
bên trong tế bào bạch cầu. Tiến hành lấy 100µl dung dịch poly-L-lysine được hòa tan
(0.2%) cho vào 96 giếng để yên từ 30 – 60 phút cho tế bào kết dính. Sau đó các giếng
được rửa một lần với 100 µl L-15 và cho vào 100 µl bạch cầu từ thận trước 1x106 tế
bào trong môi trường L-15 đem ủ ở nhiệt độ phòng 37oC trong 2 giờ. Rửa sạch 2 lần
với L-15. Bổ sung 100 µl Zymosan ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút tiếp tục cho 100 µl
nitroblue tretrazolium (NBT) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Phản ứng được ngừng lại
bằng cách thêm vào 100µl methanol (100%) và các bạch cầu được rửa 3 lần với 100 µl
-) được
methanol (70%). Các giếng để khô tự nhiên, sau đó thêm vào 120 µl KOH và 140 µl
dimethylsulfoxide (DMSO) trong 2 phút. Hoạt động sản sinh oxy hoạt hóa (O2
biểu thị bằng lượng giảm cơ chất NBT được đo ở bước sóng 630 nm.
3.3 Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm SPSS 3.0 dể xử lý số liệu về sự khác biệt của các nghiệm thức.
35
Mức khác biệt có ý nghĩa thống kế p < 0,05.
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Khảo sát tỉ lệ sống của cá bằng phương pháp thực nghiệm
4.1.1 Xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá tra giống khi gây bệnh thực
nghiệm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E.ictaluri
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát LD50 bằng phương pháp tiêm
Tổng số Tổng số Tỉ lệ chết Liều gây nhiễm Tổng số cá Tổng số cá cá chết cá sống cộng dồn (cfu/ml) chết sống cộng dồn cộng dồn (%)
103 23 22 23 32 41,82
104 38 7 61 10 85,92
105 43 2 104 3 97,20
106 44 1 148 1 99,33
PD 0,81446
1,53x103 CFU/ml LD50
Kết quả khảo sát LD50 cho thấy tỉ lệ chết 50% của cá tra sau khi cảm nhiễm
E.ictaluri Gly09M ở mật độ 1,53x103 cfu/ml cá sau 8 ngày cảm nhiễm. Do đó liều vi
khuẩn gây bệnh E. ictaluri dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm chính thức gấp 2 lần LD50,
36
cụ thể là 3,07x103cfu/ml cá.
Đồ án tốt nghiệp
4.1.2 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ
Bảng 4.2 Bảng tỉ lệ sống cá tra sau 10 ngày cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Tỉ lệ sống của cá tra sau khi cảm nhiễm vi khuẩn (%) sau 10 ngày cảm nhiễm vi khuẩn bằng
phương pháp tiêm
1,2,3 4 5 6 7 8 9 10
ĐC (+) 100 ± 0.0 96.7± 5.8 76.7±5.8 70±10.0 60±10.0 60±10.0 60±10.0 60±10.0
100mg/kg 100 ± 0.0 100 ± 0.0 100±0.0 93.3±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8
200mg/kg 100 ± 0.0 96.7±5.8 96.7±5.8 90 ± 0.0 83.3±5.8 83.3±5.8 83.3±5.8 83.3±5.8
37
ĐC (-) 100 ± 0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0
Đồ án tốt nghiệp
Hình 4.1 Khả năng kháng bệnh gan thận mủ của cá tra sau 28 ngày cho ăn thức ăn bổ
sung Haematococcus pluvialis
Kết quả cho thấy ở nghiệm thức đối chứng âm cá hoạt động bình thường chứng
tỏ yếu tố môi trường không ảnh hưởng đến cá. Ở các nghiệm thức 100 mg/kg, 200
mg/kg, nghiệm thức đối chứng dương cá có biểu hiện đặc trưng do nhiễm vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri. Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn cho thấy, chỉ xuất
hiện khuẩn lạc của vi khuẩn E.ictaluri trên môi trường nuôi cấy BHIA. Điều này chứng
tỏ các chết ở các nghiệm thức là do vi khuẩn này gây ra. Hình 4.1 thể hiện tỷ lệ sống
của cá từ ngày đầu tiên cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Nghiệm thức đối chứng dương cho tỉ lệ cá chết là cao nhất tiếp đến là nghiệm
thức 200 mg/kg và nghiệm thức 100 mg/kg. Trong đó nghiệm thức 100 mg/kg tỉ lệ cá
còn sống là cao nhất đạt 86,7%.
Tỉ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm với Edwardsiella ictaluri giữa các nghiệm
38
thức có sự khác biệt về mặt ý nghĩa (p<0,05). Nghiệm thức 100 mg/kg, nghiệm thức
Đồ án tốt nghiệp
200 mg/kg và nghiệm thức đối chứng âm không có sự khác biệt về mặt thống kê (p >
0,05). Tuy nhiên, sự khác biệt về tỉ lệ sống giữa nghiệm thức đối chứng dương so với
nghiệm thức 100 mg/kg và nghiệm thức 200 mg/kg là có ý nghĩa về mặt thống kê (p <
0,05). Điều này chứng tỏ, nâng cao tỉ lệ sống của cá tra khi bổ sung thức ăn 100 mg/kg
và 200 mg/kg tảo Haematococcus pluvialis có khả năng giúp cá kháng lại bệnh do vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra nhờ thành phần astaxanthin có trong tảo.
Mặc khác, Lê Thanh Nga tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng sản phẩm Nutribull
lên sự tăng trưởng và sức khỏe cá tra nuôi. Sau khi cho ăn thức ăn bổ sung Nutribull
thì tỉ lệ sống của cá tra tăng lên cụ thể. Khi bổ sung 0,2% Nutribull thì tỉ lệ sống cá tra
tăng đến 23,75% so với đối chứng khi không bổ sung Nutribull. Điều này chứng tỏ
thức ăn có bổ sung 0,2% Nutribull có khả năng nâng cao tỉ lệ sống của cá tra kháng lại
bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra sau 14 ngày cảm nhiễm.
Cũng có kết quả tương tự, Trương Quốc Phú và ctv (2005) sử dụng Aflatoxin
nâng cao tỉ lệ sống cá tra khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri. Trong thí nghiệm
này, khi cá ăn aflatoxin với hàm lượng 50 mg/kg thức ăn thì cho tỉ lệ sống cao hơn so
39
thức ăn không bổ sung aflatoxin.
Đồ án tốt nghiệp
4.2 Ảnh hưởng Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên
A
B
4.2.1 Hoạt động thực bào
Hình 4.2 Hoạt động thực bào của tế bào bạch cầu của cá sau khi cho ăn
thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis ở các lô đối chứng (A), 100
Tế bào thực bào
mg/kg (B)
Hình 4.3 Hoạt động thực bào của tế bào bạch cầu của cá sau khi cho
40
ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis 200mg/kg
a
a
a
Đồ án tốt nghiệp
Hình 4.4 Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B)
41
Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn
Đồ án tốt nghiệp
Haematococcus pluvialis sau 28 ngày. Mỗi cột biểu thị số trung bình của 6 lần
lặp lại và độ lệch chuẩn. Số liệu ở cùng thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau
biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0.05).
Bảng 4.3 Tỉ lệ thực bào (PA) và chỉ số thực bào (PI) của cá tra sau khi cho ăn thức ăn
đối chứng và thức ăn trộn Haematococcus pluvialis trong 28 ngày
Nghiệm thức Thời gian cho ăn (ngày)
PA PI
0 28 0 28
11.7 ± 6.4 8.3 ± 3.5b 1.25 ± 0.12 1.44 ± 0.05a ĐC dương
11.7 ± 6.4 31.4 ± 5.0a 1.25 ± 0.12 1.50 ± 0.13a 100 mg/kg
11.7 ± 6.4 27.3 ± 10.8a 1.25 ± 0.12 1.44 ± 0.21a 200mg/kg
Kết quả tỉ lệ thực bào sau khi bổ sung tảo vào thức ăn thì có sự khác biệt ý
nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Điều này chứng tỏ việc bổ sung tảo vào
thức ăn làm tăng hệ miễn dịch tự nhiên của cá tra bảo vệ chống lại các tác nhân gây
bệnh. Nghiệm thức đối chứng dương tỉ lệ thực bào là thấp nhất (8,3%) so với 2 nghiệm
thức 100 mg/kg (31,4%) và 200 mg/kg (27,3%). Nghiệm thức 100 mg/kg tăng 3,78 lần
so với nghiệm thức đối chứng dương và không có sự khác biệt so với nghiệm thức 200
mg/kg.
Tỉ lệ thực bào nghiệm thức 100 mg/kg cao nhất so với các nghiệm thức 200
mg/kg và nghiệm thức đối chứng dương. Sự khác biệt này có thể được giải thích do tác
động của astaxanthin lên hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cá, làm gia tăng số
lượng và hoạt động của đại thực bào. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy khi cá bị
vi khuẩn gây bệnh xâm nhập thì trong máu và dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải một
hàng rào rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ không đặc hiệu của cá bao gồm các tế bào
thực bào như: bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng lên nhanh chóng Vũ Triệu An
(2003). Theo Newman và ctv (1993), đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được
42
thực hiện bởi việc gia tăng các tế bào bạch cầu chống lại tác nhân gây bệnh.
Đồ án tốt nghiệp
Trong khi đó chỉ số thực bào (PI) của cá tra ở 0 ngày và sau 28 ngày cho ăn thức
ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê
giữa các nghiệm thức (p>0,05). Chỉ số thực bào của nghiệm thức 100 mg/kg có tăng
nhưng không đáng kể so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 200 mg/kg.
-
4.2.2 Sản sinh O2
Hình 4.5 Sản xuất oxi hoạt hóa của cá sau khi cho ăn Haematococcus
pluvialis sau 28 ngày
Bảng 4.4 Oxy hoạt hóa của cá tra sau khi cho ăn thức ăn đối chứng và thức ăn trộn
Haematococcus pluvialis trong 28 ngày
Oxy hoạt hóa (OD 630nm), thời gian nuôi (ngày) Nghiệm thức 28 0
Đối chứng 0.19 ± 0.05b 0.16 ± 0.11
100mg/kg 0.29 ± 0.02ab 0.16 ± 0.11
43
200mg/kg 0.35 ± 0.11a 0.16 ± 0.11
Đồ án tốt nghiệp
Kết quả hoạt động oxy hoạt hóa ở thời gian 0 ngày không có sự khác biệt về mặt
thống kê (p>0.05). Nhưng sau 28 ngày cho ăn thức ăn có bổ sung tảo Haematococcus
pluvialis thì có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghiệm thức 200 mg/kg sản
xuất oxi hoạt hóa tăng 1,2 lần so với 100 mg/kg và 1,84 lần so với nghiệm thức đối
chứng.
Kết quả trên chứng minh việc bổ sung Haematococcus pluvialis vào thức ăn làm
tăng khả năng sản xuất oxi hoạt hóa trong cá. Đồng thời cũng kích thích hệ miễn dịch
không đặc hiệu của cá giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh.
Oxy hoạt hóa được sản sinh bởi tế bào thực bào phagocyte (hay tế bào bạch cầu,
leucocyte) có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh trong suốt quá trình thực bào và cũng là một
cơ chế bảo vệ vật chủ xảy ra thường xuyên nhằm chống lại khả năng xâm nhiễm của
mầm bệnh. Tuy nhiên, sự hoạt động quá mức của các chất hoạt hóa dẫn xuất từ oxy
(ROIs) có thể gây hại và độc cho tế bào chủ Dalmo và ctv (1997). Do đó, tế bào vật
- thành
chủ có cơ chế bảo vệ và chuyển hóa các chất độc được tạo ra từ quá trình ROIs bằng
các enzyme chống oxy hóa như Superoxide dismutase (SOD) chuyển hóa O2
H2O2, glutathione peroxidase và catalase chuyển hóa H2O2 thành nước có lợi cho tế
bào Sampaio và ctv (2008), Scandalios và ctv (2005). Tăng hoạt động thực bào và oxy
hoạt hóa của tế bào bạch cầu của cá hồi sau khi chúng được cho ăn với thức ăn có bổ
cfu/g khoảng
sung Lactobacillus. Lactic và Lactobacillus mesenteroides với mật độ 106
14 ngày Balcázar và ctv (2007b). Tuy nhiên trong nghiên cứu này sự tăng có khác biệt
có ý nghĩa của hoạt động thực bào, chỉ số thực bào, đồng thời tăng oxy hoạt hóa của tế
bào bạch cầu sau khi cho cá tra thức ăn bổ sung tảo. Điều này chứng tỏ rằng sự gia
44
tăng oxy hoạt hóa có tương quan với hoạt động thực bào.
Đồ án tốt nghiệp
4.2.3 Hoạt tính lysozyme
Kết quả khảo sát hoạt tính lysozyme theo phương pháp Elis (1990) ta có như sau:
Hình 4.6 Hoạt động lysozyme sau 28 ngày cho ăn tảo Haematococcus pluvialis
Bảng 4.5 Hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ sung
Haematococcus pluvialis sau 28 ngày
Nồng độ lysozyme (µg/ml), thời gian nuôi (ngày) Nghiệm thức 0 28
Đối chứng 2.86 ± 0.17 2.65 ± 0.17a
100 mg/kg 2.86 ± 0.17 3.08 ± 0.01a
200 mg/kg 2.86 ± 0.17 3.13 ± 0.65a
Qua biểu đồ ta nhận thấy được ở 0 ngày cả 3 nghiệm thức đối chứng và 100
mg/kg, 200 mg/kg đều cho nồng độ lysozyme như nhau không có sự khác biệt về mặt
45
thống kê giữa các nghiệm thức.
Đồ án tốt nghiệp
Hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá tra sau 28 ngày cho ăn thức ăn bổ sung
Haematococcus pluvialis cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê của cả 3 nghiệm
thức: đối chứng, 100 mg/kg và 200 mg/kg. Việc bổ sung tảo H.pluvialis vào trong thức
ăn không ảnh hưởng đến hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá.
Lysozyme là một trong những yếu tố bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm các mầm
bệnh ở các động vật có xương sống Osserman và ctv (1974). Lysozyme có khả năng
phân giải vi khuẩn gram dương và tiêu diệt vi khuẩn gram âm sau khi phá vỡ vỏ ngoài
tế bào Hjelmeland và ctv (1983). Ngoài ra hoạt động bổ thể cũng tham gia bảo vệ tế
bào từ sự xâm nhiễm các vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng. Muller-Eberhard và ctv
(1988). Một số nghiên cứu của Thompson (1994) trên đối tương cá hồi ở Đại Tây
Dương chứng tỏ việc bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn cũng không ảnh hưởng đến
46
nồng độ lysozyme trong huyết thanh.
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Thức ăn bổ sung 100 mg/kg Haematococcus pluvialis giúp nâng cao khả năng
đề kháng của cá tra đối với Edwardsiella ictaluri với tỷ lệ sống cao nhất là 86,7±5,8 %.
Ngoài ra việc bổ sung tảo vào trong thức ăn còn nâng cao hệ miễn dịch không
đặc hiệu của cá tra cụ thể là:
- Hoạt động thực bào (PA) của tế bào bạch cầu cá cho ăn với thức ăn có bổ sung
astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis 100 mg/kg (31.4 ± 5.0) và 200 mg/kg (27.3
± 10.8) tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng (8.3 ±
3.5)
- Sản sinh oxi hoạt hóa: Hoạt động oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu của cá tra
sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis ở nồng độ 200 mg/kg (0.35
± 0.11a) tăng cao khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, hoạt
động oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu ở nghiệm thức 100 mg/kg (0.29 ± 0.02ab) khác
biệt không có ý nghĩa đối với nghiệm thức đối chứng (0.19 ± 0.05b) .
- Hoạt động lysozyme trong huyết thanh của cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ
sung Haematococcus pluvialis không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa giữa các nghiệm
thức.
5.2 Đề nghị
Cần nghiên cứu thêm về liều lượng, tần xuất và thời gian sử dụng trên cá tra
nhằm tìm ra chiến lược cho ăn thích hợp để tăng sức đề kháng của cá tra kháng bệnh
gan thận mủ.
Nghiên cứu ảnh hưởng của Haematococcus pluvialis lên màu sắc của cá tra.
Cần có những công trình nghiên cứu nhiều hơn về loại tảo này trên nhiều đối
47
tượng khác nữa.
Đồ án tốt nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1] Vũ Triệu An, 2003. Miễn dịch học. Nhà xuất bản y học Hà Nội, trường Đại Học Y
Hà Nội. Bộ môn miễn dịch và sinh lý bệnh. 376 trang.
[2] Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn, 2009. “Hiện trạng đa
kháng trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra
Pangasianodon hypophthalmus ở Đồng bằng sộng Cửu Long”. Trang 219-227
[3] Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình
“Bệnh Học Thủy Sản”. 162 trang
[4] Đồng Thanh Hà, Đỗ Thị Hòa, 2008 - 2009. “Nghiên cứu xác định tác nhân gây
bệnh mủ ở gan thận trên cá tra Pangasius hypophthalmus nuôi tại Bến Tre”. Kỷ
yếu hội nghị sinh viên NCKH 2008-2009. Trang 1-7
[5] Đặng Diễm Hồng và, Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thủy, Hoàng Thị Lan Anh,
2010. Tạp chí sinh học: “Lựa chọn môi trường tối ưu để nuôi trồng vi tảo lục
Haematococcus pluvialis giàu Astaxanthin”. 32 (2): 43-53
[6] Phạm Văn Khánh, 2011. “Kỹ thuật nuôi cá tra và basa trong bè”. Nhà xuất bản
nông nghiệp.
[7] Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008. Tìm hiểu
sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) nuôi nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Bộ
môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ.
Trang 202-211.
[8] Lê Thị Nga, Nguyễn Hữu Thịnh, Lê Thanh Hùng. ‘Đánh giá tác dụng của sản phẩm
Nutribull lên tăng trưởng và cải thiện tình trạng sức khỏe của cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)”. Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm
48
TP.HCM. Trang 139 - 149.
Đồ án tốt nghiệp
[9] Phạm Thị Kim Oanh, Trương Hoàng Minh, 2011. “Thực trạng nuôi cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) có liên kết và không liên kết ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long”. Tạp chí khoa học 2011: 20b 48 - 58.
[10] Trương Quốc Phú, Nguyễn Anh Tuấn, Dương Thúy Yên, Phạm Trần Nguyên
Thảo, Trần Thị Thanh Hiền, Nguyễn Quốc Thịnh, 2005. Ảnh hưởng của
Aflatoxin lên tỉ lệ sống và tốc độ sinh trưởng của cá tra (Pangasius
hypophthalmus). Báo cáo khoa học. Đề tài cấp Bộ. Trang 1-33.
[11] Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị Hiền, Võ Hồng Phượng, Ngô Thị Bích Phượng,
Nguyễn Phạm Hoàng Huy, 2011. Phân lập và kiểm tra độc lực Edwardsiella
ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus. Tạp
chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. Tháng 12/2011. Trang 80 – 81.
[12] Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I.
Tài liệu Tiếng Anh
[13] Bader A. Joel , Shoemaker A.Craig , Phillip H. Klesius, 2004. “ Immune response
induced by N-lauroylsarcosine extracted outer-membrane proteins of an isolate
of Edwardsiella ictaluri in channel catfish”. 16. Page 415 – 428.
[14] Balcázar, J.L., I. de Blas, I. Ruiz-Zarzuela, D. Vendrell, O. Girones, and J.L.
Muzquiz (2007b) Enhancement of the immune response and protection induced
by probiotic lactic acid bacteria against furunculosis in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). FEMS Immunology and Medical Microbiology 51:185-
193.
[15] Capelli Bob, Cysewski Gerald; 2007. “ Natural Astaxanthin: King of the
carotenoids”. Trang 1 – 132.
[16] Cheng Ann-Chang, Chen Chia-Yung, Liou Chying-Hwa, Chang Ching-Fong,
2006. Effects of dietary protein and Lipids on blood Parameters and superoxide
Annion production in the Grouper, Epinephelus coioides. Zoological Studies
49
45(4): 492 -502.
Đồ án tốt nghiệp
[17] Crumlish. M, Dung T.T, Turnbull J F , Ngoc N.T.N, Ferguson H .W, 2002. “
Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvage) cultured in the Mekong Delta, VietNam”.
Trang 733-736.
[18] Cysewski and Lorenz, 2004. Industrial production of microalgal cell-mass and
secondary product – species of high potential. Haematococcus. Trang 281 -288.
[19] Dalmo, R.A., K. Ingebrigtsen, and J. Gwald (1997) Non-specific defence
mechanisms in fish, with particular reference to the reticuloendothelial system
(RES). Journal of Fish Diseases 20:241-273.
[20] Dore E John and Cysewski R. Gerald, 2008. “ Haematococcus algae meal as a
source of natural astaxanthin for aquaculture feeds”. Trang 1-5
[21] Dore E. John, Ph.D; 2008. “ Astaxanthin and cancer chemoprevention”. Trang 1 –
45.
[22] Dragos .N, Bercea. V, Adriana Bica, Drugă .B, Ana Nicoată, Coman .C, 2010.
“Astaxanthin production from a new strain of Haematococcus pluvialis grown
in batch culture”. Vol .XV, Issue 2.
[23] Ellis, A.E. (1990) Lysozyme assays. Techniques in Fish Immunology, 101 -103.
[24] Guerin Martin, Huntley Mark E, Olaizola Miguel, 2003. “ Haematococcus
Astaxanthin: applicantions for human health and nutrition”. Trang 210-216
[25] Higuera-Ciapara, L.Felix-Valenzuela, Goycoolea F.M.; 2006. “Astaxanthin: A
review of its chemistry and applicantions”. Critical reviews in food science amd
nutrition, 46: 185 – 196.
[26] Hjelmeland, K., Christie, M., Raa, J. (1983). Skin mucus protease from rainbow
trout, Salmo gairdneri Richardson, and its biological significance.J.Fish Biol.
23:13-22.
[27] Holt, J.G., Noel, R.K (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
50
Chapper V, pp. 178, 222.
Đồ án tốt nghiệp
[28] Lorenz R.Todd, Cysewski Gerald . R, 2000. “Commercial potential for
Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin”. Vol 18. Trang
160-167.
[29] Muller-Eberhard, H.J. (1988) Molecular organization and function of the
complement system. Annual Review of Biochemistry 57:321-347.
[30] Newaj-Fyzul, A., Adesiyun, A. A., Mutani, A., Ramsubhag, A., Brunt, J., and
Austin, B. (2007). Bacillus subtilis AB1 controls Aeromonas infection in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Journal of Applied
Microbiology 103, 1699-1706.
[31] Olaizola, M. 2000. Commercial production of astaxanthin from Haematococcus
pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreators. Joumal of Applied
Phycology 12:499 – 506.
[32] Orosa, M., D. Franqueira, A. Cid, and J. Abalde. 2005. Analysis and enhancement
of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis. Bioresource
Technology 96: 373 – 378.
[33] Osserman, E.F., Canfield, R.E., Beychok, S. (1974). editors. "Lysozyme"
Academic Press, New York, 641p.
[34] Parris Kidd, 2011. “Astaxanthin, Cell Membrance Nutrient with Diverse Clinical
benefits and Anti-Aging Potential”. Volume 16. Trang 355 – 363.
[35] Plumb, J,A., 1999. Fish diseases and disorders. Aquaculture and aquatic
Environment, Aburn University, Alabana 36849 USA.
[36] Reed L.J, Muench .H, 1938. A simple method of estimating fifty per cent
endpoints. Vol. 27. Trang 493 – 497.
[37] Sampaio, F.G., C.L. Boijink, E. Oba, L.B. dos Santos, A.L. Kalinin, and F.T.
Rantin (2008) Antioxidant defenses and biochemical changes in pacu (Piaractus
mesopotamicus) in response to single and combined copper and hypoxia
51
exposure. Comparative Biochemistry and Physiology 147C:43-51.
Đồ án tốt nghiệp
[38] Scandalios, J.G (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of
signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research 38:995-1014.
[39] Shotts, E.B, Blazer, VS., Watlman, W.D, 1986. “Pathogenesis of experimental
Edwardsiella ictaluri in channel catfish (Ictalurus punctatus). Can.J.Fish Aquat.
Sci. 43: 36 – 42
[40] Thompson, G. Choubert, D.F. Houlihan, C.J. Secombes; 1995. “The effect of
dietary vitamin A and Astaxanthin on the immunocompetence of rainbow
trout”. Trang 91 – 102.
[41] Wiener Harold , Amir Drory, Algatechnologyies Ltd and Larry Line, 2003. “
Astaxanthin from the Microalga Haematococcus – a superb natural antioxidant
for human health”. Trang 22 – 23
Tài liệu trang web
[42] http://www.mendeley.com/research/technical-review-haematococcus-algae/
[43] http://www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn
[44] http://www.scribd.com
[45] http://www.vinafood2.com.vn
[46] http://godaco-seafood.com.vn
[47] http://www.saigonvet.com
[48] http://en.wikivet.net/Edwardsiella_ictaluri
[49] http://www.themagicisbac.com/page4-10.html
52
[50] http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Pangasius_hypophthalmus/en
