Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN

Bacillus subtilis Natto

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

ThS. PHAN TRUNG HẢI

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ MINH TRANG

MSSV: 1211100022

Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự

hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và ThS. Phan Trung Hải. Các

nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới

bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho

việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác

nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.

Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số

liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích

nguồn gốc.

Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về

nội dung đồ án của mình.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực tập

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được

sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc

trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có

cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập

này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức

thực tiễn bổ ích cho công việc sau này.

Em xin chân thành biết ơn:

- Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học

Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã

cho em có cơ hội được đi thực tập.

- Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo

điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình.

- Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn

thành đồ án này.

Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của:

Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh

Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi

điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành

luận văn này.

Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ,

giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống.

Sinh viên thực tập

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................ i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH ........................................................... vi

MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

1. Tính cấp thiết .................................................................................................. 1

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 2

3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2

4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................... 3

5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 3

6. Kết quả đạt được ............................................................................................. 3

7. Kết cấu đề tài nghiên cứu ............................................................................... 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5

1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto .................................................................. 5

1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto ............................................. 5

1.1.2. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 5

1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 7

1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto...................................................... 7

1.2. Enzyme protease ........................................................................................... 10

1.2.1. Khái niệm về protease ........................................................................... 10

1.2.2. Phân loại ................................................................................................ 11

1.2.3. Nguồn thu nhận ..................................................................................... 12

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis ......... 14

1.4. Ứng dụng của protease .................................................................................. 18

1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease ................................................... 19

Đồ án tốt nghiệp

1.5.1.Trên thế giới ........................................................................................... 19

1.5.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 22

2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm .................................................. 22

2.1.1. Địa điểm ................................................................................................ 22

2.1.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22

2.2. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 22

2.2.1. Nguồn vi sinh vật ................................................................................... 22

2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm .............................................................. 22

2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................. 23

2.3. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 23

2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) ................... 23

2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) ........................... 23 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) ............ 24

2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) ............................... 24

2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 25

2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 25

2.4.2. Phương pháp tăng sinh .......................................................................... 25

2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào .................................................... 25

2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease ............................. 26

2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn .............................................................. 27

2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn ........................... 27

2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease .................................. 27

2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease ........................................................ 30

2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê .................................................................. 30

2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30

2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme

protease cao ..................................................................................................... 30

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus

subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ....... 30

2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme

protease của chủng Bacillus subtilis Natto ..................................................... 31

2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng

Bacillus subtilis Natto ...................................................................................... 32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 33

3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao .......... 33

3.2. Khảo sát hoạt độ protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường

bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ............................................................ 35

3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng

B. subtilis Natto BN2.1 ........................................................................................ 37

3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng

hợp protease ..................................................................................................... 37

3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ........................ 39

3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ..... 41

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng

B.subtilis Natto BN2.1 ......................................................................................... 43

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 45

4.1. Kết luận ......................................................................................................... 45

4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46

iii

PHỤ LỤC

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. candidus Aspergillus candidus

A.oryzae Aspergillus oryzae

B. Bacillus

B. subtilis Bacillus subtilis

BDN Bã đậu nành

CB Cám bắp

CG Cám gạo

CM Cám mì

CFU Colony Foming Unit

DX Đậu xanh

kDa kiloDalton

nKat nanoKatal

OD Optical Density

pI Điểm đẳng điện của protein

P. roquerti Penicillium roqueforti

UI Đơn vị hoạt độ

SPSS Phần mềm xử lý thống kê

(Statistical Package for the Social Science)

TLPT Trọng lượng phân tử

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis ................................... 8

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus

licheniformis N-2 ................................................................................... 15

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng

Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 16

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng

Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 17

Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu ............................................................ 22

Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 28

Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ........................... 29

Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn ........ 31

Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng

B. subtilis Natto ..................................................................................... 34

Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần

nuôi cấy khác nhau ................................................................................. 35

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ

protease ................................................................................................... 38

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ......................... 40

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ....... 41

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease .................. 43

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Sản phẩm Natto ....................................................................................... 6

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto .................................................. 7

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. ................................................... 10

Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease ................................................... 11

Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng

Bacillus subtilis Natto ........................................................................... 33

Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng

B. subtilis Natto. ............................................................................... 34

Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử

dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. ........................................ 36

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ

protease. ............................................................................................ 38

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. ................... 40

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt

độ protease. ....................................................................................... 42

Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. ........... 43

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết

Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là

một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát

triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase,

protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn này đã được sử

dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành,

chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54]... Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto

đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F [45]…

Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và

nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu

hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh... Tuy nhiên, việc

nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa

nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”.

Ý nghĩa đề tài nghiên cứu:

- Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của

Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế

phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam.

- Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease,

giúp đa dạng hóa sản phẩm.

Đồ án tốt nghiệp

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn

được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt

Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu:

- Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme

protease từ vi khuẩn B. subtilis Natto. Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2%

maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với

môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu

được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat. Sau khi tinh chế bằng

phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân

đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat. Đã xác định được phân đoạn này có

khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5].

- Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh

dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27].

- LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi

khuẩn B. subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3%[24].

- Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B.

subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như:

Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza

của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ

phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO…

3. Mục tiêu nghiên cứu

Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme

protease cao từ các chủng nghiên cứu.

Đồ án tốt nghiệp

Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh

tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất.

Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B.

subtilis Natto.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto

khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành

phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy.

Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng

Bacillus subtilis Natto.

5. Phương pháp nghiên cứu

Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử.

Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0.

Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài:

- Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.

- Phương pháp tăng sinh.

- Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc).

- Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease.

- Phương pháp nuôi cấy bán rắn.

- Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn.

- Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson).

- Phương pháp tủa enzyme protease.

6. Kết quả đạt được

Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme

protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và

BN3. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng

sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại. Môi trường nuôi cấy thích

Đồ án tốt nghiệp

hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp. Với các điều kiện ảnh

hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã

đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu

thích hợp nhất là 60%. Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng

Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7.

7. Kết cấu đề tài nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương:

Chương 1: TỔNG QUAN

- Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease.

- Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong

và ngoài nước.

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU

- Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường

nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

- Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu.

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

- Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto

1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto

Giới Bacteria

Ngành Firmicutes

Lớp Bacilli

Bộ Bacillales

Họ Bacillaceae

Giống Bacillus

Loài subtilis

Phân loài Bacillus subtilis Natto.

“Nguồn: Keith H. Steinlraus (2004)”

1.1.2. Lịch sử phát hiện

B. subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của

Nhật Bản. Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt

tên là Bacillus Natto Sawamura. Kể từ đó B. subtilis Natto được chấp thuận để dùng

cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968,

thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996. Và hiện đang thu hút sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55].

Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh

vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [28], [50], các khóa phân loại đã xếp B. subtilis

Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại như B. subtilis Natto B – 12 [21], B. subtilis Natto OK2 [47], B. subtilis Natto NRRL 3666 [39]…

Đồ án tốt nghiệp

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được

hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu,

gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt

đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình

qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis

Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh

dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto[46].

Hình 1.1. Sản phẩm Natto.

(Nguồn: healthplus.vn)

Chức năng của B. subtilis Natto[55]:

- Tăng cường vi khuẩn có lợi.

- Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại.

- Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột

- Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B

Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Phân bố

B. subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn

truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis Natto có nhiều

trong rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương. Vi

khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [40].

1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto

1.1.4.1. Đặc điểm hình thái

B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào

tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với

nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn

và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23].

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần). “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”

1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý

B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể

phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly

Đồ án tốt nghiệp

giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH

trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23].

1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá

B. subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose,

saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển

của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid

glutamic, arginin, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [23].

Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Hoạt tính catalase +

Sinh indol -

MR +

VP +

Sử dụng citrate +

Khử nitrate +

Tan chảy gelatin +

Phân giải tinh bột +

Arabinose +

Xylose +

Saccharose +

Đồ án tốt nghiệp

Mannitol +

Glucose +

Lactose -

Maltose +

(Theo Holt, 1992)

1.1.4.4. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis Natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis Natto có khả năng sinh

tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ– transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo Yamane K năm 1974 [31]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [29], Shimizu M năm 1992 [36]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [48]; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53].

Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau:

o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay

subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có

275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến 29 kDa [21],[33]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được

nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.

o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42].

Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32].

o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp[45].

o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là 55oC, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [49],[53].

Đồ án tốt nghiệp

1.2. Enzyme protease 1.2.1. Khái niệm về protease[1]

Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong

phân tử protein và các cơ chất tương tự.

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide.

“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”

Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên

kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là “

các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este

và vận chuyển amino acid.

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm

phụ:

 Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch

polypeptit

 Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của

mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.

 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.

 Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi

sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ

dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc

Đồ án tốt nghiệp

điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao

gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên

rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật

thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease. “Nguồn: Tống Ngọc Triêm(2010)[16]”

1.2.2. Phân loại [9]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh

vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động

thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm

như sau:

o Protease – xerin

o Protease – thiol

o Protease – kim loại

o Protease – acid

Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao

gồm:

o Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp

bánh kẹo.

Đồ án tốt nghiệp

o Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH

hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus

thermoproteolyticus.

o Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm

hoạt động của chúng có serine.

Trong bốn protease kể trên, các protease - xerin và protease - thiol có khả năng

phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.

Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase

của các dẫn suất của amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được

nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác

dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương

đối bé, nhất là các P-xerin.

Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20,000 – 27,000 Dalton.

Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme

của Pelicillium cyoneo-fulvum (44,000), Asp, oryzae OUT 5038 (52,000). Trọng

lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33,800

– 48,400). Protease thiol và nhiều protease - acid cũng có trọng lượng phân tử vào

khoảng 30,000 - 40,000 Dalton. 1.2.3. Nguồn thu nhận

Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc

tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn

thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật,

thực vật và vi sinh vật.

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở

vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và

xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất

enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống .

Đồ án tốt nghiệp

Enzyme protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và

ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay

lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi

sinh vật do enzyme thu nhận từ nguồn thực vật và động vật thường rất khó và hiệu

quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ

động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ

thuật sản xuất được liệt kê như sau:

 Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối

lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.

 Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.

 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được

lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một

lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.

 Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,

kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.

 Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.

 Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme

của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản

xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp

được.

 Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền

và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt

môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng

của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme. Chính vì thế enzyme

được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác.

 Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác

nhau[9].

Đồ án tốt nghiệp

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis[7],[16]

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh

vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ

thông khí và thành phần môi trường…

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng

sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp,

mỗi loài có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng

hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao

hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ưu của Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37oC.

 Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH

môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, hơn

nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh

vật. Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn

đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện rất

rõ ở các loài thuộc chi Bacillus. pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng

hoặc trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH tối ưu cho sự phát triển và sinh

tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0.

 Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng

lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau

tùy theo loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp:

+ Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm

tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinh tổng

hợp protease.

+ Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có

khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976).

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn

phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính của protease có thể

Đồ án tốt nghiệp

giữ được trong khoảng từ 60 - 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian.

Hoạt động của protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn.

Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt động tốt nhất trong khoảng thời

gian 46 - 68 giờ.

 Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh

vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và cả polysaccharide (tinh bột), đặc

tính tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc

tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường

nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Ở vi khuẩn

Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là

tinh bột với nồng độ khoảng 8%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% sẽ làm

giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy.

Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn carbon Hoạt tính protease (U/ml)

Trisodium citrate 0,00

Glucose 678

Tinh bột hoà tan 596

Cám gạo 407

Trấu 515

Cám mì 541

Bột bắp 368

“Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008)[37] ”

 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen

trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối vô

cơ. Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3.

+ Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng

hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các

Đồ án tốt nghiệp

nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám,

nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm

lượng amino acid tương đối thấp.

+ Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể

quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô

Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên

khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã

dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4,

NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ

pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa

nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là

0,038 UI/ml so với các nguồn khác.

+ Khi cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo,

các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, hoạt lực enzyme protease tăng 22 - 74%.

Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ

dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung.

Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml)

198 NaNO3

245 KNO3

242 NH4H2PO4

175 (NH4)2HPO4

60,8 (NH4)2SO4

90,1 NH4NO3

107 NH4HCO3

19,6

NH4Cl “Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]”

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease

của chủng Bacillus licheniformis N-2

Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml)

Mạch nha 333

Casein 464

Cao nấm men 551

Peptone 470

Cao thịt 445

0,00

Urea “Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]”

 Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng đáng kể đến quá

trình sinh tổng hợp protease. Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến

quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá

trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó.

 Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như NaCl và

vitamin… cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh

vật. Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp

protease.

 Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng

hợp enzyme của vi sinh vật. Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực

protease của chủng đột biến A.oryzae 251 - 90 đến 6 - 9% và nguyên chủng

A.oryzae 132 - 63 tới 7 - 24%. Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp

enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus

megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid ức chế trong quá

trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu…

 Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường bổ sung các chất cảm ứng, các

chất này thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Casein thuộc nhóm

Đồ án tốt nghiệp

protein chủ yếu có trong sữa và thường dùng làm chất cảm ứng cho vi khuẩn sản xuất protease[5]. 1.4. Ứng dụng của protease[4]

 Trong Y học: Sử dụng nhiều protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu

cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương.

 Trong chế biến thủy sản: Trong chế biến nước mắm sử dụng enzym protease

thực vật ( bromelain, papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện

hương vị của nước mắm.

 Trong công nghiệp sữa : Sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của

chúng.

Ví dụ : Renin, Pepsin, và một số protease vi sinh vât: A. candidus, P. roquerti,

B. mensentericus…

 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy: Protease làm giảm thời gian

đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.

 Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn

thời gian lọc, protease của A. oryrae dùng thủy phân protease trong hạt ngủ cốc tạo

điều kiện xử lý bia tốt hơn.

 Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ da

khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen thành phần

làm da dị ứng. Protease được sử dụng tách từ vi khuẩn (B. mensertericus,

B.subtilis), nấm mốc và xạ khuẩn…

 Trong công nghiệp dệt: Đây là protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy

tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatine) để sợi được

được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm

dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm

lượng hoá chất để tẩy trắng.

 Một số ứng dụng khác:

Đồ án tốt nghiệp

+ Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực

phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.

+ Protease có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành

hỗn hợp enzym dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong

chăn nuôi gia súc và gia cầm.

+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản

xuất mỹ phẩm …

+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng

sinh…

1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease

1.5.1.Trên thế giới

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả.

Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận

được ở dạng chế phẩm. Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu

nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 - 1919 Waksman đã phát hiện được khả

năng phân giải protein của Xạ khuẩn.

Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về

protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (protease từ vi

sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west,

1996).

Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng

cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Khảo sát

các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat, casein, pepton từ đậu nành

và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và glycerol với

hàm lượng 20g/l. Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO4.7H2O,

KH2PO4.3H2O, cao nấm men và CaCl2. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose

2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1,300U/ml

Đồ án tốt nghiệp

với thành phần môi trường tối ưu (g/l) : pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [27].

Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng

hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các nhân tố được chọn để khảo sát:

glucose, pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ. Hoạt tính đạt 3,194U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [51].

Weng và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cải thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự

oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E.coli bằng đột biến điểm: thay thế Methioni tại vị

trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này[35].

1.5.2. Tại Việt Nam

Các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh

học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác.

Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ

sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh

học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế.

“Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy

phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên

cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn

toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung

protease từ B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50oC.

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch,

Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc

gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa

(pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích

ly và tinh sạch enzyme protease từ ruột cá Basa. Dịch chiết protease kiềm thu được

từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/g CKNT (chất khô nội tạng) trong điều

Đồ án tốt nghiệp

kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút[3].

Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus

sp. 7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase 470FU/g

trên môi trường đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay

từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto[13].

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm

2.1.1. Địa điểm

Thực hiện tại phòng thí nghiệm – chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh

Bình Dương, kho C2 – lô D – Tổng kho Sóng Thần – KCN Sóng Thần 1, huyện Dĩ

An.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Từ 16/5/2016 đến 7/8/2016.

2.2. Vật liệu thí nghiệm

2.2.1. Nguồn vi sinh vật

Năm chủng vi khuẩn được cung cấp bởi chi nhánh công ty TNHH Gia Tường

tỉnh Bình Dương.

Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu

Ký hiệu Tên chủng

BN 1 Bacillus subtilis Natto 1

BN 2.1 Bacillus subtilis Natto 2.1

BN 2.2 Bacillus subtilis Natto 2.2

BN 2.3 Bacillus subtilis Natto 2.3

BN 3 Bacillus subtilis Natto 3

2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm

Bã đậu nành, cám bắp, cám mì, cám gạo và đậu xanh được cung cấp bởi chi

nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương.

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.2.3.1. Hoá chất

Các hoá chất do phòng thí nghiệm – chi nhánh công ty TNHH Gia Tường

tỉnh Bình Dương cung cấp.

2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, bình định mức, erlen…

- Thiết bị thí nghiệm: tủ sấy, tủ lạnh, máy lắc, máy đo OD, lò viba, bể ổn

nhiệt, máy li tâm…

2.3. Môi trường nuôi cấy 2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1)[18]

Công thức môi trường:

Giá đậu 100g

Glucose 50g

Pepton 10g

Agar 20g

Nước cất đủ 1000 ml

Cách thực hiện:

 Rửa sạch giá, cân 100g giá đậu, đun đến khi sôi thì vặn nhỏ lửa, tiếp tục nấu

trong 20 phút. Lọc lấy nước chiết, sau đó bổ sung thêm nước cho đủ 1000 ml.

 Hoà tan glucose, pepton và agar vào dung dịch trên ,sau đó vừa đun vừa

khuấy đều. Khi dung dịch vừa sôi thì phân vào các dụng cụ và hấp khử trùng ở

1atm trong 30 phút. 2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2)[18]

Công thức môi trường:

Giá đậu 100g

Glucose 50g

Pepton 10g

Nước cất đủ 1000 ml

Đồ án tốt nghiệp

Cách thực hiện:

 Làm tương tự như MT1 nhưng không bổ sung agar.

 Đong 200 ml môi trường vào các chai nước biển, đem hấp khử trùng ở 1 atm

trong 30 phút. 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) [11]

Công thức môi trường:

Casein 4g

Glucose 0,05g

Peptone 0,2g

NaCl 3g

1,5g K2HPO4

1,5g KH2PO4

0,1g MgSO4.4H2O

Agar 15

Nước cất đủ 1000 ml

Cách thực hiện:

 Nấu cách thuỷ Casein trong 50ml đệm Sorensen cho đến khi tan.

 Hoà dung dịch trên vào môi trường đã bổ sung các chất khoáng và định mức

cho đủ 1000 ml. Sau đó hoà tan agar vào dung dịch và đun cho tới khi agar tan.

 Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút.

2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4)[6]

Công thức môi trường:

Bã đậu nành 200g

Cám bắp 200g

0,2 g MgSO4

0,4 g KH2PO4

Diamoniphosphate 0,8 g

2,4 g CaCO3

Đồ án tốt nghiệp

1,44g NaCl

0,0014g ZnSO4

60% (w/w) Nước

Cách thực hiện:

 Trộn bã đậu nành và cám bắp lại với nhau rồi cho 30g vào erlen. Bổ sung 37

ml nước đã hoà tan các khoáng chất vào các erlen. Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30

phút.

2.4. Phương pháp tiến hành 2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật[18]

 Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn cấy vào môi trường thạch

nghiêng và ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đi bảo quản lạnh.

 Cấy chuyền hàng tháng. 2.4.2. Phương pháp tăng sinh[18]

 Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chứa môi trường nườc chiết

giá đậu đường pepton. Nuôi cấy lắc với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ ở 37oC. Dịch giống có màu vàng nâu, thơm ngái đặc trưng. 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào (phương pháp đếm khuẩn lạc)[2]

2.4.3.1. Chuẩn bị:

Đổ môi trường MT1 đã hấp khử trùng vào các đĩa petri vô trùng. Để 2 - 3

ngày cho bề mặt môi trường khô ráo.

Dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,85%): hòa tan 0,85 g NaCl trong 1000

ml nước cất thành, phân vào mỗi ống nghiệm 9 ml. Khử trùng ở áp suất 1 atm trong

30 phút.

2.4.3.2. Cách tiến hành:

 Dùng nước muối sinh lý vô trùng pha loãng mẫu tuần tự thành các nồng độ thập phân (10-1, 10-2, 10-3,..). Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển

dịch chứa giống đã pha loãng vào bề mặt đĩa petri chứa môi trường MT1.

Đồ án tốt nghiệp

 Sử dụng que trang trải cho dịch khuẩn đều trên bề mặt môi trường thạch khô.

Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Sau khi ủ tiến hành quan sát và đếm khuẩn lạc. Đếm các

đĩa có khuẩn lạc từ 30 đến 300.

Số vi khuẩn A trên gam hoặc ml đươc tính theo công thức:

A (CFU/ml) = (N1/(n1.V1.f1) + N2/(n2.V2.f2) + … + Ni/(ni.Vi.fi))/i

Với:

A: là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc, CFU) vi khuẩn trong 1ml mẫu.

Ni: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa tại nồng độ i.

ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i.

V: là thể tích dịch mẫu cấy vào trong môi trường đĩa (ml).

fi: là độ pha loãng tương ứng.

2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease[12]

2.4.4.1. Nguyên tắc

Khi protease tác dụng lên cơ chất casein trong môi trường thạch, Casein bị

phân giải làm cho độ đục của môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt.

2.4.4.2. Cách tiến hành:

 Chuẩn bị các đĩa petri có chứa khoảng 20 ml môi trường thạch Casein đã

được đục lỗ với đường kính 12 mm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được nuôi cấy lắc tăng sinh cho vào lỗ đã đục ở đĩa petri. Sau 48 giờ ủ ở 37oC, tráng dung dịch Lugol.

Quan sát vòng phân giải tạo thành. Nếu thấy xuất hiện vòng phân giải trong suốt

xung quanh lỗ thạch, tức là Casein đã bị phân giải. Như vậy, chủng Bacillus subtilis

Natto có khả năng sinh tổng hợp protease.

 Đo đường kính vòng phân giải (ký hiệu D) và lỗ khoan (ký hiệu d). Khả năng

sinh tổng hợp protease của các chủng vi khuẩn được tính bằng đường kính vòng

phân giải (ΔD). Các giá trị (ΔD) càng lớn thì khả năng sinh enzyme của các chủng

càng mạnh.

Đồ án tốt nghiệp

ΔD = D - d

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải (mm).

d: đường kính lỗ thạch (mm). 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn[4]

Cấy 1 ml dung dịch tăng sinh Bacillus subtilis Natto có mật độ tế bào

106CFU/ml vào môi trường bán rắn, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.

Canh trường được sấy ở 40 - 45oC đến độ ẩm 5 – 8%. 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn[17]

Cân 10 g canh trường đã sấy khô hoà trong 100 ml nước cất, đem lắc ở tốc

độ 200 vòng/phút trong 15 phút.

Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, ta có dịch enzyme pha loãng

10 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác

định hoạt tính protease. 2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson)[17]

2.4.7.1. Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản

phẩm là các Tyrosine và Tryptophan hoà tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác

định lượng Tyrosine và Tryptophan hoà tan bởi thuốc thử Folin.

2.4.72. Hoá chất

 Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nước

vừa đủ 250 ml.

 Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước vừa đủ

100ml.

 Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6: trộn chung 177 ml dung dịch

Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M.

Đồ án tốt nghiệp

 Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thuỷ 1g Casein trong dung dịch đệm

Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100 ml.

 Dung dịch TCA 10% : hoà tan 10 g TCA trong nước cho đủ 100 ml.

 Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml.

 Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:2).

 Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HClđđ với nước cho vừa đủ 250 ml.

 Dung dịch Tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosine trong dung

dịch HCl 0,2N vừa đủ 500ml.

 Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng 5 ml

dung dịch Tyrosine 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml .

2.4.7.3. Cách tiến hành:

Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine

Ống nghiệm Dung dịch hoá chất 1 2 3 4 5 0

Lượng Tyrosine (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Dung dịch Tyrosine chuẩn 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 1mM (ml)

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 1 0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Ống 0 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thử thật (TT).

Vẽ đường chuẩn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (µM) và OD

(OD = ODTT – ODTK).

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu

Ống nghiệm Dung dịch hoá chất Thử thật Thử không

Dung dịch Casein 1% (ml) 2,5 2,5

Dung dịch TCA 10% (ml) 2,5 0

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0 0,5

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút.

Dung dịch TCA 10% (ml) 0 2,5

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0,5 0

Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu

Dịch lọc (ml) 1 1

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6

Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm.

2.4.7.4. Cách tính:

Định nghĩa đơn vị Anson: Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (35,5oC; pH 7,6…) thuỷ phân Casein trong 1 phút tạo thành sản

phẩm hoà tan trong TCA , phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở

bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM Tyrosine trong đường chuẩn.

Với:

V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (5,5 ml).

v: thể tích dịch enzyme phản ứng (0,5 ml).

Đồ án tốt nghiệp

t: thời gian thuỷ phân (30 phút).

K: độ pha loãng mẫu.

x: lượng µM Tyrosine suy ra từ đường chuẩn.

1UI (Anson) = 1µmol Tyrosine/ml/phút; hoặc = 1µmol/mg/phút.

HT: hoạt tính enzyme.

2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease[18]

Chọn canh trường có hoạt độ cao đã sấy khô, xay nhuyễn. Hòa tan 1 g canh

trường khô vào 100 ml nước, lắc 200 vòng/phút trong 30 phút để enzyme từ canh

trường khô tan vào nước. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch thu được lọc

phần nổi bỏ phần cặn.

Tủa enzyme trong phần dịch nổi đã lọc với cồn 96% lạnh theo tỉ lệ thể tích

enzyme với cồn là 1:3, giữ lạnh trong 30 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút.

Thu phần cặn, bỏ phần dịch nổi. Phần cặn được sấy khô và bảo quản.

2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê

Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để tìm hiểu sự tác động về ý nghĩa thống kê

của yếu tố thí nghiệm và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme

protease cao

Mỗi loài B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease khác nhau, vì

vậy nhóm thực hiện tiến hành nghiên cứu định tính các chủng B. subtilis Natto, dựa

vào kích thước vòng phân giải để xác định được chủng B. subtilis Natto có khả năng

tổng hợp protease cao.

2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus

subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau

Môi trường dinh dưỡng thích hợp là yếu tố quan trọng giúp vi sinh vật sinh

tổng hợp enzyme cao, trong đó mỗi thành phần cơ chất mang nguồn dinh dưỡng

khác nhau kích thích cho sự phát triển và tạo khả năng sinh enzyme. Vì vậy nhóm

Đồ án tốt nghiệp

thực hiện tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng

Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau

nhằm lựa chọn môi trường bán rắn thích hợp nhất cho B. subtilis Natto.

Cấy chủng B. subtilis Natto đã xác định ở mục 2.5.1 vào môi MT4 có thành

phần cơ chất thay đổi theo bảng 2.2.

Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn.

Thành phần Bột đậu Bã đậu xanh Cám bắp Cám gạo Cám mì nành Nghiệm (BDX) (CB) (g) (CG) (g) (CM) (g) (BDN) (g) thức (g)

NT1 0 15 15 0 0

NT2 0 15 0 15 0

NT3 0 15 0 0 15

NT4 15 0 15 0 0

NT5 15 0 0 15 0

NT6 15 0 0 0 15

Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ enzyme protease bằng

phương pháp Anson. Dựa vào kết quả, ta tìm được thành phần môi trường tốt nhất

và chủng sinh protease cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme

protease của chủng Bacillus subtilis Natto

2.5.3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn

Mỗi loài B. subtilis Natto có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp enzyme với mỗi

loại cơ chất nuôi cấy khác nhau. Ngoài ra, khả năng sinh tổng hợp enzyme còn phụ

thuộc vào thành phần và tỷ lệ đối với từng loại cơ chất riêng biệt. Mục đích của thí

nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn.

Đồ án tốt nghiệp

Nuôi cấy chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp protease cao với môi trường

nuôi cấy có thành phầm cơ chất thích hợp đã tìm thấy ở mục 2.5.2. Trong đó tỉ lệ khối lượng 2 thành phần cơ chất có sự thay đổi 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, và 8:2.

Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp

Anson. Lựa chọn được môi trường có tỷ lệ cơ chất thích hợp cho khả năng sinh tổng

hợp enzyme protease tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng về độ ẩm của môi trường bán rắn

Nuôi cấy chủng B. subtilis Natto xác định từ mục 2.5.3.1. trên môi trường bán

rắn với độ ẩm thay đổi: 40%, 50%, 60% và 70%.

Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp

Anson. Môi trường nuôi cấy với độ ẩm cho hoạt độ protease mạnh là điều kiện thích

hợp để khảo sát thí nghiệm tiếp theo.

2.5.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy bán rắn

Ở mỗi thời điểm khác nhau, vi khuẩn đều cho lượng enzyme tổng hợp khác

nhau. Vì vậy sau khi nuôi cấy chủng B.subtilis Natto theo điều kiện xác định ở thí

nghiệm trên, các chủng sẽ được ủ ở nhiệt độ phòng sau các khoảng thời gian khác

nhau: 12, 24, 36, 48, 60, 72 và 84 giờ, để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi

cấy bán rắn lên khả năng tổng hợp enzyme protease.

2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác enzyme protease của

chủng Bacillus subtilis Natto

Sử dụng enzyme protease đã tinh sạch sơ bộ. Tiến hành đo hoạt độ enzyme

protease bằng phương pháp Anson với giá trị pH thay đổi từ 6,0 – 8,0. Lựa chọn pH

thích hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao

Cấy 5 chủng Bacillus subtilis Natto vào môi trường thạch đĩa casein. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 - 33oC). Sau 48 giờ, tráng lugol và quan sát đĩa thạch.

Kết quả được trình bày theo hình 3.1, bảng 3.1 và biểu đồ 3.1.

Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto.

A: Chủng BN1; B: Chủng BN2.1; C: Chủng BN2.2; D: Chủng BN2.3; E: Chủng BN3; F: Mẫu đối chứng.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto

Chủng D trung bình (mm)

BN1 7,00  1,73c

BN2.1 20,3  0,58a

BN2.2 12,3  0,58b

BN2.3 12,7  1,53b

BN3 13,0  1,73b

Mẫu đối chứng 0,00  0,00d

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto.

Dựa vào kích thước vòng phân giải, nhận thấy các đĩa có chủng B. subtilis

Natto so với mẫu đối chứng không chứa khuẩn, tất cả đều có khả năng sinh tổng

hợp enzyme protease. Trong đó chủng BN1 cho khả năng phân giải casein thấp hơn

các chủng còn lại với đường kính vòng phân giải là 7,00 mm. Các chủng BN2.2,

Đồ án tốt nghiệp

BN2.3 và BN3 có khả năng phân giải casein cao hơn BN1 nhưng không khác biệt

về mặt thống kê. Chủng BN2.1 cho khả năng phân giải casein mạnh với đường kính

vòng phân giải là 20,3mm, cao hơn khoảng 36 - 39% so với các chủng BN2.2,

BN2.3, BN3. Kết quả trên cho thấy, mỗi chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh

tổng hợp enzyme protease khác nhau. Trong đó, chủng BN 2.1 có khả năng sinh

enzyme protease cao nhất, do đó được lựa chọn để tiến hành những thí nghiệm tiếp

theo.

3.2. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên

môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau

Thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng

và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mục đích của thí nghiệm này nhằm khảo sát

khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng BN2.1 trên các môi trường nuôi

cấy có sự kết hợp giữa các nguồn cơ chất khác nhau.

Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau

Thành phần môi trường Hoạt độ trung bình (UI/g)

BDN:CB 0,80  0,13a

BDN:CG 0,66  0,03abc

BDN:CM 0,68  0,08abc

DX:CB 0,62  0,08bc

DX:CG 0,52  0,12c

DX:CM 0,77  0,03ab

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Đồ án tốt nghiệp

Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau.

Theo kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, với mỗi môi trường nuôi cấy khác nhau thì

chủng vi khuẩn BN2.1 cho khả năng sinh tổng hợp protease khác nhau. Ở môi

trường DX:CG, chủng BN2.1 cho hoạt độ enzyme thấp hơn các môi trường còn lại

đạt 0,52 UI/g. Trong khi đó, môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất đạt

0,80 UI/g. Với ba môi trường nuôi cấy chứa thành phần là bã đậu nành thì môi

trường BDN:CG cho hoạt độ protease thấp nhất chỉ đạt 0,66 UI/g, môi trường

BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn 2 môi trường còn lại. Bên cạnh đó, những

môi trường chứa thành phần là đậu xanh thì môi trường DX:CG cho hoạt tính

enzyme protease thấp hơn môi trường DX:CB và DX:CM. Môi trường DX:CM cho

hoạt tính cao hơn 2 môi trường còn lại với 0,77 UI/g. Qua đó cho thấy, hai môi

trường BDN:CB và DX:CM là môi trường thích hợp để chủng BN2.1 sinh tổng hợp

enzyme protease cao. Môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn môi

trường DX:CM, tuy nhiên không khác biệt về mặt thống kê. Kết quả nghiên cứu

tương tự với báo cáo của Abdelnaser S.S. Ibrahim và cộng sự (2009) khi chủng

Bacillus halodurans tổng hợp protease trên môi trường đậu nành cao hơn trên môi

trường cám mì. Một nghiên cứu khác của U.O.George-Okafor và cộng sự (2012)

Đồ án tốt nghiệp

cho thấy, chủng Bacillus sp. Sw-2 khi nuôi cấy trên đậu nành cũng cho hoạt độ

protease cao hơn so với các môi trường còn lại. Sự chênh lệch hoạt độ giữa các môi

trường này có thể là do sự kết hợp giữa độ thoáng khí và nguồn dưỡng chất của các

thành phần cơ chất khác nhau. Đậu xanh là nguồn nguyên liệu tương đối đắt tiền,

trong khi đó bã đậu nành là nguồn phế phụ liệu có giá thành rẻ hơn. Vì vậy, để tiết

kiệm chi phí sản xuất và tận dụng nguồn phế phụ liệu nông nghiệp là bã đậu nành,

thông qua kết quả thí nghiệm, nhóm thực hiện lựa chọn bã đậu nành và cám bắp là

nguồn cơ chất tối ưu để thu nhận enzyme protease từ chủng BN2.1.

3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của

chủng B. subtilis Natto BN2.1

3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng

hợp protease

Chủng BN2.1 được nuôi cấy trên môi trường bán rắn đã chọn là BDN:CB, với

các tỉ lệ khối lượng thành phần cơ chất thay đổi lần lượt: 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 7:3

và 8:2. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.3.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease

Tỉ lệ Hoạt độ trung bình (UI/g)

2:8 0,39  0,05c

3:7 0,50  0,13bc

4:6 0,58  0,04abc

5:5 0,75  0,10a

6:4 0,61  0,10ab

7:3 0,57  0,16abc

8:2 0,48  0,12bc bc

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease.

Đồ án tốt nghiệp

Quan sát kết quả ở bảng 3.3, nhận thấy hoạt độ enzyme có sự thay đổi theo

thành phần cơ chất của môi trường nuôi cấy. Cụ thể, khi ở tỉ lệ 2:8 hoạt độ protease

đạt 0,39 UI/g, ở tỉ lệ 3:7 thì tăng lên mức 0,50 UI/g. Tuy nhiên, từ tỉ lệ 4:6 đến tỉ lệ

7:3 hoạt độ protease không chênh lệch vê mặt thống kê. Khi tăng lượng bã đậu nành

đến tỉ lệ 8:2, hoạt độ protease chỉ đạt 0,48 UI/g. Nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng

(2013) cho thấy chủng B. subtilis Ba-15 tổng hợp protease tốt nhất khi nuôi cấy trên

môi trường bán rắn chứa nguồn cơ chất bã đậu nành và bột bắp với tỉ lệ 2:8. Theo

Nguyễn Đức Lượng (2012), tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và

nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành

các enzyme thuỷ phân. Chỉ khi nào môi trường có đủ lượng carbon, nitơ cần thiết

mới tích luỹ được lượng enzyme lớn. Bã đậu nành không chỉ là nguồn cung cấp nitơ

chính mà còn tạo độ thoáng khí cần thiết cho môi trường bán rắn. Có thể thấy bã

đậu nành là một nguồn cơ chất kích thích sự sinh tổng hợp enzyme protease. Nhưng

khi nồng độ cơ chất quá cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ

chất, gây ra sự ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme này. Như vậy, mỗi loài vi

khuẩn đều có nhu cầu khác nhau về độ thoáng khí cũng như nguồn dinh dưỡng từ

thành phần môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ 4:6 đến 7:3 tuy hoạt tính không khác biệt về

thống kê nhưng xét về năng suất thu được canh trường thì tỷ lệ 5:5 cho năng suất

cao hơn so với 3 tỷ lệ phối trộn còn lại. Vì vậy đối với chủng đối với chủng BN2.1,

tỉ lệ 5:5 của BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất được lựa chọn để tiến hành thí

nghiệm tiếp theo.

3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease

Thực hiện nghiên cứu độ ẩm môi trường bán rắn với điều kiện nuôi cấy đã

chọn ở trên, trong đó độ ẩm môi trường thay đổi 40, 50, 60 và 70%. Kết quả được

trình bày theo bảng 3.4 và biểu đồ 3.4.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp enzyme protease

Độ ẩm (%) Hoạt độ trung bình (UI/g)

40 0,02  0,01d

50 0,38  0,07c

60 0,79  0,14a

70 0,57  0,10b

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease.

Theo Ramesh (1990), độ ẩm ban đầu ảnh hưởng đến sự sản sinh các loại

enzyme thủy phân khi nuôi ở môi trường bán rắn vì nó ảnh hưởng đến sự tăng

trưởng của sinh vật. Từ kết quả cho thấy, độ ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ

protease, độ ẩm 40% cho hoạt độ thấp nhất là 0,02 UI/g, hoạt độ tăng dần đến độ

ẩm 60% thì chủng BN2.1 cho hoạt độ protease mạnh hơn đạt 0,79 UI/g, cao gấp đôi

so với ở độ ẩm 50%. Tuy nhiên sự gia tăng này không kéo dài, với 70% ẩm, hoạt độ

protease giảm đáng kể, chỉ đạt 0,57 UI/g. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy là một

Đồ án tốt nghiệp

trong những yếu tố chính trong nuôi cấy bán rắn và thường quyết định sự thành

công của cả quá trình (Narahara và cộng sự, 1982; Lonsane và cộng sự, 1985; Renu

và cộng sự, 2001). Báo cáo về độ ẩm trung bình (50 - 63%) bởi George và cộng sự

(1995) cho thấy, khi độ ẩm vượt quá mức, không có sự tăng thêm hoạt độ enzyme,

thậm chí làm giảm sự tăng trưởng và sản xuất enzyme. Qua đó cho thấy việc giữ ẩm

cho môi trường ở mức tối thích là sự cần thiết đối với các chủng vi sinh vật và độ

ẩm thích hợp để chủng BN2.1 tổng hợp protease cao nhất là 60%.

3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease

Tiến hành cấy chủng B. subtilis Natto theo điều kiện đã xác định ở các thí

nghiệm trên, sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian khác nhau:

12, 24, 36, 48, 60, 72 vả 84 giờ.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease

Thời gian nuôi cấy (giờ) Hoạt độ trung bình (UI/g)

12 0,84  0,02d

24 0,89  0,01cd

36 0,93  0,02bc

48 0,96  0,04b

60 1,01  0,04a

72 1,04  0,02a

84 1,04  0,03a

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Đồ án tốt nghiệp

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease.

Theo thời gian nuôi cấy, hoạt độ protease của chủng BN2.1 tăng đều trong

khoảng thời gian nuôi cấy từ 12 đến 72 giờ. Ở thời điểm 12 giờ hoạt độ protease chỉ

đạt 0,84 UI/g, đến 60 giờ thì tăng đến 1,01 UI/g. Sau 72 giờ thì hoạt độ protease

không tăng nữa và duy trì ở mức ổn định với 1,04 UI/g. Kết quả tương tự với

nghiên cứu của U.O.George-Okafor và E.E.Mike-Anosike (2012) khi chủng

Bacillus sp. Sw-2 cho hoạt độ protease cao nhất ở 72 giờ (2,697 UI/ml). Khi kéo dài

thời gian nuôi cấy thì các thành phần trong môi trường thay đổi do sự hình thành

các hợp chất mới của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, dẫn đến hàm lượng các

chất dinh dưỡng giảm, làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt.

Chủng BN2.1 sinh tổng hợp enzyme mạnh và lượng protease tích luỹ trong canh

trường cao nhất trong khoảng thời gian từ 60 đến 84 giờ. Vì vậy để tiết kiệm thời

gian nuôi cấy, thời điểm 60 giờ sẽ được chọn làm thời điểm để thu nhận canh

trường và tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng

B. subtilis Natto BN2.1

Tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme từ canh trường cho hoạt độ cao theo các

điều kện tối ưu ở trên và khảo sát sát ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc

tác enzyme protease của chủng BN2.1 với pH phản ứng thay đổi từ 6 đến 8.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease

pH Hoạt độ trung bình (UI/g)

6,5

7,5

8 59,7  2,42b 61,6  1,15b 67,9  2,27a 67,2  4,28a 66,7  1,43a

Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05.

Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease.

Kết quả khảo sát cho thấy, mỗi pH khác nhau cho khả năng xúc tác enzyme

protease khác nhau. Chủng BN2.1 sinh tổng hợp protease tăng dần từ pH 6 đến 7.

Trong đó, hoạt độ protease thấp nhất ở pH 6 đạt 59,7 UI/g và cao nhất ở pH 7 với

Đồ án tốt nghiệp

hoạt độ đạt 67,9 UI/g, ổn định trong khoảng pH từ 7 đến 8. Kết quả tương tự với

nghiên cứu của E. M. El-Safey and U. M. Abdul-Raouf (2004) trên B. subtilis, khi

hoạt độ protease của chủng này mạnh nhất ở pH 7 của bộ đệm phosphate. Bên cạnh

đó, một số nghiên cứu về ảnh hưởng của pH lên đặc tính của enzyme cho thấy sự

khác biệt như Ishtiaq Ahmed và cộng sự (2011), lựa chọn pH 10 cho protease của

chủng B. subtilis; Sun và cộng sự (1997) lựa chọn khoảng pH 11 cho hoạt độ tối ưu

của protease từ chủng Bacillus sphaericus C3 - 41, protease này ổn định ở mức pH

từ 5 đến12. Theo nghiên cứu của Sadia Almas và cộng sự (2009) thì chủng Bacillus

SAL1 cho protease hoạt độ tối ưu ở pH 9 và ổn định trong khoảng pH 7 đến 10.

Như vậy, enzyme từ mỗi chủng khác nhau chịu ảnh hưởng khác nhau của pH lên

hoạt độ protease của chúng. Từ kết quả khảo sát trên nhận thấy, pH 7 là pH tối ưu

đối với protease của chủng BN2.1.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu nhóm thực hiện rút ra được kết luận như sau:

- Sàng lọc được chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 cho hoạt độ protease cao từ

năm chủng Bacillus subtilis Natto nghiên cứu.

- Các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp protease cao của chủng BN2.1

là hỗn hợp môi trường bán rắn BDN:CB, với tỉ lệ thích hợp là 5:5; thời gian

nuôi cấy tốt nhất là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất để nuôi

cấy là 60%.

- Khảo sát được ảnh hưởng của pH phản ứng tối ưu lên khả năng xúc tác enzyme

protease của chủng BN2.1 là pH 7.

4.2. Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu một số thông số khác trong quá trình nuôi cấy ảnh hưởng

đến khả năng sinh enzyme của chủng BN2.1 như: nhiệt độ, điều kiện cấp khí,

pH môi trường... từ đó đưa ra được môi trường nuôi cấy tổng hợp tối ưu giúp

chủng BN2.1 tăng tiết enzyme đích protease, đồng thời hạn chế được các

enzyme amylase và cellulase để thuận lợi hơn trong quá trình tinh chế sau này.

- Nghiên cứu về hoạt độ enzyme amylase, phytase, nattokinase… cùa chủng

BN2.1.

- Phân lập các dòng vi khuẩn từ sản phẩm Natto và định danh để tiếp tục nghiên

cứu cho ra những chủng Bacillus subtilis Natto có hoạt độ protease cao.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến

(1998). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.

2. Lâm Thị Kim Châu (2004). Thực tập lớn sinh hoá, Đại học Khoa học tự

nhiên, TP Hồ Chí Minh.

3. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006). Nghiên cứu thu nhận chế phẩm

protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti),Tạp chí Phát Triển KH&CN,

tập9, số11.

4. Hin Vireak (2012). Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng

tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp

Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội

5. Trần Ngọc Hùng (2006). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và tính chất của

α-amylase từ một số chủng Bacillus subtilis, Khoá luận tốt nghiệp ngành sinh

học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh.

6. Trần Ngọc Hùng (2010). Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus

subtilis sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận văn thạc sĩ sinh học,

trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh.

7. Đinh Thu Hương (2013). Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzym

protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Luận văn thạc sĩ dược học,

trường Đại học Dược, Hà Nội.

8. Đinh Thị Kim Loan (2006). Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease từ

một số chủng Bacillus sp. phân lập từ các chế phẩm sinh học dung trong

chăn nuôi ở Việt Nam, Khoá luận cử nhân khoa học, trường Đại học Khoa

học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh.

9. Nguyễn Đức Lượng (2004). Công Nghệ Enzyme, Nhà Xuất Bản Đại Học

Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.

Đồ án tốt nghiệp

10. Nguyễn Đức Lượng (2012). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc

gia, TP Hồ Chí Minh.

11. Đặng Lê Minh (2006). Khảo sát khả năng thuỷ phân một số dạng cơ chất

của một số chủng Bacillus phân lập từ các sản phẩm thuốc thú y và thuỷ sản,

Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành sinh hoá.

12. Trương Thị Hồng Nhung, Hoàng Minh Nguyệt (2013). Phân lập và xác

định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý

môi trường, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, trường Đại học

Nông nghiệp Hà Nội.

13. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng,

Trương Thị Hồng Vân và Lê Thị Hương (2012). Phân lập và tuyển chọn một

số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase, Tạp chí sinh học, 34(3), tr. 99

– 104.

14. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương (2006). Xác định một

số tính chất hóa lý của protease chủng Serratia sp. DT3, Tạp chí sinh học -

tập4(2), Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội.

15. Trần Linh Thước (2005). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm

và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật, Hà Nội.

16. Tống Ngọc Triêm(2010). Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis,

khóa luận tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TPHCM.

17. Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu (1982). Enzyme vi sinh vật tập 1,

NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội.

18. Bùi Ngọc Xuân (2012). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và một số đặc tính

enzyme α-amylase của chủng Bacillus stearothermophilus, Luận văn tốt

nghiệp, trường Đại học, Bình Dương.

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu nước ngoài

19. Ishtiaq Ahmed, Muhammad Anjum Zia and Hafiz Muhammad Nasir Iqbal

(2011). Purification and Kinetic Parameters Characterization of an Alkaline

Protease Produced from Bacillus subtilis through Submerged Fermentation

Technique, World Applied Sciences Journal 12 (6): 751-757.

20. Sadia Almas, Abdul Hameed, Dennis Shelly and Priya Mohan (2009).

Purification and characterization of a novel protease from Bacillus strain

SAL1, African Journal of Biotechnology, Vol. 8 (15), pp. 3603 - 3609

21. Wang C, Du M (2009). Purification and characterization of Nattokinase

from Bacillus subtilis natto B – 12, Journal of Agricultural and food

chemistry article, 57, p. 9722 – 9729.

22. Qiu D, Fujita K et al (2004). Comparative analysis of physical maps of four

Bacillus subtilis (natto) genomes, Appl Environ Microbiol (70), pp. 6247 –

6256.

23. Keith H. Steinkraus (2004). Industrialization of indigenous fermented foods,

pp.227 - 230.

24. Rong L.H (2011).The optimization, extraction and purification of

Nattokinase and genetic cloning, Master's thesis, Hebei Union University

(China).

25. Yiu H. Hui, Lisbeth Meunier - Goddik, Jiste Josephsen, Wai-Kit Nip (2005).

Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612 - 620.

26. Abdelnasser S.S. Ibrahim, Ali A. Al-Salamah (2009). Optimization of media

and cultivation conditions for alkaline protease production by Alkaliphilic

Bacillus halodurans, Research journal of microbiology 4 (7): 251 - 259.

27. Liu J, Xing J, Chang T, Ma Z and Liu H (2005). Optimization of nutritional

conditions for Nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using

statistical experimental methods, Process Biochemistry, vol.40(8), pp. 2757–

2762.

Đồ án tốt nghiệp

28. Tamang J, Thapa S. (2002). Phylogenetic analysis of Bacillus strains

isolated from fermented soybean foods of Asian: Kinema, Chungkokjang and

Natto, Journal of Hill Research, 15(2), pp.56 - 62.

29. Kerovuo J et al (1998). Isolation, characterization, molecular gene cloning

and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis, American society

for microbiology Appl. Environ. Microbiol, vol. 64 no. 6 p 2079 – 2085.

30. Noda K, Igata K (1989). Synthesis of γ – glytamyl peptides catalyzed by

transamidase from Bacillus natto, Agricultural Biology and Chemistry, 44,

p. 2419 – 2423.

31. Yamane K, Hiroshi M (1974). Hybrid α – amylase produced by

transformants of Bacillus subtilis – Purification and characterization of

extracellular α – amylase produced by the parental strains and trasformants,

Biochimica et Biophysica Acta, 365, p. 235 – 247.

32. Muramatsu K, Yamawake K (2000). Purification and crystallization of a

new Bacillus subtilis elastase, Journal of Home Economics of Japan, 51(12),

p. 1127 – 1135.

33. Fujita M et al (1993). Purification and characterization of a strong

fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular

soybean fermented food in Japan, Biochemical and Biophysical research

communication, p. 1340 – 1347.

34. Fujita M, Hong K (1995). Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically

induced thrombosis model in rat, Biological and Pharmaceutical Bulletin,

18(10), p. 1387 – 1391.

35. Weng M, Zheng Z, Bao W, Cai Y, Yin Y, Zou G (2009). Enhancement of

oxidative stability of the subtilisin Nattokinase by site-directed mutagenesis

expressed in Escherichia coli, Biochim Biophys Acta, 1794(11):1566 - 72

Đồ án tốt nghiệp

36. Shimizu M (1992). Purification and Characterization of Phytase from

Bacillus subtilis (natto) N – 77, Bioscience biotechnology and biochemistry,

56(8), p. 1266 – 1269.

37. Muhammad Nadeem, Javed Iqbal Qazi, Shahjahan Baig, Qurat-ul-Ain Syed

(2008). Effect of Medium Composition on Commercially Important Alkaline

Protease Production by Bacillus licheniformis N-2, Food Technol.

Biotechnol, 46 (4): 388 – 394

38. U.O.George-Okafor and E.E.Mike-Anosike (2012). Screening and optimal

protease production by Bacillus sp. Sw-2, using low cost substrate medium,

Research journal of microbiology 7 (7): 327 - 336.

39. Mahajan P, Sagar V (2010). Production of Nattokinase using Bacillus natto

NRRL 3666: media optimization, scale up and kinetic modeling, Food

Science and Biotechnology, 19(6), p. 1593 – 1603.

40. Gupta R, Beg Q.K (2002). Bacterial alkaline proteases: molecular

approaches and industrial applications, Applied Microbiology and

Biotechnology, 59, p. 15 – 32.

41. R. Sindhu, G. N. Suprabha and S. Shashidhar (2009). Optimization of

process parameters for the production of alkaline protease from Penicillium

godlewskii SBSS 25 and its application in detergent industry, African Journal

of Microbiology Research Vol. 3(9) pp. 515 - 522.

42. Hiroyuki S, Misako Y (1999). Elastase activity in Natto and its relation to

nattokinase, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p. 1187 – 1190.

43. Joo H.S., Kumar C.G., Park G.C., Paik S.R., Chang C.S. (2002).

Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from

Bacillus horikoshii, Process Biochemistry, 38, 155 – 159.

44. S Vijayalaksmi, J Ranjitha, V Devi Rajeswari (2013). Enzyme production

ability by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis – A comparative study,

Asian journal of pharmaceutical and clinical research, Vol 6, Issue 4, 2013.

Đồ án tốt nghiệp

45. Tokudome S, Omura K (2005). A newly derived protein from Bacillus

subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects, Journal of

Pharmacological Sciences , 99, p. 247 – 251.

46. William Shurtleff, Akiko Aoyagi (2012). History of Natto and Its Relatives,

Soyinfo Center.

47. Ashikaga S, Nanamiya H (2000). Natural genetic competence in Bacillus

subtilis natto OK2, Journal of Bacteriology, 182(9), p. 2411 – 2415.

48. Yan S, JiaQi W (2011). Screening of protease and cellulase producing

Bacillus subtilis natto strain and its growth characteristics, Dongbei Nongye

Daxue Xuebao Journal, 42(3), p. 39 – 43.

49. Kato T et al (1992). Purification of a new extracellular 90 – kDa serine

proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and

elucidation of its distinct mode of action, Bioscience biotechnology and

biochemistry, 56 (7), p. 1166 – 1168.

50. Seki T., Oshima T. (1975). Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic

acid – deoxyribonucleic acid hybridization and interspecific transformation,

International Journal of Systematic Bacteriology, 25(3), pp.258 - 270.

51. Deepak V et al (2008). Optimization of media composition for Nattokinase

production by Bacillus subtilis using response surface methodology,

Bioresource Technology (99), pp.8170 - 8174.

52. Ogawa Y, Hosoyama H, Hamano M, Motai M (1991). Purification and

properties of γ – glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto),

Agricultural Biology and Chemistry, 55, p. 2971 – 2977.

53. Yamagata Y, Abe R (1995). Molecular cloning and nucleotide sequence of

the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16,

Current Microbiology, 31(6), p. 340 – 344.

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu Internet

54. Báo điện tử Sahifa (2016). NATTOKINASE là gì? - Những điều cần biết.,

15/8/2016:

http://shopthucphamsach247.com/natokinase-la-gi-va-co-tac-dung-nhu-nao-

doi-voi-suc-khoe/.html

55. Japan NattoKinase Associasion (online). Bacillus subtilis Natto, 5/7/2016:

http://j-nattokinase.org/en/jnka_nattou_02.html.

56. Lorie Kramer (2011). Resen(online). The Bacillus subtilis Story, 5/9/2015:

http://www.rense.com/general4/bac.htm

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A. Bảng độ ẩm nguyên liệu ban đầu

Nguyên liệu Độ ẩm (%)

Bã đậu nành Đậu xanh Cám bắp Cám gạo Cám mì 9,6 11 10,65 9,8 10

PHỤ LỤC B. Đường chuẩn Tyrosine theo phương pháp Anson.

OD trung bình 0,0163 0,2320 0,5546 0,694 1,0767 1,2966

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lượng Tyrosine (µM)

0 0,2157 0,5383 0,6777 1,0604 1,2803 OD

Đồ thị phụ lục B. Đường chuẩn Tyrosine.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C. Khảo sát khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các

chủng B. subtilis Natto

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean Upper Lower Bound Bound N Mean Std. Error

.00000 .0000 .0000

Minimum Maximum 9.00 21.00 13.00 14.00 14.00 .00 21.00 6.00 20.00 12.00 11.00 11.00 .00 .00

Std. Deviation 2.6973 11.3027 3 7.0000 1.73205 1.00000 1 .33333 18.8991 21.7676 .57735 3 20.3333 2 .33333 10.8991 13.7676 3 12.3333 .57735 3 8.8721 16.4612 .88192 3 12.6667 1.52753 4 8.6973 17.3027 3 13.0000 1.73205 1.00000 5 .0000 .00000 3 6 7.6621 14.1157 Total 18 10.8889 6.48880 1.52943

HD ANOVA

Sum of Squares df Sig.

.000

697.778 18.000 715.778 Mean Square 139.556 1.500 5 12 17 F 93.037

Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable:HD

95% Confidence Interval

Mean Lower Bound Upper Bound

Dunnett t (2-sided)a

9.9013 23.2346 15.2346 15.5679 15.9013 (I) NT (J) NT 1 2 3 4 5 6 6 6 6 6 Difference (I-J) Std. Error Sig. 7.00000* 1.00000 20.33333* 1.00000 12.33333* 1.00000 12.66667* 1.00000 13.00000* 1.00000

.000 4.0987 .000 17.4321 9.4321 .000 .000 9.7654 .000 10.0987

a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

Subset for alpha = 0.05

N 2 3 4 NT

1 .0000

7.0000

12.3333 12.6667 13.0000

3 3 3 3 3 3

Duncana 6 1 3 4 5 2 Sig. 1.000 1.000 20.3333 1.000

.538

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto trên

môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

Descriptives

Std. Deviation Minimum Maximum

1 2 3 4 5 6

N Mean .7980 3 .6600 3 .6797 3 .6160 3 .5220 3 .7713 3 .6745 Total 18 Std. Error .13258 .07654 .02606 .01504 .07950 .04590 .08271 .04775 .11988 .06921 .02948 .01702 .12077 .02847 95% Confidence Interval for Mean Upper Lower Bound Bound .4687 1.1273 .7247 .5953 .8772 .4822 .8215 .4105 .8198 .2242 .8446 .6981 .7346 .6144 .95 .69 .77 .71 .64 .79 .95 .72 .64 .63 .56 .40 .74 .40

ANOVA

HD df F Sig. Sum of Squares Mean Square

5 .031 3.977 .023 .155

.008

.093 .248 12 17

Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

Dependent Variable:HD

95% Confidence Interval

Sig. Lower Bound Upper Bound

Dunnett t (2- sided)a

Mean Std. Difference (I-J) Error .02667 .07200 -.11133 .07200 -.09167 .07200 -.15533 .07200 -.24933* .07200 (I) NT (J) NT 1 2 3 4 5 .995 .432 .599 .176 .019 6 6 6 6 6 .2356 .0976 .1172 .0536 -.0404

-.1822 -.3202 -.3006 -.3642 -.4582 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

N NT

Subset for alpha = 0.05 3 2 1 .5220 .6160 .6600 .6797

.6160 .6600 .6797 .7713

3 3 3 3 3 3

.064 .068 .6600 .6797 .7713 .7980 .100 Duncana 5 4 2 3 6 1 Sig.

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤC LỤC E: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

Descriptives

N Mean Std. Deviation Minimum Maximum 95% Confidence Interval for Mean Upper Lower Bound Bound

.2687 .1652 .4880 .4908 .3655 .1705 .1687 .4883 .5133 .8281 .6687 .9985 .8631 .9608 .7820 .6163 Std. Error .04924 .02843 .13342 .07703 .03636 .02099 .10218 .05899 .10016 .05783 .15908 .09184 .12345 .07127 .14060 .03068 .35 .40 .55 .63 .54 .38 .38 .35 .45 .65 .62 .81 .73 .66 .62 .81 .3910 .4967 .5783 .7447 .6143 .5657 .4753 .5523

3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 Total 21

HD ANOVA

Sum of Squares df Sig.

.032

Mean Square .038 .012 6 14 20 F 3.253 .230 .165 .395

Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable:HD

95% Confidence Interval

Lower Bound

Dunnett t (2-sided)a

Upper Bound .1739 .2796 .3613 .5276 .3973 .3486 (I) NT (J) NT 1 2 3 4 5 6 7 7 7 7 7 7 Mean Difference (I-J) -.08433 .02133 .10300 .26933* .13900 .09033 Std. Sig. Error .845 .08868 .08868 1.000 .717 .08868 .040 .08868 .456 .08868 .807 .08868

-.3426 -.2369 -.1553 .0111 -.1193 -.1679

a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

NT N

Subset for alpha = 0.05 3 2 1 .3910 .4753 .4967 .5657 .5783

.4753 .4967 .5657 .5783 .6143

3 3 3 3 3 3 3

Duncana 1 7 2 6 3 5 4 Sig. .075 .176 .5657 .5783 .6143 .7447 .083

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC F: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp enzyme

protease

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean

Std. Deviation Minimum Maximum

Std. Error .00651 .00376 .07184 .04148 .13903 .08027 .10312 .05954 .30579 .08827 Upper Lower Bound Bound .0368 .0045 .1995 .5565 .4460 1.1367 .8238 .3115 .6337 .2451 .01 .30 .70 .45 .01 .03 .43 .95 .65 .95 N Mean 3 .0207 1 3 .3780 2 3 .7913 3 4 3 .5677 Total 12 .4394

Sum of Squares ANOVA Mean Square df F Sig.

.319 36.330 .000 .958 3

.009 .070 1.029 8 11

HD Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable:HD

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound Sig.

Dunnett t (2-sided)a

-.3265 .0308 .4441 (J) NT 4 4 4 (I) NT 1 2 3 Mean Difference Std. (I-J) Error -.54700* .07656 -.18967 .07656 .22367* .07656 .000 .091 .047

-.7675 -.4101 .0032

a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

Subset for alpha = 0.05

NT N 2 4 3

1 .0207

.3780

.5677

3 3 3 3

Duncana 1 2 4 3 Sig. 1.000 1.000 .7913 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 1.000

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC G: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp

enzyme protease

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

Descriptives

95% Confidence Interval for Mean Upper Lower Bound Bound N Mean Std. Deviation

.8397 3 .8857 3 .9323 3 3 .9577 3 1.0070 3 1.0420 3 1.0363 .9572 21 Std. Error .02346 .01354 .01021 .00590 .01804 .01041 .03512 .02028 .03637 .02100 .02433 .01405 .03215 .01856 .07641 .01667 Minimum Maximum .86 .89 .95 .99 1.04 1.06 1.07 1.07 .81 .87 .92 .92 .97 1.01 1.01 .81 .8979 .9110 .9771 1.0449 1.0974 1.1024 1.1162 .9920 .7814 .8603 .8875 .8704 .9166 .9816 .9565 .9225

1 2 3 4 5 6 7 Total

HD ANOVA

Sum of Squares df Sig.

.000

Mean Square .018 .001 6 14 20 F 24.060 .106 .010 .117

Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

Dependent Variable: HD

95% Confidence Interval

Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

Dunnett t (2-sided)a

(I) NT 1 2 3 4 5 6 (J) NT 7 7 7 7 7 7 Mean Difference (I-J) -.19667* -.15067* -.10400* -.07867* -.02933 .00567 .000 .02217 .000 .02217 .002 .02217 .015 .02217 .02217 .611 .02217 1.000 -.1321 -.0861 -.0394 -.0141 .0352 .0702

-.2612 -.2152 -.1686 -.1432 -.0939 -.0589

a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

Subset for alpha = 0.05

NT N 4 2 3

1 .8397 .8857

.8857 .9323

.9323 .9577

3 3 3 3 3 3 3

Duncana 1 2 3 4 5 7 6 Sig. 1.0070 1.0363 1.0420 .156 .054 .057

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. .272

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC H: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác

enzyme protease

ONEWAY HD BY NT

/STATISTICS DESCRIPTIVES

/MISSING ANALYSIS

/POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05).

Oneway

[DataSet0]

HD Descriptives

Std. 95% Confidence Interval for Mean Upper Lower Bound Bound N Mean Deviation Std. Error

3 59.7249 2.41668 1.39527 53.7215 65.7283 .66296 58.7467 64.4517 3 61.5992 1.14829 3 67.9251 2.26877 1.30988 62.2892 73.5610 3 67.1832 4.27583 2.46865 56.5614 77.8049 .82627 63.1594 70.2698 3 66.7146 1.43115 15 64.6294 4.05478 1.04694 62.3839 66.8749 Minimum Maximum 61.97 62.67 69.35 70.87 68.35 70.87 57.17 60.39 65.31 62.50 65.72 57.17

1 2 3 4 5 Total

HD ANOVA

Sum of Squares df Sig.

.008

164.903 65.274 230.177 Mean Square 41.226 6.527 4 10 14 F 6.316

Between Groups Within Groups Total

Đồ án tốt nghiệp

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

Dependent Variable:HD

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound Sig.

Dunnett t (2- sided)a

Mean Difference (I-J) -6.98971* -5.11537 1.21051 .46858 Std. Error 2.08605 2.08605 2.08605 2.08605 (I) NT (J) NT 1 2 3 4 5 5 5 5 -.9600 .9143 7.2402 6.4983

.024 -13.0194 .102 -11.1451 -4.8192 .937 -5.5611 .998

a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

Subset for alpha = 0.05

N 1 2 NT

59.7249 61.5992

3 3 3 3 3

66.7146 67.1832 67.9251 .592 Duncana 1 2 5 4 3 Sig. .390

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.