Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước từ Bồ công anh (Lactuca indica L)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH (LACTUCA INDICA L)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Trịnh Thị Phƣơng Thảo

MSSV: 1311100687 Lớp: 13DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở

lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh

Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố

trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan

này.

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017.

Sinh viên

Trịnh Thị Phƣơng Thảo

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học

Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học -

Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý

báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.

Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,

ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong

suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở

Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh

chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề

tài của mình.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con

những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong

cuộc sống.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017

Sinh viên

Trịnh Thị Phƣơng Thảo

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ......................................................................................................................... i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... viii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................. 3

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 3

4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 4

1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý .................................................. 4

1.1.1. Phân loại ................................................................................................................ 4

1.1.2. Nguồn gốc và phân bố ........................................................................................... 4

1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh ......................................................................... 5

1.1.4. Tác dụng dƣợc lý ................................................................................................... 5

1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh ................................................................... 6

1.1.5.1. Flavonoid ............................................................................................................ 6

1.1.5.2. Alkaloid ............................................................................................................... 8

1.1.5.3. Carbohydrate .................................................................................................... 10

1.1.5.4. Glycoside ........................................................................................................... 11

1.1.5.5. Saponin .............................................................................................................. 12

1.1.5.6. Tannin ............................................................................................................... 13

1.1.5.7. Amino acid ........................................................................................................ 14

1.1.5.8. Isoprenoid ......................................................................................................... 15

1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật ............................ 16

1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn ................................................................... 16

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn ............................................................................................ 16

1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật ....................................... 19

1.2.3.1. Hợp chất phenolic ............................................................................................. 19

1.2.3.2. Nhóm alkaloid ................................................................................................... 21

1.3. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ....................................................... 23

1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli ......................................................................... 23

1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ......................................................................... 24

1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. .............................................................................. 26

1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. ............................................................................... 27

1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................................................................. 28

1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. .................................................. 29

1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. ................................................... 30

1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus .............................................................. 31

CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 33

2.1. Địa điểm và thời gian .............................................................................................. 33

2.1.1. Địa điểm .............................................................................................................. 33

2.1.2. Thời gian ............................................................................................................. 33

2.2. Vật liệu .................................................................................................................... 33

2.2.1. Nguồn mẫu .......................................................................................................... 33

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ................................................................................................... 33

2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng ......................................................................... 33

2.2.4. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................. 34

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 35

2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu ................................................................ 35

2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật ............................................... 35

2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ................................................. 36

2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị ..................... 36

Đồ án tốt nghiệp

2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ............................................................................... 37

2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .................................................... 38

2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết ........................... 38

2.3.7.1. Định tính carbohydrate ..................................................................................... 39

2.3.7.2. Định tính alkaloids ............................................................................................ 39

2.3.7.3. Định tính saponin .............................................................................................. 39

2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside .............................................................................. 39

2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside ................................................................... 40

2.3.7.6. Định tính flavonoid ........................................................................................... 40

2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol .......................................................................... 41

2.3.7.8. Định tính tannin ................................................................................................ 41

2.3.7.9. Định tính steroid ............................................................................................... 41

2.3.7.10.Định tính amino acid ........................................................................................ 41

2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH ..................................... 42

2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học ..................................................... 42

2.3.9.1. Định lượng vitamin C........................................................................................ 42

2.3.9.2. Định lương Alkaloid .......................................................................................... 43

2.3.9.3. Định lượng Flavonoid ....................................................................................... 44

2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 44

2.4. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 44

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi

cao chiết từ Bồ công anh ................................................................................................ 46

2.4.1.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................ 46

2.4.1.2. Thuyết minh quy trình ....................................................................................... 47

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. ..................................................................... 48

2.4.2.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................ 48

iii

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.2. Thuyết minh quy trình ...................................................................................... 50

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây Bồ

công anh. ........................................................................................................................ 50

2.4.3.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................ 50

2.4.3.2. Thuyết minh quy trình ....................................................................................... 51

2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc

từ cây Bồ công anh. ........................................................................................................ 51

2.4.4.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................ 51

2.4.4.2. Thuyết minh quy trình ....................................................................................... 53

2.4.5. Thí nghiệm 5: Định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ cây

Bồ công anh .................................................................................................................... 53

2.4.5.1. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................ 53

2.4.5.2. Thuyết minh quy trình ....................................................................................... 55

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 56

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc ........ 56

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh trên các

chủng vi khuẩn gây bệnh ................................................................................................ 56

3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................................... 56

3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn Listeria Spp. .................................................................................................... 58

3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn Samonella Spp. ................................................................................................ 58

3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn Shigella Spp. .................................................................................................... 60

3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn Vibrio spp. ....................................................................................................... 61

Đồ án tốt nghiệp

3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm

vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. .................................................................................. 62

3.3. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh đối với

20 vi khuẩn gây bệnh ..................................................................................................... 63

3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc Bồ công

anh 64

3.5. Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc Bồ công anh .. 66

3.6. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh .................... 67

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 71

4.1. Kết luận .................................................................................................................... 71

4.2. Đề nghị .................................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 72

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl sulfoxide

RNA: Ribonucleic acid

TSA: Trypton Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

LiWE: Lactuca indica Water extract

NA: Non Activity

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,

1999)............................................................................................................................... 18

Bảng 3.1 Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết nƣớc Bồ công anh trên

20 chủng vi khuẩn gây bệnh........................................................................................... 63

Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh. ................................................................................................................................. 65

Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của Bồ công anh ................. 67

Bảng 3.4. Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C............................................ 69

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid,

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid ........................................ 9

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate .............................................................. 10

Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside .............................................................................. 12

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin ...................................................................... 13

Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)

........................................................................................................................................ 17

Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi ................................................................... 23

Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. ............................................................... 25

Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. ............................................................. 26

Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. .................................................................. 27

Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. .................................................................... 28

Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................... 30

Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp. ........................................................................ 31

Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ................................................................. 32

Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ......................................................................... 37

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .................................................................. 45

Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây bồ công anh ................................ 46

Hình 2.4. Mẫu Bồ công anh sau khi sấy khô ................................................................ 47

Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh 49

Hình 2.6. Quy trình khảo sát kháng oxy hóa của cao chiết ........................................... 51

Hình 2.7. Sơ đồ định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc ............................... 52

Hình 2.8. Sơ đồ định lƣợng vitamin C, alkaloid và flavonoid ...................................... 54

Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ........................................................................ 57

viii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp. .............................................................................. 58

Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ......................................................................... 59

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. .............................................................................. 60

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................................................................. 61

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với vi khuẩn E. feacalis ............................................................................................ 62

Hình 3.7. Hiệu quả kháng oxy hóa của vitamin C ........................................................ 68

Hình 3.8. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh ....................... 68

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài

nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo các nhà phân loại thực vật, nƣớc ta có

khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài đƣợc dùng làm dƣợc

liệu (Viện dƣợc liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên

thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Trong

tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu

trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10% là cây thuốc trồng.

Tác dụng chữa bệnh của cây cỏ là do các hợp chất tự nhiên có ở trong chúng quyết

định. Do đó, nói tới nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú trên đất nƣớc ta

cũng là nói tới khả năng sinh tổng hợp, chuyển hóa và tích lũy các hợp chất tự nhiên có

hoạt tính sinh học của nguồn gen thực vật. Ngày nay, các hợp chất có nguồn gốc thiên

nhiên đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh đã và đang đƣợc các nhà khoa học trong và

ngoài nƣớc quan tâm do tính ít độc và khả năng dung nạp tốt của chúng với cơ thể

sống. các hợp chất thiên nhiên từ thực vật cũng nhƣ các sinh vật khác rất phong phú về

mặt cấu trúc hóa học và thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: kháng sinh, kháng

viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, kìm hãm HIV, điều hòa miễn dịch, chống sốt rét.

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2009 đến nay, số lƣợng bán thuốc

kháng sinh ở Việt Nam ra ngoài cộng đồng đã tăng gấp 2 lần so với thời điểm hiện tại.

Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh của

ngƣời dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên tới 91%, tỉ lệ sử

dụng kháng sinh ở các bệnh viện tuyến trung ƣơng chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị

trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%. Việc lạm dụng kháng

sinh trong điều trị bệnh đã khiến quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn đẩy mạnh

làm mất đi vai trò của kháng sinh trong điều trị bệnh. Vấn đề về thực trạng kháng

kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nƣớc đang phát triển. Các

Đồ án tốt nghiệp

bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa, đƣờng hô hấp, các bệnh lây truyền qua đƣờng tình

dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử

vong cao ở các nƣớc đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu

sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi

khuẩn.

Bồ công anh còn có tên gọi khác là rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi

mác, diếp trời, rau mũi cày. Là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae), sống

một năm hoặc hai năm, không lông. Thân cao 60-200 cm, đơn hoặc chẻ nhánh ở phần

trên. Lá dài 30cm rộng 5 – 6cm, mép có răng cƣa thƣa. Bấm vào lá và thân đều thấy

tiết ra nhũ dịch màu trắng đục nhƣ sữa. Bồ công anh mọc hoang nhiều ở các tỉnh phía

Bắc. Thƣờng dùng lá bồ công anh, thu hoạch lá về dùng tƣơi hay phơi hoặc sấy khô,

dùng tƣơi tốt hơn. Cũng có thể dùng rễ, toàn cây phơi khô. Dùng để chữa một số bệnh

nhƣ: chữa sung vú, tắc tia sữa, chữa đau, viêm loét dạ dày, tá tràng, mắt đau sung đỏ,

mụn nhọt, viêm họng, viêm phổi, phế quản…

Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật để thay thế các loại

thuốc kháng sinh hóa học là một giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh. Tuy nhiên,

loại cây này đƣợc con ngƣời sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền

miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính vẫn chƣa đƣợc xác

định cụ thể. Vì thế việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây

thuốc là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh

giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nƣớc từ Bồ công anh (Lactuca indica

L)”. Đề tài này đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh.

Đồ án tốt nghiệp

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá một số hoạt tính sinh học từ cao chiết nƣớc của cây bồ công anh.

- Xác định một số thành phần hóa học hiện diện trong cao nƣớc.

3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bồ công anh đối với các

chủng vi khuẩn gây bệnh.

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây bồ công anh.

- Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết bồ công anh.

- Định lƣợng các chất vitamin C, alkaloid, flavonoid.

4. Phạm vi nghiên cứu

- Mẫu cây bồ công anh đƣợc tách chiết cao từ dung môi nƣớc và khảo sát hoạt

tính kháng khuẩn trên các nhóm vi khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp.,

Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp.,

Staphylococcus spp.

- Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac

glycoside, antharaqinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin,

steroid, amino acid.

- Định lƣợng các chất: vitamin C, alkaloid, flavonoid.

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thuốc thử DPPH.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý

1.1.1. Phân loại

Bồ công anh hay rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp trời,

rau mũi cày, là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae).

Bộ (ordo): Asterales (Cúc)

Họ (familia): Asteraceae (Cúc)

Chi (genus): Lactuca

Loài (species): L.indica

Tên tiếng Anh: The common dandelion (thƣờng gọi là "dandelion")

Tên khoa học: Lactuca indica L

Tên đồng nghĩa:

Brachyramphus sinicus Miq.

Chondrilla squarrosa (Thunb.) Poir.

Lactuca amurensis Regel & Maxim.

Lactuca amurensis Regel

Lactuca bialata Griff.

Lactuca brevirostris Champ.

Lactuca brevirostris Champ. ex Benth.

Lactuca brevirostris var. brevirostris

Lactuca brevirostris var. foliis laciniatis Hemsl.

1.1.2. Nguồn gốc và phân bố

Nguồn gốc: Cây bồ công anh (Lactuca indica L) có nguồn gốc từ đại lục Á – Âu,

và ngày nay đƣợc trồng khắp Châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á), Bắc Mỹ,

Nam Phi, Nam Mỹ, New Zealand, Australia, và Ấn Độ.

Phân bố: cây mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các vùng ẩm thuộc các nƣớc Châu Á

nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và các nƣớc Đông Dƣơng. Ở

Đồ án tốt nghiệp

Việt Nam, Bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi (thƣờng ở độ cao dƣới 1000 mét)

đến trung du và đồng bằng. Cây thƣờng mọc ở nơi đất ẩm, trong vƣờn, ven đƣờng đi,

bãi sông hoặc trên các thửa ruộng, nƣơng rẫy đã bỏ hoang. Thu hái vào khoảng tháng 5

– 7, lúc câu chƣa ra hoa hoặc bắt đầu ra hoa, loại bỏ lá già, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô.

1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh

Cây bồ công anh sống một năm hoặc hai năm. Thân không lông, cao 60 – 200 cm,

thân thƣờng đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên. Các lá phía dƣới không lông, lá đơn mọc

cách. Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thƣớc phiến lá dài từ 13 – 25

cm, rộng từ 1,5 – 11 cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá

thƣờng ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá. Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng

cƣa thô to. Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dƣới xanh xám. Các lá mọc ở phía trên

gần đỉnh ngọn sinh hoa thƣờng trên nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn, đầu cành.

Hoa tựa hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng.

Tổng bao hình trụ, kích thƣớc chùm hoa thƣờng cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá

bắc không lông, màu tía, các lá ngoài hình trứng, dài 2 – 3 mm, các lá trong hình trứng

– mũi mác, các lá bắc tận trong cùng khoảng 8, hình mũi mác. Hoa tự thƣờng có 21 –

27 bông, màu vàng nhạt, kích thƣớc hoa 12 – 13 mm, rộng mm. Quả bế hình elip,

phẳng, màu đen, kích thƣớc quả dài 4 – 4,5 mm, rộng 2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm.

Mào lông màu trắng gắn liền quả dài 7 – 8 mm. Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n =

18 (Peng & Hsu, 1978).

1.1.4. Tác dụng dƣợc lý

Flavonoid của Bồ công anh đã đƣợc nghiên cứu tác dụng sinh học thấy có tác dụng

ức chế men oxy hóa khử peroxydase và catalase máu chuột cống trắng. Những thí

nghiệm tiến hành với huyết thanh ngƣời cũng cho những kết quả ức chế men oxy hóa

khử rõ rệt.

Bồ công anh (Đông y cho là thuộc về hàn lƣơng) đƣợc áp dụng phƣơng pháp lồng

cử động đã thể hiện tác dụng an thần. Theo tài liệu nƣớc ngoài, tại một số nƣớc, ngƣời

Đồ án tốt nghiệp

ta có sử dụng và nghiên cứu những loài Lactuca khác nhƣ L.virosa, L. sativa (rau diếp

ăn của Việt Nam), thấy những cây này không độc và có tác dụng trên hệ thần kinh

trung ƣơng gây ngủ nhẹ.

Tác dụng tiêu độc, chữa bệnh sƣng vú, tắc tia sữa, mụn nhọt đang sƣng mủ. Còn

dùng uống để chữa bệnh đau dạ dày, ăn kém tiêu.

Theo Y học cổ truyền, Bồ công anh có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thấp thông

lâm, chủ trị các chứng ung nhọt, sang lở, nhũ ung (viêm vú), trƣờng ung (viêm ruột),

đau họng (hầu tý), mắt sƣng đỏ đau, chứng thấp nhiệt hoàng đản (viêm gan vàng da),

nhiệt lâm (viêm tiết niệu).

1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh

1.1.5.1. Flavonoid

a. Khái niệm: Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây

còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng

benzen A và B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid

có màu vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong

thực vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ

carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011).

Chúng thƣờng đƣợc cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3) và

thƣờng ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến

nhƣ flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone.. Chỉ riêng hai nhóm flavon,

flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38 627 chất

(Ngô Văn Thu, 1998).

Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các

protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng có khả

năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011).

b. Phân loại: Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của

mạch 3C nên các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính:

Đồ án tốt nghiệp

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid.

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid.

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011).

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid,

c. Vai trò:

- Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung

thƣ, tăng nhanh sự lão hóa,...) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng.

- Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu

cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl,… giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình

oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất

flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão

hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn

ở gan và bảo vệ chức năng gan.

Đồ án tốt nghiệp

- Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự

phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ

histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien,… (Quỳnh Ngọc, 2011).

1.1.5.2. Alkaloid

a. Khái niệm:

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản

ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thƣờng các

alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các

muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít

phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi

thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.

Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin do

động vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác động

dƣợc lý học đối với con ngƣời và các động vật khác. Các alkaloid thông thƣờng là các

dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng. Chúng đƣợc tìm

thấy nhƣ là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động

vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có thể đƣợc tinh chế từ

các dịch chiết thô bằng phƣơng pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv,

2010).

Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm

thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh

ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là

anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với

phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt

khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu

cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998).

b. Phân loại

Đồ án tốt nghiệp

Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:

- Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin,

nicotin, spartein, pelletierin.

- Nhóm isoquinolin: các ancaloit gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain,

papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.

- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin.

- Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine.

- Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine,

brucin, veratrin, cevadin.

- Nhóm phenothylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine.

- Nhóm indole:

Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin

Các ergolin: Các ancaloit từ nhựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamine, acid

lysergic v.v

Các beta-cabolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin

- Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffeine, theobromin, theophylline (Tôn Nữ Minh

Nguyệt và ctv, 2010).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid

Đồ án tốt nghiệp

c. Vai trò

Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần

kinh nhƣ morphin, codein, cocain,… Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp

chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013).

1.1.5.3. Carbohydrate

a. Khái niệm

Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật.

Đƣợc cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n,

thƣờng m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lƣợng carbohydrate ở

thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn

sinh trƣởng và phát triển.

- Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận nhƣ củ, quả, lá, thân, cành.

- Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,.. (Phùng Trung Hùng và ctv,

2013).

b. Phân loại

Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate đƣợc chia làm ba nhóm lớn:

monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide (Phùng Trung

Hùng và ctv, 2013).

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate

Đồ án tốt nghiệp

c. Vai trò:

Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng:

- Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lƣợng cho các quá trình sống.

- Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican...).

- Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide).

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phƣơng Hà

Linh Linh, 2011).

1.1.5.4. Glycoside

a. Khái niệm

Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng

(glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv

(2011). Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị

phân huỷ khi có nƣớc dƣới ảnh hƣởng của các enzyme (men) có chứa trong cây.

Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây

là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycosides phụ thuộc vào phần aglycon

còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hòa tan

trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010).

b. Phân loại

Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết

giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside

c. Vai trò

Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có vai

trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra một số chất

kháng khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt nhƣ độc tố Solanine ở khoai tây (Trần

Trƣờng Hận, 2010).

1.1.5.5. Saponin

a. Khái niệm

Saponin là một glycoside tự nhiên thƣờng gặp trong nhiều loài thực vật.Dƣới tác

dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponins bị thuỷ phân thành

genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngô Văn Thu, 2011).

Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol và

rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm sức

căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

b. Phân loại

Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid

(Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin

c. Vai trò

- Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng).

- Một số saponin có tác dụng chống viêm.

- Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus.

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.

1.1.5.6. Tannin

a. Khái niệm

“Tannin” đƣợc dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch

chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến

thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin đƣợc định nghĩa là những hợp chất

polyphenol có trong thực vật, có vị chát đƣợc phát hiện dƣơng tính với “thí nghiệm

thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất

hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thƣờng gặp chủ yếu trong

thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm.

Đồ án tốt nghiệp

Tannin tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong

các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân,

kẽm, sắt).

b. Phân loại

Tannin có thể chia thành hai loại chính:

- Tannin thủy phân đƣợc hay còn gọi là tanin pyrogalli (Gallic acid).

- Tannin ngƣng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone).

c. Vai trò

- Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ sâu.

- Tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng.

- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy…(Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012).

1.1.5.7. Amino acid

a. Khái niệm

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử chứa

cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide

hay polypeptides.Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid, nhóm amino

(-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngoài các nhóm –NH2,

−COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhómchức khác nhƣ: −OH, HS−,

−CO−…

b. Phân loại

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm. Một trong

các cách phân loại là 20 amino acid đƣợc phân thành 5 nhóm nhƣ sau (Hồ Chí Tuấn,

2009):

- Nhóm 1: Các amino acid có gốc R không phân cực kị nƣớc, thuộc nhóm này có

6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline

(P).

Đồ án tốt nghiệp

- Nhóm 2: Các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino

acid: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W).

- Nhóm 3: Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dƣơng, thuộc nhóm này có 3

amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H).

- Nhóm 4: Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này

có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine

(N), Glutamine (Q).

- Nhóm 5: Các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2

amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E).

c. Vai trò

Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật:

- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất.

- Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật.

- Tăng khả năng ra hoa và quả.

1.1.5.8. Isoprenoid

a. Khái niệm

Isoprenoid (terpene)là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon đƣợc tạo

thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8.Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ

thông.

b. Phân loại

Phân loại dựa và số đơn vị isoprene cấu thành phân tử

- Sesterterpenoid (5 đơn vị)

- Triterpenoid (6 đơn vị)

- Tetraterpenoid (8 đơn vị)

- Polyterpenoid (n đơn vị)

- Monoterpenoid (2 đơn vị)

- Sesquiterpenoid (3 đơn vị)

Đồ án tốt nghiệp

- Diterpenoid (4 đơn vị)

c. Vai trò

- Ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thƣ

- Bảo vệ thực vật

- Có khả năng xua đuổi côn trùng

1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật

1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật,

có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn

thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng

rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã

đƣợc nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá

trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đƣờng truyền tín hiệu

(Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003).

Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và

một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hƣởng bởi các cơ chế khác (Hình 1.7).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)

Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi

khuẩn ở các mức độ khác nhau nhƣ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của

màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy

các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần

cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ

chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ

màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng

điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và

ctv, 2008) cụ thể ở Bảng 1.1.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,

1999)

Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế

Catechol Phá vỡ màng sinh chất Phenol đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào

Phenolic acid Cinnamic acid ?

Quinone Hypericin

Liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, làm bất hoạt enzyme

Flavonoid Chrysin Liên kết bám dính

Tạo phức hợp với thành tế bào

Flavone Khử hoạt tính enzyme

Phenolic Abyssinone

Ức chế phiên mã ngƣợc HIV

Flavonol ?

Bám dính Protein

Bám dính Adhesin

Ức chếenzyme

Tannin Ellagitannin Phá vỡ màng sinh chất

Tạo phức hợp với thành tế bào

Phá vỡ vách tế bào

Đồ án tốt nghiệp

Tạo phức kim loại-ion

Coumarin Warfarin Tƣơng tác với DNA nhân thực (hoạt tính kháng vius)

Terpenoid Phá vỡ vách tế bào - Capsaicin Tinh dầu

Berberine - Alkaloid Xen vào thành tế bào hoặc DNA Piperine

Khóa sự kết hợp của virus hoặc hấp phụ Mannose- specific Lectin

agglutinin Polypeptide

Falxatin Hình thành cầu Disulfide

- ?

Polyacetylen 8s-heptadeca- 2(Z),9(Z)- diene-4,6- diyne-1,8-diol

1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật

1.2.3.1. Hợp chất phenolic

Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là

sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm

sulfhydryl hoặc thông qua sự tƣơng tác không đặc hiệu của các chất này với protein.

Quinone

Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất

màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trƣng cao.

Đồ án tốt nghiệp

Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein,

thƣờng dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng kháng

khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào,

polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền

không thể sử dụng đƣợc cho các vi sinh vật.

Ngƣời ta nhận thấy rằng anthraquinone đƣợc lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ

Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium

pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với

Pseudomonas pseudomalliae.Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng

chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và

ctv, 2010).

Flavonoid

Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và

có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của

flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế

bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho

thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo

càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

Catechin là những hợp chất flavonoid đƣợc nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt

trong trà xanh oolong. Qua những nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy trà xanh có hoạt tính

kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella spp., và

các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế

enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S.mutans, cơ chế tác dụng cũng là do khả

năng tạo phức nhƣ đƣợc mô tả ở phần quinone. Hoạt động nghiên cứu gần đây đƣợc

tiến hành trên cơ thể chuột. khi chuột đƣợc cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0,1%

catechine có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của chuột do S.mutans gây ra

giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

Đồ án tốt nghiệp

Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng

ức chế virus (RSV). Ngƣời ta đã tìm ra hoạt tính và phƣơng thức hoạt động của

quercetin, naringin, hesperetin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus type

1 (HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ

hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phƣơng thức khác nhau.

Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chếsự lây

nhiễm nhƣng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV-1, quercetin là

chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm cácloại bệnh do vi sinh vật gây ra.

Ngƣời ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hƣởng rất

quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng.

Tannin

Một trong những tính chất rất đặc trƣng của tannin là tạo phức với các protein

thông qua các liên kết không đặc hiệu nhƣ liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị.

Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các

protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide…

Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông đƣa

ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này,

tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng

khuẩn của tannin đƣợc tăng cƣờng bởi tia cực tím (UV) ởmức ánh sáng kích hoạt bƣớc

sóng khoảng 320 đến 400nm.Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng tannin

có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngƣợc quá trình phiên mã DNA của virus.

1.2.3.2. Nhóm alkaloid

Solamargine

Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và

Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây

bệnh tiêu chảy. Thƣờng có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum) và các

Đồ án tốt nghiệp

alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải

HIV.

Berberine

Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng,

hoàng bá, hoàng liên… có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp.,

Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần

đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều vi

khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số

nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh.

Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do

berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chínhđiều này

mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này.

Nhóm terpenoid và tinh dầu

Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và

động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh

dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế đƣợc vi khuẩn. Đồng thời,

các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế đƣợc

HIV. Cơ chế tác động của tecpen chƣa đƣợc khẳng định rõ ràng, nhƣng đƣợc suy đoán

là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic.

Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu

thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogene. Theo Mendoza, việc tăng

nhóm ƣa nƣớc (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng

khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện

diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria

monocytogenes. Dầu húng quế, một thảo dƣợc đƣợc thƣơng mại hóa, đƣợc xác định là

hiệu quả kháng khuẩn tƣơng đƣơng với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tôn

Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

Đồ án tốt nghiệp

1.3. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh

1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

Đặc điểm hình thái

E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau

trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp

(ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm).

Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di

động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012).

Trực khuẩn E.coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 – 7,4 ; phát triển đƣợc ở pH

= 5,5 – 8,0 (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 1997).

Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E.coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để

lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi

khuẩn lắng xuống đáy ống.

Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng,

không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm.

Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi

Khả năng gây bệnh

E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu

hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân

Đồ án tốt nghiệp

chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm

màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ

dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong

bỏng.

Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên

ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập

vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu

quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp

hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hải Hòa, 2012).

E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải

cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ

mới gây chết đƣợc súc vật.

1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

Đặc điểm hình thái

Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thƣớc trung bình 3,0 x 0,5

µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có khả năng di

động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005).

Là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 – 9 , nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2.

Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trƣờng

đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có

màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).

Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong

hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp.

Khả năng gây bệnh

Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay

còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy, co thắt dạ

dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nƣớc (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có thể tiến triển

từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thƣờng kéo dài trong vòng từ 4 –

7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và

gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013).

Salmonella spp. còn gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S.typhii gây thƣơng tổn

mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt

kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạch… Các bệnh khác (không phải thƣơng hàn)

thƣờng là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S.typhimurium,

S.enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có

thể gây nên các tổn thƣơng ở ngoài đƣờng tiêu hóa nhƣ viêm màng não, thể nhiễm

trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi...

Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể

bệnh: bệnh thƣơng hàn, phó thƣơng hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc,

S.choleraesuis chủng Kunzendorf và S.typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó

thƣơng hàn cho heo, S.enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thƣơng hàn

Đồ án tốt nghiệp

cho bò, bê, S.abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S.gallinarum – pullorum gây

bệnh thƣơng hàn cho gà (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).

1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.

Đặc điểm hình thái

Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đƣờng ruột) là trực khuẩn gram

âm, nhỏ, dài với kích thƣớc 0.5-0.6 x 1 – 3 µm, không sinh bào tử, không di động,

thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhƣng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều

kiện lý hóa khắc nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl

hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử

trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur.

- Trong môi trƣờng lỏng, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục

đều môi trƣờng.

- Trên môi trƣờng đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đƣờng kính khoảng 1mm,

tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều.

Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp.

Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn Shigella spp. thƣờng chỉ giới hạn ở đƣờng tiêu hóa. Chỉ cần số lƣợng

nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp biểu mô

Đồ án tốt nghiệp

niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết.

Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ngày và

kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thƣờng

kéo dài dƣới 7 ngày (Nguyễn Văn Minh Hoàng, 2013).

Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết

mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết,... theo

Nguyễn Đức Hiền (2013).

1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp.

Đặc điểm hình thái

Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dƣơng, có kích thƣớc ngắn (0,4 – 0,5 x

0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 200C chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhƣng sự di dộng không quan sát đƣợc ở 370C. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có thể sinh trƣởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 450C (tối ƣu là 30 – 360C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng có thể mọc ở

pH 9,6, nhƣng đạt điều kiện tối ƣu ở pH hơi kiềm hoặc môi trƣờng trung tính (Nguyễn

Hữu Liêm, 2013).

Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp.

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng gây bệnh

Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở ngƣời với các triệu chứng rất nguy

hiểm và có tỷ lệ tử cong cao. Ngƣời nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ

nhƣ sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L.monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở

trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô cấy ghép và có hệ

miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi ngƣời mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu

chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống nhƣ bị cảm cúm nhƣng bào thai và thai

nhi sẽ bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ

sinh hay nhiễm trùng.

Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp .tác động chuyên biệt

trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ viêm não, viêm màng não, nhiễm

trùng máu, sảy thai, đẻ non.

1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

Đặc điểm hình thái

Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn

Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thƣớc 0,3 –

0,5 x 1,4 – 2,6 µm.Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên

mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là

vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trƣờng bổ sung muối (NaCl) và không

sinh H2S.

Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp.

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng gây bệnh

Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm

sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ

dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài phân lỏng có

mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu

không điều trị kịp thời.

Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày,

đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013).

Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã đƣợc công bố là tác nhân gây

bệnh nghiêm trọng ở một số đối tƣợng thủy sản (Austin & Austin 1993).Một số bệnh ở

thủy sản do Vibrio spp. gây ra nhƣ sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết

lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh khác nhƣ: gây

chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đƣờng ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp

xác…(Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).

1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp.

Đặc điểm hình thái

Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình thẳng, hai

đầu tròn, dài 1 – 5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm mao đơn

cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn.

Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ phát triển tối ƣu ở 370C, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trƣờng đặc,

thƣờng có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù

xì, lồi.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas

Khả năng gây bệnh

Pseudomonas spp. gây bệnh cho ngƣời: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có

điều kiện nhƣ khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi

dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết

thƣơng hở,…

Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi,

chúng gây bệnh toàn thân nhƣ nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc

nhiễm trùng đƣờng tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não,

viêm tủy xƣơng…

Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm

vào màng bụng chuột 0,1 – 0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ,

những con chuột sống dần dần đƣợc hình thành những ổ mủ.

1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp.

Đặc điểm hình thái

Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn gram

dƣơng thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đƣờng kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 30 – 350C.

Đồ án tốt nghiệp

Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trƣờng, không chịu

đƣợc sự thành trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. Không sinh độc tố.

(Dƣơng Văn Sĩ, 2010).

Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp.

Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thƣờng của

ngƣời, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ

thể ngƣời khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu

dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thƣờng gây nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, gây

nhiễm trùng vết thƣơng (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn

huyết.

1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus

Đặc điểm hình thái

Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ

lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay

thành từng chuỗingắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí

hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả

Đồ án tốt nghiệp

năngsinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C).

Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Khả năng gây bệnh

Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng

(Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây

bệnh. Staphylococcus aureus cƣ trú trên ngƣời và động vật, có trong sữa bò bị bệnh,

thịt heo tƣơi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất.

Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc

(khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn nhƣ tổ chức lympho,

biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra Staphylococcus aureus

còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng nhƣ: nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết

thƣơng hậu phẩu, tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng.

Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ

cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian

2.1.1. Địa điểm

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực

phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM.

2.1.2. Thời gian

Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn mẫu

Mẫu cây Bồ công anh (cành, lá) đƣợc thu ở vƣờn trồng tại tỉnh Thái Bình.

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn đƣợc cung

cấp bởi Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu

Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm:

- Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7.

- Nhóm vi khuẩn Salmonella: S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, S.dublin.

- Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri.

- Nhóm vi khuẩn Vibrio: V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi,

V.cholerae.

- Nhóm vi khuẩn Listeria: L.monocytogenes, L.innocua.

- Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa.

2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng

Môi trường nuôi cấy và tăng sinh vi khuẩn

- Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).

- Môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).

Hóa chất

Đồ án tốt nghiệp

- H2SO4 đậm đặc, HCl đậm đặc, chloroform.

- Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol.

- Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium.

- NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%.

- Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff,

Hager, Wagner.

- Hồ tinh bột, KNO3/ KI 0,001N

- NH4OH, NH4OH 10%

- DPPH

Dung môi

- Ethanol 70 %, 96% (Việt Nam).

- Methanol 85%.

- Nƣớc cất.

- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc).

2.2.4. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ

- Đĩa petri - Ống trụ kim loại (d= 6 mm)

- Ống nghiệm lớn, nhỏ - Thƣớc đo

- Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không

- Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 thấm nƣớc

ml - Đũa thuỷ tinh

- Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ

- Ống ly tâm ependoff 2 ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl

- Bình môi trƣờng 250 ml, 500 ml, - Eppendorf

1000 ml - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao

- Que cấy trang chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp

- Đèn cồn gấp, muỗng, dao, thun,...

Đồ án tốt nghiệp

Thiết bị

- Cân phân tích (Orbital

- Autoclave (Huxky Đài Loan) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert Germany)

mermany) - Bếp từ (Billy – England)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy nƣớc cất (Branstead USA)

- Máy cô cách thủy - Thiết bị cô quay chân không.

- Máy đo UV – VIS (Hach) - Tủ an toàn sinh học (Biosafety

- Tủ hút (Fumehood) cabinet)

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Mẫu bồ công anh đƣợc thu một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá mang đi rửa

sạch và sấy ở 400C đến khi có đƣợc khối lƣợng không đổi.

Mẫu sau khi đƣợc sấy khô tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lƣợng

bột mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói trong túi nhựa và lƣu trữ trong một bình kín hơi

dùng để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm.

2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật

Mẫu bồ công anh đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp ngâm kiệt ở nhiệt độ thƣờng

và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết

bằng các thiết bị cô thích hợp.

Nguyên tắc: sử dụng phƣơng pháp ngâm kiệt, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong

lƣợng lớn dung môi ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan

vào dung môi.

Cách tiến hành: ngâm một lƣợng bột mẫu vào lƣợng lớn dung môi (tỷ lệ 1:20

(w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc ngâm trong khoảng 24h,

thỉnh thoảng đƣợc lắc đều sau đó đem đi lọc, ép bã thu dịch chiết. Tiếp tục cho thêm

lƣợng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi

dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết đƣợc cô đặc, thu hồi cao bằng

Đồ án tốt nghiệp

phƣơng pháp cô cách thủy ở 70oC (đối với dung môi nƣớc). Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể

giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá

trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy

các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để

khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và

làm tan nhanh nhƣ glycerol.

Cách tiến hành: Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích

hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu

cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007).

2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị

Nhằm hoạt hoá các vi khuẩn đƣợc giữ giống phát triển lại bình thƣờng vì chúng có

thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.

Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh

dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh

dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật

mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa

vi sinh vật và môi trƣờng.

Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn

chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng

cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB trong điều kiện

vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).

Đồ án tốt nghiệp

Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD ở bƣớc

sóng 600nm.

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (cfu/ml)

2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai

trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ

thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật.

Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp

vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi sinh vật trong mẫu.

Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần

thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).

Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu

Đồ án tốt nghiệp

2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp

khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phƣơng pháp của

Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều

kiện của phòng thí nghiệm.

Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác

động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi

khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó,

đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng

ức chế (mm).

Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi

trƣờng lỏng TSB, lắc qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng

đƣờng kính 6 mm.

Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lƣợng cao chiết trong Dimethyl

Sulfoxide (DMSO) 1% theo nồng độ yêu cầu 200 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao

chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao đƣợc khuếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370C

trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm)

trên đĩa thạch. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các

phản ứng hóa học theo các phƣơng pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã đƣợc

chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lƣơng Văn Tiến và ctv, 2015).

Cách tiến hành: Cao chiết đƣợc đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành

lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần

hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trƣng.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.7.1. Định tính carbohydrate

Thử nghiệm Molisch: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2 –

3 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và

đọc kết quả. Kết quả đƣợc xem là dƣơng tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím.

Thử nghiệm Fehling: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lƣợt 0,5

ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả.

Kết quả dƣơng tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O.

Thử nghiệm Barfoed: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml

thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết

quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013).

2.3.7.2. Định tính alkaloids

Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt

thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi quan sát đƣợc kết tủa màu

trắng đục tạo thành.

Thử nghiệm Dragendorff: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài

giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa

màu vàng cam.

Thử nghiệm Hager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml

thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng.

Thử nghiệm Wagner: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 1 ml

thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi hình thành kết tủa

màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013).

2.3.7.3. Định tính saponin

Thử nghiệm tạo bọt: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2

ml nƣớc cất vào lắc mạnh. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn

định (Abba và ctv, 2009).

2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Legal: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml

pyridine hoặc 0,5 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 2 – 3 giọt NaOH 10% vào và

đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.

Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5

ml acid acetic glacial và 0,5 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 0,5 ml H2SO4 đậm đặc vào

và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic

(Yadav và ctv, 2013)

2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside

Thử nghiệm Bontrager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml

dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, bổ

sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống nghiệm

khác, tiếp tục thêm 1 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dƣơng

tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009).

2.3.7.6. Định tính flavonoid

Thử nghiệm Alkaline reagent: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho

vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy

ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối

chứng làm tƣơng tự, thay NaOH 10% thành nƣớc cất). Kết quả dƣơng tính nếu xuất

hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có

thực hiện ống đối chứng dƣơng thay NaOH thành nƣớc cất.

Thử nghiệm Shinoda: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột

Magnesium vào, cho từ từ vài giọt HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó

thêm 3 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi mẫu có xuất hiện

cam, hồng, đỏ đến tím,..

Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó

thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi

ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012).

Đồ án tốt nghiệp

2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol

Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào

1.5 ml chì acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa

trắng trong ống nghiệm.

Thử nghiệm Gelatin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt

gelatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trắng.

(Mamta và ctv, 2012).

2.3.7.8. Định tính tannin

Thử nghiệm ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1

ml NaCl 10%, cho 2 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng

tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh (Abba và ctv, 2009).

Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1

ml NaCl 10%, cho 2 giọt chì acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi

ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu vàng (Mamta và ctv, 2012).

2.3.7.9. Định tính steroid

Thử nghiệm Salkowski: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 1

ml chloroform và nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2

lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: ở lớp

dƣới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid.

Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm

thêm 1 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi

đọc kết quả. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: Xuất hiện vòng màu nâu

ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là

triterpenoid (Mamta và ctv, 2012)

2.3.7.10. Định tính amino acid

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho

vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng

tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013).

2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH

Nguyên tắc: Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl) bằng cách cho hydrogen sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác

định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bƣớc sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm.

Cách tiến hành: Bổ sung 100l DPPH (6mM) và 2800l methanol vào mỗi ống

nghiệm đã chứa 100l mẫu cao chiết tại các nồng độ khác nhau (0-1000g/ml). Ủ 30

phút trong điều kiện không có ánh sáng, sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại

bƣớc sóng 517nm. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của

mẫu. Chứng dƣơng trong thí nghiệm là acid ascorbic (3 mg/ml), chứng âm là nƣớc cất.

Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa đƣợc xác định theo công thức sau:

Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = x 100

Trong đó, ODC : là giá trị mật độ quang OD của đối chứng âm;

ODm : là giá trị mật độ quang OD của mẫu thử.

2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học

2.3.9.1. Định lượng vitamin C

Nguyên tắc: Acid ascorbic là một hợp chất không no có chứa nhóm endiol dễ bị

oxy hóa khử thuận nghịch, bị phá hủy nhanh dƣới tác dụng của các chất oxy hóa và bền

trong môi trƣờng acid.

Cách tiến hành: Cân 10g lá cây bồ công anh, nghiền nhỏ trong dung dịch HCl

1%. Chuyển dịch vào bình định mức 100ml, trích ly và định mức đến vạch bằng dung

dịch HCl 1%. Lắc trộn đều và lọc, ta có dung dịch phân tích.

Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức cho vào erlen, thêm 5 giọt hồ tinh bột và

đem định phân bằng KIO3/KI 0,001N cho tới khi xuất hiện màu xanh.

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành song song mẫu kiểm chứng thay dịch chiết vitamin C bằng dung dịch

HCl 1%.

Tính kết quả: Hàm lƣợng vitamin C trong mẫu thí nghiệm đƣợc tính bằng công

thức:

( )

Trong đó:

X: hàm lƣợng vitamin C, mg%

a là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân dịch chiết vitamin C

b là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân mẫu kiểm chứng

100: thể tích bình định mức

0.088: số mg acid ascorbic tƣơng ứng với 1ml dung dịch KIO3/KI 0,001N

m : là khối lƣợng mẫu nguyên liệu, g

2.3.9.2. Định lương Alkaloid

Nguyên tắc: Định lƣợng alkaloid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của

Harbone (1973). Tách alkaloid ra khỏi nguồn nguyên liệu, do có tính kiềm nên trong

thực vật alkaloid thƣờng tồn tại ở dạng muối và acid hữu cơ. Để chiết rút các alkaloid

trong nguyên liệu thƣờng sử dụng các dung dịch đã đƣợc acid hóa. Sau đó làm bay hơi

một phần dung môi, muối alkaloid trong môi trƣờng acid tiếp tục đƣợc trích ly bằng

dung môi hữu cơ, làm bay hơi dung môi thu đƣợc alkaloid.

Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 40ml acid acetic 10% và để yên trong 4 giờ sau đó cô cách thủy ở 700C đến khi còn ¼ thể

tích.

Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc vào cho đến khi tạo tủa. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng

NH4OH 10% rồi đem đi sấy đến khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính toán

hàm lƣợng alkaloid nhƣ sau:

( )

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó, X: Hàm lƣợng alkaloid có trong mẫu (%)

mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g)

ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu alkaloid (g)

m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g)

2.3.9.3. Định lượng Flavonoid

Nguyên tắc: Định lƣợng flavonoid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của Bohm

và Kocipai – Abyazan (1994) (Mir và ctv, 2013). Chiết xuất và tinh chế thành phần

flavonoid trong dƣợc liệu. Ứng dụng đối với nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít

tạp chất. Ƣu điểm là thực hiện nhanh, để thực hiện tuy nhiên sai số mắc phải lớn.

Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 25ml

dung dịch methanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy lắc 150vòng/phút trong

1 giờ. Lọc thu dịch, sấy đến khi khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính hàm

lƣợng flavonoid nhƣ sau:

( )

Trong đó, X: Hàm lƣợng flavonoid có trong mẫu (%)

mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g)

ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu flavonoid (g)

m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g)

2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm

SAS. với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phƣơng sai One-way

ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê.

2.4. Bố trí thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu Bồ công anh

Xử lý mẫu

Tách chiết và thu hồi cao

Cao chiết nƣớc Bồ công anh

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao

Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao

Định lƣợng một số thành phần của cao

Đánh giá kết quả

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất

thu hồi cao chiết từ Bồ công anh

2.4.1.1. Sơ đồ thí nghiệm

Mẫu bồ công anh

Xử lý mẫu: sấy khô, xay nhuyễn

Ngâm với nƣớc (1:20) (w/v)

Dịch lọc Bã

Cô cách thủy 70oC

Đánh giá hiệu suất thu hồi cao

Cao chiết

Bảo quản lạnh 40C

Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây bồ công anh

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1.2. Thuyết minh quy trình

Bồ công anh sau khi đƣợc thu nhận tiến hành xử lý mẫu cây. Trƣớc tiên cây đƣợc rửa sạch và đem đi sấy ở 400C đến khối lƣợng không đổi, sau khi khô đem xay

nhuyễn.

Hình 2.4. Mẫu Bồ công anh sau khi sấy khô

Tiến hành ngâm mẫu với dung môi nƣớc cất theo tỉ lệ 1:20 (w/v). Mẫu đƣợc ngâm

với lƣợng lớn nƣớc cất chứa trong erlen thủy tinh. Cách 4 giờ, tiến hành lọc chân

không thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục đƣợc ngâm và lọc với lƣợng nƣớc cất

nhƣ lần đầu cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cô cách thủy ở 700C để thu nhận cao chiết.

Xác định hiệu suất thu hồi cao:

Lƣợng cao sau khi đƣợc cô, đem đi cân để xác định hiệu suất thu hồi cao so với

khối lƣợng bột mẫu ban đầu.

(%)

Hiệu suất thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau:

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó

H: hiệu suất cao thu đƣợc (%)

m1: khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g)

m0: khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g)

m: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g)

Sau khi xác định hiệu suất thu hồi các loại cao thu hồi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí

nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần.

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ

công anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh.

2.4.2.1. Sơ đồ thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Vi sinh vật chỉ thị

Tăng sinh trong

môi trƣờng TSB

Môi trƣờng TSA

Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ)

Hấp tiệt trùng 1210C – 1 atm trong 15 phút

Đo OD600nm Đổ đĩa

Cao chiết nƣớc

Hút 100 µl dịch vi khuẩn Pha loãng về 106 cfu/ml

Cấy trang

Hòa tan DMSO 1% Đục lỗ (d= 6 mm)

Nhỏ dịch

Nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml

Ủ 370C/24 giờ

Đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn

Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.2. Thuyết minh quy trình

Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc Bồ công anh bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch.

Các chủng vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB

(riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120

vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo

OD ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi

khuẩn đã đƣợc pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các

chủng Vibrio spp. môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều

dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi

khuẩn tƣơng ứng. Dùng que đục đã khử trùng có đƣờng kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6

giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa

1cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa.

Cao chiết đƣợc hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml.

Hút 100 µl cao chiết ở mỗi nồng độ khảo sát cho vào các giếng. Sau khi hoàn thành các

đĩa petri đƣợc để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 - 24h và

đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thông qua vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị.

Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 µg/ml với chủng Vibro spp. và 500 µg/ml với

các chủng còn lại.

Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây

Bồ công anh.

2.4.3.1. Sơ đồ thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu cao chiết nƣớc Mẫu acid ascorbic Mẫu trắng

100µl DPPH + 2800µl methanol + 100µl mẫu

Ủ tối trong 30 phút

Đo OD 517nm

Hình 2.6. Quy trình khảo sát kháng oxy hóa của cao chiết

2.4.3.2. Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị mẫu:

Đối với mẫu cao chiết: cao chiết đƣợc hòa tan bằng DMSO theo các nồng độ 1000

µg/ml; 800 µg/ml; 600 µg/ml; 400 µg/ml; 200 µg/ml; 100 µg/ml.

Đối với mẫu acid ascorbic: pha loãng bằng DMSO nồng độ 3mg/ml

Đối với mẫu trắng: sử dụng methanol 80%.

Hút 100µl mẫu vào các ống nghiệm, sau đó, bổ sung thêm 2800µl methanol và

100µl DPPH. Sau đó đem ống nghiệm đi ủ tối trong vòng 30 phút và đo mật độ quang

OD ở bƣớc sóng 517nm và đánh giá tỉ lệ kháng oxy hóa theo 2.3.8.

Mỗi mẫu với các nồng độ đƣợc lặp lại thí nghiệm 3 lần.

2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết

nƣớc từ cây Bồ công anh.

2.4.4.1. Sơ đồ thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

Hòa tan trong dung dịch DMSO 1%

Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10%

Lọc Lọc

Phân tích thành phần hoá học

Dịch trong Dịch trong

Steroid Alkaloid Saponin Phenolic Cardiac glycoside

Flavonoid Amino acid Carbohydrate Tannin Athraquinone glycoside

Hình 2.7. Sơ đồ định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc

Đồ án tốt nghiệp

2.4.4.2. Thuyết minh quy trình

a. Chuẩn bị mẫu

• Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao chiết đƣợc hòa tan trong dung dịch H2SO4

10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần

dịch trong để tiến hành các thử nghiệm.

• Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao đƣợc hòa trong dung dịch DMSO 1% cho

đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, lọc dung dịch cao qua giấy lọc và thu dịch trong để tiến

hành các thử nghiệm.

b. Xác định sự hiện diện của một số thành phần hóa học trong cao chiết

- Định tính thành phần carbohydrate (Thử nghiệm Molisch, Fehling, Barfoed )

- Định tính thành phần saponin (Thử nghiệm tạo bọt)

- Định tính thành phần alkaloid (Thử nghiệm Mayer, Dragendroff, Hager,

Wagner )

- Định tính thành phần cardiac glycoside (Thử nghiệm Legal, Keller Killiani)

- Định tính thành phần anthraquinone glycoside (Thử nghiệm Bontrager)

- Định tính thành phần flavonoid (Thử nghiệm Alkaline, Shinoda, Ferric

chloride)

- Định tính hợp chất phenolic (Thử nghiệm Lead acetate, Gelatin)

- Định tính thành phần tannin (Thử nghiệm Ferric chloride, Lead acetate)

- Định tính thành phần steroid (Thử nghiệm Salkowski, Libermann Burchard)

- Định tính thành phần amino acid (Thử nghiệm Ninhydrin)

2.4.5. Thí nghiệm 5: Định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ

cây Bồ công anh

2.4.5.1. Sơ đồ thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu cao chiết nƣớc

40ml acid acetic 10%

25ml Methanol 80%, nhiệt độ phòng Nghiền nhỏ trong HCl 1%

Lắc, 1 giờ Để yên 4h Định mức đến 100ml

Lọc, thu dịch Lắc đều và lọc Cô cách thủy 700C đến ¼ thể tích

Sấy Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc Hút 10ml dung dịch vào erlen

Lọc thu tủa Cân khối lƣợng Thêm hồ tinh bột

Rửa tủa bằng NH4OH 10%

Tính hàm lƣợng flavonoid

Định phân bằng phƣơng pháp chuẩn độ Sấy

Cân khối lƣợng

Tính hàm lƣợng vitamin C

Tính hàm lƣợng alkaloid

Hình 2.8. Sơ đồ định lƣợng vitamin C, alkaloid và flavonoid

Đồ án tốt nghiệp

2.4.5.2. Thuyết minh quy trình

a. Định lƣợng vitamin C

Cân 10g lá cây bồ công anh, nghiền nhỏ trong dung dịch HCl 1%. Chuyển dịch vào

bình định mức 100ml, trích ly và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 1%. Lắc trộn

đều và lọc, ta có dung dịch phân tích.

Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức cho vào erlen, thêm 5 giọt hồ tinh bột và

đem định phân bằng KIO3/KI 0,001N cho tới khi xuất hiện màu xanh.

Tiến hành song song mẫu kiểm chứng thay dịch chiết vitamin C bằng dung dịch

HCl 1%. Tính kết quả hàm lƣợng vitamin C theo công thức ở mục 2.3.9.1.

Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

b. Định lƣợng Flavonoid

Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 25ml dung dịch

methanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy lắc 150 vòng/phút trong 1 giờ.

Lọc thu dịch, sấy đến khi khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính kết quả

theo công thức ở mục 2.3.9.2.

c. Định lƣợng Alkaloid

Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 40ml acid acetic 10%

và để yên trong 4 giờ sau đó cô cách thủy ở 700C đến khi còn ¼ thể tích.

Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc vào cho đến khi tạo tủa. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng

NH4OH 10% rồi đem đi sấy đến khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính kết quả

theo công thức ở mục 2.3.9.3.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc

Mẫu bồ công anh sau khi đƣợc xử lý, tiến hành tách chiết và thu hồi cao với dung

môi nƣớc. Để khảo sát sự ảnh hƣởng của loại dung môi tách chiết đến quá trình thu

nhận cao chiết từ bồ công anh thì cần xác định hiệu suất thu hồi cao.

Hiệu quả chiết cao của dung môi phụ thuộc vào độ phân cực và khả năng khuếch

tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu (Trần Thị Ngọc Thanh, 2012).

Dung môi tách chiết có ảnh rất lớn đến hiệu suất quá trình tách chiết, thu hồi cao cũng

nhƣ hoạt tính sinh học. Mẫu bồ công anh đƣợc tách chiết bằng dung môi nƣớc cho hiệu

suất thu hồi cao chiết là 12%

Việc sử dụng các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực là do các dung

môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất có trong thực vật nhƣ các glycosides, các

muối của alkaloids, saponins hay các hợp chất polyphenol (flavonoids, tannin,..),..

Ngoài ra, khả năng bốc hơi trong quá trình cô mẫu cũng nhanh hơn so với các dung

môi không phân cực. Việc sử dụng dung môi nƣớc trong quá trình tách chiết an toàn

hơn so với các dung môi không phân cực đồng thời phù hợp với cách dân gian sử

dụng.

Kết quả này cho thấy nƣớc là dung môi có thể sử dụng để tách chiết cao từ bồ công

anh, tuy nhiên cần tiến hành thêm các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học để có thể

đánh giá đƣợc nƣớc là dung môi tốt hay không?

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

trên các chủng vi khuẩn gây bệnh

3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn Escherichia coli

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli

Dựa vào kết quả thí nghiệm trên hình 3.1 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh (nồng độ 200 mg/ml) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 3/4 chủng vi khuẩn E.

coli khảo sát là E.0208, E.coli và ETEC với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ

9,7mm đến 10mm. Riêng cao chiết nƣớc ở nồng độ 100 mg/ml không thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn.

Cao chiết nƣớc ở nồng độ 200 mg/ml cho khả năng ức chế tốt đối với chủng E.coli

và E.0208 với đƣờng kính trung bình 9,8 – 10mm và có hoạt tính kháng khuẩn gần

tƣơng đƣơng với đối chứng Ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phƣơng diện thống kê (p >

0,05). Nhƣng đối với chủng ETEC, lại cho khả năng kháng khuẩn thấp hơn với đƣờng

kính kháng khuẩn là 9,7mm.

Theo nghiên cứu của Bhat và Al-Daihan (2014), hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết

nƣớc của cây Lactuca sativa đối với E.coli cho kết quả vòng ức chế là 11 ± 0,23 mm.

Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc

từ Bồ công anh đối với E.coli là 10 ± 0,87 mm.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn Listeria Spp.

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp.

Kết quả nghiên cứu ở hình 3.2 cho thấy cao chiết nƣớc từ bồ công anh (nồng độ

100 mg/ml, 200 mg/ml) có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn Listeria spp. với đƣờng

kính vòng ức chế từ 8,7 mm đến 9,5 mm. Riêng cao chiết nƣớc ở nồng độ 100 mg/ml

chỉ thể hiện khả năng ức chế đối với chủng vi khuẩn L.innocua.

Đánh giá mức độ ức chế của LiWE ở các nồng độ so với Ciprofloxacin (500

µg/ml) nhận thấy rằng mặc dù LiWE ở nồng độ 200 mg/ml ức chế cả 2 chủng vi khuẩn

L.monocytogenes và L.innocua tuy nhiên mức độ ức chế vẫn thấp hơn Ciprofloxacin 1

cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn Samonella Spp.

Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh ở

nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Salmonella spp. gồm

Đồ án tốt nghiệp

các chủng: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, và S. dublin. Kết quả khảo sát đƣợc

thể hiện ở hình sau:

Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

Dựa vào hình 3.3 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chỉ chỉ ức chế

đƣợc 2/4 chủng vi khuẩn khảo sát là S.enteritidis và S.typhii với đƣờng kính vòng ức

chế trung bình từ 10,5mm đến 11,5 mm, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn thể hiện ở cả

hai nồng độ 100 mg/ml và 200mg/ml.

Bên cạnh đó, cao chiết nƣớc từ bồ công anh ở 2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml

cho khả năng ức chế tốt đối với chủng vi khuẩn S.typhii với đƣờng kính trung bình

11,2 – 11,5 mm và có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng đƣơng với đối chứng Ciprofloxacin

(500 µg/ml) không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p > 0,05).

Theo nghiên cứu của Francis Mugweru Gitau và các cộng sự (2016) hoạt tính

kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Senna spectabilis đối với chủng S.typhii có

vòng ức chế là 9,6 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung

bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng S.typhii là 11,5 mm.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn Shigella Spp.

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp.

Dựa vào kết quả ở hình 3.4 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chỉ ức

chế đƣợc 2/3 chủng khảo sát là Shi.flexneri và Shi.sonnei với đƣờng kính vòng ức chế

trung bình từ 9,3 – 10,7 mm.

Cao chiết nƣớc cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn khá tốt đối với chủng vi khuẩn

Shi.flexneri nhƣng chỉ ở nồng độ 200 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế trung bình

10,3 mm.

Riêng với chủng vi khuẩn Shi.sonnei, chúng khá nhạy cảm với kháng sinh

Ciprofloxacin ở nồng độ 0,5 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế lên đến 33 mm. Đồng

thời, Shi.sonnei cũng bị ức chế ở cả 2 nồng độ cao chiết 100 mg/ml và 200mg/ml với

đƣờng kính trung bình từ 9,3 mm đến 10,7 mm.

Theo nghiên cứu của F.M Gitau và các cộng sự (2016) hoạt tính kháng khuẩn từ

cao chiết nƣớc của cây Maytenus putterlickoides đối với chủng Shi.flexneri có vòng ức

Đồ án tốt nghiệp

chế là 9,2 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của

cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng Shi.flexneri là 10,3 mm.

3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

Dựa vào hình 3.5 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ bồ công anh thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn khá tốt, ức chế đƣợc 4/4 chủng vi khuẩn nhóm Vibrio spp. với đƣờng

kính trung bình từ 8,3 mm đến 11,2 mm.

Ở 3 chủng vi khuẩn V. alginolyticus, V.cholera và V.harveyi cao chiết nƣớc chỉ thể

hiện hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml. Chủng vi khuẩn V.alginolyticus cho

kết quả kháng khuẩn thấp nhất với đƣờng kính vòng ức chế trung bình là 8,3 mm.

Riêng đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

tốt ở cả 2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ

Đồ án tốt nghiệp

9,7 mm đến 10,2 mm và ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng đƣơng

với đối chứng Ciprofloxacin (0,008mg/ml) về phƣơng diện thống kê (p > 0,05).

Theo nghiên cứu của A.A.Shamsuddin và cộng sự (2013) hoạt tính kháng khuẩn từ

cao chiết nƣớc của cây Avicennia alba đối với chủng V.alginolyticus và

V.parahaemolyticus có vòng ức chế là 8,7 và 9,3 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả

đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng

V.alginolyticus và V.parahaemolyticus là 8,3 và 10,2 mm.

3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với

nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da.

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin

đối với vi khuẩn E. feacalis

Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có phổ

kháng khuẩn hẹp, chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở 1/3 chủng vi khuẩn khảo sát với

nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da với đƣờng kính vòng kháng từ 10,5 mm đến

10,2 mm.

Đồ án tốt nghiệp

Nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở cả

2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml đối với chủng vi khuẩn E. feacalis tuy nhiên mức

độ ức chế vẫn thấp hơn Ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Theo nghiên cứu của Richa Arora và các cộng sự (2012) hoạt tính kháng khuẩn từ

cao chiết nƣớc của cây Hippophae rhamnoides L. (củ cải đƣờng) đối với chủng E.

faecalis có vòng ức chế là 11,3 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng

ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng E. faecalis là 10,5

mm.

3.3. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

đối với 20 vi khuẩn gây bệnh

Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh, kết quả tổng

hợp đo đƣờng kính vòng ức chế đƣợc trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết nƣớc Bồ công anh trên

20 chủng vi khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml 200 mg/ml Ciprofloxacin (µg/ml)

13,2 ± 0,29 E.coli 0157:H7 NA NA

12,3 ± 0,29a E.coli 0208 9,8 ± 0,29b NA

13,2 ± 0,29a E.coli 10 ± 0,87b NA

31,0 ± 0,5a ETEC 9,7 ± 0,29b NA

12,0 ± 0,5a L.innocua 8,7 ± 0,58b 9,3 ± 0,29b

12,2 ± 0,29a L.monocytogenes 9,5 ± 0,5b NA

12,2 ± 0,77 S.dublin NA NA

13 ± 0,5a S.enteritidis 10,5 ± 0,5b 11,5 ± 0,5b

12,5 ± 0,5a S.typhii 11,5 ± 0,5a 11,2 ± 0,76a

Đồ án tốt nghiệp

11,0 ± 0 S.typhimurium NA NA

NA Shi.boydii NA NA

13,2 ± 0,29a Shi.flexneri NA 10,3 ± 0,29b

33 ± 0,5a Shi.sonnei 9,3 ± 0,76b 10,7 ± 0,58b

16,2 ± 0,29a V.alginolyticus NA 8,3 ± 0,58b

13,3 ± 0,58a V.cholerae NA 11,2 ± 0,29b

18,0 ± 0,5a V.harveyi NA 10,8 ± 0,58b

11,3 ± 0,29a V.parahaemolyticus 9,7 ± 0,76b 10,2 ± 0,58ab

12,2 ± 0,58 P.aeruginosa NA NA

12,2 ± 0,29 S.aureus NA NA

12,0 ± 0,5a E.feacalis 10,2 ± 0,29b 10,5 ± 0,5b

Chú thích: NA: non activity.

Dựa vào Bảng 3.1 có thể kết luận rằng cao nƣớc từ Bồ công anh ở nồng độ 100

mg/ml và 200 mg/ml có phổ hoạt động và hoạt tính kháng khuẩn khác nhau trên 6

nhóm vi khuẩn gây bệnh với đƣờng kính vòng ức chế từ 8,3 mm đến 11,5 mm.

Tất cả các kết quả nhận đƣợc trong những thí nghiệm cho thấy rằng: cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh nồng độ 200 mg/ml có khả năng ức chế đƣợc 14/20 chủng vi

khuẩn gây bệnh khảo sát với đƣờng kính vòng kháng từ 8,3 mm – 11,5 mm. Đồng thời,

cao chiết nƣớc ở nồng độ này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở tất cả các nhóm vi

khuẩn Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. và

nhóm gây bệnh cơ hội trên da

3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc Bồ

công anh

Từ kết quả các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cao chiết nƣớc

từ Bồ công anh có khả năng ức chế các loại vi khuẩn. Dựa vào cơ sở trên, tiến hành

Đồ án tốt nghiệp

thực hiện các thử nghiệm để xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học có khả

năng kháng khuẩn trong mẫu cao chiết nƣớc Bồ công anh. Kết quả đƣợc trình bày ở

Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh.

Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả

Molisch +

Fehling ++ Carbohydrate

Barfoed ++

Saponin Foam +

Mayer +

Dragendorff ++ Alkaloid Hager ++

Wagner +

Legal ++ Cardiac glycoside KellerKilliani +

Anthraquinone glycoside Bontrager -

Alkaline +

Shinoda + Flavonoid

Ferric chloride ++

Lead acetate - Phenolic compound Gelatin -

Tannin Ferric chloride Lead acetate + +

Salkowski + Steroid + Libermann Burchard

Amino acid Ninhydrin ++

Chú thích: (+): dƣơng tính, (-): âm tính

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết Bồ công anh từ nƣớc

đƣợc trình bày ở Bảng 3. nhận thấy rằng trong dung môi nƣớc có khả năng tách chiết

đƣợc rất nhiều hợp chất từ cây Bồ công anh bao gồm các hợp chất thông thƣờng và cả

những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thƣờng đƣợc tìm thấy trong

cao chiết nƣớc của cây Bồ công anh thấy có sự hiện diện của hầu hết các nhóm

carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dƣơng tính) nhƣng không

thấy có sự hiện diện của nhóm các hợp chất phenol. Trong cao chiết nƣớc từ Bồ công

anh có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm các

loại hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin và nhóm

steroid.

Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Bồ công anh nói

riêng là do chúng có các thành phần alkaloids, flavonoid, tannin và triterpenoid quyết

định. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy

tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc

DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, hợp chất của flavonoids

có dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất

ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các

dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp

với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp

tiêu diệt vi sinh vật. Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao chiết

nƣớc Bồ công anh có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do có sự hiện diện của các

hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid.

3.5. Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc Bồ công

anh

Từ kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản ta thấy trong Bồ công anh

có sự hiện diện của các chất nhƣ alkaloid, flavonoid….

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của Bồ công anh

Hàm lƣợng (%) Thành phần hóa học n

1,61 ± 0,25 Vitamine C 3

14,67 ± 1,15 Alkaloid 3

42,0 ± 4,0 Flavonoid 3

Lƣợng vitamin C trong bồ công anh (0,16 mg/g) đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

chuẩn độ tƣơng ứng với số lƣợng đƣợc xác định bởi Mueeay và Stratton (0,19 mg/g,

0,12 mg/g, 0,15 mg/g) (MUEEAY và STRATTON). Vitamin C là một chất kích hoạt

enzyme, có thể gia tăng sự hoạt động của một số kim loại, là một chất khử và một chất

chống oxy hóa có khả năng hòa tan nhiều trong nƣớc.

Từ kết quả trên bảng 3.3 có thể thấy cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có hàm lƣợng

flavonoid khá cao. Flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng.

Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ

OH[SUP]•[/SUP], ROO[SUP]•[/SUP] (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung

thƣ, tăng nhanh sự lão hoá…).

3.6. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

a. Kết quả hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C

Hoạt động trung hòa gốc tự do DPPH đƣợc đánh giá dựa trên lƣợng gốc tự do

DPPH còn lại sau khi đã kết hợp với chất kháng oxy hóa. Tỷ lệ giảm của mật độ quang

đo đƣợc ở bƣớc sóng 517 nm khi có và không có chất kháng oxy hóa đƣợc xem nhƣ

nhƣ hiệu suất kháng oxy hóa của mẫu thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.7. Hiệu quả kháng oxy hóa của vitamin C

Dựa vào khả năng kháng oxy hóa của vitamin C để xây dựng đƣờng chuẩn và tính

hàm lƣợng chất kháng oxy hóa có trong cao chiết nƣớc từ Bồ công anh.

b. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

Hình 3.8. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

Đồ án tốt nghiệp

Nhƣ vậy, theo sự tăng dần nồng độ từ 100 µg/ml – 1000 µg/ml, khả năng bắt gốc

tự do DPPH của các cao chiết đều tăng dần. Điều đó chứng tỏ, khả năng kháng oxy hóa

của các cao chiết tăng tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ với tỉ lệ trung bình từ 4,99 –

30,98%. Nồng độ 1mg/ml có hoạt tính kháng oxy cao nhất với tỉ lệ trung bình 30,98%.

Mặc dù khả năng chống oxy hoá của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh thấp hơn so với

acid ascorbic (P <0,05) nhƣng kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng LiWE có hoạt

tính chống oxy hoá.

Phân tích cây bồ công anh (Taraxacum officinale) cho thấy khả năng chống oxy

hoá cao nhất trung bình là 80,664% ức chế dung dịch DPPH, các bộ phận khác của cây

(hoa, lá và thân) có khả năng ức chế dung dịch DPPH khoảng 69% (Paduret và cộng

sự, 2016).

Đánh giá hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo hàm lƣợng vitamin C có trong cao

chiết nƣớc từ Bồ công anh. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4. Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C

Nồng độ (µg/ml) Hàm lƣợng (µg/ml)

1000 13,60 ± 1,99

800 10,88 ± 1,77

600 7,95 ± 1,34

400 6,44 ± 1,75

200 2,95 ± 1,01

100 1,43 ± 1,90

Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa trong LiWE tăng dần tỉ lệ thuận với nồng độ mẫu

khảo sát. Khi so sánh với kết quả hàm lƣợng chất kháng oxy hóa trong cao chiết

ethanol 70% từ Bồ công anh (Đoàn Lê Thảo Trang, 2017) ở nồng độ 100 – 1000 µg/ml

có hàm lƣợng chất kháng oxy hóa tƣơng đƣơng với vitamin C là 20,07 – 34,74 µg/ml

thấy rằng LiWE có hiệu quả kháng oxy hóa thấp hơn, điều này do ảnh hƣởng của dung

Đồ án tốt nghiệp

môi tách chiết đến khả năng tách các chất có hoạt tính kháng oxy hóa, cụ thể là nƣớc

hòa tan ít các chất có hoạt tính kháng oxy hóa hơn so với ethanol 70%.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Từ mẫu cây bồ công anh thực hiện tách chiết để thu hồi cao với dung môi

nƣớc, hiệu suất thu hồi cao đạt 12%

- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh trên

20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết nƣớc

bồ công anh có phổ hoạt động rộng và có khả năng ức chế tất cả các chủng vi

khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời, có hoạt tính kháng khuẩn với đƣờng

kính vòng ức chế từ 8,3 – 11,5 mm.

- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc bồ công anh ở

các nồng độ khác nhau, nồng độ 1000 µg/ml thể hiện tính kháng cao nhất với

tỉ lệ 30,98%. Hàm lƣợng các chất kháng oxy hóa tƣơng đƣơng vitamin C ở

các nồng độ 100 – 1000 µg/ml là 1,43 – 13,60 µg/ml.

- Thử nghiệm xác định thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ bồ công anh

thấy sự hiện diện của các hợp chất: carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac

glycoside, flavonoid, tannin và nhóm steroid.

- Kết quả định lƣợng hàm lƣợng vitamin C đạt 1,61%, flavonoid chiếm 42% và

alkaloid chiếm 14,67%.

4.2. Đề nghị

- Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh ở nhiều loại dung môi

khác nhau để tìm đƣợc loại dung môi tách chiết tốt nhất.

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây bồ công anh với nhiều

vi sinh vật gây bệnh khác.

- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ các loại dung môi khác

nhau.

- Tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của LiWE ở các nồng độ cao hơn

để xác định giá trị EC50

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất

bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội.

Trần Trƣờng Hận (2010). Hợp chất thiên nhiên.

http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4329903

Nguyễn Thị Hằng và ctv (2015). Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của loài

tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe Pentandra (L.) MIQ.).

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012). Phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực

vật, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Hà Nội.

GV Bùi Thi Hải Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc Tố E.coli,

Viện Đại học Mở Hà Nội.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/chuyen-de-doc-to-ecoli-61023/

TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol,

Đại học Y dƣợc TPHCM.

BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh

viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-dac-diem-vi-khuan-shigella-gay-benh-tieu-

chay-cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/

Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate.

http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan1/chuong14/index.html

Phạm Thanh Kỳ (1998). Bài giảng dược liệu – tập II. Nhà xuất bản Trung tâm

thông tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.

Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của

carbohydrate.

http://tailieu.vn/doc/cau-tao-tinh-chat-va-vai-tro-cua-carbohydrate-887289.html

Đồ án tốt nghiệp

Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải

sản đông lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng đại học Công Nghệ TP.HCM.

Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông

tin KH&CN TPHCM.

Phạm Minh Nhựt(2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trƣờng Đại học Công Nghệ

Tp. HCM.

Dƣơng Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis (Enterococcus

faecalis), Chyên đề tốt nghiệp, Trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM.

http://www.zbook.vn/ebook/tim-hieu-ve-vi-khuan-streptococcus-faecalis-

enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh-chieu-

29121/

Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có

bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên

TPHCM.

Lâm Phạm Huệ Tâm (2015). Đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến

hoạt tính kháng khuẩn của cây Medinilla sp. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ

Sinh học, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM.

Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội

Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội

Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013). Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng

sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá luận tốt

nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM.

Đái Thị Xuân Trang và ctv (2015). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy

hóa của cao methanol cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas MERR.).

Lƣơng Quang Anh, Nguyễn Hà Anh (2012). Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa

học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc bồ công anh Việt Nam. Viện Bỏng Quốc gia,

Học viện Quân Y.

Đồ án tốt nghiệp

Đỗ Thị Túy Phƣợng (2007). Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính

kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây Xuân

Hoa (Pseudranthemum palatiferum). Khóa luận tốt nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ

Chí Minh: 20 – 23.

Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Võ Thị Ngọc Diễm và Quách Tú

Huê (2012). Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxy hóa của cao chiết cây

Nhàu (Morindan citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu đường. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần

Thơ: 23b; 115-124.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Ramesa Shafi Bhat and Sooad Al-Daihan (2014), Phytochemical constituents and

antibacterial activity of some green leafy vegetables. King Saud University, 4(3): 189–

193.

A.A.Shamsuddin, M.Najiah, A. Suvik, M.N.Azariyah, B.Y.Kamaruzzaman, A.W.

Effendy and B. Akbar John (2013), Antibacterial Properties of Selected Mangrove

Plants Against Vibrio Species and its Cytotoxicity Against Artemia salina. World

Applied Sciences Journal 25 (2): 333-340.

Mugweru FG, Nyamai DW, Arika MW, Ngugi MP, Gathumbi PK, et al. (2016)

Antimicrobial Activity of Aqueous Extracts of Maytemus putterlickoides, Senna

spectabilis and Olinia usambarensis on Selected Diarrhea-Causing Bacteria. J

Bacteriol Parasitol 7:270. doi: 10.4172/2155-9597.1000270.

Richa Arora, Sunil Mundra, Ashish Yadav, Ravi B.Srivastava and Tsering Stobdan

(2012), Antimicrobial activity of seed, pomace and leaf extracts of sea buckthorn

(Hippophae rhamnoides L.) against foodborne and food spoilage pathogens. African

Journal of Biotechnology Vol. 11(45), pp. 10424-10430.

Dai Thi Xuan Trang, Vo Thi Tu Anh (2016), Antioxidant and antimicrobial

activitiesagainst Enterobacter cloacaeof extracts of Eclipta alba Hassk. Science &

Technology Development, Vol 19, No.T5.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO

CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH ĐỐI VỚI CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY

BỆNH

A.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn

Escherichia coli (d = 6 mm)

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

13,5 E. coli O157:H7 - - - - - - 13 13

12,5 E. coli 0208 - - - 10 10 9,5 12,5 12

13,5 E.coli - - - 9 10,5 10,5 13 13

31,5 ETEC - - - 10 9,5 9,5 30,5 31

A.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn

Listeria spp. (d = 6 mm)

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

12,5 L. innocua 9,5 9,5 11,5 12 9 8 9 9

12,5 - - - 9 L. monocytogenes 10 9,5 12 12

A.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn

Salmonella spp. (d = 6mm)

Đồ án tốt nghiệp

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

13 S. Dublin - - - - - - 12 11,5

12,5 S. enteritidis 11,5 11 12 10,5 10 11 13,5 13

12,5 S. typhii 10,5 12 11 11,5 12 11 13 12

11 S. typhimurium - - - - - - 11 11

A.4. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn

Shigella spp. (d = 6 mm)

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

- Shi. boydii - - - - - - - -

13,5 Shi. flexneri - - - 10,5 10 10,5 13 13

32,5 Shi. sonnei 10 8,5 9,5 11 10 11 33,5 33

A.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (8 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn

Vibrio spp. (d = 6 mm)

Đồ án tốt nghiệp

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

16 V. alginolyticus 9 8 8 16,5 16 - - -

14 V.cholerae - - - 11 11 11,5 13 13

18,5 V. harveyi - - - 11,5 10,5 10,5 17,5 18

11 V. parahaemolyticus 9,5 9 10,5 9,5 10,5 10,5 11,5 11,5

A.6. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh

(nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi

khuẩn gây bệnh cơ hội trên da (d= 6 mm)

Ciproffloxacin 200 mg/ml Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml (500 µg/ml)

P. aeruginosa - - - - - - 12,5 11,5 12,5

12,5 S. aureus - - - - - - 12 12

E. feacalis 10 10,5 10 10,5 10 11 12 11,5 12,5

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT

TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH VỚI

CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH

B.1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn Escherichia coli.

B.1.1. E.coli

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

283.3888889 141.6944444 510.10 <.0001

Model

1.6666667

0.2777778

Error

285.0555556

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

13.1667 3 ND500

10.0000 3 ND200

0.0000 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

B.1.2. ETEC

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

1509.555556

754.777778 6793.00 <.0001

Model

0.666667

0.111111

Error

1510.222222

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

31.0000 3 ND500

9.6667 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.1.3. E.coli 0208

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

255.0555556 127.5277778 2295.50 <.0001

Model

0.3333333

0.0555556

Error

255.3888889

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.3333 3 ND500

9.8333 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp.

B.2.1. L.innocua

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

18.66666667

9.33333333

42.00 0.0003

Model

1.33333333

0.22222222

Error

20.00000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.0000 3 ND500

9.3333 3 ND200

8.6667 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

B.2.2. L.monocytogene

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

245.3888889 122.6944444 1104.25 <.0001

Model

0.6666667

0.1111111

Error

246.0555556

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.1667 3 ND500

9.5000 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

B.3.1. S.enteritidis

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

9.50000000

4.75000000

19.00 0.0025

Model

1.50000000

0.25000000

Error

11.00000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

13.0000 3 ND500

11.5000 3 ND100

10.5000 3 ND200

B.3.2. S.typhii

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

2.88888889

1.44444444

4.00 0.0787

Model

2.16666667

0.36111111

Error

5.05555556

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.5000 3 ND500

11.5000 3 ND200

11.1667 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

B.4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn Shigella spp.

B.4.1. Shi.flexneri

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

288.1666667 144.0833333 2593.50 <.0001

Model

0.3333333

0.0555556

Error

288.5000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

13.1667 3 ND500

10.3333 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.4.2. Shi.sonnei

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

1060.666667

530.333333 1363.71 <.0001

Model

2.333333

0.388889

Error

1063.000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

33.0000 3 ND500

10.6667 3 ND200

9.3333 3 ND100

B.5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

B.5.1. V.algino

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

392.1666667 196.0833333 1411.80 <.0001

Model

0.8333333

0.1388889

Error

393.0000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

16.1667 3 ND0.008

8.3333 3 ND200

0.0000 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

B.5.2. V.cholerae

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

307.1666667 153.5833333 1105.80 <.0001

Model

0.8333333

0.1388889

Error

308.0000000

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

13.3333 3 ND0.008

11.1667 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.5.3. V.harveyi

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

492.7222222 246.3611111 1267.00 <.0001

Model

1.1666667

0.1944444

Error

493.8888889

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

18.0000 3 ND0.008

10.8333 3 ND200

0.0000 3 ND100

B.5.4. V.para

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4.38888889

2.19444444

6.58 0.0307

Model

2.00000000

0.33333333

Error

6.38888889

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

11.3333 3 ND0.008

10.1667 3 ND200

9.6667 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

B.6. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

nƣớc từ Bồ công anh đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da

B.6.1. E.feacalis

Bảng The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

5.72222222

2.86111111

14.71 0.0049

Model

1.16666667

0.19444444

Error

6.88888889

Corrected Total

Bảng The ANOVA Procedure

Tukey's Studentized Range (HSD)

Means with the same letter are not significantly different.

Tukey Grouping Mean N Cao

12.0000 3 ND500

10.5000 3 ND200

10.1667 3 ND100

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C. CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ

C.1. Thuốc thử Molisch

Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml.

C.2. Thuốc thử Fehling

* Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O đƣợc hòa tan hoàn toàn vào nƣớc

cất, sau đó tiếp tục định mức đến 500ml .

* Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào

nƣớc cất và định mức cho đến 500ml.

C.3. Thuốc thử Barfoed

Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml

acid acetic glacial và 1000ml nƣớc cất. Hỗn hợp trên đƣợc mang đi đun và khuấy đến

khi tan hoàn toàn.

C.4.Thuốc thử Mayer:

Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nƣớc cất. Tiếp tục cân 5g KI hòa tan trong

10ml nƣớc cất. Sau đó tiến hành trộn 2 dung dịch trên lại với nhau và định mức bằng

nƣớc cất đến100 ml.

C.5. Thuốc thử Dragendroff: Gồm 2 dung dịch:

-Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid

acetic 20%.

-Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan trong nƣớc cất.

Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nƣớc cất.

C.6. Thuốc thử Hager

Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nƣớc cất, sau đó lọc dung dịch trên và thu

dịch lọc.

C.7. Thuốc thử Wagner

Hòa tan 2g I2 và 6g KI vào nƣớc cất và định mức đến 100ml. Thuốc thử là dung

dịch tan hoàn toàn, tránh sự tiếp xúc ánh sáng.

Đồ án tốt nghiệp

C.8. Natri nitro prusside

Hòa tan1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nƣớc cất.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D. KẾT QUẢ HÌNH ẢNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA

HỌC CỦA CAO CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH.

D.1. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Carbohydrate

A

B

A. Thử nghiệm Molisch B. Thử nghiệm Barfoed

D.2. Kết quả dƣơng tính của thử nghiệm định tính Saponin

Thử nghiệm Foam

Đồ án tốt nghiệp

D.3. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Alkaloids

A B C

A Thử nghiệm Wagner B. Thử nghiệm Hager C. Thử nghiệm Dragendroff

D.4. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Tannin

Thử nghiệm Tannin

Đồ án tốt nghiệp

D.5. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính amino acid

Thử nghiệm Ninhydrin

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC E. KẾT QUẢ HÌNH ẢNH VÒNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH.

A B

A. L.monocytogenes 200 mg/ml B. L.innocua200 mg/ml

C D

C. Shi.sonnei 200 mg/ml D. Shi.sonnei 100 mg/ml

E F

E. V.cholerae 200 mg/ml F. V.alginolyticus 200 mg/ml

Đồ án tốt nghiệp

G H

G. E.feacalis 200 mg/ml H. E.feacalis 100 mg/ml

I J

I. S.typhii 200 mg/ml J. ETEC 200mg/ml