Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (Musa paradisiaca)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIOETHANOL SỬ DỤNG NGUYÊN LIỆU VỎ CHUỐI (MUSA PARADISIACA)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ KIM PHỤNG

Th.S TRẦN THỊ TƯỞNG AN

Sinh viên thực hiện

: CHÂU NHẬT HUY

MSSV: 1051110086 Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐƯỢC THỰC HIỆN TẠI

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Trần Thị Tưởng An. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.

Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu

của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. Trường đại học Công nghệ TP.HCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có).

TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Châu Nhật Huy

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu tại Phòng nghiên cứu Năng lượng sinh học tại trường

ĐH Bách Khoa TP.HCM, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và quan tâm

của quý thầy cô. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc.

Ngoài ra, chúng em cũng cảm ơn đến các anh chị là cán bộ phòng thí nghiệm

năng lượng sinh họcđã giúp đỡ, hướng dẫn, và giải đáp những thắc mắc trong quá trình

thực tập. Xin trân trọng cảm ơn:

• Th.S Trần Thị Tưởng An , Bộ môn Quá Trình & Thiết Bị, Khoa Kỹ Thuật

Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa, TP. Hồ Chí Minh. Xin cảm ơn cô là

người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện cũng như giúp đỡ, hỗ trợ kinh phí

cho tôi thực hiện đề tài này .

• TS Nguyễn Đình Quân – cảm ơn thầy đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá

trình thực hiện và giải đáp một số thắc mắc giúp tôi.

• Chị Trần Phước Nhật Uyên, Chị Vũ Lê Vân Khánh, Anh Phan Đình Đông,

anh Hải, anh Thiên và Chú Nguyễn Văn Khanh– đã sẵn sàng giải đáp, trao

đổi các thắc mắc trong quá trình thực tập tại xưởng.

Cũng xin cám ơn các bạn sinh viên đến từ các trường ĐH Bách Khoa, Tôn Đức

Thắng và ĐH Lạc Hồng, trong thời gian thực hiện các bạn đã giúp đỡ nhiệt tình.

Một lần nữa xin chân thành cám ơn quý thầy cô và các bạn!

Sinh viên thực hiện

Châu Nhật Huy

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4

1.1. Bioethanol .............................................................................................. 4

1.1.1. Giới thiệu chung về bioethanol...................................................... 4

1.1.2. Phân loại bioethanol....................................................................... 6

1.1.2.1. Bioethanol thế hệ thứ nhất ..................................................... 6

1.1.2.2. Bioethanol thế hệ thứ hai ....................................................... 6

1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba ......................................................... 7

1.1.3. Nguồn nguyên liệu cho sản xuất ................................................... 7

1.1.3.1. Sucrose .................................................................................... 7

1.1.3.2. Tinh bột ................................................................................... 8

1.1.3.3. Lignocellulose ........................................................................ 8

1.1.3.4. Cellulose ................................................................................. 9

1.1.3.5. Hemicellulose ......................................................................... 10

1.1.3.6. Lignin ...................................................................................... 10

1.1.4. Ưu và nhược điểm của bioethanol ................................................. 10

1.1.4.1. Ưu điểm .................................................................................. 11

1.1.4.2. Nhược điểm ............................................................................ 11

1.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và

Việt Nam ....................................................................................... 12

Đồ án tốt nghiệp

1.1.5.1. Trên thế giới ........................................................................... 12

1.1.5.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 14

1.1.6. Các công trình nghiên cứu sản xuất bioethanol ............................ 16

1.1.6.1. Trên thế giới ........................................................................... 16

1.1.6.2. Ở Việt Nam ............................................................................. 18

1.1.7Các phương pháp sản xuất bioethanol ............................................. 20

1.1.7.1. Khái niệm cơ bản ..................................................................... 20

1.1.7.2. Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocelluloses ............... 21

1.1.7.3. Quá trình và các phương pháp tiền xử lý ............................... 21

1.1.7.4. Quá trình thủy phân ................................................................. 25

1.1.7.1. Quá trình lên men ..................................................................... 26

1.1.7.5. So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp SSF và SHF ..... 29

1.1.7.6. Quá trình chưng cất và tinh chế ............................................... 30

1.2.Nguyên liệu ............................................................................................ 32

1.2.1. Giới thiệu về chuối ......................................................................... 32

1.2.2 Diện tích và sản lượng chuối ở Việt Nam ...................................... 32

1.23. Tình hình sản xuất chuối trên thế giới ............................................ 33

1.3. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất ethanol ................................ 34

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 35

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 35

2.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 35

2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 35

2.3.1. Nguyên vật liệu .............................................................................. 35

2.3.2. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu................................... 35

Đồ án tốt nghiệp 2.4. Tiến hành thí nghiệm............................................................................. 35

2.4.1Lên men riêng (SHF) ....................................................................... 32

2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Tiền xử lý........................................................ 34

2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Thuỷ phân ....................................................... 34

2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Lên men .......................................................... 36

2.4.2. Thuỷ phân và Lên men đồng thời (Simultaneous saccharification

and fermemtation, SSF) ............................................................................... 37

2.5.Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 38

2.6. Các phương pháp phân tích ................................................................... 40

2.6.1. Phương pháp hóa lý ....................................................................... 40

2.6.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm ................................................. 40

2.6.1.2. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS . 40

2.6.1.3. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng Anthrone ......... 41

2.6.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ............................... 41

2.6.1.5. Xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan ............... 43

2.6.2. Phương pháp vi sinh ...................................................................... 43

2.6.2.1. Phương pháp nuôi cấy nấm men ............................................ 43

2.6.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc ................................................... 44

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 47

3.1. Kết quả khảo sát các phương pháp thuỷ phân ...................................... 46

3.1.1. Thuỷ phân bằng H2SO4 .................................................................. 47

3.1.2. Thuỷ phân bằng Cellulase ............................................................. 48

3.2 Kết quả khảo sát các phương pháp lên men .......................................... 48

iii

3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian lên men SHF ....................................... 48

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SHF ........................................ 52

3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH trong lên men SHF .............. 54

3.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống nấm men trong lên men SHF ........... 56

3.2.5. Kết quả khảo sát thời gian lên men SSF........................................ 57

3.2.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SSF ......................................... 60

3.2.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH trong lên men SSF .............. 61

3.3. Kết quả đo hoạt tính enzyme ................................................................. 62

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 65

PHỤ LỤC A.Cách xây dựng đường chuẩn định lượng đường khử (glucose) PHỤ LỤC B.Cách xây dựng đường chuẩn định lượng cellulose PHỤ LỤC C.Quy trình nhân giống nấm men PHỤ LỤC D.Bảng số liệu kết quả

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc chính của linocellulose ........................................................... 8

Hình 1.2. Chuỗi mạch thẳng của cellulose ............................................................ 10

Hình 1.3. Chuối musha paradisiaca ....................................................................... 16

Hình 2.1. Quy trình lên men SHF .......................................................................... 32

Hình 2.2. Quy trình lên men SSF .......................................................................... 37

Hình 3.1. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 1 ngày ...... 47

Hình 3.2. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 2 ngày ...... 47

Hình 3.3. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 3 ngày ...... 48

Hình 3.4. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng H2SO4 ............................... 48

Hình 3.5. Sự thay đổi độ cồn theo thời gian trong lên men SHF.......................... 49

Hình 3.6. Sự thay đổi độ Brix theo thời gian trong lên men SHF ........................ 50

Hình 3.7. Sự thay đổi hàm lượng glucose theo thời gian trong lên men SHF...... 51

Hình 3.8. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo nhiệt độ trong lên men SHF .............. 53

Hình 3.9. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo nhiệt độ trong

lên men SHF........................................................................................................... 53

Hình 3.10. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo pH trong lên men SHF .................... 54

Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo pH trong lên men

SHF................................................................................................................... …55

Hình 3.12. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo tỉ lệ giống trong lên men SHF ........ 56

Hình 3.13. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo tỉ lệ giống trong

lên men SHF........................................................................................................... 56

Hình 3.14. Sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo thời gian trong lên men SSF ...... 57

Hình 3.16. Sự thay đổi hàm lượng glucose theo thời gian trong lên men SSF .... 58

Đồ án tốt nghiệp Hình 3.16. Sự thay đổi độ cồn và brix theo nhiệt độ trong lên men SSF ............. 60

Hình 3.17. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo pH trong lên men SSF ..................... 60

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

SSF ...................................................... Thuỷ phân và lên men đồng thời

SHF...................................................... Thuỷ phân và lên men riêng biệt

vii

SSCF ................................................... Đồng đường hoá và đồng lên men

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.Sản lượng ethanol theo khu vực ............................................................ 13

Bảng 2.2.Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam....................................... 14

Bảng 2.3.Diện tích trồng chuối theo các vùng ...................................................... 31

Bảng 2.4.Sản lượng trồng chuối theo vùng ........................................................... 32

viii

Bảng 2.5.Thành phần hóa học của chuối............................................................... 33

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Đã từ rất lâu, dầu mỏ luôn giữ một vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế của mỗi quốc gia. Hơn 90% lượng dầu mỏ khai thác được phục vụ cho nhu cầu năng lượng như xăng nhiên liệu, nhiên liệu phản lực, diesel, nhiên liệu đốt lò Có thể nói dầu mỏ là nền tảng của sự tăng trưởng và phát triển kinh tế của bất kì một quốc gia nào. Trong những năm gần đây, với sự leo thang của giá xăng dầu gây nhiều tác động tiêu cực đến nền kinh tế thế giới. Vì vậy việc tìm kiếm những nguồn năng lượng sạch, có khả năng tái tạo để thay thế một phần xăng dầu trở thành một vấn đề cấp thiết và được nhiều quốc gia quan tâm. Một trong những hướng đi hiệu quả là sử dụng ethanol để pha vào xăng vừa làm tăng chỉ số octane, vừa làm giảm ô nhiễm môi trường nên xăng pha cồn ngày càng trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Hơn nữa, nước ta là một nước nông nghiệp có nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol là rất phong phú. Việt Nam sở hữu hai đồng bằng rộng lớn là đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng Sông Cửu Long. Đây là vùng nguyên liệu lí tưởng, là tiền đề cho sự ra đời của nhà máy sản xuất ethanol từ cellulose.

Ngày nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm trọng. Như chúng đã biết, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 60-80% nguồn năng lượng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trừ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40- 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an ninh năng lượng đáp ứng cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới, trong đó nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hướng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá thạch đang cạn kiệt, đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia.

Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại các lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi trường vì nguyên liệu sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học không chứa các hợp chất thơm, hàm lượng lưu huỳnh thấp, không chứa chất độc hại, mặt khác nhiên liệu sinh học khi thải vào đất có tốc độ phân hủy sinh học cao nhanh hơn gấp 4 lần so với nhiên liệu dầu mỏ và do đó giảm được rất nhiều tình trạng ô nhiễm nước ngầm.

Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng thích nghi như nguồn nhiên liệu mới cho tương lai. Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do tinh bột là nguồn lương thực của con người. Nếu sử dụng lương thực để sản xuất bioethanol sẽ

Đồ án tốt nghiệp làm cho giá của lương thực tăng cao. Như vậy, sẽ làm bất bình ổn giá của lương thực, tác động xấu đến thị trường lương thực trong nước. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40 – 75% tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu là yêu cầu cho việc sản xuất bioethanol. Như các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của ngành nông nghiệp: rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ cam chanh, phụ phẩm trái cây…

Với những lí do như trên, đề tài này là bước đi hỗ trợ việc sản xuất ethanol

phục vụ cho nhu cầu năng lượng ngày càng tang ở nước ta.

2. Mục đích nghiên cứu của đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát và qua đó rút ra được điều kiện tối ưu của

các phương pháp lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài tập trung vào những nghiên cứu:

3.1. Khảo sát và so sánh kết quả thuỷ phân vỏ chuối bằng enzyme và H2SO4.

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men SHF như: thời gian, nhiệt độ, pH và tỉ lệ giống.

3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men SSF như: thời gian, nhiệt độ và pH.

3.4. Thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme.

4. Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sử dụng các phương pháp và phần mềm:

5.1. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS.

5.2. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng thuốc thử Anthrone.

5.3. Phương pháp xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan.

5.4. Phương pháp nuôi cấy nấm men.

5.5. Phương pháp đếm khuẩn lạc.

5.6. Phần mềm Statgraphics Centurion XV.

Đồ án tốt nghiệp 5. Các kết quả đạt được của đề tài

5.1. Kết quả thuỷ phân bằng cellulase nồng độ 5% trong 1 ngày là tối ưu nhất.

5.2. Phương pháp SHF

5.2.1. Khảo sát thời gian cho kết quả lên men trong 18 giờ đạt độ cồn cao nhất 4.8%.

5.2.2. Khảo sát nhiệt độ cho kết quả lên men ở 370C là tối ưu nhất.

5.2.3. Khảo sát pH cho kết quả lên men ở pH 5 là thích hợp nhất.

5.2.4. Khảo sát tỉ lệ giống cho kết quả lên men với tỉ lệ giống 5% là thích hợp và tiết kiệm nhất.

53. Phương pháp SSF

5.3.1. Khảo sát thời gian cho kết quả lên men trong 38 giờ đạt độ cồn cao nhất 5.1%.

5.3.2. Khảo sát nhiệt độ cho kết quả lên men ở 370C là tối ưu nhất.

5.3.3. Khảo sát pH cho kết quả lên men ở pH 5 là thích hợp nhất.

6. Kết cấu của đồ án

Đồ án gồm 4 chương:

Chương 1. Tổng quan tài liệu.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Chương 3. Kết quả và thảo luận.

Chương 4. Kết luận và kiến nghị.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bioethanol

1.1.1. Giới thiệu chung về bioethanol

Bioethanol là rượu ethanol sinh học thu được từ quá trình lên men vi sinh các

loại nguyên liệu chứa đường hoặc từ tinh bột, cellulose nhờ vào phản ứng trung gian

thủy phân thành đường của vi sinh. Bioethanol được tổng hợp thông qua quá trình sinh

học, vi sinh sử dụng nguồn nguyên liệu đường làm thức ăn để thực hiện hô hấp kỵ khí

và thải ra ethanol và khí CO2. Trong khi đó, ethanol có nguồn gốc dầu mỏ thì được

tổng hợp thông qua quá trình hóa học, không có mặt tham gia của cơ thể sống trong

quá trình tạo ethanol.

Đặc tính của ethanol [4]

Công thức phân tử: C2H5OH

Khối lượng phân tử: 46.07 g/mol

Trạng thái: lỏng, không màu (từ -117 oC – 78 oC)

Tỉ trọng: 0.789 kg/l

Điểm sôi: 78.5 oC

Điểm đông đặc: -1170C

Giới hạn nổ: dưới 3.5% v/v; trên 19% v/v

Áp suất hơi: 38 oC, 50mmHg

15.9 pKa:

Độ nhớt: 1.200 mPa.s (20 oC)

Bioethanol có thể sử dụng để tạo ra ethanol khối gel để sử dụng làm năng

lượng nấu ăn ( sử dụng trong nhà bếp), làm nhiên liệu phát điện, sử dụng làm dung

môi trong chiết suất dược liệu. Ethanol tuyệt đối được ứng dụng để làm phụ gia khi

thêm vào ETBE, polyethylenterephtalate trong sản xuất bao bì và chai nhựa, pha vào

xăng để tăng chỉ số octane của xăng.

Đồ án tốt nghiệp

Bioethanol là nguồn năng lượng tái tạo và không đóng góp vào việc làm

tăng hiệu ứng nhà kính. Nếu như ta đốt cháy các sinh khối sẽ sinh ra CO2 thì tác động

xấu tới môi trường mà không có hiệu quả kinh tế. Các nguồn sinh khối có nguồn gốc

thực vật, được tổng hợp thông qua quá trình tổng hợp quang học. Tổng hợp bioethanol

từ nguồn sinh khối là chuyển nguồn năng lượng tổng hợp quang học thành nguồn năng

lượng có giá trị và nhiều ứng trong thực tế. Sinh khối thực vật không phải thực phẩm

là nguồn nguyên liệu thuộc “thế hệ thứ hai” được sử dụng để chuyển hóa thành

bioethanol với sự kết hợp công nghệ hóa học hiện đại và công nghệ sinh học, đó là

nguồn phụ phẩm của ngành nông nghiệp như rơm rạ, vỏcacao … . Với sự phát triển

của ngành sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối thực vật sẽ thúc đẩy các hộ

nông dân trồng trọt tăng diện tích cây trồng cung cấp nguồn lương thực cho con người

và tận dụng sinh khối. Như vậy, sẽ tạo ra diện tích cây xanh nhiều hơn giúp cân bằng

hệ sinh thái, giảm hiện tượng hiệu ứng nhà kính.

1.1.2. Phân loại bioethanol

1.1.2.1.Bioethanol thế hệ thứ nhất

Ethanol sinh học thếhệ thứ nhất là ethanol sinh học làm từđường, tinh bột,

bằng cách sửdụng công nghệ thông thường.Các nguyên liệu cơ bản để sản xuất ethanol

sinh học thếhệđầu tiên thường là hạt giống hoặc các loại ngũ cốc như lúa mì, tinh bột

được lên men thành ethanol sinh học.

1.1.2.2. Bioethanol thế hệ thứ hai

Quy trình sản xuất ethanol sinh học thế hệ đầu tiên có ích, nhưng hạn chế:

không thể sản xuất đủ ethanol sinh học mà không đe dọa nguồn cung cấp thực phẩm

và đa dạng sinh học và việc phải cạnh tranh về chi phí với nhiên liệu hóa thạch như

xăng.

Ethanol sinh học thế hệ thứ hai có thể giúp giải quyết những vấn đề này và có

thể cung cấp một lượng nhiên liệu bền vững,chi phí thấp, và với những lợi ích lớn hơn

về môi trường.

Ethanol sinh học thế hệ thứ hai được sản xuất bằng cách lên men thực vật có

nguồn gốc đường để sản xuất ethanol,bằng cách sử dụng một quá trình tương tự như

Đồ án tốt nghiệp được sử dụng trong bia và rượu.Điều này đòi hỏi việc sử dụng cây trồng như mía, ngô,

lúa gạo, lúa mì, và củ cải đường.

Ethanol sinh học cũng có thể sản xuất từ phụ phẩm của các loại cây trồng hiện

nay, như thân cây, rơm rạ, lá và trấu cũng như các loại cây trồng khác mà không được

sử dụng cho các mục đích thực phẩm (không phải cây lương thực), như cỏ, jatropha và

ngũ cốc v.v…

1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba

Sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung (dầu thực vật, biodiesel, bioethanol,

biogas, biomethanol, biobutanol và nhiên liệu sinh học khác), ethanol sinh học nói

riêng từ tảo.Trong số các đặc điểm hấp dẫn nhiên liệu từ tảo: không ảnh hưởng đến

nguồn nước ngọt, có thể được sản xuất bằng cách sử dụng biển và nước thải, được

phân hủy và tương đối vô hại cho môi trường.Trong quá trình quang hợp, tảo và các

sinh vật khác sử dụng carbon dioxide và ánh sáng mặt trời và chuyển nó thành oxy và

nhiên liệu sinh học.

1.1.3. Nguồn nguyên liệu cho sản xuất

Công nghệ chiếm ưu thế hiện nay trong sản xuất bioethanol là chuyển hoá sinh

khối thành ethanol thông qua lên men rượu rồi chưng cất. Quá trình lên men rượu này

là quá trình chuyển hoá sinh hoá học, sinh khối sẽ được vi khuẩn hoặc nấm men phân

huỷ. Phương pháp lên men có thể áp dụng đối với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau.

1.1.3.1Sucrose

Đường mía, ở dạng dịch ép hoặc rỉ đường, là nguồn nguyên liệu quan trọng

nhất ở các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới để sản xuất bioethanol. Ở các nước Châu Âu,

đường từ củ cải đường được sử dụng. Bên cạnh đó, cây lúa miến ngọt cũng là nguồn

nguyên liệu thô triển vọng, phần than có thể được chiết tách tạo ra dịch trích chứa

nồng độ sucrose cao, hạt của nó chứa lượng lớn tinh bột, phần bã là nguồn

lignocelluloses quan trọng.

Quá trình chuyển hoá sucrose thành ethanol dễ hơn so với tinh bột và sinh khối

lognocellulose vì không cần qua quá trình tiền xử lý, tế bào nấm men có thể thuỷ phân

Đồ án tốt nghiệp disaccharide, thêm vào đó là điều kiện lý tưởng của dịch đường và rỉ đường cho quá

trình lên men.

Đánh giá hiệu quả kinh tế của Maiorella và cs (1984) thì chi phí nguyên liệu lên

đến 70% chi phí sản xuất bioethanol nếu sử dụng rỉ đường làm nguyên liệu.

1.1.3.2. Tinh bột

Tinh bột là một polysaccharide carbohydrate chứa hỗn hợp amylose và

amylopectin. Chúng đều là các polymer carbohydrate phức tạp của glucose. Để chuyển

hoá tối đa lượng tinh bột thành đường, tạo điều kiện lên men rượu, bột nhão được nấu

và cho thuỷ phân bằng enzyme hoặc acid loãng. Quá trình lên men được thực hiện khi

có mặt một số chủng men rượu. Để thuận lợi cho quá trình lên men, pH của dịch thuỷ

phân cần điều chỉnh ở mức 4,8 – 5. Bioethanol sinh ra trong quá trình lên men sẽ hoà

tan trong nước. Nhờ hàng loạt các bước chưng cất để loại nước, nồng độ bioethanol sẽ

được tăng cao tối đa. Đối với các loại hạt, năng suất ethanol thu được vào khoảng

2.800 lít/ha, tức khoảng 3 tấn nguyên liệu hạt sẽ thu được 1 tấn bioethanol.

1.1.3.3. Lignocellulose

Hình 1.1.Cấu trúc chính của linocellulose

Lignocellulose là một chất hữu cơ tái tạo và là thành phần cấu trúc chính của

thành tế bào thực vật.Lignocellulose bao gồm ba thành phần chính: cellulose,

hemicellulose và lignin.Ngoài ra, có một số thành phần khác như protein, pectin, và

Đồ án tốt nghiệp tro.Tỉ lệ giữa các thành phần là khác nhau tùy thuộc vào nguồn lignocellulose.Ngoài

ra, tỉ lệ đó còn phụ thuôc vào tuổi, giai đoạn tăngtrưởng, điều kiện sinh trưởng.

Các thành phần cấu tạo nên lignincellulose (lignin, cellulose, hemicellulose) là

các đối tượng khó bị phân hủy.Tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khichúng

liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa tạo thành một thể cấu trúcchặt chẽ và

phức tạp.Các vi sợi cellulose, lignin, hemicellulose được sắp xếp theo những quy tắc

nhất định để hình thành nên cấu trúc vi sợi.Với cấu trúc nhiều lớp, gồm nhiều

thànhphần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignocellulose có độ bền vật lý cao,

rấtkhó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme.Hơn nữa để phân hủy bất cứ

thànhphần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến

thànhphần khác.Ví dụ như, để phân giải lignocellulose thì cần đồng thời tác động của

lignin, cellulose và hemicellulose. Nhưng do cả ba điều có tính chất hóa học khácnhau

nên cơ chế tác động và điều kiện tiến hành cũng khác nhau.

1.1.3.4. Cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Chúng là một homopolimer mạch

thẳng, được cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose. Các glucose này liên kết với nhau

bằngliên kết α-1, 4 glucoside. Cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các

gốcglucose trong cellulose thường lệch một góc 1800và có dạng như một chiếc ghế

bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình.

Hình 1.2.Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000 – 2.500.000 dalton.Các

phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút “Van der waals” và “liên kết hydro”.

Các phân tử celluose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm.Các sợi sơ

cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibri ).Và hemicellulose và lignin bao

xung quanh các vi sợi đó.

Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.5. Hemicellulose

Hemicellulose là thành phần chính thứ hai của sinh khối lignocellulose, với

hàm lượng lớn sau cellulose.Hemicellulose là một polymer không đồng nhất (hỗn tạp),

được cấu tạo từ các loại đường khác nhau như pentoses (bao gồm xylose vàarabinose),

hexose (chủ yếu là mannose, ngoài ra còn có glucose và galactose) vàthậm chí cả từ

acid uronic của chúng (ví dụ như 4-omethylglucuronic, d-glucuronic,và d-

galactouronic axít). Người ta gọi tên cụ thể một loại hemicellulose dựa theotên một

loại đường nào đó chiếm tỷ lượng lớn trong thành phần của hemicellulose.Ví dụ như

xylan-loại hemicellulose dễ gặp nhất trong thiên nhiên.Xylan là một hemicellulose mà

thành phần chủ yếu của nó là xylose, mannose,…trong đó xylose chiếm tỷ lượng lớn

nhất.Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm

khoảng 20-25%).Ở những cây lá kim thường chứa ít xylan.

Phân tử lượng của hemicellulose nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất

nhiều.Hemicellulose thường được cấu tạo từ 150 gốc đường.Các gốc đường này được

nối với nhau bằng các liên kết β-1,4; β-1,3; β-1,6 glucoside.Chúng thường là những

mạch ngắn, phân nhánh.

Trong tế bào thực vật, hemicellulose thường nằm xen kẽ giữa các bó sợi

cellulose tạo nên một dạng cấu trúc bền vững.

1.1.3.6. Lignin

Lignin là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung

ởnhững mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm

nướcqua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh.

Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của

phenyl, propan, một sốchất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin làsản

phẩm ngưng tụ chủ yếu của ba loại rượu thơm:coniferyl (guaiacyl propanol),sinapyl

(syringyl alcohol) và p-coumaryl (p-hydroxyphenyl propanol) theo tỷ lệkhác nhau tùy

loại thực vật.

Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kếtvà

loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa cácmonome là

kiểu liên kết aryl-glyxerol-aryl ete.Ngoài ra còn có các kiểu liên kết phenyl- coumaryl,

biphenyl.

Đồ án tốt nghiệp

Lignin hoạt động như một rào cản, cản trở sự thủy phân cellulose,

hemicellulose thành đường và các hợp chất hữu cơ khác để có thể biến đổi thành nhiên

liệu, bằng cách liên kết chặt chẽ với cả hemicellulose và cellulose.

1.1.4. Ưu và nhược điểm của bioethanol

1.1.4.1. Ưu điểm:

Ethanol sinh học được biết đến với rất nhiều lợi thế: là một trong những biện

pháp kìm hãm hiện tượng nóng lên toàn cầu; giúp các quốc gia chủ động, không bị lệ

thuộc vào vấn đề nhập khẩu nhiên liệu, đặc biệt đối với những quốc gia không có

nguồn dầu mỏ và than đá;kiềm chế sự gia tăng giá xăng dầu, ổn định tình hình năng

lượng cho thế giới;tạo thêm công ăn việc làm cho người dân; và cũng không đòi hỏi

phải có những thiết bị và công nghệ đắt tiền.

Về mặt kĩ thuật thì cồn nguyên chất khi cháy dưới điều kiện lý tưởng, theo lý

thuyết thì chỉ có CO2 và H2O, nhưng thực tế thì CO cũng được sinh ra, tuy nhiên lượng

CO thường thấp hơn đối với xăng. Nguyên nhân ethanol có chứa 6% oxygen theo thể

tích cho phép động cơ tự đốt cháy nhiên liệu hoàn toàn, kết quả là làm giảm sự ô

nhiễm khí CO. Ethanol là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh vì được sản xuất từ

cây nông nghiệp thu hoạch hàng năm, sử dụng năng lượng mặt trời là chính.Ethanol có

nguồn gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối hấp thụ lại tạo nên sự cân

bằng về lượng CO2, do đó không gây nên hiệu ứng nhà kính.

Công suất lớn hơn có thể đạt được ở ethanol nhiên liệu do tỉ số nén của xăng

dầu là 8:1còn của ethanol là 12:1.Số liệu thực nghiệm chỉ ra rằng ethanol nhiên liệu có

thể tạo ra công suất lớn hơn 20% so với xăng dầu (Pimentel, 1980).Ethanol có chỉ số

octan là 113, cao hơn so với khoảng 83- 95 của xăng.Chỉ số này cao đồng nghĩa với

việc hạn chế được hiện tượng tự phát nổ, xảy ra trước khi đánh lửa, sẽ làm hại động

cơ.Mặt khác, ethanol không chứa các chất khác độc hại như chì.

1.1.4.2. Nhược điểm:

Bên cạnh các ưu điểm đã biết, công cuộc phát triển ethanol sinh học cũng chứa

đựng không ít nhược điểm về mặt kĩ thuật cũng như nguy cơ vềmôi trường, kinh tếvà

xã hội.Nếu không được quản lý và kiểm soát tốt, các tác dụng xấu sẽ xảy ra, thậm chí

có thể lớn tới mức lấn át cả những mặt tích cực do nhiên liệu sinh học mang lại.Nguy

Đồ án tốt nghiệp cơ sẽ càng rõ hơn theo quy mô ngày càng tăng của nền công nghiệp nhiên liệu sinh

học.

Những nhược điểm và nguy cơ chính trong quá trình phát triển Bioethanol cần

phải kể đến là:

Về mặt kỹ thuật:

Bioethanol là một nhiên liệu kém hiệu quả hơn xăng, chỉ chứa năng lượng bằng

70% so với xăng.Mặt khác, để sử dụng được xăng có nồng độ ethanol cao, một số xe

cần phải cải biến.

Vấn đề lương thực:

Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ...) có lợi hơn

trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp

cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm.

Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước:

Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì

vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước

trong khu vực.

Giảm diện tích rừng:

Để có đất trồng cây nguyên liệu, người ta có thể tiếp tục phá rừng.Giảm diện tích

rừng cũng đồng nghĩa với tai hoạ từ sự xói mòn đất, giảm lượng gỗ dùng cho xây dựng

và các nhu cầu khác của người dân.

Nguy cơ từ sự độc canh:

Trồng duy nhất một loại cây trong một thời gian dài trên cùng diện tích đất sẽ làm

đất đai trở nên cằn cỗi và không thể tiếp tục canh tác được.

Nguy cơ từ sự biến đổi gen cây nguyên liệu:

Gây tác động xấu tới các loài vi sinh vật sống nhờ vào thực vật và có thể gây nên

sự mất cân bằng sinh thái.

Nguy cơ do khai thác nhiên liệu sinh học từ rác thải nông nghiệp và một số loài thực

vật khác:

Ngoài mía đường, đậu tương, cọ,... nhiên liệu sinh học còn có thểđược sản xuất từ

rác thải nông nghiệp khác và cỏ.Tuy nhiên, rác thải nông nghiệp và cỏ cũng có vai trò

riêng đối với môi trường, không thể khai thác một cách không tính toán.

Đồ án tốt nghiệp Nguy cơ về kinh tế xã hội:

Những người nghèo, không có khảnăng tựchủcanh tác phải bán ruộng.Đất đai tập

trung vào một sốđiền chủlớn.Như vậy, một lớp người sẽtước mất phương tiện sản

xuất, rơi vào tình trạng thất nghiệp, nghèo đói, làm bất ổn đời sống xã hội.Kéo theo đó

là tình trạng phân hoá giàu nghèo ngày càng rõ rệt.

1.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và ViệtNam

1.1.5.1. Tình hình sản xuất trên thế giới

Theo báo cáo F.O. Licht thì bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu đốt trong

từ năm 1860 do nhà khoa học Nicolas August Otto (Đức) khám phá. Vào những năm

20 của thế kỷ 20, Henry Ford đã thiết kế ra động cơ xe ô tô chạy bằng ethanol đầu tiên

trên thế giới.[17]

Đến sau 1930 thì Mỹ, Brazil, Anh, Pháp, Đức, Ý, Thuỵ Điển… đã bắt đầu sử

dụng Bio-Ethanol thay thế xăng. Nhưng trào lưu này thực sự bùng nổ vào những năm

1970 khi nguồn nhiên liệu chính là dầu mỏ bị khủng hoảng nguồn cung.

Cũng theo báo cáo trên thì 47 % bioethanol nhiên liệu trên thế giới được sản

xuất từ mía đường, 53% là từ cây có chứa tinh bột (bắp, sắn lát và lúa mì). Sản lượng

bioethanol sản xuất năm 2008 khoảng 65.7 tỷ lít. Nhu cầu Bio-Ethanol nhiên liệu trên

toàn thế giới vào năm 2015 sẽ cao gấp hơn 2 lần sản lượng năm 2006 (100 tỷ lít).

Trước đó, Brazil là quốc gia đứng đầu về sản xuất và tiêu thụ bioethanol. Đến

năm 2006, Mỹ vượt qua Brazil và trở thành nước sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn

nhất thế giới. Các quốc gia sản xuất bioethanol lớn như Braxil, Mỹ, Trung Quốc, Ấn

Độ và Pháp chiếm 84% sản lượng bioethanol nhiên liệu của toàn thế giới trong năm

2005.

Brazil là nước đi đầu trên thế giới trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu từ

mật rỉ đường trong năm 2004 và đến năm 2008, Brazil đã sản xuất được 30 tỷ lít,

chiếm 34 % sản lượng bioethanol toàn thế giới. Trong giai đoạn 2012 – 2013, Brazil sẽ

đạt được 37 tỷ lít/năm từ 728 tỷ rỉ đường. Ở Brazil, tỉ lệ bioethanol pha trộn với xăng

hóa thạch là 20% và 25% tương ứng với loại xăng E20 và E25. Nhóm các nước nhập

khẩu bioethanol nhiên liệu từ Brazil là Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thụy Điển

và Hà Lan.

Đồ án tốt nghiệp

Năm 2007, Mỹ đã vượt qua Brazil trở thành quốc gia lớn nhất thế giới về sản

xuất bioethanol nhiên liệu từ nguồn nguyên liệu là ngô, chiếm 44 % sản lượng toàn thế

giới. Theo chương trình phát triển năng lượng quốc gia, Mỹ sẽ sản xuất 150 tỷ lít

bioethanol vào năm 2030.

Năm 2010, sản lượng bioethanol của EU là 341.250.000 lít chiếm 8% sản lượng

thế giới. Trong đó, Pháp là quốc gia sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất châu Âu

(114 triệu lít, chiếm 33 %), Tây Ban Nha 47.8 triệu lít ( chiếm 14 %) và Đức 44.4 triệu

lít ( chiếm 13 %).

Trung Quốc là nước sản xuất bioethanol lớn nhất khu vực Châu Á, đứng thứ ba

trên thế giới, sản xuất ethanol từ ngô. Năm 2005, tổng sản lượng bioethanol của quốc

gia này xấp xỉ 3.8 tỷ lít (trong đó 1.3 tỷ lít là bioethanol nhiên liệu), chiếm gần 8 % sản

lượng toàn thế giới.

Các quốc gia khác đã có những thành tựu đáng kể trong việc sản xuất

bioethanol đó là Ấn Độ, Thái Lan và một số quốc gia khác:

Ấn Độ là quốc gia đứng thứ 2 ở châu Á về sản xuất bioethanol sau Trung

Quốc, chiếm 4% sản lượng ethanol toàn cầu. Năm 2005 sản lượng bioethanol của Ấn

Độ là 1.7 tỷ lít, trong đó 200 triệu lít là bioethanol nhiên liệu.

Thái Lan là quốc gia Đông Nam Á đi tiên phong trong việc sản xuất bioethanol

nhiên liệu. Năm 2007, Thái Lan có 9 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu với tổng

công suất gần 400 triệu lít/năm, trong khi đó chỉ có duy nhất nhà máy Thai Nguan sản

xuất bioethanol từ sắn lát. Dự kiến đến năm 2011, Thái Lan sẽ sản xuất khoảng 1 tỷ lít

bioethanol nhiên liệu.

Bàng 2.1.Sản lượng ethanol theo khu vực (Đơn vị: triệu lít)[1]

2008 2009 2010 2011 2012 2013

Châu Âu 1.627 1.958 3.945 4.851 6.015 8.812

Châu Phi 71 101 154 168 170 213

Châu Mỹ 60.913 65.144 76.890 79.311 81.192 85.133

Đồ án tốt nghiệp

Châu Á- Thái 2.832 3.189 4.721 5.828 7,144 8.903

Bình Dương

Thế giới 65.762 74.921 85.933 89.294 95.450 96.132

Nguồn: Dr.Chirstoph Berg F.o.Litch, World fuel ethanol analysis

1.1.5.2. Tại Việt Nam

Ở Việt Nam bioethanol được sử dụng một phần trong công nghiệp, thực phẩm,

thức uống và phần lớn được dùng làm nhiên liệu sinh học. Tính đến tháng 4/2012, có

13 dự án sản xuất ethanol nhiên liệu, 5 nhà máy đã đi vào hoạt động với công suất

thiết kế 490 triệu lít/năm. Hiện nay một phần xăng được sử dụng ở các thành phố lớn ở

nước ta đều được pha bioethanol để được sản phẩm xăng sinh học E5. Đây là cơ hội

tốt cho Việt Nam góp phần vào nỗ lực cải thiện đời sống nông thôn, xóa đói giảm

nghèo và thu hẹp khoảng cách đời sống giữa nông thôn và thành thị. Cho nên cần có

một chính sách và quy hoạch quốc gia nhằm vừa hỗ trợ phát triển ngành sản xuất các

loại nhiên liệu sinh học vừa tạo thêm việc làm ở nông thôn, tăng gia lợi tức nông dân

và bảo đảm an ninh năng lượng trong nước. Thế nhưng việc đưa xăng E5 ra thị trường

còn nhiều trở ngại, lượng tiêu thụ trong thời gian qua ở mức rất thấp. Để có thể duy trì

hoạt động, các doanh nghiệp sản xuất ethanol Việt Nam đang phải tìm đường xuất

khẩu.

Bảng 2.2. Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam.[3]

Công suất – Nguyên liệu Chủ đầu tư Tên nhà máy đầu vào

Nhà máy Ethanol Đại Lộc 100 triệu lít/năm – Sắn Công ty Đồng Xanh

– Quảng Nam

Nhà máy Ethanol Cư Dút – 50 triệu lít/năm –Rỉ đường Công ty Đại Việt

Đắc Nông

Nhà máy Ethanol Tam 100 triệu lít/năm – Sắn, Công ty PVB thuộc PV

Đồ án tốt nghiệp

Nông – Phú Thọ mía OIL

Nhà máy Ethanol Dung 100 triệu lít/năm – Sắn Nhà máy liên doanh Bình

Sơn thuộc Petrovietnam Quất

Nhà máy Ethanol Bình 100 triệu lít/năm – Sắn Liên doanh ITOCHU Nhật

Bản và PV OIL Phước

1.1.6 Các công trình nghiên cứu sản xuất bioethanol

1.1.6.1. Trên thế giới

Trong những thập niên gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất

bioethanol từ biomass ở rất nhiều nơi trên thế giới và đã thu được những thành công

nhất định, tạo cơ sở khoa học cần thiết cho việc chuyển giao công nghệ sản xuất

bioethanol vào quy mô công nghiệp, để phục vụ nhu cầu năng lượng cho thế giới.

Năm 2008, B.C. Akin-Osanaiye, H.C. Nzelibe and A.S. Agbaji, đã báo cáo đề

tài “Sản xuất ethanol từ phụ phẩm của trái đu đủ”. Sau quá trình trích ly enzyme

papain để sản xuất các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa thức ăn giàu protein ở người thì

những phần còn lại sẽ được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae trong thời gian 72

giờ, nhiệt độ 300C. Kết quả đạt độ cồn từ 2.82 – 6.60% theo thể tích.

Năm 2009, Simone Brethauer, Charles E. Wyman đã báo cáo nghiên cứu “Tổng

quan: Phương pháp thủy phân và lên men liên tục cho sản xuất ethanol từ nguyên liệu

cellulose”.

Năm 2011, Hossain, A. B. M. S.1, Ahmed, S. A, Ahmed M. Alshammari, Faris

M. A. Adnan, Annuar, M. S. M., Hadeel Mustafa1 and Norah Hammad, đã báo cáo

nghiên cứu “ Sản xuất nhiên liệu bioethanol từ phụ phẩm vỏ chuối để quản lý chất thải

và phát triển nguồn năng lượng bền vững”. Đề tài đã tiến hành thủy phân nguyên liệu

bằng sự kết hợp giữa cellulase và pectinase. Kết quả lên men bằng Saccharomyces

cerevisiae cho độ cồn từ 4.1 tới 7.1% bioethanol.[22]

Đồ án tốt nghiệp

Năm 2011, Kulanthaivel Senthilguru, Tanya Susan George, Narasinganallur

Sankaranarayanan Vasanthi và Kilavan Packiam Kannan, đã báo cáo kết quả nghiên

cứu đề tài “ Sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose phụ phẩm”. Đề tài tiến hành

tiền xử lý nguyên liệu để tăng hiệu quả thủy phân của enzyme trong giai đoạn thủy

phân cellulose tạo ra đường. Đồng thời kết hợp với sử dụng loài nấm Phoma Sp. Kết

quả thu được 2.4% (v/w) cho 100 gram nguyên liệu lignocellulose.

Năm 2011, Razif Harun, Michael K. Danquah đã báo cáo nghiên cứu “Ảnh

hưởng của acid trong giai đoạn tiền xử lý sinh khối từ vi tảo cho sản xuất ethanol sinh

học”. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol sinh học thu được cao nhất là 7.2 g/L khi

bước tiền xử lý được thực hiện với 15 g/L vi tảo ở 140 oC sử dụng 1 % (v/v) acid

sulfuric trong 30 phút. Về sản lượng ethanol, tối đa khoảng 52% khối lượng (g

ethanol/ g tảo) thu được bằng cách sử dụng 10 g/L vi tảo và 3 % (v/v) acid sulfuric ở

160 oC trong 15 phút. Phân tích thống kê cho thấy trong số các thông số khảo sát thì

nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sử dụng acid trong tiền xử lý vi tảo

để sản xuất ethanol sinh học.

Năm 2012, Aloia Romaní, Gil Garrote, Juan Carlos Parajó đã báo cáo nghiên

cứu “Sản xuất ethanol sinh học từ gỗ bạch đàn globulus tự phân bằng phương pháp

đường hóa và lên men đồng thời”. Kết quả tạo ra được 291 L ethanol/1000 kg gỗ khô

từ cellulose trong đó chủ yếu chứa phần lớn là lignin.

Năm 2012, María Boluda-Aguilar, Antonio López-Gómez, đã báo cáo kết quả

nghiên cứu đề tài “Quá trình sản xuất bioethanol từ quá trình lên men vỏ cam chanh

được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi nước”. Trong vỏ cam chanh có chứa nhiều D

– limonene (0.8 – 1.6%) là chất ức chế hoạt động của nấm men. Nên đề tài áp dụng

phương pháp nổ hơi nước vỏ cam chanh để giảm hàm lượng D – limonene xuống còn

0.05%. Sau quá trình lên men, lượng cồn thu được 60 lít/1000 kg vỏ cam chanh tươi.

Tại Rio de Janeriro (Brazil), Elba P.S Bon và Maria Antoniete Ferrara đã tiến

hành nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ sinh khối bằng cách thủy phân bởi

enzyme. Đặc biệt gần đây tại Sao Paulo ( Brazil), nhóm nghiên cứu gồm Marcia A.

Ribeiro, Vanessa M. Cardoso, Manoel N. Mori, Jaime Finguerut, Celia M. A. Galvao

Đồ án tốt nghiệp và Celina L. Duarte đã tiến hành nghiên cứu tận dụng nguồn bã mía để sản xuất

bioethanol dùng phương pháp tiền xử lí bằng chiếu xạ điện tử.

- Tối ưu hoá các thông số của quá trình lên men để sản xuất ethanol từ chất thải

Kinnow và vỏ chuối bằng đường hoá đồng thời và quá trình lên men của Naresh

Sharma, K.L. Kalra, Harinder Singh Oberoi và Sunil Bansal thuộc trường Đại học

Punjab Agricultural, Ludhiana, Ấn Độ. Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá vai trò

của các thông số trong quá trình lên men như nồng độ nấm men, nhiệt độ, thời gian ủ

và thời gian khuấy trong việc sản xuất bioethanol từ vỏ chuối và bã Kinnow. Nghiên

cứu cho kết quả tối ưu trong việc lên men sản xuất bioethanol ở 300C, nồng độ nấm

men 6%, ủ trong 48 giờ kết hợp khuấy trong 24 giờ cho kết quả tốt nhất.

- Nghiên cứu tối ưu hoá sản xuất ethanol từ vỏ chuối bằng thuỷ phân và lên

men đồng thời của trường Đại học Kansas, Manhattan, Hoa Kỳ. Nghiên cứu cho kết

quả tối ưu về thời gian và nhiệt độ của quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời là

370C trong vòng 35 giờ cho nồng độ ethanol 28.2g/l và lượng ethanol sản xuất được là

2.3g/l/h là kết quả tối ưu nhất từ vỏ chuối.[18]

- Công trình nghiên cứu của bà Kadambini Gaur thuộc trường Đại học Deemed

về “tối ưu hoá sản xuất ethanol bằng lên men” vào tháng 6 năm 2006. Nghiên cứu sử

dụng nguyên liệu mía đường. Kết quả thu được ở 300C, pH 6.0 và nồng độ đường 20%

là tối ưu cho quá trình lên men.

1.1.6.2.Ở Việt Nam

Năm 2008, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” của

tác giả Trần Diệu Lý bằng cách sử dụng rơm rạ cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng

phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc. Sau đó được tiến hành thủy phân bằng

enzyme cellulase hoặc thủy phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và

Saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra. Kết quả cho thấy rằng, quá trình

thủy phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11 % bã rắn, 5 % enzyme, 50 0C và pH

4.8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55.08 g/l và hiệu suất đạt 81 %. Quá trình

thủy phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11 % bã rắn, 5 % enzyme, 23.6

triệu tế bào nấm men/ml, 500C và pH 4.8. Quá trình này thu được 30.86 g/l ethanol

Đồ án tốt nghiệp tương ứng hiệu suất là 86.61 %. Kết quả này cho thấy quá trình thủy phân và lên men

đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ.

Năm 2011, Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng, đã báo cáo kết

quả đề tài “ Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lông cứng (Cladophora Socialis

Kutzing) ứng dụng trong sản xuất cồn”. Với hàm lượng carbohydrate cao nên rất thuận

lợi để thủy phân tạo ra một lượng đường lớn cung cấp cho nấm men sinh ra lượng cồn

cao. Khi lên men 200 ml dịch đường sau quá trình thủy bằng Saccharomyces

cerevisiae trong điều kiện 300C trong 72 giờ, thu được 50 ml dịch bay hơi đầu tiên từ

quá trình chưng cất đạt độ cồn 5%. Cladophora Socialis Kutzing dễ dàng bị thủy phân

và lên men tạo ethanol hứa hẹn là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất

bioethanol..

Tháng 6, 2010, KS.Phạm Hải Triều thuộc Đại học Cần Thơ báo cáo đề tài :”

Nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ bã mía” cho thấy ảnh hưởng của các yếu

tố: thời gian, tỉ lệ cơ chất, tỉ lệ enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình tổng hợp bioethanol.

Nguyên liệu được cắt nhỏ và tiền xử lý bằng NaOH để phá vỡ cấu trúc lignin và một

phần hemicellulose. Sau đó tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulose, lên men bằng

Saccharomyces cerevisiae. Kết quả thu được cho thấy quá trình thủy phân diễn ra tốt

nhất ở điều kiện:10% bã rắn, 8% enzyme, 55oC và pH 4,8, tương ứng thu được nồng

độ glucose là 7,76% thời gian thủy phân là 21 giờ. Sau khi tiếp tục lên men trong 21

giờ thu được 3,93% ethanol với hiệu suất là 88,8%. Quá trình lên men tạo ethanol diễn

ra tốt nhất ở điều kiện: 11% bã rắn, 9% enzyme, 2,5% nấm men, 40oC , pH là 4,8,

tương ứng với nồng độ ethanol thu được là 3,63% và hiệu suất chuyển hóa là 82,77%.

Năm 2010, Tiến sĩ Lê Như Hậu, trưởng phòng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên

biển, thuộc viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang giới thiệu kết quả

nghiên cứu về đề tài :” Tiềm năng rong biển cho sản xuất cồn sinh học ở Việt Nam”.

Thống kê cho thấy số liệu đo đạt khảo sát thực tế về diện tích phân bố rong biển của

Viet Nam có thể đạt diện tích 79126,32 ha và sản lượng thu hoạch được là 69703,26

tấn khô. Rong biển có hàm lượng carbonhydrat cao, phù hợp với quá trình lên men để

sản xuất ethanol. Vì vậy. có thể sản xuất ethanol nhiên liệu sinh học từ rong biển. Kết

quả nghiên cứu cho thấy bức tranh toàn cảnh về tiềm năng rong biển làm nguyên liệu

Đồ án tốt nghiệp sản xuất bioethanol, góp phần vào chiến lược cho sự phát triển năng lượng bền vững

tại Việt Nam.

Năm 2009, Trường Đại học Bách Khoa TPHCM phối hợp với trường Đại học

Tokyo( Nhật Bản) thực hiện dự án” Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phương

với công nghiệp chế biến biomass”(Dự án JICA-JST Biomass). Dự án JICA-JST do cơ

quan hợp tác quốc tế Nhật Bản (JICA) và Bộ Khoa học Công nghệ Nhật Bản (JST) tài

trợ với tổng chi phí gần 150 đồng thực hiện trong thời gian 5 năm (2009 – 2014). Dự

án hướng đến việc sản xuất xăng sinh học, biogas sạch có nhiệt trị cao từ các phế

phẩm công nghiệp như: Rơm, rạ, trấu, phân bò,… nhằm bảo vệ môi trường, giảm hiệu

ứng nhà kính và góp phần đảm bảo năng lượng.

Năm 2009, dự án đã xây dựng một mô hình thiết bị tại Trường Đại học Bách

Khoa TPHCM để nghiên cứu sản xuất bioethanol. Sau gần 5 năm thực hiện, các nhà

khoa học đã nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ và các chất thải

có nguồn gốc cellulose. Tuy nhiên, một trong những khó khan cua dự án là giá thành

xăng sinh học sản xuất từ rơm rạ là khá cao, chi phí phân hủy cellulose là khá lớn.

TS. Lê Thị Kim Phụng – Điều phối viên của dự án cho biết, biogas từ nguồn

phân bò rất khó thực hiện nhưng dự án đã triển khai thành công ở xã Thái Mỹ, huyện

Củ Chi, TPHCM. Kỹ thuật làm sạch và làm giàu khí metan trong biogas đã được phát

triển và ứng dụng trên quy mô nhỏ. Cụ thể, dự án đã xây dựng được một xưởng thực

nghiệm sử dụng dây chuyền khép kín sản xuất thành công biogas sạch có nhiệt trị cao,

dung làm nhiên liệu cho động cơ và sản xuất công nghiệp. Qua dây chuyền này, những

phế phẩm nông nghiệp như: Rơm rạ, trấu, phân bò… sẽ được tạo thành nhiên liệu khí

có thể sử dụng như để chạy máy phát điện, máy kéo, máy cày,… Như vậy sản xuất

nông nghiệp tạo thành một vòng khép kín: Sauk hi thu hoạch, chất thải nông nghiệp lại

biến thành năng lượng và năng lượng này quay trở lại phụ vụ đời sống và sản xuất.

1.1.7. Các phương pháp sản xuất bioethanol

Sản xuất ethanol bằng phương pháp hóa học rất tốn nhiều chi phí cho thiết bị,

nguyên liệu và năng lượng. Nên để có hiệu quả kinh tế cao và đồng thời bảo vệ môi

Đồ án tốt nghiệp trường thì phải chọn phương pháp tổng hợp ethanol bằng con đường sinh học để thu

được bioethanol.

1.1.7.1. Khái niệm cơ bản

Nguyên liệu sản xuất biothenol gồm ba thành phần chính là cellulose,

hemicellulose và lignin. Công nghiệ chuyển đổi nguyên liệu này thành ethanol đã

được phát triển trên hai nền tảng có thể được gọi là nền tảng đường và nền tảng khí.

Trong nền tảng đường, cellulose và hemicellulose đầu tiên được chuyển đổi

thành đường lên men, sau đó được lên men đẻ sản xuất bioethanol. Những phân tử

đuường lên men gồm glucose, xylose, galactose và manose. Có thể sử dụng các acid

và enzyme để thủy phân cellulose và hemicellulose để tạo ra các loại đường (Drapcho

et al, 2008).

Trong nền tảng khí tổng hợp, nhiên liệu sinh học là đối tượng thông qua một

quá trình được gọi là khí hóa. Trong quá trình này, sinh khối được đun nóng với không

khí có oxy hoặc chỉ có một phần 3 oxy bình thường để đốt cháy hoàn toàn, sau đó

chuyển đổi thành sản phẩm khí trong đó có chủ yếu là carbon monoxide và hydro. Khí

được gọi là khí tổng hợp có thể lên men vi sinh vật cụ thể hoặc chuyển đổi xúc tác để

sản xuất bioethanol.

Trong nền tảng đường, chỉ có các phân tử carbohydrat được sử dụng để sản

xuất bioethanol, trong khi ở nền tảng khi tổng hợp, tất cả ba thành phần của nhiên liệu

sinh học được chuyển đổi thành bioethanol (Drapcho et al, 2008)

1.1.7.2. Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocelluloses:

Về nguyên tắc, quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa

cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản:

• Tiền xử lý nguyên liệu: giúp cho quá trình thủy phân cellulose thành

đường có hiệu quả hơn.

• Thủy phân nguyên liệu: sử dụng hệ enzyme thủy phân cellulase-

pectinase

• Lên men: sử dụng Saccharomyces cerevisiae.

Đồ án tốt nghiệp

• Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào

nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau.

1.1.7.3. Quá trình tiền xử lí và các phương pháp tiền xử lý

Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin và

hemicellulose. Trong đó, cellulose là thành phần quan trọng được sử dụng trong

chuyển hóa sinh khối thực vật thành bioethanol. Nhưng cellulose rất khó bị phân hủy

vì phân tử của nó rất lớn, liên kết giữa các monomer rất bền vững, phân tử có độ kết

tinh cao và nó liên kết chặt chẽ với lignin và hemicellulose. Nên cần phải có phương

Cellulose và hemicellulose được bảo vệ bởi lớp lignin dày đặc chống lại thủy

pháp tiền xử lý thích hợp nhất để phân hủy phân tử cellulose.

phân của enzym.Vì vậy, cần thiết phải có một bước tiền xử lý để phá vỡ lignin để lộ

cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được dễ dàng. Tiền xử

lý nhằm mục đích giảm kết tinh của cellulose, tăng diện tích bề mặt sinh khối, loại bỏ

hemicellulose, và phá vỡ lignin. Tiền xử lý làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với các

enzyme để chuyển đổi polyme carbohydrate thành đường lên men có thể đạt được

nhanh hơn và với sản lượng lớn hơn. Tiền xử lý bao gồm các phương pháp hóa học,

vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng. Tiền xử lý đã được xem là một trong những

bước quan trọng xử lý các bước trong việc chuyển đổi đường cellulose để lên men.

Tiền xử lý vật lý

Tiền xử lý vật lý sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và kích thước của lỗ

chân long, giảm tinh thể và mức độ trùng hợp của cellulose. Thường được sử dụng vật

lý trị liệu để làm suy giảm dư lượng lignocellulosic bao gồm hấp, mài và xay xát,

chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất.

- Nghiền và xay:

Thông thường nghiền và xay là những bước đầu tiên của tiền xử lý của bất kỳ

sinh khối nào làm giảm kích thước hạt, mặc dù sự kết hợp của phương pháp mài với

phương pháp tiền xử lý khác đã được thử. Ở một mức độ nào đó nó làm giảm sự kết

tinh của sinh khối. Để nghiền rơm rạ ướt dùng đĩa phay tốt hơn so với bóng phay cả về

Đồ án tốt nghiệp thu hồi glucose cũng như tiết kiệm năng lượng (Hideno et al, 2009). Phát triển trong

lĩnh vực này cung cấp một số thiết bị tiền xử lý cho phép đường hóa enzyme, ví dụ

như bóng phay, phay lăn, phay đĩa ướt, và chúng đã được sử dụng dựa trên sinh khối

nguyên liệu.

- Xử lý vi sóng:

Chiếu xạ vi sóng đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì hiệu quả sưởi

ấm cao và hoạt động dễ dàng. Chiếu xạ vi sóng có thể thay đổi cấu trúc siêu cellulose

(Xiong et al, 2000) làm suy giảm lignin và hemicelluloses trong vật liệu

lignocellulose, và làm tăng tính nhạy cảm enzyme trong vật liệu lignocellulose

(Azuma et al, 1984). Chế phẩm enzim dùng thủy phân rơm rạ có thể được tăng cường

bởi tiền xử lý lò vi sóng khi có mặt của nước (Azuma et al, 1984;. Ooshima et al,

1984) hoặc trong môi trường glycerine với số lượng ít hơn nước (Kitchaiya et al,

2003.).

Tiền xử lý hóa học

Enzyme có thể không có hiệu quả chuyển đổi lignocelluloses các loại đường lên

men mà không có tiền xử lý hóa học. Các hóa chất quan trọng nhất cho tiền xử lý rơm

rạ bao gồm kiềm và ammoniac.

- Tiền xử lý kiềm:

Tiền xử lý kiềm liên quan đến việc ứng dụng các giải pháp kiềm như NaOH

hoặc KOH để loại bỏ lignin và một phần của hemicelluloses, và hiệu quả làm tăng khả

năng tiếp cận các men tiêu hóa cellulose. Tiền xử lý kiềm có thể gây ra một sự gia tăng

mạnh về sản lượng đường hóa. Tiền xử lý có thể được thực hiện ở nhiệt độ thấp,

nhưng với một thời gian tương đối dài và nồng độ cao của các bước cơ sở. So với axit

hoặc các chất phản ứng oxy hóa, xử lý bằng kiềm dường như là phương pháp hiệu quả

nhất trong việc phá vỡ liên kết este giữa lignin, hemicellulose và cellulose, và tránh sự

phân mảnh của hemicellulose polyme (Gaspar et al, 2007) do đó tạo điều kiện thuận

lợi cho thủy phân enzym.

- Tiền xử lý Ammoniac:

Đồ án tốt nghiệp

Là một tiền xử lý thuốc thử ammonia có số lượng đặc tính mong muốn.Nó là

một thuốc thử hiệu quả đối với nguyên liệu lignocellulose. Nó có tính chọn lọc cao

cho các phản ứng với lignin hơn so với carbohydrate. Biến động cao của nó làm cho

nó dễ dàng để phục hồi và tái sử dụng. Đây là một hóa chất không gây ô nhiễm môi

trường và không ăn mòn. Một trong các phản ứng được biết đến dung dịch nước

amoniac với lignin là phân cắt liên kết của C-O- lignin cũng như liên kết ether và ester

trong lignin carbohydrate phức tạp (Kim và Lee, 2007).

Một dòng chảy thông qua quá trình gọi là Amoniac Recycle thấm (ARP) được

phát triển để xử lý trước. Trong quá trình này, ammonia được bơm qua một lớp sinh

khối duy trì ở 1700C. Bởi quá trình này có thể đạt được lên đến gần như 85% năng

suất lý thuyết của glucose trong quá trình thủy phân enzyme (Drapcho et al, 2008).

- Tiền xử lý Acid:

Tiền xử lí với tác nhân oxy hóa liên quan đến việc bổ sung thêm một hợp chất

oxy hóa. Tiền xử lý này loại bỏ hemicellulose và lignin tăng khả năng tiếp cận của

cellulose. Trong quá trình tiền xử lý oxy hóa nhiều phản ứng có thể xảy ra, như thay

thế electrophilic, chuyển của chuỗi bên, sự phân tách của ether aryl alkyl liên kết hoặc

chia tách oxy hóa của hạt nhân thơm (Hon và Shiraishi, 2001). Báo cáo có sử dụng

mỗi axit axetic cho các tiền xử lý rơm (Taniguchi et al, 1982; Toyama và Ogawa,

1975). Biến đổi về lượng trong thành phần của xử lý rơm, tinh thể của rơm xử lý và

cellulose chiết xuất, và sự nhạy cảm của rơm khi xử lý bằng acid acetic cho kết

quả mỗi phương pháp xử lý bằng acid acetic gây ra sự cố ít hoặc không có tinh thể

cấu trúc của cellulose . Mức độ enzyme hòa tan tương đối còn lại là 42% sau khi xử lý

với axit axetic 20%.

- Tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ:

Tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ tăng cường khả năng tiêu hoá enzyme chủ

yếu là để loại bỏ lignin và hemicellulose thu được phần còn lại giàu cellulose, có thể

được thủy phân bằng enzym ở mức cao và gần như đạt sản lượng glucose theo lý

thuyết. Hemicellulose và lignin có thể được thu hồi đồng thời để sản xuất sản phẩm có

giá trị cao. Sự thay đổi của tinh thể cellulose trong dung môi hữu cơ tiền xử lý rõ ràng

Đồ án tốt nghiệp không được nêu ra, nhưng nó có được nhắc đến rằng cellulose trong dung môi hữu cơ

phụ thuộc nhiều vào các loại dung môi hữu cơ, nồng độ dung môi và nhiệt độ

(Mantanis et al, 1994, 1995). Lần đầu tiên nó được dùng trong làm giấy, nhưng gần

đây nó cũng đã được xem xét tiền xử lý lignocellulose nguyên liệu cho sản xuất

ethanol. Có một số nhược điểm cố hữu để tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ. Hiện nay

tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ là đắt tiền hơn so với các quá trình tiền xử lý khác

nhưng ứng dụng tách và tái chế dung môi có thể làm giảm chi phí hoạt động của quá

trình. Nó cũng đòi hỏi các điều kiện nghiêm ngặt kiểm soát do sự biến động của dung

môi hữu cơ. Loại bỏ dung môi từ xử lý trước cellulose thường là cần thiết vì các dung

môi có thể ức chế enzyme thủy phân và lên men hoặc tiêu hóa thủy phân (Xuebing et

al., 2009). Dung môi hữu cơ thường được sử dụng cho tiền xử lý là dung môi có điểm

sôi thấp như ethanol, methanol và cồn với điểm sôi cao như ethylene glycol, glycerol,

tetrahydrofurfuryl rượu và các hợp chất chất hữu cơ như dimethylsulfoxide, ete, xeton,

và phenol (Thring et al, 1990.).

Tiền xử lý sinh học

Tiền xử lý sinh học cung cấp một số khái niệm quan trọng lợi thế như hóa chất

thấp và sử dụng năng lượng, nhưng không tìm thấy được hệ thống điều khiển đầy đủ

và nhanh chóng. Hóa chất tiền xử lý có những nhược điểm nghiêm trọng trong yêu cầu

sử dụng cho các thiết bị chuyên ngành chống ăn mòn, mở rộng giặt, và xử lý thích hợp

chất thải hóa học. Tiền xử lý sinh học là một phương pháp an toàn và thân thiện với

môi trường do lignin loại bỏ từ lignocellulose. Các vi sinh vật đầy hứa hẹn nhất trong

tiền xử lý sinh học là nấm trắng thối thuộc về lớp Basidiomycetes (Taniguchi et al,

2005). . Patel et al. (2007) đã làm một nghiên cứu sơ bộ về tiền xử lý vi sinh vật và lên

men các chất thải nông nghiệp như rơm. Một sự kết hợp của năm loại nấm khác nhau:

Aspergillus niger, Asp.awamori, Trichoderma reesei, Phenerochaete chrysosporium,

Pleurotus sajor-caju, thu được từ sàng lọc được sử dụng cho tiền xử lý và

Saccharomyces cereviseae (NCIM 3095) đã được sử dụng để thực hiện quá trình lên

men. Tiền xử lý với A. niger và A. Asp.awamori và lên men sau đó mang lại sản lượng

ethanol cao nhất (2,2 g L-1).

Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.4. Quá trình thủy phân

Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các

đường đơn (hexoses và pentoses). Ở đây, quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose,

do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Quá trình thủy phân cellulose

được thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu

thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid.

Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc

được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid

loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại

có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng

phân tử thấp, dẫn xuất furfuran và các hợp chất vô cơ. Các mắt xích của cellulose có

thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng cellulase. Vì cellulase là

một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết

1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. Nguồn thu cellulase lớn nhất

hiện nay là vi sinh vật (nấm, vi khuẩn). Nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng

suất của lignocellulose, đường monomeric và những sản phẩm khác, ví dụ như kích

thước hạt, nồng độ acid, nhiệt độ và thời gian phản ứng, cũng như độ dài của các đại

phân tử, mức độ trùng hợp của cellulose, cấu hình của chuỗi cellulose, sự kết hợp của

cellulose với các cấu trúc khác bảo vệ polyme trong thành tế bào thực vật như lignin,

pectin, hemicellulose, protein, và các yếu tố khoáng chất. Hiệu suất thuỷ phân của

nhiên liệu sinh học lignocellulosic gia tăng khi có sự kết hợp của các enzyme như

cellulase, xylanases và pectinaza nhiều hơn là chỉ dùng cellulase (Zhong et al, 2009)

nhưng chi phí của quá trình tăng mạnh mặc dù có những quan điểm sinh học rất hấp

dẫn.

Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T. emersonii có

thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào. Vật liệu

lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50 oC và pH ~ 5), cho

phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không hình thành nên

các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme.

Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.5. Quá trình lên men

Hiện nay có 1 số phương pháp lên men được chú trọng như sau:

• SHF (Separate hydrolysis and fermention): đây là phương pháp lên men

truyền thống, thủy phân và lên men riêng biệt.

• SSF (Simulneous saccharification and fermention): đây là phương pháp

cải tiến thủy phân và lên men đồng thời.

• SSCF (Simultaneous saccharification and fermentation): đồng đường

hóa và đồng lên men, đây là phương pháp đang được nghiên cứu nhiều.

Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm

đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ

được lên men thành ethanol. Trong số các sản phẩm của quá trình thủy phân, glucose

là phong phú nhất, theo sau là đường xylose hoặc mannose và một ít các đường khác.

S. cerevisiae có ưu điểm như phổ biến, tỷ lệ lên men cao và lượng ethanol tạo thành

cao. Vì vậy, S. cerevisiae là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho quá trình lên

men sinh khối lignocellulose thành ethanol. Tuy nhiên, S. cerevisiae không có khả

năng lên men xylose thành ethanol được. Để quá trình biến đổi sinh khối

lignocellulose có khả thi về kinh tế, nó cần thiết lựa chọn những sinh vật có khả năng

lên men cả glucose và xylose.

Ngoài xylose, S. cerevisiae không có khả năng lên men arabinose, trừ khi cải

tiến chúng. Do đó, S. cerevisiae tái tổ hợp chứa gen có khả năng lên men xylose đã

được thiết kế với gen chuyển hóa arabinose từ những vi sinh vật khác. S.cerevisiae tái

tổ hợp gần đây nhất (TMB 3400) đã cho thấy lên men thành công cả ba loại đường

glucose, xylose và arabinose.

Trong quá trình lên men sinh khối lignocellulose, hoạt tính của S. cerevisiae

giảm xuống nếu có sự hiện diện của các hợp chất ức chế bao gồm các acid hữu cơ có

trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất fufural, phenol và các hợp chất vô cơ. Các hợp chất

này được sinh ra trong quá trình tiền xử lý và cũng có thể từ quá trình thủy phân

lignocellulose. Vì vậy, cần phải loại bỏ các hợp chất ức chế có trong môi trường trước

khi tiến hành lên men, mà điều đó sẽ làm tăng chi phí của quá trình công nghệ cũng

Đồ án tốt nghiệp đồng thời làm mất mát lượng đường cần thiết cho quá trình lên men. Điều thú vị, S.

cerevisiae là một trong những vi sinh vật ít nhạy cảm với các chất ức chế của quá trình

thủy phân lignocellulose.

Hai bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol (thủy phân

và lên men) có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF).

Trong phương pháp thủy phân và lên men độc lập (SHF), các sản phẩm thủy phân sẽ

được lên men để sản xuất ethanol trong một quá trình riêng. Ưu điểm của phương pháp

này là cả hai quá trình có thể được tối ưu hóa riêng, không phụ thuộc vào nhau (ví dụ

như nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân là 45-50 oC, trong khi đó quá trình lên men

là 30 oC). Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là sự tích tụ các chất ức chế cản trở

hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến

đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém (phải bổ sung thêm một lượng lớn enzyme). Trong

phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF), thì các sản phẩm cuối của quá

trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành ethanol ngay nhờ vi sinh vật. Do

đó, việc bổ sung một lượng lớn enzyme là không cần thiết và điều này sẽ làm giảm chi

phí sản xuất ethanol. Nhưng, nhược điểm của SSF là cần phải chọn được điều kiện

nhiệt độ và pH gần với điều kiện tối ưu của mỗi quá trình riêng.

SSF là được ưa chuộng hơn vì chi phí thấp (Wyman, 1994) và năng suất

ethanol cao hơn so với SHF bằng cách giảm thiểu sự ức chế sản phẩm. Một trong

những hạn chế của quá trình này là sự khác biệt về nhiệt độ tối ưu của các enzym thủy

phân và vi sinh vật lên men. Hầu hết các kết quả báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho thủy

phân enzym ở 40-50 0C, nhưng các vi sinh vật có năng suất và sản lượng ethanol tốt

thường không chịu đựng được nhiệt độ cao này. Vấn đề này có thể tránh được bằng

cách áp dụng các vi sinh vật chịu nhiệt như Saccharomyces cerevisiae (Golias et al,

2002;. Spindler et al, 1988).

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

a) Nhiệt độ.

Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ để phát triển tối ưu. Đối với nấm men, nhiệt độ

tối ưu ở khoảng 28-32oC, ở nhiệt độ cao hơn, hoạt tính của chúng giảm nhanh. Mặt

Đồ án tốt nghiệp khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tao nhiều các sản phẩm phụ không cần như ester,

aldehyde gây tổn thất lượng ethanol tạo thành.

b) pH.

Nồng độ ion H+ trong môi trường lên men ảnh hưởng mạnh đến hoạt động của

nấm men, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấm chất dinh dưỡng trong quá trình lên

men. Mỗi vi sinh vât chỉ có thể hoạt động tốt ở một trạng thái, trạng thái này phụ thuộc

nhiều vào pH của môi trường.

c) Thời gian.

Thời gian là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của như khối

lượng sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng

độ, chủng nấm men,… Thời gian lên men bắt đầu từ lúc cấy nấm men vào môi trường

lên men và thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và mục

đích lên men mà ta tiến hành.

d) Nồng độ CO2 trong môi trường.

CO2 hình thành trong quá trình lên men từ đường. Một phần tồn tại trong môi

trường, một phần tách lên bề mặt môi truồng và phần còn lại tao thành một lớp ngăn

giữa không khí và môi trường. Lượng CO2 tích tụ trong môi trường sẽ làm giảm khả

năng sinh sản của nấm men nhưng không làm cho khả năng lên men của nấm men yếu

đi.

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài , dẫn

đến ức chế quá trình lên men.

e) Hàm lượng giống nấm men.

Nấm men là nhân tố tối quan trọng trong quá trình lên men, chuyển hóa đường

thành ethanol và khí CO2. Mỗi loại nấm men có khả năng lên men khác nhau, ở những

điều kiện khác nhau thì khả năng lên men và sản phẩm của quá trình lên men cũng

khác nhau.

Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.5. So sánh ưu điểm và nhược điểm của phương pháp SSF và SHF

- SHF ( Separate hydrolysis and fermention)

Ưu điểm:

- Vì 2 quá trình thủy phân và lên men là riêng biệt nên dễ kiểm soát.

Nhược điểm:

- Tốn thời gian hơn so với SSF.

- Tạo nhiều sản phẩm phụ sau thủy phân.

- SSF (Simulneous saccharification and fermention)

Ưu điểm:

- Hạn chế tạo các sản phẩm phụ

- Chi phí thực hiện thấp hơn

- Năng suất cao hơn

Nhược điểm:

-Nhiệt độ để quá trình thủy phân đạt tối ưu (45-50cC) không thích hợp với nhiệt

độ của các loài nấm men (35-40oC). Để khắc phục vấn đề này cần nghiên cứu tìm ra

các giống vi sinh vật chịu nhiệt tốt hơn.

1.1.7.6. Quá trình chưng cất và tinh chế

Chưng cất là phương pháp tách ethanol ra khỏi hỗn hợp cấu tử trong dịch sau

lên men. Do ethanol tạo hỗn hợp đẳng phí với nước nên sản phẩm thu được hỗn hợp

gồm cồn và nước. Để thu cồn tuyệt đối người có thể dùng các phương pháp sau:

• Chưng trích ly

• Chưng phân tử.

• Hấp phụ rây phân tử

• Dùng Na2SO4, CaSO4, CaCO3, CuSO4 khan để hấp phụ nước.

Đồ án tốt nghiệp

• Thẩm thấu qua màng lọc.

• Bốc hơi thẩm thấu và rây phân tử

• Chưng cất và thẩm thấu qua màng

1.2. Nguyên liệu

1.2.1 Giới thiêu về chuối Musa Paradisiaca

Tên khoa học: Musa Paradisiaca

Giới: Plane

Ngành: Magnoliophy

Phân lớp: Zingiberiadae

Bộ: Zingiberales

Họ: Musaceae

Chi: Musa

Hình 1.3. Chuối sứ Musa Parradisiaca

Chuối thuộc họ Musaceae. Chuối là loại trái cây quen thuộc và gắn bó với

người Việt Nam, là loại cây ăn quả chứa nhiều giá trị dinh dưỡng và chữa bệnh thiết

thực. Theo phân tích của khoa học thì ruột chuối chứa nhiều tinh bột, chất đạm, chất

Đồ án tốt nghiệp xơ, vimin và khoáng chất đặc biệt là kali. Vỏ chuối chiếm khoảng 30% khối lượng

chứa đường, tinh bột, cellulose, pectin,…

Chuối có nhiều loại: chuối già, chuối xiêm, chuối sứ, chuối cơm, chuối sáp,

chuối mật, chuối tiêu…. Nếu đặt tên khoa học thì có đến hàng trăm giống chuối. hầu

hết chuối ăn quả đều thuộc loài musa paradisiaca L với 11 loại khác nhau bởi hình

dạng, màu sắc và vị của thịt quả.

1.2.2. Diện tích và sản lượng chuối ở Việt Nam

Chuối sứ được trồng phổ biến ở nhiều nơi, chuối sứ không kén đất, chịu được

hạn, úng, đất xấu và chịu rét khá hơn chuối tiêu. Do đó chuối sứ thường được trồng ở

các vùng trung du, miền núi, cây mọc khỏe, cao to, lá dài rộng, cuống lá có phấn trắng.

trái to, ngắn, mập, vỏ mỏng, khi chín có màu vàng tươi, vị ngọt, kém thơm. Một buồng

nặng khoảng 15-20 kg. Khả năng vận chuyển bảo quản kém.

Ở nước chuối là loại cây lương thực có diện tích và sản lượng cao. Tuy nhiên

diện tích trồng chuối lại không tập trung. Do đặc điểm là loại cây ngắn ngày, nhiều

công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trong các vườn cây

ăn trái và hộ gia đình. Một số tỉnh miền trung và miền nam có diện tích trồng chuối

khá lớn (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau có diện

tích từ 3000 ha đến gần 8000 ha) trong khi đó các tỉnh miền bắc có diện tích trồng

chuối lớn nhất như: Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ chưa đạt đến 3000 ha.

Bảng 2.3. Diện tích trồng chuối theo các vùng (đơn vị: ha)[4]

Năm Năm Năm Năm Năm 2005 Vùng 2004 2005 2007 2008

Đồng bằng sông 17900 18100 17456 17407 16400 Hồng

Đông Bắc bộ 8900 6300 9021 8849 8700

Tây Bắc bộ 2300 2200 2376 2668 2600

Đồ án tốt nghiệp

Bắc Trung bộ 15400 15500 15876 16029 16400

Duyên hải Nam 10200 10500 10642 10713 11400 Trung bộ

Tây Nguyên 2900 3400 3492 3630 3700

Đông Nam bộ 12100 12300 12689 12653 12800

Đồng bằng sông 31600 27700 27706 30142 31303 Cửu Long

(nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối)

Bảng 2.4. Sản lượng trồng chuối theo vùng (Đơn vị: tấn)[4]

Vùng Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Năm 2011

Đồng bằng sông 359500 342700 426161 352181 403500 Hồng

Đông Bắc bộ 95900 65200 100575 98517 96600

Tây Bắc bộ 19300 25400 27285 30691 30600

Bắc Trung bộ 80800 98300 102966 205666 110800

Duyên hải Nam 66000 103500 99636 99504 111800 Trung bộ

Tây Nguyên 33900 41400 44262 53027 58300

Đông Nam bộ 114800 146400 150717 165596 175800

Đồng bằng sông 310200 274800 330203 351629 366900 Cửu Long

Đồ án tốt nghiệp 1.2.3 Tình hình sản xuất chuối trên thế giới

Theo số liệu của FAO hàng năm toàn thế giới sản xuất trên 88 triệutấn chuối.

Chuối được trồng chủ yếu ở các nước đang phát triển trên thế giới. Khoảng 98% sản

lượng chuối được trồng ở các nước đang phát triển và xuất khẩu tới các nước đang

phát triển. Năm 2004 tổng cộng có 130 nước xuất khẩu chuối. mười nước sản xuất

chính chiếm đến 75% sản lượng thế giới. Trong đó Ấn Độ, Ecuador, Brazil và Trung

Quốc chiếm 1 nửa của toàn thế giới.

Vỏ chuối chiếm 20-30% khối lượng trái nên ở Việt Nam trung bình mỗi năm có

tới ~ 350.000 tấn vỏ phế phẩm. Trên thế giới lượng vỏ chuối thải ra hàng năm ~ 24

triệu tấn. Để giải quyết vấn đề môi trường các nước phải cấp chi phí cho việc xử lí rác

thải. Tuy nhiên, nếu lượng rác thải được tận dụng vào mục đích hợp lí khác thì vừa giữ

vệ sinh môi trường, vừa đỡ tốn kém, vừa tạo thêm sản phẩm có thêm thu nhập. Và

hiện nay xu hướng cho vấn đề này chính là lên men sản xuất ethanol sinh học.

Bảng 2.5. Thành phần hóa học của chuối[6]

Chỉ tiêu Vỏ chuối

Đường 1,61-1,97%

Chất béo (%) -

Protein (%) 1,40-1,45

Pectin (%) -

Lignin (%) -

Cellulose (%) 4,5-4,6

Hemicellulose (%) -

1.3. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất ethanol

Năm 1883, Hansen viết về đề tài lựa chọn chủng nấm men. Ông mô tả các tế

bào nấm men đơn lẻ có thể phân tách thành từng khuẩn lạc riêng rẽ bằng cách pha

loãng và nuôi cấy trên đĩa thạch, các tế bào nấm men được nuôi cấy thuần khiết này

được nhân lên ở quy mô lớn nhờ kỹ thuật vô trùng.

Kỹ thuật nuôi cấy nấm men thuần khiết của Hansen giúp ta chọn tạo, phân lặp

được dòng nấm men đáp ứng yêu cầu sản xuất ethanol công nghiệp:

Đồ án tốt nghiệp

1. Tốc độ lên men nhanh

2. Sử dụng nguồn đường có hiệu quả, tạo độ cồn cao.

3. Có khả năng chịu được cồn ở nồng độ cao.

4. Khả năng chịu nhiệt, tính chịu acid, làm việc ở pH thấp.

5. Lên men tốt nhiều loại đường khác nhau như đường xylose.

6. Sử dụng tốt nguồn nitơ hữu cơ.

7. Đặc tính duy truyền ổn định cao.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 15/02/2014 – 28/06/2014.

Địa điểm: PTN Nhiên liệu sinh học & sinh hoá - trường ĐH Bách Khoa

TPHCM.

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là vỏ chuối khô.

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Nguyên liệu

Enzyme: cellulose Viscozyme của hang Brenntag.

Giống vi sinh vật : Saccharomyces cerevisae.

Các hóa chất có nguồn gốc Trung Quốc.

Môi trường nuôi cấy nấm men : SDA và SDB.

2.3.2. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị:

- Autoclave - Máy ly tâm - Máy xay

- Tủ hấp - Cồn kế - Máy khuấy từ

- Tủ lạnh - Brix kế - Tủ sấy

- Máy quang phổ - pH kế - Nồi đun

- Cân - Tủ ủ

Dụng cụ:

- Ống nghiệm - Đĩa petri - pipet, micropipette

- Cuvet - Becher - Eppendorf

- Ống đong - Bình định mức - Que cấy

2.4.Tiến hành thí nghiệm

Đề tài này tập trung khảo sát quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao. Quá

trình khảo sát được thực hiện song song 2 phương pháp: lên men đồng thời (SSF) và

lên men truyền thống (SHF) để so sánh từ đó chọn ra phương pháp tối ưu nhất.

Đồ án tốt nghiệp 2.4.1Lên men riêng (SHF):

Vỏ chuối

Tiền xử lý H2SO4

- H2SO4, nhiệt độ

- Enzyme Thủy phân

Lên men Nấm men

Hình 2.1. Quy trình SHF

Quy trình lên men gồm có 3 giai đoạn chính:

• Tiền xử lý nguyên liệu:

Lớp vỏ cứng của cacao có chứa hầu hết các loại glucide, trong đó tỉ lệ cellulose

và đường chiếm khá cao. Do đặc điểm cấu tạo của vỏ quả cacao có chứa các

lignocellulose, trong đó có các phân tử lignin là vỏ bao bọc bên ngoài các mạch

cellulose, hemicellulose nên việc xâm nhập của enzyme vào bên trong mạch phân tử

rất khó khăn. Trong thành phần của vỏ quả có mặt của các phân tử lignin, là polymer

vô định hình trong phân tử có các nhóm – OH, – OCH3, là các cầu nối chính để liên

kết các mạch cellulose lại với nhau nên làm cho vỏ quả trở nên dai và cứng. Do đó, để

thực hiện quá trình thủy phân có hiệu quả cần phải loại bỏ các liên kết giữa lignin và

cellulose, giúp cho các tác nhân thủy phân như acid dễ dàng tác động vào mạch

cellulose và bẻ gãy liên kết giữa các monomer thành các phân tử đường.

Để loại bỏ liên kết có thể sử dụng các phương pháp: nhiệt độ cao, acid, nổ hơi

nước, sinh học, điện trường.

Vỏ cacao được thu gom về sẽ được cắt nhỏ khoảng 3 – 4 cm để thuận tiện trong

quá trình sấy khô nguyên liệu.Vỏ cacao được sấy khô sẽ được xay nhuyễn thành bột

Đồ án tốt nghiệp mịn nhằm tăng diện tích tiếp xúc với tác nhân thủy phân giúp quá trình thủy phân diễn

ra nhanh và đạt hiệu quả cao nhất. Quá trình tiền xử lý phải đáp ứng những yêu cầu:

- Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo.

- Hạn chế sự mất mát Hydrocarbon.

- Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và quá

trình lên men tiếp theo.

- Tiết kiệm được chi phí.

• Thủy phân nguyên liệu:

Cellulose có trong nguyên liệu vỏ cacao là hợp chất cao phân tử gồm rất nhiều

mắt xích β - D - glucose ghép lại và rất bền vững.Vì thế phải dùng các tác nhân thủy

phân để phân cắt cellulose thành các mạch đường ngắn như oligosaccharide,

cellobiose và cuối cùng là glucose để nấm men dễ dàng sử dụng và chuyển hóa đường

thành ethanol.Có nhiều phương pháp thủy phân nhưng thường được sử dụng là dùng

acid H2SO4 hoặc thủy phân bằng enzyme. Hiện nay phương pháp dùng enzyme được

sử dụng nhiều nhất vì đạt hiệu quả cao, ít độc hại và an toàn hơn.

Đề tài tiến hành khảo sát phương pháp thủy phân bằng cellulase 1%, 3 %, 5 % ở

50oC, pH = 5 trong 1, 2, 3 ngày. Đồng thời tiến hành khảo sát quá trình thủy phân bằng

H2SO4 để tìm ra điều kiện thuỷ phân tối ưu nhất cho quá trình lên men.

Nguyên liệu sau khi thủy phân được đem hấp khử trùng (1atm, 10 phút, 121 oC)

để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng được bổ

sung nấm men có mật độ 108 CFU/ml tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng.Sau lên men

thu dịch cồn.

• Lên men:

Nguyên liệu sau khi thủy phân được đem hấp khử trùng (1atm, 10 phút, 121 oC)

để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng được bổ

sung nấm men có mật độ 109 CFU/ml tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng.Sau lên men

thu dịch cồn.

Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Lên men đồng thời

Vỏ chuối

enzyme

Nấm men

Thủy phân & lên men đồng thời

Tiền xử lý H2SO4

Hình 2.2. Quy trình SSF

Nguyên liệu sau khi tiền xử lí sẽ được trung hoà pH, mang hấp khử trùng

(1210C, 1 atm, 20 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên

men. Cuối cùng được bổ sung enzyme và nấm men tiến hành thủy phân và lên men

đồng thời. Sau lên men thu dịch cồn.

Nấm men sử dụng trong thủy phân và lên men đồng thời là nấm men chịu

nhiệt (Top~380C) để thích hợp với nhiệt độ tối thích của enzyme thủy phân.

2.5 Bố trí thí nghiệm

2.5.1 Thí nghiệm 1 : tiền xử lý

Tiền xử lý bằng hóa chất là Acid H2SO4 2% trong thời gian 2 ngày. Tỉ lệ nguyên liệu :

Acid là 1:10.

2.5.2 Thí nghiệm 2 : thủy phân nguyên liệu

Thủy phân bằng là H2SO4 2% trong các khoảng thời gian

Thời 15 30 60 120

gian(phút)

Glucose

Cellulose

Đồ án tốt nghiệp

Thủy phân bằng enzyme cellulose trong các khoảng thời gian và nồng độ khác nhau

Lượng đường (mg/ml) Nồng độ cellulase Thời gian (ngày)

1% 1

3% 2

5% 3

Tiến hành so sánh giữa các nghiệm thức nhằm tìm ra phương pháp thủy phân

tối ưu về thời gian, enzyme.

2.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát thời gian lên men

Khảo sát thời gian lên men thích hợp, tiến hành trong 48 giờ, mỗi nghiệm thức

cách nhau 2 giờ. Chọn nhiệt độ lên men là 37oC, pH~5.

Xác định các chỉ tiêu: độ cồn(%), độ Brix(%), đường khử(mg/ml).

2.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát nhiệt độ lên men:

-Khảo sát nhiệt độ lên men ở các nhiệt độ 35oC, 37oC và 39oC:

. Thời gian tối ưu đã khảo sát ở thí nghiệm 3.

. pH trong khoảng gần 5

. Dịch nấm men 5% (4.108tb/mL)

- Thành lập nghiệm thức :

Nhiệt độ (0C) Nghiệm thức

35 1

37 2

40 3

2.5.5. Thí nghiệm 5: khảo sát pH của quá trình lên men:

- Khảo sát pH ở các mốc 4,5 – 5 – 5,5.

. Thời gian tối ưu đã khảo sát.

. Dịch nấm men 5% (4.108tb/mL).

. Nhiệt độ len men đã khảo sát.

Đồ án tốt nghiệp - Thành lập nghiệm thức :

pH Nghiệm thức

4 1

5 2

6 3

2.5.6. Thí nghiệm 6: khảo sát hàm lượng dịch nấm men:

- Khảo sát hàm lượng dịch nấm men ở các nồng độ 2,5%; 5%; 7,5%

.Thời gian tối ưu đã khảo sát.

. pH tối ưu đã khảo sát.

. Nhiệt độ tối ưu đã khảo sát.

- Thành lập các nghiệm thức

Tỉ lệ giống (%) Nghiệm thức

2,5 1

5 2

7,5 3

- Tiến hành : ở mỗi bình lên men mang đi ly tâm 4000 vòng/phút trong thời

gian 5 phút . Thu dịch sau đó tiến hành pha loãng . Sử dụng phương pháp đếm khuẩn

lạc để xác định số tế bào khuẩn lạc còn lại sau quá trình lên men.

2.6. Các phương pháp phân tích

2.6.1. Phương pháp hóa lý

2.6.1.1Phương pháp xác định độ ẩm

Nguyên tắc: dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong mẫu.

Tiến hành:

- Cân m1(g) mẫu.

- Cho mãu vào cốc, cân khối lượng cốc chứa mẫu (m2)

- Sấy khô cốc ở 150oC đến khối lượng không đổi.

- Cân chính xác khối lượng cốc sau khi sấy (m3)

Đồ án tốt nghiệp

Cách tính hàm lượng ẩm : W = (m3 –m2)/m1.100%

2.6.1.2. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS:

Nguyên tắc : dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS.

DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử tạo màu đỏ cam khi đun nóng với

hỗn hợp phản ứng.

Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử được đo bằng

máy đo quang phổ với bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với

thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng đường trong mẫu.

Tiến hành :

- Hút 1ml dịch mẫu và 1ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không.

- Thêm 3ml thuốc thử DNS.

- Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 15 phút.

- Làm nguội nhanh, đo ở bước song 540nm.

- Dựa vào đường chuẩn để tính ra nồng độ đường trong mẫu.

2.6.1.3. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng thuốc thử Anthrone:

Nguyên tắc: dựa trên phản ứng tạo màu giữa Anthrone với cellulose có trong

dịch mẫu tạo màu xanh lá đến xanh đen phụ thuộc vào nồng độ cellulose trong mẫu.

Tiến hành:

- Hút 0,5 ml dịch mẫu và 0,5 ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không.

- Thêm 5ml dd Anthrone vào ống nghiệm.

- Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 5 phút.

- làm nguội, đo ở bước sóng 630nm.

- Dựa vào đường chuẩn để tính được nồng độ cellulose có trong mẫu.

2.6.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme:

Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme:

Ống 0 1 2 3 4 5 6

Nồng độ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

glucose(mg/ml)

Ml dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Đồ án tốt nghiệp

(1mg/ml)

Ml dd CMC1% 1 1 1 1 1 1 1

Ml dd DNS- 2 2 2 2 2 2 2

lactose

Ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

Lắc đều, đun sôi cách thủy 15’. Làm nguội.

Xác định hoạt tính enzyme carboxymethuy cellulose (CMCase):

- Ống nghiệm 1:

Hút 1ml dd đệm Na-acetac 50Mm, pH5 cho vào ống nghiệm.

Thêm 2ml dd DNS-lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.

Thêm 1ml dd CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.

Đun sôi cách thủy 15’, để nguội. Đặt độ hấp thụ ở bước song 540nm là 0.

- Ống nghiệm 2: phản ứng enzyme

Hút 1ml dd enzyme cho vào ống nghiệm để ở 40oC/5’. Đồng thời để chai chứa

dd CMC 1% vào tủ 40cC/5’.

Thêm 1ml dd CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều.

Để phản ứng 40oC trong 10’

Thêm 2ml dd DNS-lactose,lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.

Đun sôi cách thủy 15’, để nguội rồi đo.

- Ống nghiệm 3 : không có phản ứng enzyme

Hút 1ml dd enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5-10’ để bất hoạt enzyme

Thêm 2ml dd DNS-lactose và lắc đều

Thêm 1ml dd CMC 1% chứa dd enzyme và lắc đều.

Đun sôi cách thủy 15’, để nguội rồi đo OD.

Định lượng đơn vị hoạt tính:

1 đơn vị CMCase là lượng enzyme sẽ giải phóng đường khử như glucose

khi thủy phân CMC với vận tốc 1umol/phút cơ chất dưới các điều kiện phản

ứng.

Tính kết quả

- Giá trị hệ số glucose trung bình (F):

Đồ án tốt nghiệp

F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 + … + 0,6/AG0,6)/6

- Hoạt tính enzyme:

CMCase (IU/g) = (AT – AB) x F x(1000/180) x (1/10 phút) x (1/1ml) x (1/C)

Trong đó:

F : Hệ số glucose (mg/ml).

AG: Độ hấp thu OD của dd glucose chuẩn.

AR: Độ hấp thu của dd có phản ứng enzyme ( ống TN).

AB: Độ hấp thu của dd không có phản ứng enzyme ( ống ĐC).

1000: chuyển mg thành µg.

180; trọng lượng phân tử glucose, đổi từ µg sang µmol.

10 phút: thời gian phản ứng.

1: Thể tích enzyme (ml)

C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).

2.6.1.5. Xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan:

- Dùng pH kế xác định độ pH.

- Dùng Brix kế xác định nồng độ chất rắn hòa tan.

- Dùng cồn kế xác định độ cồn.

2.6.2. Phương pháp vi sinh

2.6.2.1. Phương pháp nuôi cấy nấm men:

Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống

nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.

Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang ống môi trường thạch

nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường SDA có bổ sung thạch với hàm

Đồ án tốt nghiệp lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các

vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.

Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh

khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua

hai giai đoạn:

• Giai đoạn 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch

nghiêng, cấy sinh khối vào erlen chứa 20ml dịch môi trường SDB đã được hấp tiệt

trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28 – 30 oC) trong 24 giờ.

• Giai đoạn 2: lấy 10 ml dịch môi trường SDA cho vào erlen 250ml, hấp

tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong erlen đã nuôi giống (giai đoạn 1)

vào erlen và nuôi ở điều kiện 30 oC, 24 giờ.

Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được dùng trong lên men

bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt lên men sau thì cần hoạt hóa

trước 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực

trở lại.

2.6.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc: xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi

trường thạch , xác định số tế bào sống để phục vụ cho quá trình lên men cũng nhu xác

định số tế bào còn lại sau quá trình lên men.

Tiến hành:

- Pha loãng mẫu: chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml dd nước muối sinh lý và

micropipette đã hấp khử trùng , tiến hành pha loãng mẫu ở các hệ số pha loãng như :

10-1, 10-2, 10-3,10-4,… chọn 3 nồng độ pha loãng thích hợp.

- Cấy mẫu: Dùng 0,1 micropipet hút 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa

thạch, sử dụng que cấy trang để trang đều các tế bào lên bề mặt đĩa thạch. Tiến hành

trên các độ pha loãng khác nhau sẽ cấy trang lên các đĩa thạch .

- Đặt các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong thời gian 48 giờ.

- Tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1ml dd mẫu.

- Mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch mẫu theo số liệu đã tiến hành trên thí

nghiệm pha loãng được tính theo công thức:

Đồ án tốt nghiệp

A(cfu/ml) = B x C/V

B: số khuẩn lạc trung bình mỗi đĩa ở 1 độ pha loãng.

C: Độ pha loãng.

V: dung tích huyền phù ở mỗi đĩa (0,1ml)

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát các phương pháp thủy phân

Để thực hiện quá trình thủy phân có hiệu quả cần phải loại bỏ các liên kết giữa lignin và cellulose, giúp cho các tác nhân thủy phân như acid dễ dàng tác động vào mạch cellulose và bẻ gãy liên kết giữa các monomer thành các phân tử đường đơn.

Vỏ chuối được thu gom về sẽ được cắt nhỏ khoảng 1 – 2 cm để thuận tiện trong quá trình sấy khô nguyên liệu.Vỏ cacao được sấy khô sẽ được xay nhuyễn thành bột mịn nhằm tăng diện tích tiếp xúc với tác nhân thủy phân giúp quá trình thủy phân diễn ra nhanh và đạt hiệu quả cao nhất.

3.1.1. Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân bằng H2SO4 2%

39.98

39.54

38.88

36.1

Nguyên liệu sau khi tiền xử lý tiến hành thuỷ phân bằng H2SO42%, sau đó so sánh với thí nghiệm thuỷ phân bằng cellulase nhằm tìm ra phương pháp thuỷ phân tối ưu nhất.

l

Glucose

m / g m

Cellulose

9.23

8.65

7.76

7.58

120

Thời gian (phút)

Hình 3.1. So sánh đường khử khi thủy phân bằng bằng H2SO4 2%

Khi thủy phân bằng H2SO4, lượng glucose ở khoảng thời gian 30 phút là thấp

nhất (7,8mg/ml) và cao nhất ở thời gian 120 phút ( 9mg/ml). Và ngược lại , hàm lượng

cellulose sau khi thủy phân 15 phút bằng H2SO4 là cao nhất (40,03mg/ml) và sau khi

thủy phân 120 phút cho kết quả thấp nhất. Đây là điều hiển nhiên bởi quá trình thủy

phân sẽ cắt các mạch của cellulose để cuối cùng tạo thành glucose, vì vậy lượng

cellulose sẽ giảm xuống và glucose tăng lên theo thời gian. Tuy nhiên, nếu xét trên

Đồ án tốt nghiệp tổng thời gian và nguyên liệu được thủy phân bằng H2SO4thì hiệu quả thủy phân chưa

cao nên đề nghị tiếp tục thủy phân phân bằng H2SO4 thêm ở các khoảng thời gian 150

và 180 phút để khảo sát xem lượng đường khử sau thủy phân có tiếp tục tăng và có sự

chênh lệch đáng kể không.

3.1.2. Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân bằng enzyme cellulase

Cellulose có trong nguyên liệu vỏ chuối là hợp chất cao phân tử gồm rất nhiều

mắt xích β - D - glucose ghép lại và rất bền vững. Vì thế phải dùng các tác nhân thủy

phân để phân cắt cellulose thành các mạch đường ngắn như oligosaccharide,

cellobiose và cuối cùng là glucose để nấm men dễ dàng sử dụng và chuyển hóa đường

33.79

30.81

30.03

29.18

thành ethanol.

l

m / g m

Glucose

Cellulose

12.84

12.22

11.2

9.55

Nồng độ enzyme (%)

Hình 3.2.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 1 ngày

Đồ án tốt nghiệp

32.11

29.88

28.88

28.22

l

m / g m

Glucose

13.85

Cellulose

11.95

11.92

9.38

Nồng độ enzyme (%)

31.88

29.09

28.12

26.88

Hình 3.3.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 2 ngày

l

m / g m

Glucose

13.54

12.14

Cellulose

10.48

10.01

Nồng độ eznyme (%)

Hình 3.4.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 3 ngày

Sau quá trình thủy phân bằng enzyme cellulose, lượng glucose thấp nhất là

8,7mg/ml sau thời gian 1 ngày với nồng độ enzyme là 1% .Và lượng glucose đạt giá trị

cao nhất là 13,87 mg/ml ở khoảng thời gian 2 ngày với nồng độ enzyme là 7%. Ngược

lại với nghiệm thức thủy phân 1 ngày , 1% enzyme thấy rằng lượng cellulose là cao

nhất và thấp nhất ở mốc thời gian 3 ngày với nồng độ enzyme 5%.Tuy nhiên , nếu

Đồ án tốt nghiệp phân tích số liệu rõ sẽ thấy lượng đường khử sinh ra ở các nồng độ 5%,7% là ko có sự

chênh lệch lớn (P-value <0,05) , cũng như thời gian thủy phân là 1,2,3 ngày. Vì vậy để

tạo hiệu quả kinh tế và tiết kiệm thời gian thực hiện thì nên chọn nghiệm thức thủy

phân bằng cellulose nồng độ 5% trong thời gian 1 ngày là hợp lý nhất.

Kết quả: nếu so sánh giữa 2 phương pháp thủy phân , thấy rằng thủy phân bằng

H2SO4 cho lượng đường khử thấp hơn nhiều so với thủy phân bằng enzyme. Lượng

đường cao nhất khi thủy phân bằng H2SO4 là 7,23 ± 0,22 mg/ml , so với lượng đường

cao nhất của quá trình thủy phân bằng enzyme cellulose 5% là 13,82 ± 2,98 mg/ml.

Như vậy lượng đường sau khi thủy phân bằng cellulose hơn 3,2 lần so với thủy phân

bằng H2SO4.

3.2. Kết quả khảo sát các phương pháp lên men:

3.2.1 Kết quả khảo sát thời gian lên men SHF:

Thời gian lên men là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men

bioethanol, Thời gian của quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ

lên men, nồng độ đường trong dịch lên men, tỉ lệ nấm men … Nếu thời gian lên men

quá ngắn, quá trình lên men chưa xảy ra hoàn toàn, đường sót sẽ còn nhiều trong dịch

lên men và độ cồn tạo ra thấp, và nếu thời gian lên men quá dài , lượng ethanol sẽ bị

oxy hóa thành acid acetic gây ức chế lại quá trình lên men.Vì vậy, việc xác định thời

gian lên men có ý nghĩa quan trọng để mang lạu hiệu quả kinh tế.

Đồ án tốt nghiệp

Độ cồn

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48

Thời gian ( giờ)

Hình 3.5.Sự thay đổi độ cồn theo thời gian lên men

Trước khi lên men độ cồn trong dịch là 0% và tăng lên rất nhanh thành 3,2%

chỉ sau 4 giờ lên men và vẫn tăng dần với tốc độ chậm lại. Sau 20 giờ kể từ thời điểm

cho nấm men vào, độ cồn đạt ngưỡng cao nhất là 4,9%.Từ 20 giờ đến 28 giờ , độ cồn

vẫn duy trì khá ổn định và bắt đầu có dấu hiệu xuống thấp.Kể từ 32 giờ trở đi, độ cồn

trong dịch giảm dần theo thời gian và chỉ còn 3,1% ở thời điểm 48 giờ.

Độ Brix

%

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Thời gian (giờ)

Hình 3.6. Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men

Đồ án tốt nghiệp

Trước quá trình lên men ghi nhận độ Brix của dịch là 9% và trong 8 giờ đầu của

quán trình lên men , độ Brix tăng dần và đạt cao nhất là 9,4% ở mốc 8 giờ. Và kể từ

sau đó hàm lượng chất tan trong dịch bắt đầu giảm xuống dần theo thời gian lên men

và giảm khá nhanh từ khoảng thời gian 8 giờ đến 20 giờ. Sau 20 giờ, độ Brix vẫn giảm

nhưng với tốc độ chậm hơn và đạt mức thấp nhất là 6,2% ở 48 giờ.

l

Glucose

m / g m

Cellulose

h 2

h 0

h 4

h 6

h 8

h 2 1

h 0 3

h 8 4

h 0 1

h 4 1

h 6 1

h 8 1

h 2 3

h 4 3

h 6 3

h 8 3

h 0 4

h 2 4

h 4 4

h 6 4

h 6 2

h 2 2

h h h 0 4 8 2 2 2 Thời gian (giờ)

Hình 3.7. Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian lên men

Kết quả: Trong 2 giờ đầu tiên độ cồn tăng nhanh từ 0 lên 3,3. Sau đó trở đi độ cồn tăng

chậm dần và sau 20 giờ độ cồn đạt cao nhất (4,8%), sau đó độ cồn giảm xuống do

lượng cồn cũng như lượng acid sinh ra đã bắt đầu ức chế khả năng lên men.

Tổng số chất rắn hòa tan giảm dần theo thời gian lên men. Ở 8 giờ đầu, nấm

men sử dụng đường và chất trong môi trường chưa nhiều nên độ Brix không có dấu

hiệu giảm xuống. Kể từ sau 8 giờ, độ Brix bắt đầu giảm xuống khá nhanh do nấm men

đã bắt đầu hoạt động mạnh. Sau 40 giờ , độ Brix giảm ít và gần như ko giảm về sau do

nấm men đã suy yếu và quá trình lên men bị ức chế.

Trong quá trình lên men, lượng đường khử tất nhiên sẽ giảm dần theo thời gian.

Ở 8 giờ đầu tiên lượng đường khử giảm khá nhanh sau đó giảm chậm dần cho đến thời

Đồ án tốt nghiệp điểm đạt độ cồn cao nhất là 20 giờ do nấm men bị lượng ethanol và acid sinh ra gây ức

chế quá trình lên men. Đường lúc này được nấm men sử dụng để duy trì sự sống là chủ

yếu. Sau 34 giờ lượng đường không thay đổi nhiều do sinh khối nấm men đã giảm .

Trong khoảng 20 giờ đầu của quá trình lên men , mật độ tế bào nấm men tăng

mạnh trong dịch lên men và đạt số lượng cao nhất là 141 triệu tế bào/ml. Ở giai đoạn

này nấm men phát triển mạnh, thích nghi tốt với môi trường làm cho quá trình lên men

diễn ra mạnh mẽ.Theo khảo sát , nấm men sau 10 giờ đã bắt đầu thích nghi và tăng

sinh khối chuẩn bị cho quá trình lên men thực sự diễn ra và đến 20 giờ là cao nhất. Sau

khoảng thời gian đó mật độ nấm men vẫn duy trì và có xu hướng giảm dần, có thể nói

là nấm men lúc này đang vào pha ổn định.

Từ 28 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm nhanh do bước vào giai đoạn suy vong

do môi trường tích tụ acid gây ức chế nấm men.

30.11

30.01

28.19

3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SHF:

l

Glucose

m / g m

Cellulose

5.12

4.88

3.87

35oC

39oC

37oC

Nhiệt độ

Hình 3.8. Khảo sát lượng đường khử theo nhiệt độ

Khảo sát ở mốc thời gian tối ưu là 20 giờ thấy rằng hàm lượng glucose và

cellulose trong dịch mẫu đạt thấp nhất ở nhiệt độ 37oC (4,1 mg/ml và 28,3 mg/ml).

Đồ án tốt nghiệp Lượng cellulose và glucose đạt cao nhất (30,03mg/ml và 4,9mg/ml) ở nhiệt độ 35OC.

Vậy nên có thể kết luận ở nhiệt độ 37oC thì quá trình lên men diễn ra là tốt nhất và

7.8

7.5

4.8

4.6

Độ cồn

lượng đường khử được sử dụng là nhiều hơn cả.

(%)

Độ Brix

35oC

39oC

37oC Nhiệt độ

Hình 3.9. khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nhiệt độ

Ở thời điểm khảo sát 20 giờ thấy rằng ở 37oC đạt độ cồn cao nhất là 4,8% và

thấp nhất là 4,5% ở 35oC. Nhiệt độ hoạt động tối ưu theo tài liệu vi sinh đại cương của

thầy Nguyễn Lân Dũng (2006) nằm trong khoảng 35 – 40oC tuy nhiên trong thí

nghiệm này còn khảo sát đến cả yếu tố khác là đường khử và độ Brix. Vậy nên chọn

nghiệm thức lên men ở nhiệt độ 37oC là hợp lý nhất.

3.2.3 Kết quả khảo sát pH quá trình lên men SHF:

Độ pH hay nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu các chất dinh dưỡng, sản phẩm lên men qua thành tế bào của nấm men, hoạt động của enzyme. Do đó, pH của môi trường lên men sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả lên men.

Đồ án tốt nghiệp

33.41

29.11

27.19

l

Glucose

m / g m

Cellulose

7.82

5.11

4.87

pH4,5

pH 5,5

pH5

pH

Hình 3.10. Khảo sát lượng đường khử theo pH

Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC , lượng glucose

ở mức cao nhất (6,8mg/ml) ở mức pH khảo sát là 4,5 và cellulose đạt cao nhất

(33,7mg/ml) ở pH 5,5.Điều này thấy rằng ở 2 mức pH 4,5 và 5,5 lượng đường khử vẫn

còn cao và có thể suy ra rằng hiệu suất của quá trình lên men là chưa đạt tối ưu. Vậy

nên thực hiện quá trình lên men ở pH 5 là hiệu quả hơn cả mặc dù lượng glucose trong

dịch lên men tuy không thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại nhưng lượng cellulose

9.2

7.8

4.8

còn lại có sự giảm xuống đáng kể (29,19mg/ml)

(%)

3.8

Độ cồn

Độ Brix

pH 4,5

pH 5,5

pH 5

pH

Hình 3.11.Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo pH

Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC ở khoảng pH 5 cho độ cồn cao nhất (4,8%) và chênh lệch khá lớn so với khoảng pH 4,5 và 5,5. Càng cách xa pH 4,5 và 5,5 nấm men càng hoạt động yếu dần nên độ cồn càng thấp và hàm lượng cellulose còn càng cao. Vậy nên ta chọn nghiệm thức này để tiến hành những thí nghiệm về sau.

8.8

7.8

7.2

4.9

4.8

3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng dịch nấm men SHF:

(%)

4.4

Độ cồn

Độ Brix

2,5%

7,5%

Hàm lượng dịch nấm men (%)

Hình 3.12. Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nồng độ nấm men

Có thể thấy ở nồng độ 5% giống đạt độ cồn cao nhất là 4,8% cao hơn so với tỉ

lệ giống 2,5% nhưng khi tăng tỉ lệ giống lên 7,5% thì độ cồn cũng có tăng lên nhưng

độ cồn không thay đổi nữa vì nấm men đã bị nồng độ cồn cao ức. Vậy nên chọn hàm

lượng nấm men 5% là tốt nhất.

Đồ án tốt nghiệp

35.13

28.19

27.93

) l

Glucose

m / g m

(

Cellulose

7.82

4.87

4.38

2,5%

7,5%

Hàm lượng dịch nấm men (%)

Hình 3.13. Khảo sát lượng đường khử theo nồng độ nấm men

Ở nghiệm thức 2,5% tỉ lệ giống có mức cellulose và glucose là cao nhất (35,12

mg/ml và 7,8 mg/ml) cho thấy quá trình lên men vẫn còn ở hiệu suất thấp.

Ở nghiệm thức còn lại sau khi đã bổ sung nấm men lên thành 5% và 7,5% thấy cả 2

loại đường đều có xu hướng giảm (22mg/ml cellulose và 3,8 mg/ml glucose) ở mức tỉ

lệ giống là 7,5%. Có thể khẳng định mật độ nấm men cũng có ảnh hưởng rất lớn đến

quá trình lên men, bằng chứng là khi bổ sung nấm men thì thấy lượng đường khử dã

giảm xuống. Tuy nhiên ta nên chọn nghiệm thức có tỉ lệ giống là 5% để đảm bảo tính

kinh tế khi thực hiện cũng như lượng đường khử còn lại trong dịch cũng không có sự

chênh lệch mang tính ý nghĩa so với mức 7,5% .

3.3.1 Kết quả khảo sát thời gian lên men SSF:

Đồ án tốt nghiệp

Độ Brix (%)

Độ cồn (%)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48

Thời gian ( giờ)

Hình 3.14. Sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo thời gian lên men SSF

Trước khi lên men , trong dịch không có lượng cồn nào được sinh ra và độ Brix

đạt gần như là cao nhất (9,7%).Sau 12 giờ bắt đầu quá trình lên men, lượng cồn bắt

đầu tăng với tốc độ khá nhanh và đạt 2,5% ở thời gian 12 giờ. Bên cạnh đó Độ Brix

cũng bắt đầu giảm mạnh từ 10,1% xuống còn 8,3% trong 6 giờ. Có thể nói quá trình

lên men lúc này đã bắt đầu diễn ra dù chưa đạt đến đỉnh điểm.

Kể từ 12 giờ đến 40 giờ, lượng cồn trong dung dịchdù ko đạt được tốc độ tăng

cao như 12 giờ đầu nhưng vẫn tăng lên rất đều đặn và đã đạt được độ cồn cao nhất là

5,1% sau 38 giờ lên men. Trong khoảng thời gian này, nồng độ cơ chất hòa tan trong

dung dịch có xu hướng duy trì ổn định và có dấu hiệu đi xuống.

Kể từ 38 giờ , độ cồn duy tiếp tục duy trì như vậy trong những giờ tiếp theo và

giảm dần còn 3,4% ở 48 giờ. Độ Brix cũng bắt đầu giảm với tốc độ nhanh hơn so với

khoảng thời gian đầu. Và đây cũng là giai đoạn đánh dấu quá trình lên men bắt đầu đi

vào pha “suy vong”.

Đồ án tốt nghiệp

) l

m / g m

Glucose

(

Cellulose

h 0

h 2

h 4

h 6

h 8

h 6 2

h 0 1

h 2 1

h 4 1

h 6 1

h 8 1

h 0 2

h 2 2

h 4 2

h 8 2

h 0 3

h 2 3

h 4 3

h 6 3

h 8 3

h 0 4

h 2 4

h 4 4

h 6 4

h 8 4

Thời gian (giờ)

Hình 3.15. Sự thay đổi lượng đường theo thời gian lên men SSF

Trước quá trình lên men, lượng đường khử đạt mức cao nhất (31 mg/ml

cellulose và 10,2 mg/ml glucose) và sau quá trình lên men trong 48 giờ chỉ còn lại 11,2

mg/ml cellulose và 0,31 mg/ml glucose. Điều này cho thấy quá trình lên men đạt hiệu

suất khá cao và lượng glucose tiến rất sát về 0. Quan sát vào biểu đồ thấy rằng trong

quá trình lên men trong 14 giờ đầu lượng đường khử hầu như là không thay đổi nhiều

so với trước lên men dù có giảm xuống . Không những vậy còn thấy có những khoảng

thời gian lượng đường có sự tăng lên do quá trình thủy phân lúc này vẫn còn đang diễn

ra mạnh và quá trình lên men được xem là chưa thực sự diễn ra.

Kể từ sau 20 giờ, lượng đường trong dịch lên men bắt đầu giảm xuống rõ rệt,

lượng cellulose( từ 33,5 mg/ml giảm còn 14,7 mg/ml) trong 14 giờ và glucose ( 4,8

mg/ml giảm còn 0,31 mg/ml) ở mốc thời gian 48 giờ. Đây là mốc thời gian qua trọng

đánh dấu quá trình lên men đã thực sự bắt đầu.

Trong khoảng 10 giờ đầu của quá trình lên men đồng thời, mật độ tế bào nấm

men tăng mạnh đây là giai đoạn tế bào nấm men thích nghi và bắt đầu sử dụng được

chất dinh dưỡng trong môi trường để tăng sinh khối. Ở giai đoạn này , độ cồn thu được

Đồ án tốt nghiệp cũng tăng mạnh (1,8% lên 2,5% chỉ trong 2 giờ), tuy nhiên lượng cồn thu được vẫn

chưa phải là cao nhất. Tương tự độ Brix cũng tăng dần ở khoảng thời gian 6 giờ là

10,1%. Bên cạnh đó có thể thấy lượng glucose sinh ra có xui hướng tăng dần là nồng

độ cellulose giảm dần. Có thể nói rằng quá trình lên men lúc này chưa thực sự bắt đầu

do tốc độ lên men của nấm men trong giai đoạn này còn yếu do tăng sinh chưa đủ .

Theo khảo sát, khoảng thời gian sau 22 giờ là thời điểm nấm men bắt đầu hoạt

động mạnh, cụ thể là độ cồn tăng nhanh đạt cao nhất là 5,1% ở mốc 38 giờ (mỗi 2 giờ

tăng khoảng 0,2%). Song song đó nồng độ glucose và cellulose cũng giảm dần và độ

Brix cũng giảm mạnh (giảm 3% trong 12 giờ). Mật độ tế bào nấm men lúc này là khá

ổn định tuy nhiên cũng bắt đầu giảm dần.Vậy nên đây chính là thời điểm đánh dấu quá

trình lên men đã thực sự bắt đầu.

Bắt đầu từ 38 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm dần và bước vào giai đoạn suy

vong. Độ cồn bắt đầu giảm xuống còn 3,6% ở 48 giờ có thê do cồn đã khuếch tán ra

ngoài môi trường, độ Brix dao động trong khoảng 6,8 – 7,6 và có xu hướng giảm dần.

Lúc này lượng glucose và cellulose cũng giảm xuống. Chất dinh dưỡng trong môi

trường lúc này đã gần như không còn đảm bảo cho quá trình lên men cũng như sự tích

lũy các chất gây ức chế như CO2, acid, aldehyde... Và lượng glucose trong quá trình

thủy phân để sau đó lên men được sử dụng triệt để hơn so với lên men SHF (lượng

glucose tiến về 0 gần hơn).Như vậy thời gian tối ưu để lên men SSF là 38 giờ, đạt độ

cồn là 5,1%.

Nếu so sánh với thời gian lên men SHF thì thời gian để lên men SSF đạt độ cồn

cao nhất sẽ mất nhiều thời gian hơn mặc dù lượng cồn cao nhất thu được nhỉnh hơn dù

không đáng kể.

Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF:

9.1

5.1

4.8

4.4

(%)

Độ cồn

Độ Brix

35oC

39oC

37oC

Nhiệt độ

Hình 3.16. Sư thay đổi độ cồn và độ brix theo nhiệt độ lên men SSF

Kết quả cho thấy ở 37oC thu được độ cồn cao nhất nhưng độ cồn cũng chênh

lệch không nhiều và tạo ra lượng ethanol cũng gần như nhau. Tuy nhiên xét thêm độ

Brix cũng như lượng glucose tạo thành có xu hướng tăng dần thì ta nên chọn nhiệt độ

tối ưu cho quá trình lên men SSF là 37oC.

9.1

8.8

5.1

4.8

4.7

3.3.3. Khảo sát pH lên men SSF:

(%)

Độ cồn

Độ brix

pH4,5

ph5,5

pH5

pH

Hình 3.17. Sự thay đổi độ cồn và độ brix theo pH trong lên men SSF

Khảo sát ở 3 mức pH, nhiệt độ 37oC, tỉ lệ nấm men 5%, cellulose 5%, đo ở 38

giờ cho thấy ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời. pH từ

Đồ án tốt nghiệp 4,5 đến 5 đạt độ cồn cực đại là 5,1% nhưng tăng lên pH 5,5 thì độ cồn lại giảm xuống

chỉ còn 4,5%. Bên cạnh đó pH 5 theo ta biết cũng là pH tối ưu cho cellulase hoạt động

trong quá trình thủy phân. Vậy nên khẳng định pH 5 là tối ưu để thực hiện quá trình

lên men SSF.

3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme

Độ hấp thụ OD của dd có phản ứng enzyme sau thủy phân

Nồng độ enzyme 3% 5% 7%

OD 540nm 0,869 0,851 0,906

Áp dụng vào công thức tính toán , ta xác định được hoạt tính CMCase của enzyme này

là 38,15(IU/g)

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

4.1.1 Quá trình tiền xử lý

Từ các khảo sát về các phương pháp tiền xử lý nguyên liệu trước đã rút ra điểm

tối ưu cho quá trình tiền xử lý vỏ chuối khô:

- Nồng độ H2SO4 : 2%

- Thời gian ngâm: 2 ngày

- Tỉ lệ Acid : nguyên liệu = 10:1

- Nhiệt độ phòng

4.1.2 Quá trình thủy phân

Kết quả rút ra từ khảo sát:

- Nồng độ enzyme cellulose : 5%

- Thời gian thủy phân : 1 ngày

- Nhiệt độ : 50oC

- pH 5.0

4.1.3 Quá trình lên men SHF

- Thời gian lên men : 20 giờ

- Nhiệt độ : 37oC

- pH 5.0

- Tỉ lệ giống : 5%

4.1.4 Quá trình lên men SSF

- nồng độ enzyme cellulose : 5%

- Thời gian : 38 giờ

- Nhiệt độ 37oC

- pH 5.0

- Tỉ lệ giống : 5%

Đồ án tốt nghiệp 4.2 Kiến nghị

Từ những số liệu rút ra từ bài khảo sát đã cho thấy phần nào khả năng thực hiện

quá trình lên men SHF và SSF cũng như so sánh về khả năng tạo ethanol từ vỏ chuối

khô của 2 quá trình này. Tuy nhiên, vì không có điều kiện để nghiên cứu sâu hơn nên

vẫn còn hạn chế nhiều mặt. Một vấn đề còn rất hạn chế chính là lượng cellulose vẫn

còn khá nhiều kể cả sau khi lên men khiến cho khả năng lên men chưa thực sự đạt

được như mong muốn. Vì vậy cần nghiên cứu để sử dụng triệt để lượng đường 5C này

trong các giai đoạn tiền xử lý và thủy phân là cần thiết.

Chi phí tinh chế ethanol sau khi lên men cũng là một vấn đề khó khăn, gây tốn

kém về mặt năng lượng, dù đã thành công trong việc sản xuất xăng sinh học từ phế

phẩm nông nghiệp, nhưng để thương mại hóa sản phẩm, cần nên tiếp tục nỗ lực nghiên

cứu nhằm hạ giá thành sản phẩm.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] . Nguyễn Văn Mùi (2007), Thực hành hóa sinh học, nhà xuất bản Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội.

[2]. Nguyễn Văn Pháp, (2013), Bước đầu khảo sát tiền xử lý và thủy phân vỏ cacao

để làm nguyên liệu cho quá trình lên men bioethanol bằng saccharomyces

cerevisiae, Khóa luận tốt nghiệp đại học, đại học Cần Thơ, Việt Nam.

[3]. Nguyễn Ngọc Thùy Linh, (2014), Khảo sát quá trình lên men bioethanol từ vỏ chuối bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời, Khóa luận tốt nghiệp, đại học Tôn Đức Thắng, Việt Nam.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[4]. Dian Nasir Azam, Sami Ullah and Farheen Sadullah, Akhlaq Ahma, Mir Sadiq Shah and Nisar Khan (2011), “Production of bioethanol through enzymatic hydrolysis of potato”, African Journal of Biotechnology, 11(25), 6739 -6743.

[5]. E-journal: science & technology (e-jst) biotechnology influencefor the

production ofethyl alcohol (ethanol) from waste fruites

[6]. G.Lalitha and Rajeshwari Sivaraj Fermention of pretreated hydrolyzates of banana and mango fruit wastes for ethanol production, 2011, vol2/issue2.

[7]. Graeme M.Walker Bioethanol: Science and technology of fuel alcohol, 2010

[8]. Hossain, A.B.M.S, Ahmed, S. A, Ahmed M. Alshammari, Faris M. A. Adnan, Annuar, M. S. M, Hadeel Musfa1 and Norah Hammad Bioethanol fuel production from rotten banana as anenvironmenl waste management and susinable energy African Journal of Microbiology Research, 2011, 5(6), 586- 598

[9].

Jing Zhao, Liming Xia (2010), “Bioconversion of corn stover hydrolysate to ethanol by a recombinant yeast strain”, Fuel Processing Technology, 4(91), 1807–1811.

[10]. Karhumaa K, W.B, Hahn-Hagerdal B, Boles E, Gorwa-Grauslund MF Co- industrial laboratory and

utilization of L-arabinose and D-xylose by Saccharomyces cerevisiae strains Microb Cell Fact, 2006, 5:18.

Đồ án tốt nghiệp [11].

laboratory and

Karhumaa K, W.B, Hahn-Hagerdal B, Boles E, Gorwa-Grauslund MF, Co- utilization of L-arabinose and D-xylose by industrial Saccharomyces cerevisiae strains Microb Cell Fact, 2006, 5:18.

[12].

Karimi, Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production from International. Journal of Molecular Sciences, 2008, 9, 1621-1651 .

[13].

Päivi Ylitervo Production of ethanol and biomass from orange peel waste by Mucor indicus, 2008, 181 – 300

[14].

Parveen Kumar, D.M.B, Michael J. Delwiche, and Pieter Stroeve. Industrial & Engineering Chemistry Research Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production, 2009, 48(8), 3713– 3729

[15].

[16]. R. Arumugam & M.Manikandan Production of ethanol

from mango (Mangifera indica L.) peel by Saccharomyces cerevisiae, 2011, vol10(20), 712- 749.

[17].

Saha BC Alpha-L-arabinofuranosidases: biochemistry, m.b.a. and a.i. biotechnology, 2000, 18, 403 – 423.

TÀI LIỆU WEBSITE

[18].

Luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối, http://luanvan.net.vn/luan-van/de- i-nghien-cuu-san-xuat-necr-chuoi-37922/,

[19]. Nhiên liệu sinh học, http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/1/1/7.

[20]. sản hình Ethanol xuất trên tiêu thụ và

Tình thế giới,http://www.asiacreative.vn/tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-ethanol-tren-the- gioi/

[21]. Luận văn phân sinh học,

tích các ưu nhược điểm của xăng phan-tich-cac-uunhuoc-diem- tai- su-dung-xang-sinh-hoc-thay-the-cho-cac-nhien- lieu-truyen- thong-o-

http://luanvan.net.vn/luan-van/de- khi- viet- nam-47716/

Đồ án tốt nghiệp [22]. Tình hình sản xuất, tiêu thụ Ethanol trên thế giới

,http://www.asiacreative.vn/tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-ethanol-tren-the- gioi/,

[23]. Đột phá mới về năng lượng, http://nhienlieusinhhoc.blogspot.com/

[24]. Optimization of fermentation parameters for production of ethanol from

kinnow waste and banana peels by simultaneous saccharification and fermentation,2007.http://pubmedcentralcanada.ca/articlerender.cgi?accid=P MC3450031

[25]. KADAMBINI GAUR, « PROCESS OPTIMIZATION FOR THE PRODUCTION OF

ETHANOL.VIAFERMENTATION »http://dspace.thapar.edu:8080/dspace/bitstre am/123456789/102/1/3040010..

[26].

Immobilized Yeast Cells by Saccharomyces cerevisiae ,http://www.researchgate.net/publication/242354151_Optimizati

[27]. Optimization of Ethanol Fermentation from Pineapple Peel Extract Using

Response,Surface&Methodology(RSM),http://connection.ebscohost.com/c/artic les/889

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A

CÁCH XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ

• Cân chính xác 1 g glucose hòa n trong 200 ml nước cất,

• Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5 ml dung dịch đường glucose vào 5 bình định mức 50

ml, thêm nước cất đến vạch mức,

• Các dung dịch mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5

mg/ml

• Thực hiện phản ứng giữa 3 ml dịch đường và 1 ml DNS, đun cách thủy trong 5

phút ,

Từ kết quả đo được xác định được đường chuẩn

Tương quan giữa nồng độ glucose và (540nm)

Nồng độ Glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

y = 3.4557x + 0.1066 R² = 0.9907

0,147 0,438 0,706 1,166 1,573 1,793 A= (540nm)

)

m n ( A

2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Glucose(mg/ml)

Đường chuẩn glucose

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B

CÁCH XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG CELLULOSE

Dựa theo đồ thị chuẩn CMC tinh khiết với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử Anthrone, Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu, cellulose của mẫu nghiên cứu, Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 630nm,

Cách pha Anthrone:

Cân 0,2g Anthrone hòa n trong 100ml H2SO4 98%, Dung dịch sau khi được pha chứa trong chai thủy tinh nâu và để ở điều kiện lạnh 4 - 6oC trong 2 giờ trước khi dung,

Dựng đường chuẩn CMC tinh khiết với thuốc thử Anthrone:

• Dung dịch CMC chuẩn (20mg/ml): cân chính xác 1g CMC hòa n trong 50

ml nước cất,

• Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch CMC vào 6 bình định mức 100

ml, thêm nước cất đến vạch mức, Các dung dịch mới pha này có nồng độ CMC lần

lượt là 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 mg/ml

• Cho 5ml thuốc thử Anthrone vào mỗi ống nghiệm chứa 0,5ml dung dịch

trên, Nung cách thủy trong 5 phút, Làm lạnh nhanh rồi đi đo OD ở bước sóng

630nm,

Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn CMC,

Cách tiến hành:

• Hút 0,5ml dung dịch (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) + 5ml dung dịch

Anthrone

• Nung cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước

sóng 540nm,

• Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn CMC suy ra hàm

lượng celulose trong mẫu,

Đồ án tốt nghiệp

Đường chuẩn cellulose

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM MEN

Khuẩn lạc trên môi trường SDA

Khuẩn lạc trên môi trường thạch nghiêng SDA

Đồ án tốt nghiệp

Nhân giống cấp 1 trong môi trường SDB

Nhân giống cấp 2 trong môi trường SDB

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D

BẢNG SỐ LIỆU KẾT QUẢ

Bảng số liệu lên men SHF theo thời gian

Thời gian Độ cồn Độ Brix Glucose Cellulose Mật độ tế

(giờ) (%) (mg/ml) (mg/ml) bào (log/ml)

0 0 9,0 10,22 ± 1,19 30,81 ± 2,11

2 3,3 9,2 8,71± 0,81 31,18± 1,82 4,2

4 3,4 9,2 8,91± 1,22 31,22± 0,88

6 3,6 9,4 7,72± 0,88 33,12± 4,01

8 4,0 8,8 8,11± 0,21 30,09± 2,54 5,0 10 4,1 8,2 6,19± 0,09 31,98± 1,17

12 4,0 8,6 6,25± 1,12 29,18± 0,87

14 4,4 8,6 4,77± 0,38 27,12± 2,11 8,2

16 4,6 8,4 3,66± 0,18 17,88± 2,42

18 4,8 7,8 4,87± 0,22 28,19± 3,07

20 4,8 7,7 4,55± 0,15 30,22± 4,22 14,6

22 4,6 7,7 3,98± 0,19 28,11±2,14

24 4,6 7,8 4,51± 0,45 25,90± 1,98

26 4,4 7,7 3,12± 0,22 25,88± 3,22 11,7

28 4,5 7,4 2,99± 0,41 27,12± 1,15

30 4,6 7,4 1,84± 0,27 24,09± 2,55

32 4,6 7,2 1,78± 0,09 19,81± 3,01 8,1

34 4,3 7,2 2,25± 0,11 22,55± 2,92

36 4,3 7,4 1,89± 0,09 19,42± 1,92

38 4,0 7,0 0,87± 0,05 17,09± 2,23 6,6

40 3,9 6,6 1,41± 0,09 14,78± 2,01

42 3,6 6,8 0,94± 0,03 18,11± 1,19 3,8

Đồ án tốt nghiệp

0,95± 0,07 19,66± 1,09 3,4 6,6 44

0,87± 0,09 17,81± 0,98 3,4 6,8 46

0,87± 0,11 16,66± 1,22 3,2 6,8 48

Bảng số liệu kết quả lên men SHF theo nhiệt độ

Nhiệt độ Độcồn ĐộBrix Glucose Cellulose Mật độ tế

(oC) (%) (%) (mg/ml) (mg/ml) bào

(triệu/ml)

5,12 ± 0,96 32,11 ± 1,55 126 4,6 8 35

4,87± 0,22 28,19± 3,07 146 4,8 7,8 37

4,88 ± 1,21 30,01 ± 4,81 140 4,8 7,5 39

Bảng số liệu kết quả lên men SHF theo pH

pH Độcồn ĐộBrix Glucose Cellulose Mật độ tế

(%) (%) (mg/ml) (mg/ml) bào

(triệu/ml)

4,5 4,0 7,82 ± 1,26 29,11 ± 1,63 140 8

5 4,8 4,87± 0,22 28,19± 3,07 146 7,8

5,5 3,8 5,11 ± 0,91 35,41 ± 2,12 128 8,2

Bảng số liệu kết quả lên men SSF theo thời gian

Thời gian Độ cồn Độ Brix Glucose Cellulose Mật độ tế

(giờ) (%) (mg/ml) (mg/ml) bào (log/ml) (%)

0 9,7 10,22 ± 1,15 31,11 ± 2,15 0

0,6 9,8 8,71± 0,41 30,78± 1,89 4,2 2

0,6 9,7 8,91± 1,41 31,12± 0,81 4

0,9 10,1 7,72± 0,88 29,12± 4,22 6

5,0 1,5 9,9 8,11± 0,21 31,11 ± 2,94 8

Đồ án tốt nghiệp

7,19± 0,12 31,92 ± 1,17 1,8 9,2 10

8,25± 1,54 21,14 ± 0,77 2,5 8,6 12

7,77± 0,32 27,13 ± 1,11 7,8 2,5 8,6 14

5,66± 0,26 14,81 ± 3,12 2,8 8,4 16

4,87± 0,23 26,79± 1,02 3,0 8,8 18

4,55± 0,19 33,12± 1,92 11,8 3,1 8,7 20

5,22 ± 0,88 28,11±2,14 3,4 8,7 22

4,71± 0,71 25,70± 1,28 3,6 8,8 24

3,02± 0,28 24,81 ± 1,24 12,5 3,9 8,7 26

2,99± 0,41 21,12± 1,45 4,0 8,4 28

2,84± 0,47 21,09± 3,55 4,3 8,4 30

2,78± 0,29 19,21± 2,01 11,4 4,5 8,2 32

2,32 ± 0,13 22,53 ± 2,91 4,8 8,2 34

2,89± 0,52 18,42± 1,93 4,8 8,4 36

1,87± 0,45 16,01 ± 2,23 9,8 5,1 8,0 38

2,43 ± 0,19 14,73 ± 2,15 5,0 7,6 40

1,94± 0,09 17,51± 1,89 5,1 6,8 42

0,77 ± 0,11 18,46± 1,99 3,8 6,6 44 8,6 0,85 ± 0,04 13,22 ± 0,18 4,0 6,8 46

0,31 ± 0,06 11,04 ± 1,24 3,6 6,8 48

Bảng số liệu kết quả lên men SSF theo nhiệt độ

Nhiệt độ Độcồn ĐộBrix Glucose Cellulose Mật độ tế

(oC) (%) (%) bào

(triệu/ml)

4,8 8,0 35 126 6,12 ± 0,61 28,62 ± 1,75

5,1 8,0 37 122 6,87± 0,45 26,98 ± 4,23

5,0 8,2 39 140 6,88 ± 2,52 25,01 ± 4,81

Đồ án tốt nghiệp

Bảng số liệu kết quả lên men SHF theo pH

pH Độcồn ĐộBrix Glucose Cellulose Mật độ tế

(%) (%) bào

(triệu/ml)

4,5 4,7 9,1 118 9,92 ± 1,13 31,88 ± 2,91

5 5,1 8,0 122 6,87 ± 0,45 26,98 ± 4,23

5,5 4,5 8,8 108 7,18 ± 1,12 33,56 ± 2,44

Bảng số liệu kết quả lên men SHF theo mật độ nấm men

Tỉ lệ Độcồn ĐộBrix Glucose Cellulose Mật độ tế

giống (%) (%) (mg/ml) (mg/ml) bào

(%) (triệu/ml)

2,5 4,4 8,8 7,82 ± 1.51 35,13 ± 2,25 81

5 4,8 7,8 4,87± 0,22 28,19± 2,41 146

7,5 4,9 7,2 4,38 ± 1,55 27,93 ± 3.44 172

Bảng ANOVA thủy phân vỏ chuối bằng enzyme thời gian 1 ngày

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (Musa paradisiaca)

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát và qua đó rút ra được điều kiện tối ưu của các phương pháp lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối. Mời các bạn cùng tham khảo.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH