Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CỦ ĐẬU VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS.NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

Sinh viên thực hiện: HUỲNH KIM KHÁNH

MSSV: 1211100258 Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung

thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các nghiên, đồ án nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này.

TP.HCM, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản

thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ cá nhân và tập thể.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS. Nguyễn Thị

Thu Hương, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người

đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành

luận văn tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trường Đại học Công

nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm

nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn

thành luận văn này.

TP.HCM, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Kim Khánh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC

MỤC LỤC .................................................................................................................. 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ 4

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. 5

DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. 6

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 7

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 14

1.1. Tổng quan về cây củ đậu ........................................................................... 14

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ....................................................................... 14

1.1.2. Đặc điểm và sinh thái .......................................................................... 15

1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt

Nam….. .............................................................................................................. 16

1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................ 21

1.1.5. Tính vị và công dụng ........................................................................... 21

1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone ............................................... 22

1.2.1. Phenol ................................................................................................... 22

1.2.2. Flavonoid .............................................................................................. 25

1.2.3. Rotenone ............................................................................................... 30

1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật ............. 33

1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng .................................................................... 33

1.3.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng ..................................................................... 35

1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 ...................... 41

1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh .. 45

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.6. Sinh vật thí nghiệm .................................................................................... 47

1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii .................................................. 47

1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm ........................................................ 49

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 56

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 56

2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 56

2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ............................................................... 56

2.3.1. Dụng cụ ................................................................................................ 56

2.3.2. Hóa chất ............................................................................................... 57

2.4. Phương pháp .............................................................................................. 57

2.5. Nội dung thí nghiệm .................................................................................. 58

2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết ........................................... 59

2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ

đậu…… .............................................................................................................. 62

2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu . 63

2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tính .......................................................... 66

2.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn ................................ 68

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 73

3.1. Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi

khác nhau.............................................................................................................. 73

3.2. Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu ................................ 74

3.2.1. Định tính flavonoid .............................................................................. 74

3.2.2. Định tính rotenone ............................................................................... 75

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.3. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao

chiết.. ..................................................................................................................... 76

3.3.1. Hàm lượng chất khô ............................................................................ 76

3.3.2. Định lượng polyphenol tổng số ........................................................... 76

3.3.3. Định lượng Flavonoid tổng số ............................................................ 80

3.4. Khảo sát độc tính ....................................................................................... 84

3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết ................................. 86

3.5.1. Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết ....... 86

3.5.2. Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết ...... 88

3.5.3. Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết ... 89

3.5.4. Không có hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết . 90

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95

PHỤ LỤC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AG: Acid Gallic

BVTV: Bảo vệ thực vật

db: vật liệu

ĐC: Đối chứng

DMSO: Dimethyl sulfoxide

LC50: Lethal concentration

NA: Nutrient Agar

NB: Nutrient Broth

NĐ: Nồng độ

OD: Optical density

HTHC: Hợp chất thứ cấp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối

với ruồi giấm ............................................................................................................. 42

Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng..................................................................... 43

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii ............................... 67

Bảng 3. 1. Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu 75

Bảng 3. 2. Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết ................................ 76

Bảng 3. 3. Kết quả đường chuẩn Acid Gallic ........................................................... 77

Bảng 3. 4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu .... 78

Bảng 3. 5. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin ............................................................ 81

Bảng 3. 6. Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết ......... 82

Bảng 3. 7. Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết ......... 84

Bảng 3. 8. Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết .............................................. 86

Bảng 3. 9. Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết .................... 87

Bảng 3. 10. Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết ............. 88

Bảng 3. 11. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết .............. 89

Bảng 3. 12. Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết ................... 91

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2. 1. Nội dung thí nghiệm ............................................................................... 58

Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu .................................. 59

Sơ đồ 2. 3. Quy trình định lượng polyphenol tổng ................................................... 65

Sơ đồ 2. 4. Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu ....... 69

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1. Cây củ đậu ............................................................................................... 14

Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng..................................... 17

Hình 1. 3. Cây củ đậu được trồng theo luống .......................................................... 19

Hình 1. 4. Củ đậu đến thời gian thu hoạch ............................................................... 20

Hình 1. 5. Tephrosin ................................................................................................. 21

Hình 1. 6. Rotenone .................................................................................................. 21

Hình 1. 7. Củ đậu tốt cho sức khỏe .......................................................................... 22

Hình 1. 8. Một số món ăn được chế biến từ củ đậu.................................................. 22

Hình 1. 9. Một số hợp chất phenol ........................................................................... 24

Hình 1. 10. Một số Eucoflavonoid ........................................................................... 25

Hình 1. 11. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone .................................... 31

Hình 1. 12. Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể ...... 32

Hình 1. 13. Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ ..................................... 32

Hình 1. 14. Chiết 2 lớp chất lỏng ............................................................................. 34

Hình 1. 15. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ....................................................................... 35

Hình 1. 16. Bộ chiết Soxhlet .................................................................................... 37

Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa ............................................................................ 38

Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước ............................................................................. 38

Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn .......................................................... 39

Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn .................................................................................... 40

Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii ....................................................... 48

Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella ............................................................................. 50

Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................... 51

Hình 1. 24. Listeria monocytogenes ......................................................................... 52

Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli ...................................................................... 53

Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa ....................................................................... 54

Hình 2. 1. Lá cây củ đậu ........................................................................................... 56

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm .......................................................................... 60

Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet ...................................................................... 61

Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ ...... 63

Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ ....................................................... 63

Hình 2. 6. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii ................. 68

Hình 3. 1. 4 loại cao chiết ......................................................................................... 73

Hình 3. 2. Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o ... 74

Hình 3. 3. Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit

................................................................................................................................... 75

Hình 3. 4. Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit

................................................................................................................................... 75

Hình 3. 5. Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic .............................................. 77

Hình 3. 6. Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC ................ 77

Hình 3. 7. Đường chuẩn Acid Gallic ........................................................................ 78

Hình 3. 8. Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết ........ 78

Hình 3. 9. Dung dịch Rutin chuẩn ............................................................................ 81

Hình 3. 10. Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết ..................................... 81

Hình 3. 11. Đường chuẩn Rutin ............................................................................... 82

Hình 3. 12. Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết ......... 82

Hình 3. 13. Đường chuẩn của cao chiết A................................................................ 84

Hình 3. 14. Đường chuẩn của cao chiết C ................................................................ 85

Hình 3. 15. So sánh LC50 của 4 loại cao chiết .......................................................... 85

Hình 3. 17. Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết ..................... 87

Hình 3. 18. Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết .................... 88

Hình 3. 19. Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết ......................... 89

Hình 3. 20. Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết .......................... 90

Hình 3. 21. Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết ...... 91

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài

thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia

súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc. Trên thế

giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10 – 12 loài cây được

dùng phổ biến.

Thuốc thảo mộc diệt trừ côn trùng bằng con đường tiếp xúc và vị độc phổ

tác động thường không rộng. Một số loài còn có khả năng diệt cả nhện hại cây.

Sau khi sâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và

làm chết côn trùng.

Cây củ đậu là loại rau củ ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen

thuộc với con người Việt Nam và diện tích trồng trọt rất lớn do mang đến nhiều hiệu

quả kinh tế cao. Tuy nhiên, nông dân chỉ thu hoạch và sử dụng củ (rễ phình to), cắt

bỏ tất cả phần thân trên gồm thân, lá, hạt. Hạt và lá củ đậu có một số thành phần hóa

học tương tự nhau, rất độc, gây ngộ độc và có thể dẫn đến tử vong cho con người nếu

vô tình ăn phải hoặc cố ý ăn với liều lượng lớn. Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần

hóa học và độc tính bên trong hạt và lá củ đậu có thể ứng dụng trong trừ sâu, bệnh

hại thực vật vẫn còn rất hạn chế ở nước ta.

Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các chất độc được tách chiết từ thiên

nhiên vào thuốc bảo vệ thực vật, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học

gây hại cho con người và môi trường luôn được quan tâm. Những hợp chất trừ sâu

thảo mộc thông dụng như rotenone và rotenoit, arteminisinin, azadirachtin…Hiện

diện trong một số bộ phận của một số loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài

cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này

dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt là các tia cực tím), ẩm

độ, nhiệt độ và pH môi trường nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường.[7]

Sau khi thu hoạch nhiều vụ mùa củ đậu trong năm, nông dân thải bỏ số lượng

lớn lá và hạt nhưng chỉ có một số ít nhà nông biết sử dụng hạt củ đậu ngâm nước để

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bảo vệ cây trồng còn rất thủ công và đơn giản. Bên cạnh đó, các công trình nghiên

cứu về lá củ đậu cũng như những thành phần độc tính có giá trị của nó rất ít. Do vậy,

đề tài “Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc

tính trên mô hình in vitro” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu

tạo chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật mang lại nhiều giá trị thực tiễn.

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1. Các nghiên cứu trong nước

- Chuyên đề tốt nghiệp “Thử hiệu lực của một số thuốc trừ sâu có nguồn gốc

thảo mộc đối với sâu hại chính trên lúa và trên rau cải trong vụ mùa năm 2013

tại xã Thanh An – huyện Điện Biên – tỉnh Điện Biên” Đỗ Đức Anh. Đề tài sử

dụng chế phẩm được tách chiết từ hạt củ đậu.

- Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu tác dụng diệt ve kí sinh trên cho

và bò của chế phẩm thuốc mỡ từ cây thuốc cá” Nguyễn Thanh Hải (2007).

Trong đó, độc tính chủ yếu trong chế phẩm là rotenone tương tự như chất độc

bên trong lá củ đậu.

- Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp “Đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ở hai

huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên, thử nghiệm thảo dược trong trị ve cho chó”

Cù Xuân Đức (2011). Thảo dược của đề tài được dùng cho thử nghiệm là hạt

củ đậu.

- Luận án phó Tiến sĩ “ Nghiên cứu sử dụng một số loại cây có hoạt tính độc để

làm thuốc trừ sâu ở phía Bắc Việt Nam” Nguyễn Duy Trang (2016). Trong

đó, đề tài có nghiên cứu về hiệu lực trừ sâu của hạt củ đậu.

2.2. Các nghiên cứu ngoài nước

- Sahu Rc, Hameed SF (1983), “Assessment of the rotenoids of Indian yam bean

seeds”. Đánh giá rotenoid chiết xuất từ hạt củ đậu trừ các loài sâu, bướm.

- Sahu RC, Hameed SF (1989), “Effect of Pachyrrhizus erosus urban seed

extracts against tobacco caterpillar, Spodoptera litura F Tobacco Res

15(1):17-20”. Sự ảnh hưởng của hạt củ đậu đối với sâu.

3. Mục tiêu nghiên cứu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Xác định được hàm lượng các chất polyphenol, flavonoid trong cao chiết lá củ

đậu.

- Đánh giá độc tính và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu làm tiền

đề cho việc nghiên cứu ứng dụng làm dược liệu bổ sung vào BVTV.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên

cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo.

- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp

xác định, khảo sát, phân tích.

- Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và

chiết Soxhlet trong etanol 90o và acetone.

- Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ một số thành phần hóa học chính có trong cao

chiết lá củ đậu.

- Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số từ cao

chiết lá củ đậu.

- Nhiệm vụ 6: Đánh giá độc tính thông qua giá trị LC50 (nồng độ gây chết trung

bình) của cao chiết lá củ đậu, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên mô hình in

vitro.

5. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây củ đậu, thành

phần hóa học của lá và hạt củ đậu, các phương pháp xác định hàm lượng các

hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá độc tính, phương pháp đục lỗ thạch, sinh

vật thí nghiệm.

- Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết

các nhiệm vụ nghiên cứu.

- Phương pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu được sẽ được

xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

6. Kết quả đạt được của đề tài

- Thu nhận được các loại cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và

chiết Soxhlet trong 2 loại dung môi etanol 90o và acetone.

- Định tính được sự có mặt của flavonoid, rotenone có sự hiện diện học trong

cao chiết lá củ đậu.

- Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các loại cao chiết.

- Tìm ra giá trị LC50, so sánh độc tính giữa các loại cao chiết và khả năng kháng

một số loại vi sinh vật của các loại cao chiết.

7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây củ đậu

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây củ đậu hay củ sắn, sắn nước (theo cách gọi miền Nam, danh pháp hai

phần: Pachyrhizus erosus) là một cây dây leo. Loài này được Carl von Linné miêu tả

khoa học đầu tiên. Tên gọi cây gần như chủ yếu nói về củ của nó.[16]

Chi Củ đậu (Pachyrhizus) là một chi nhỏ gồm khoảng 5 – 6 loài dây leo có rể

phình to thành củ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ. Sau khi

người Châu Âu khám phá ra Châu Mỹ một số loài quan trọng trong chi này được giới

thiệu sang Châu Phi, Châu Á và Châu Úc.

Loài Củ đậu hay củ sắn dây (Pachyrhizus erosus) có nguồn gốc từ Mexico và

Trung Mỹ. Người Tây Ban Nha đưa dây củ sắn từ Mexico vào Philippines vào thế kỷ

thứ 18 và từ đó cây củ đậu được lan truyền đến các khu vực khác của Đông Nam Á

và Trung Quốc. Hiện nay, Cây củ đậu được trồng nhiều ở Châu Mỹ, Trung Quốc và

Đông Nam Á.

Ở Việt Nam, Cây củ đậu được người Pháp nhập vào đầu thế kỷ 20 và được

trồng nhiều ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ, ở Miền

Bắc gọi là Cây củ đậu.

Hình 1. 1. Cây củ đậu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phân loại khoa học Giới (regnum) Bộ (ordo) Họ (familia) Phân họ (subfamilia) Tông (tribus) Phân tông (subtribus) Chi (genus) Loài (species) Danh pháp Plantae Fabales Fabaceae Faboideae Phaseoleae Glycininae Pachyrhizus P. erosus Pachyrhizus erosus

1.1.2. Đặc điểm và sinh thái

Cây củ đậu có thể cao 4 – 5 m nếu có giàn. Lá kép gồm 3 chét hình tam giác

rộng, mỏng. Hoa màu tím nhạt; ở Việt Nam thường ra vào tháng 4, tháng 5; hoa khá

lớn, mọc thành chùm dài ở kẽ lá. Quả hơi có lông, không cuống, dài 12 cm, được

ngăn vách nhiều rãnh ngang, thường chứa từ 4 – 9 hạt. Củ do rễ phình to mà thành,

có thể dài tới 2 m và nặng đến 20 kg. Vỏ củ có màu vàng và mỏng như giấy còn ruột

có màu trắng kem hơi giống ruột khoa tây hay quả lê.

Củ đậu có chứa tinh bột 2,4%, 4,51% đường toàn bộ (glucose). Nó có chứa 86

– 90% nước; nó có một ít protein (1,46%) nhưng không có các chất béo.

Trái với củ, phần còn lại của cây củ đậu rất độc; hạt có chứa độc tố rotenone,

dùng để diệt côn trùng và thuốc cá, diệt rệp rau và rệp thuốc lá. Lá có chứa các chất

độc đối với cá và động vật nhai lại (trừ ngựa).

Củ đậu nên được bảo quản ở nơi khô ráo, nhiệt độ khoảng 12°C tới 16°C (53°F

tới 60°F); nhiệt độ thấp hơn làm hư củ. Củ đậu tươi nếu được cất giữ ở nhiệt độ thích

hợp có thể để lâu một hoặc hai tháng.

Cây củ đậu được trồng ở châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á, nơi củ đậu

sống được chế biến thành nhiều món ăn đa dạng, phong phú. Tại Việt Nam, cây củ

đậu được trồng khắp nơi vùng đồng bằng cũng như miền núi để lấy rễ củ ăn, hạt dùng

làm thuốc, nhưng ít dùng vì có độc. Mùa thu hoạch hạt: tháng 11 – 12.[17]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam

1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ

Ở Việt Nam, Cây củ đậu được được trồng nhiều ở các tỉnh Miền Bắc, Đồng

bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ.

Tại huyện Kim Thành, tỉnh Hải Dương, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi

cho phát triển nông nghiệp. Trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp của huyện, các loại

rau, củ, quả hiện là cây trồng ưu tiên hàng đầu, đặc biệt là cây củ đậu. Cây củ đậu có

quy trình canh tác đơn giản, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao.

Theo điều tra khảo sát tại 4 xã thuộc huyện Kim Thành, tổng diện tích trồng

củ đậu đạt trên 347 ha, chiếm 37,5% diện tích gieo trồng vụ đông với bình quân 3,7

sào/hộ. Giống chủ yếu được cung cấp bởi hệ thống đại lý cung ứng thường là giống

của các tỉnh miền Nam. Thời gian trồng chính vụ và trái vụ chênh lệch nhau không

nhiều (khoảng 30 ngày) cho năng suất, chất lượng không cao.

Sau khi áp dụng sản xuất theo quy trình VietGAP cho năng suất cao, đạt hiệu

quả kinh tế lớn hơn so với củ đậu không thực hiện theo VietGAP. Năng suất chính

vụ đạt trên 3.000 kg/sào, trái vụ đạt trên 1.800 kg/sào, do tiết kiệm được chi phí phân

bón, thuốc bảo vệ thực vật, mỗi sào trồng củ đậu theo VietGAP cho lợi nhuận lớn

hơn từ 400 – 500 ngàn đồng, qua đó tăng thu nhập trên 13 triệu đồng/ha/vụ.[18]

Tại Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh. Hiện nay, toàn huyện có gần 200 ha trồng

củ đậu, tập trung ở các xã Tân Việt, Bình Khê, An Sinh, Tràng An, Đức Chính…

Trong đó, xã Tân Việt là địa phương có diện tích trồng củ đậu nhiều nhất huyện với

hơn 72 ha. Được đưa vào trồng ở đồng đất địa phương từ năm 1997, đến nay cả 4

thôn trong xã, bà con nông dân đều tham gia mô hình này. Vụ mùa năm nay, cả xã

Tân Việt gieo trồng 164 ha lúa và rau màu, thì củ đậu chiếm hơn 72 ha với gần 600

hộ nông dân tham gia. So với vụ mùa năm trước, diện tích cây củ đậu tăng gần 10 ha.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng

Theo đánh giá của địa phương, mỗi ha củ đậu cho thu nhập bình quân 150

triệu đồng, năng suất cao gấp 3 – 4 lần so với cấy lúa. Ngoài ra, cây củ đậu cũng được

xã Tân Việt chọn đăng ký sản phẩm trong chương trình “Mỗi xã, thị trấn một sản

phẩm nông nghiệp đặc trưng của huyện”. Theo bà con nông dân ở đây cho biết, mỗi

sào củ đậu sau khi trừ chi phí, người nông dân thu lãi trung bình 4 – 5 triệu đồng.[19]

Vụ mùa năm 2011, người dân ở thôn Mịn To, xã Trù Hựu (Lục Ngạn – Bắc

Giang) đã có nguồn thu bạc tỷ từ củ đậu. Cả thôn Mịn To có 42 hộ trồng cây củ đậu

với tổng diện tích lên đến gần chục ha. Những hộ trồng diện tích nhiều từ 4 sào trở

lên có đến hàng chục hộ. Do điều kiện thời tiết thuận lợi, cộng với việc người dân đã

áp dụng tốt kiến thức khoa học kỹ thuật và kinh nghiệm vào sản xuất, nên cây củ đậu

sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất cao đạt bình quân hơn 3 tấn/sào. Ngoài việc

bán buôn cho tiểu thương vào tận ruộng thu mua, nhiều bà con nơi đây còn thu hoạch

dần và mang đi bán lẻ ở các chợ trong huyện được giá 4 nghìn đồng/kg.

Trước kia, chỉ có vài hộ dân trong thôn Mịn To đưa cây củ đậu về trồng với

diện tích nhỏ lẻ. Nhưng từ năm 2007, thấy việc trồng cây củ đậu không khó lại cho

hiệu quả kinh tế cao nên nhân dân đã học tập nhau cùng mua giống về trồng. Theo

đó diện tích cây củ đậu ngày càng được mở rộng, đến nay đã có gần chục ha.[20]

Năm 2011, Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang phối

hợp với UBND xã Đồng Kỳ xây dựng cánh đồng mẫu củ đậu, diện tích 21,3 ha tại

thôn Ngò 1. Mỗi hộ tham gia được hỗ trợ hơn 100 nghìn đồng/sào và hướng dẫn kỹ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thuật trồng, chăm sóc. Vụ đầu tiên, năng suất đạt 56 tấn/ha, giá tại ruộng bình quân 3

nghìn đồng/kg, một ha củ đậu người dân có thể thu lãi gần 100 triệu đồng/vụ. Nhờ

mang lại hiệu quả kinh tế cao nên xã chủ trương mở rộng diện tích. Hiện xã Đồng Kỳ

trồng hơn 70 ha củ đậu.[21]

Ngoài ra còn một số tỉnh trồng cây củ đậu với diện tích lớn và đạt hiệu quả

kinh tế cao như thị xã Long Khánh tỉnh Đồng Nai, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Thái Bình…

1.1.3.2. Kỹ thuật trồng trọt

Thâm canh cây củ đậu vụ thu đông đã và đang được nhiều địa phương quan

tâm và phát triển trong sản xuất bởi giá trị mang lại của cây trồng này (trừ chi phí thu

lãi trung bình từ 10 – 15 triệu đồng/sào, cá biệt có vụ thu lãi trên 20 triệu đồng/sào).

Trong khi đó trồng củ đậu không đòi hỏi phải tốn nhiều công chăm sóc cũng như

BVTV...Tuy nhiên, để có được năng suất và chất lượng cao cho củ đậu thương phẩm,

nhiều nông dân các vùng sản xuất vẫn còn chưa có nhiều kinh nghiệm.

 Giống: Hiện tại có 2 giống Chiêm xanh Thái Bình và Chiêm lá nhỏ miền Nam

có khả năng chịu được thời tiết khô hạn hoặc ngập úng cũng như lạnh giá.

 Lượng hạt cần cho 1 sào (360 m2) khoảng 3,5 – 4,2 kg hạt.

 Thời vụ trồng: Củ đậu có thể trồng từ tháng 6 – 9 dương lịch.

 Kinh phí đầu tư trung bình khoảng 4 – 4,5 triệu đồng/sào.

 Làm đất: Đất trồng củ đậu tốt nhất là đất cát pha hoặc thịt nhẹ giàu mùn. Đất

được lên luống 2 lần: Lần 1 (luống sơ bộ - lõi luống), lần 2 luống hoàn chỉnh.

 Lên luống sơ bộ: Đất được cày vỡ, phân luống (khoảng 4 m/luống) rồi lên

luống cao khoảng 40 cm. Tiến hành bón lót các loại phân bao gồm:

- 2 – 3 tạ phân chuồng mục

- 12 – 15 kg supe lân

- 12 – 15 kg NPK

- 4 – 5 kg ure.

 Sau đó, cày nhặt xá (cày cách xá) và lên luống hoàn chỉnh sao cho luống

cao khoảng 60 – 70 cm theo hình mai rùa (đỉnh luống rộng khoảng 3 cm),

thân luống rộng 1,8 – 2 m để thoát nước tốt. San phẳng bề mặt luống sao

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cho phân lót được vùi sâu so với bề ngoài mặt luống khoảng 5 – 7 cm để

không thất thoát phân. Đồng thời, hạt không bị thối do rễ chạm phân bón.

 Đặt hạt: Bắt đầu đặt hạt cách dõng luống khoảng 20 – 25 cm. Hạt được đặt

nằm ngang đều và so le nhau sao cho hạt cách hạt từ 8 – 10 cm.

Hình 1. 3. Cây củ đậu được trồng theo luống

 Rắc rạ phủ luống: Trồng củ đậu nhất thiết phải có rạ hoặc rơm phủ kín luống

mới mang lại hiệu quả cao cho củ sau này và thuận tiện cho quá trình chăm

sóc. Rạ phải được phủ dày tối thiểu khoảng 3 – 4 cm. Trung bình để trồng

được 1 sào củ đậu cần khoảng 1,5 sào lúa để rạ (nên chọn rạ ở những ruộng

không bị nhiễm nặng nấm khô vằn).

 Chăm sóc: Cần tưới nước giữ ẩm thường xuyên luống củ đậu giúp cây phát

triển thuận lợi. Sau trồng khoảng 1 tháng, bón phân thúc để nuôi cây với lượng

khoảng 2 kg ure + 3 kg supe lân hoặc phân tổng hợp NPK (cần tưới đủ nước

để lá cây không bị cháy).

Tùy theo thời tiết và chân đất, quan sát màu sắc lá có thể tiến hành bón phân

thúc tiếp cho cây từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 4 khoảng 2 – 3 lượt (không nên bón

đạm quá nhiều cây sẽ không phát triển được củ hoặc củ hay bị thối).

 Bấm ngọn, ngắt hoa: Khi cây củ đậu có khoảng 5 – 6 lá thật, tiến hành bấm

ngọn lần đầu tiên. Sau đó, khi cây bật ngọn phụ và ra hoa thì cần phải bấm và

ngắt bỏ kịp thời để cây xuống củ được thuận lợi. Tuy nhiên, luôn luôn phải

đảm bảo duy trì trên mỗi cây củ đậu phải có từ 10 – 12 lá thật để cây quang

hợp tốt, củ sẽ nhanh to.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Bảo vệ thực vật:

 Sâu hại: Củ đậu thu đông thường hay bị các loại sâu (sâu xanh, sâu khoang,

rệp muội) gây hại. Cần thường xuyên thăm đồng kiểm tra, áp dụng các biện

pháp tổng hợp và trừ sâu kịp thời khi đến ngưỡng.

 Bệnh hại: Một số bệnh chính gây hại củ đậu thu đông đó là: Bệnh chết thắt

thân cây con, bệnh vàng lá, bệnh đốm nâu và bệnh gỉ sắt.

Biện pháp: Sau khi hạt mọc mầm và phát triển thành cây con nên sử dụng

thuốc Validacin để phòng bệnh chết thắt thân cây con (không được sử dụng thuốc

Anvil lúc này sẽ dễ làm cây cháy lá).

 Thu hoạch: Củ đậu có thể thu hoạch sau trồng khoảng 4 tháng. Song, thu hoạch

tốt nhất khi cây được 5,5 – 6 tháng tuổi. Không nên để củ đậu trên 7 tháng tuổi

rồi mới thu hoạch vì lúc này củ đã bị xốp, mất hết chất dinh dưỡng và độ ngọt.

Với trình độ thâm canh của nông dân Tam Kì, trong nhiều năm gần đây đã đạt

được năng suất củ trung bình 3 – 3,5 tấn củ/sào. Cá biệt có những hộ đạt được 5

tấn/sào.[22]

Hình 1. 4. Củ đậu đến thời gian thu hoạch

 Cách để giống

Thu hoạch củ muộn: vào mùa thu, cây ra hoa, ngắt hết hoa, chỉ để lại 1 – 2

chùm, chờ quả chín khô đen, thu hái, đem phơi thật giòn, đập lấy hạt, phơi khô kiệt

dưới nắng nhẹ.

Trồng củ giống: thu hoạch củ sau 4 tháng trồng. Chọn củ to, đẹp, không sâu

bệnh, rũ sạch đất, cắt chừa đoạn gốc cây, không cắt rễ. Mỗi củ trồng trong 1 hốc rộng,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

sâu 50 x 50 cm, đổ khoảng 20 – 30 kg phân mục trộn thêm 0,5 – 1 kg supe lân. Khi

cây mọc chồi, làm giàn cho leo đều, cây sẽ có nhiều chùm quả. Quả chín tới đâu thu

hái và phơi tới đó. Khi cây tàn, mỗi gốc thu chừng 6 – 7 kg hạt và vẫn thu lại được

củ giống to gấp 4 – 5 lần khi đem trồng lại.[23]

1.1.4. Thành phần hóa học

Trong hạt củ đậu có 12,27% độ ẩm; 20,13% chất béo; 30,61% chất protein;

4,8% tanin; 5,85% tinh bột; 3,25% đường toàn bộ (biểu thị bằng đường glucose).

Trong hạt củ đậu có một chất độc gọi là rotenone và tephrosin. Tỷ lệ rotenone trong

hạt củ đậu khoảng từ 0,56 – 1,01%.

Tuy thành phần hóa học trong lá cây củ đậu chưa được định tính nhưng lá cũng

có một số hợp chất tương tự như trong hạt. Một trong số các flavonoid chủ yếu có

trong lá củ đậu là rotenone (C23H22O6).

Hình 1. 5. Tephrosin Hình 1. 6. Rotenone

Trong rễ củ (củ đậu), sau khi đã bóc vỏ có tới 90% nước; 2,4% tinh bột; 4,51%

đường toàn bộ (biểu thị bằng glucose); 1,46% protein; 0,39% hợp chất vô cơ; không

thấy có chất béo, không thấy có tanin, không có acid xyanhydric. Có men peroxydase,

amylase và photphatase. [16]

1.1.5. Tính vị và công dụng

Củ đậu không độc, có vị ngọt nhạt, tính mát, ăn sống thì giải khát, nấu ăn thì

bổ ích tràng vị, dùng xào với thịt, tôm, tép, nấu thay rau ăn ngon miệng. Người ta còn

dùng củ đậu kho với thịt, hầm thịt, làm nộm, làm nhân bánh đa nem, lẫn với thịt nạc

băm, thịt cua biển, thịt tôm tươi và mộc nhĩ, bún tàu làm nhân bánh xèo. Phụ nữ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thường dùng củ đậu tươi thái lát, xoa hoặc ép lấy nước để bôi mặt cho mịn da, khỏi

nứt nẻ. Củ đậu khô có thể tán bột dùng làm phấn bôi mặt, xoa rôm sảy.

Hình 1. 7. Củ đậu tốt cho sức khỏe

Hình 1. 8. Một số món ăn được chế biến từ củ đậu

Hạt cây củ đậu chỉ dùng giã nhỏ nấu với dầu vừng để nguội bôi chữa ghẻ. Có

thể phối hợp với quả Bồ hòn và hạt Máu chó. Lá cây chỉ dùng chữa bệnh ngoài da

chứ không được uống trong. Ở Ấn Độ, người ta dùng hạt giã nhỏ cho vào nước để

thuốc cá. Hạt tán bột đắp trị bệnh ngoài da cũng như chứng nổi rôm; có khi chúng

được dùng như thuốc nhuận tràng và trị giun.

Hạt và lá rất độc đối với động vật như sâu, bọ, cá và với loài nhai lại (trừ ngựa).

Làm thuốc phun trừ rệp rau và rệp thuốc lá. Hạt củ đậu ngâm với nước một đêm, sau

giã nhỏ, thêm nước với tỷ lệ 1,5% đến 2% hoăc 4% trộn đều. Phun lên những cây

bông, cây rau, cây thuốc lá ở ngoài ruộng. Sau 24 giờ đến 36 giờ rệp và nhện đỏ chết

hết hay gần hết (90 – 100%).

1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone

1.2.1. Phenol

1.2.1.1. Đại cương về hợp chất phenol

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các hợp chất phenol là các hợp chất mà trong cấu trúc có một hoặc nhiều vòng

thơm (vòng benzen) mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl –OH. Trong thiên

nhiên các hợp chất phenol là flavonoid, xanthan, coumarin, qiunon, các phenol đơn

vòng, các polyphenol (lignin, tannin…).

Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật,

chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng; vào các quá trình

trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô hấp tế bào (vận chuyển

H+ trong quá trình photphoryl hoá, oxy hoá ...), quá trình quang hợp, điều hòa sinh

trưởng phát triển của thực vật….[6]

1.2.1.2. Phân loại

Dựa vào số lượng nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt thành 2 nhóm: phenol

đơn giản và phenol phức tạp (polyphenol).

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng benzen và 1

hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: monophenol; diphenol (pyrocatechin,

rezoxyn...); triphenol (pyrogalon, oxy hydroquinon...).

Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo,

ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm: monomer

và polymer.

- Monome hay polyphenol đơn giản

 Nhóm C6 – C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm nhóm

cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm.

 Nhóm C6 – C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với nhân

benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao.

 Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các flavonoid và được chia thành các nhóm phụ

như flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím),

catechin (không màu)…

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ như

Tanin, Lignin, Axit Humic….[4]

Hình 1. 9. Một số hợp chất phenol

1.2.1.3. Tính chất hóa lý của polyphenol

Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở

dạng glycoside. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể dựa vào đặc

điểm này để theo dõi chúng trong quá trình tách chiết và cô lập chúng ra khỏi cây cỏ.

Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzyme phenolase vốn luôn

có mặt trong cây vì thế nên sự dụng acol nóng để tách chiết do acol giúp hạn chế tác

dụng của enzyme. Các phenol đều tác dụng với thuốc thử FeCl3 để cho ra màu xanh

lục, tím hoặc đen.[6]

Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặc

điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzen nên chúng có một số

tính chất chung:

 Phản ứng của nhóm hydroxyl

 Phản ứng phá vòng benzen

 Phản ứng tạo phức với kim loại

 Phản ứng este hóa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.2. Flavonoid

1.2.2.1. Đại cương về flavonoid

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều

rau, quả, hoa…Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy

vậy, một số các sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm

này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản.

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen

A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6.

Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm -OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A

và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng

glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D - glucose, kế đó là D - galactose,

L - rhamnose, L - arabinose, D - xylose, D - apiose và acid uronic.[6]

1.2.2.2. Phân loại

Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào cấu

tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm

sau[24]:

 Eucoflavonoid: flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon, antocyanin,

anthocyanidin.

Hình 1. 10. Một số Eucoflavonoid

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh thảo,

cây la apirenin và luteolin.

- Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc - Asteraceac tập trung nhiều

nhất ở vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tương, Trinh nữ hoàng cung,

Dương xỉ…). Không tìm thấy ở động vật.

 Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid.

 Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid

1.2.2.3. Lý tính

Trong tự nhiên các hợp chất này thường tồn tại dưới dạng glycoside, dễ tan

trong nước và dung môi phân cực, dễ bị thủy phân trong môi trường axit, kiềm nhẹ

hoặc bởi enzyme β – glucosidase, emulsin.

Có mùi thơm và vị đắng chát đặc trưng. Do các nối đôi liên hợp mà các

flavonoid thường có màu, đặc biệt là màu vàng. Nếu các nối đôi bị phá vỡ thì hợp

chất sẽ mất màu.

Có khả năng hấp thụ ngoại tử ngoại do có hệ thống nối đôi liên hợp. Thường

thu được 2 dải hấp thụ cực đại, dải 1 có λmax= 240 – 280 nm, dải hấp thụ 2 thường cố

định dài hơn dải 1 và giữ 2 dải thường có 1 vai phụ, đặc biệt là đối với flavon và

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

flavonol. Tùy theo pH của môi trường và điều kiện tạo muối và phức với các kim loại

(K, Na, Fe hoặc Al) mà các bước sóng hấp thụ có thể chuyển dịch.[25]

1.2.2.4. Hóa tính

Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học vì vậy khả năng phản ứng hóa học của

chúng rất lớn.

- Phản ứng oxy hóa: các flavonoid rất dễ bị oxy hóa. Quá trình này có kèm theo

sự mở vòng pyron và đó cũng là nguyên nhân gây ra tác dụng của flavonoid

đối với các enzyme oxy hóa khử (oxydoreductase). Nhiều phản ứng oxy hóa

khác như với AgNO3, KmnO4…vẫn được dùng để định tính và định lượng

flavonoid.

- Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH có nhóm axit nên dễ phản ứng với các

hydroxit kiềm tạo muối tạo muối tan trong nước, khi có nhóm C=O (cacbonyl)

trong phân tử thì tính axit lại càng tăng thêm và flavonoid có thể tan trong

dung dịch NaHCO3.

- Phản ứng este hóa: trong thiên nhiên ít gặp các este của phenol, nhưng trong

thí nghiệm in vitro, các nhóm OH của phenol thường dễ cho este, thường gặp

là este metylic.

- Phản ứng tạo phức với kim loại: Nhóm OH thường tạo phức với AlCl3, NaOH,

KOH,…cho màu vàng đặc trưng và nhóm chức này cũng là nguyên nhân làm

cho các flavonoid tự nhiên có ái lực mạnh với các ion kim loại nặng có hóa trị

2 như Fe, Cu, Zn,…và có thể tạo phức chất bền vững với các nguyên tố thuộc

chu kỳ 4. Những kim loại này thường có trong các tế bào sinh vật dưới dạng

các nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh tồn của tế bào. Mặt khác, các

flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do có hại bằng cách kết

hợp với những ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là những tác nhân xúc tác nhiều

quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do.

- Tạo liên kết hydro: các nhóm OH tự do rất dễ nối với nhau bởi các liên kết

hydro nội phân tử hoặc giữ các phân tử. Hiện tượng này ảnh hưởng nhiều đến

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

những tính chất hóa lý học như độ sôi, độ nóng chảy, tính hòa tan,…Khả năng

phản ứng cũng có thể giảm đi đáng kể.[25]

1.2.2.5. Hoạt tính sinh học

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là "những người thợ sửa chữa

sinh hóa của thiên nhiên" nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại

các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư.

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường.

Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như -OH,

ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hoá…).

Một trong những nhóm flavonoids thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins

(còn được gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe.

Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác.

Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime,

trime…polime được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO.

Năm 1986, Jacques Masquelier là người khám phá ra các đặc tính chống oxy

hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phương pháp hiện đại và phức tạp đã chứng

minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng

PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phương pháp này cho thấy PCO có

khả năng:

- Bắt giữ gốc tự do hydroxyl.

- Bắt giữ lipide peroxide.

- Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide.

- Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt.

- Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men

xanthin oxidase.

- Ức chế sự tổn thương do các enzyme (hyaluronidase, elastase, collagenase...)

có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng

như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có

tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái

hoá gan, tổn thương do bức xạ.

Năm 1936, Szent Gyorgy, dược sĩ người Hungari tách từ ớt và quả chanh một

chất cùng với vitamin C có tác dụng chữa được chứng chảy máu mao mạch, củng cố

thành mạch, ông gọi là vitamin C2 hoặc vitamin P (P là chữ đầu của từ tiếng Pháp

perméabilité - có nghĩa là tính thấm). Về sau người ta thấy trong giới thực vật có

nhiều hợp chất thứ sinh có đặc tính tương tự vitamin P và đặt cho chúng một tên

chung là Flavonoid.

Lavollay, Neumann Porrot (1941, 1942) đã chứng minh catechin có tác dụng

mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch.

Thực nghiệm cho thấy các Flavonoid có các nhóm OH ở vị trí 3,4 có tác dụng

tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác

dụng này.

Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme

này sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của

hyaluronidase.

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp

các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của

tim.... Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm

thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế

bào của nó. Hay nói cách khác, vitamin P và flavonoid nói chung duy trì độ mềm dẻo

của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay

suy yếu tĩnh mạch.

Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức

năng gan.

Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ

rệt, như là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo…

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần

hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu

hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay

cáu gắt…

Quercetin là một flavonoid làm xương sống cho nhiều loại flavonoid khác,

gồm rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này

khác với quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung

quercetin. Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên

cứu, và nhiều chế phẩm từ dược thảo có tác dụng tốt là nhờ vào thành phần quercetin

với hàm lượng cao.

- Quercetin có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng,

giúp tích lũy vitamin C trong các mô tổ chức.

- Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi

phát hiện tượng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất

- Quercetin ức chế men aldose reductase rất mạnh, men này có nhiệm vụ chuyển

trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng.

glucose máu thành sorbitol - một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển

các biến chứng của đái tháo đường (đục thủy tinh thể do đái tháo đường,

thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc, đái tháo đường).[26]

1.2.3. Rotenone

1.2.3.1. Cấu tạo

Tỷ lệ rotenone trong hạt củ đậu khoảng từ 0,56 – 1,01%. Thành phần hóa

học trong lá cây củ đậu cũng tương tự như trong hạt. Rotenone (C23H22O6) thuộc

dẫn chất isoflavonoid. Có phân tử lượng: 394,41 g; Khối lượng riêng: 1,27 g/cm3;

Nhiệt độ nóng chảy: 165 – 166oC; Nhiệt độ sôi: 210 - 220oC; Độ hòa tan: tan nhiều

trong acetone và ít tan trong etanol.[33]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 11. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone

Rotenone là một chất hóa học không mùi được sử dụng nhiều trong thuốc trừ

sâu, piscicide, và pesticide. Nó có trong rễ và hạt của một số loài thực vật như jicama.

Emmanuel Geoffroy đã chiết tách chất này đầu tiên (mà ông gọi là nicouline) từ một

tiêu bản của loài Robinia nicou, hiện là Lonchocarpus nicou, khi ông đến Guiana

thuộc Pháp. Ông đã viết về nghiên cứu này trong luận án của mình, được xuất bản

năm 1895 ngay sau cái chết của ông do bệnh ký sinh trùng. Những nhà nghiên cứu

sau đó xác định chất mà Geoffroy gọi là nicouline là rotenone.[27]

1.2.3.2. Ứng dụng

Tại Hoa Kỳ và Canada, sử dụng tất cả ứng dụng của rotenone ngoại trừ tác

dụng thuốc cá đang được loại bỏ.

Rotenone đã được sử dụng bởi người dân bản địa để bắt cá. Thông thường,

rotenone có chứa trong các cây Fabaceae họ đậu được nghiền nát và được đưa vào

một vùng nước, và rotenone cản trở hô hấp tế bào, cá sẽ bơi lên gần mặt nước để lấy

không khí và chúng dễ dàng bị bắt.

Rotenone đã được sử dụng bởi các cơ quan chính phủ để giết cá trên sông và

hồ ở Hoa Kỳ kể từ năm 1952. Các nhà nghiên cứu cá sử dụng rotenone để lấy mẫu ở

quy mô nhỏ, nghiên cứu đa dạng sinh học của các loài cá biển, sử dụng rotenone để

thu thập các loài cá khó bắt, hoặc ẩn, mà đại diện cho một thành phần quan trọng của

cộng đồng cá ven bờ. Rotenone là công cụ hiệu quả nhất vì liều lượng nhỏ và tác

dụng phụ ít ảnh hưởng đến môi trường.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Rotenone cũng được sử dụng ở dạng bột để điều trị ghẻ và chấy trên người, và

ký sinh bọ ve trên gà, chăn nuôi và nuôi động vật.

Rotenone đã được sử dụng như là thuốc trừ sâu hữu cơ cho khu vườn. Bên

cạnh đó, rotenone còn có tác dụng diệt được một số loại bọ hại cũng như hầu hết các

động vật chân đốt khác. Nó nhanh chóng phân hủy sinh học trong điều kiện có nắng

nhẹ, vì vậy dư lượng có hại là tối thiểu. Một lượng rất nhỏ trên lá của cây sẽ kiểm

soát côn trùng trong vài ngày.[27]

1.2.3.3. Cơ chế tác dụng

Rotenone hoạt động bằng cách can thiệp vào chuỗi vận chuyển điện tử trong

ty thể. Nó ức chế sự chuyển electron từ các trung tâm sắt – lưu huỳnh trong phức hợp

I đến coenzyme Q. Điều này gây trở ngại cho NADH trong quá trình tạo năng lượng

mà tế bào sử dụng được (ATP). Phức hợp I là không thể vượt qua để mang electron

đến một vật mang điện tử tan trong chất béo Coenzyme Q10, các điện tử bị giữ lại

trong ty thể. Oxy di động bị giảm đến mức cực thấp, tạo ra một loại oxy phản ứng,

có thể làm tổn hại DNA và các thành phần khác của ty thể.

Hình 1. 12. Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể

Hình 1. 13. Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Rotenone được sản xuất bằng cách chiết xuất từ rễ và thân cây của một số loài

thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là những người thuộc các chi

Lonchocarpus và chi Derris.[27]

1.2.3.4. Độc tính

Rotenone được phân loại bởi Tổ chức Y tế Thế giới là tương đối nguy hiểm.

Đó là độc tính nhẹ với con người và các động vật có vú, nhưng rất độc đối với côn

trùng và động vật thủy sinh, bao gồm cả cá. Độc tính này cao hơn trong cá và côn

trùng là do lipophilic rotenone có thể dễ dàng thông qua mang hoặc khí quản, nhưng

không phải là dễ dàng qua da hoặc qua đường tiêu hóa. Rotenone gây độc cho tế bào

hồng cầu trong ống nghiệm.

Liều tử vong thấp nhất cho một đứa trẻ là 143 mg/kg. Trường hợp tử vong do

ngộ độc rotenone là rất hiếm bởi vì nó kích thích của gây ra nôn mửa, nếu ăn có chủ

ý của rotenone có thể gây tử vong.

Các hợp chất phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và thời gian khoảng

6 ngày. Nó bị oxy hóa thành rotenolone, cường độ ít độc hại hơn rotenone. Trong

nước, tỷ lệ thủy phân tùy thuộc nhiều yếu tố, bao gồm nhiệt độ, pH và ánh sáng mặt

trời. Độc tính giảm ½ trong nửa ngày trong vùng nước tự nhiên nằm trong khoảng

nhiệt độ 24°C đến 3,5 ngày ở 0°C.[27]

1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật

1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc của sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan

tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các

hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các

hợp chất có tính phân cực mạnh.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 14. Chiết 2 lớp chất lỏng

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô

ban đầu được hoà tan vào pha nước. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại

không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha

nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi).

Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp

trên hoặc ở dưới so với pha nước.

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực ví dụ như: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,

buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi

lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung

môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết

được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4,

CaSO4…, đuổi dung môi ta thu được cao chiết.[6]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.3.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng

1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém,

phức tạp.

Hình 1. 15. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Bột cây được xay thô đạt kích cỡ thích hợp. Mẫu không nên to vì sẽ chiết

không kiệt, mẫu xay quá mịn sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt được lót

bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông

thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng

những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ

rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt.

Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.

Để yên sau một thời gian, thường là 12 – 24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho

dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh

khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết

chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.[6]

1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ,

bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan

một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây.

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ

yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết

được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ được cao chiết. Tiếp theo,

rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa

cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.

Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp

bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm

dung dịch chiết bị trào ra ngoài).

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố

định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể

hòa tan thêm được nhiều hơn: có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết là

chiết nhiều lần, mỗi lần một lượng ít dung môi.

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan

và được tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[6]

1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet

Dụng cụ: Máy có bán sẵn với nhiều cỡ lớn nhỏ khác nhau, từ bình cầu 250 ml

đến 15 lít. Máy gồm ba bộ phận tháo ráp được tại các vị trí nút mài (1), (2) và (3).

Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận

chứa mẫu bột cây, gồm ba ống: ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây;

ống B có đường kính trung bình, để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D

chứa bột cây; ống E có đường kính nhỏ, là ống thông nhau, để dẫn dung môi từ D trả

ngược trở lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngưng hơi.

Thực hành: bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt

trong một túi vải để dễ lấy bột cây ra khỏi máy. Lưu ý: Đặt vài viên bi thủy tinh dưới

đáy ống D đế tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Không được để lượng

bột cây trong ống D cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau E.

Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài

số (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua

ngõ ống thông nhau E. Lưu ý để thể tích lượng dung môi trong bình cầu không được

nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm

bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung

môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo

ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm

lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột cây. Dung môi

ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo

quá trình đun nóng, lượng dung mơi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng

lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E, vì đây là ống thông

nhau. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút

này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D.

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô

tả lúc đầu. Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi

tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết

kiệt chất trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân

cực nào có thể tan được trong eter dầu hỏa nóng).

Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài

(3), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên

kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi

dung môi, thu được cao chiết.[6]

Hình 1. 16. Bộ chiết Soxhlet

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa

Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống như máy chiết

Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây được đặt gần nguồn nhiệt hơn.

Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm

thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống

ngưng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết được rót ra và lọc ngang

giấy lọc. Dung môi được cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần như thế đến khi

chiết kiệt.[6]

Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa

1.3.2.5. Phương pháp chưng cất

Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành

hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ

yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chưng cất.

Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Thực hành: Sự lôi cuốn hơi nước thường được thực hiện trên cây tươi mới thu

hái về. Mẫu cây được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao

cho phần thể tích mẫu cây và nước chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ

thống và cắm bếp điện đun nóng.

Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay

lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở lại thể lỏng,

rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nước và lớp

tinh dầu.[6]

1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

Nguyên lý của phương pháp siêu tới hạn: Đối với một chất thông thường, dưới

mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái

rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy

nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng

không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng

thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả

chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng.

Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn

Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31oC),

áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn.

Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tượng cần tách ra

khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản

phẩm được tháo ra ở bình hứng.[28]

1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn

Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai

pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi

hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn.

Pha rắn (còn được gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính,

hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc

hydrocarbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu

cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ

(thường là cột có kích thước 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đường

kính 3 – 4 cm (đĩa chiết).

Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ,

dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương

tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại

trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu.

Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích được thực hiện bằng một dung môi

thích hợp.[29]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50

Khảo sát một đường thẳng rõ ràng là dễ hơn khảo sát một đường cong. Hơn

nữa, các sự tính toán, loại suy hoặc suy diễn dựa trên đường thẳng bao giờ cũng thuận

tiện, nhanh chóng và chính xác hơn là thực hiện điều đó trên các đường cong. Do vậy

mà trong nghiên cứu khoa học người ta thường tìm cách tuyến tính hóa các đường

cong gặp phải. Ở đây như chúng ta đã thấy, bản chất của “giải tích Probit” chính là

vấn đề tuyến tính hóa đường cong Sigmoid.[2]

Từ đó chúng ta cũng có thể áp dụng giải tích Probit để xử lí số liệu nghiên cứu

của chúng ta nhất thiết phải tuân theo luật phân phối chuẩn (còn gọi là phân phối bình

thường, phân phối hình chuông hay phân phối Gauss). Ở phân phối này, trị trung bình

bao giờ cũng chiếm tỉ lệ (tần số hay mật độ) cao nhất, càng xa trị trung bình, hay nói

một cách nôm na là “thái quá”, thì chiếm tỉ lệ càng ít đi. Điều này thường hay gặp

trong thế giới tự nhiên, đến nỗi chúng ta cảm thấy điều đó là hết sức “bình thường”.

Chẳng hạn, trong một quần thể nào đó bao giờ cá thể có kích thước trung bình cũng

chiếm đa số, càng thái quá (kích thước quá lớn hay quá nhỏ) thì chiếm tỉ lệ càng ít đi.

Tương tự như vậy khi xét tới các khía cạnh khác như tình trạng sức khỏe, sức sống,

sức chịu đựng của quần thể.

Trong những trường hợp mà số liệu nghiên cứu của chúng ta không tuân theo

luật phân phối bình thường, thì nhất thiết phải tiến hành “bình thường hóa” các số

liệu đó bằng cách lấy căn bậc hai, căn bậc ba, lấy logarit…cho số liệu nghiên cứu,

nghĩa là thay các “x” bằng các “đại diện cho x”, điều này chúng tôi đã trình bày chi

tiết ở chương “ thiết lập mô hình toán học”. Chẳng hạn, khi tác động chất độc vào

quần thể sinh vậy như côn trùng, nấm, vi khuẩn, chuột, chim, thú, tôm, cá…thì nồng

độ hay liều lượng chất độc không phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần

thể (biểu hiện ở tỉ lệ chết). Thực nghiệm cho thấy rằng trong đa số các trường hợp,

logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng của chất độc mới phản ánh đúng bản

chất sức chịu đựng của quần thế sinh vật, nghĩa là logarit thập phân của nồng độ hay

liều lượng độc chất mới đúng là thước đo dùng để đo sức chịu đựng của quần thể sinh

vật, nói một cách khác, thang đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật tương ứng với

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thang logarit nồng độ hay liều lượng độc chất. Như vậy, sức chịu đựng của quần thể

sinh vật phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng độc chất.

Tương tự như vậy, khi tác động vào quần thể sinh vật các loại chất kích thích,

các loại hormon, pheromon, các loại vitamin, các loại huyết thanh, các loại thuốc

kháng sinh…thì trong đa số các trường hợp, mức độ phản ứng hay đáp ứng của quần

thể sinh vật (biểu hiện ở tỉ lệ đáp ứng, tỉ lệ được cứu sống hay bình phục…) cũng

phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng các chất tác động

vào quần thể sinh vật đó.[2]

Về phương diện lý thuyết cũng như về mặt thực hành, dù sao chúng ta cũng

phải luôn luôn “cảnh giác” một điều là, mặc dù thang “logarit” được sử dụng rất phổ

biến và có hiệu quả trong việc “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu, chúng ta cũng

đừng bao giờ tuyệt đối hóa thang “logarit”, mà phải luôn luôn thận trọng là, trong

những trường hợp cụ thể có thể sử dụng các thang khác, chẳng hạn như thang “căn

bậc hai”, thang “căn bậc ba”…để “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu tốt hơn là sử

dụng thang “logarit”.

Để có thể đưa ra các kết luận một cách khách quan, tiến hành “phân tích biến

lượng” cho mô hình toán học đã được thiết lập.[2]

Dưới đây là một số ví dụ minh họa.

Ví dụ 1: Xác định hiệu quả tác động của chất độc vào quần thể sinh vật.

Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi giấm

Số ruồi Số tử vong % tử vong

Nicotin Sulphat g/200cc 0.6 0.8 1.1 1.4 1.3 150 150 150 150 150 97 120 133 137 145 64.7 80.0 88.7 91.3 96.7

log10 (nồng độ x100) X 1.78 1.90 2.04 2.15 2.25 10.12 2.02 Probit Y 5.38 5.82 6.17 6.36 6.85 30.58 6.12 Tổng Trung bình

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Xét mô hình toán học dạng Y = a + bX. Tiến hành thiết lập “hệ bình thường”

(xem mục “Thiết lập mô hình toán học”) và giải hệ ta được a = 0.2916 và b = 2.8826.

Như vậy, mô hình toán học cho trường hợp này có thể là

Y = 0.2916 + 2.8826X

Bây giờ chúng ta cần thẩm định lại xem là mô hình này có thích hợp hay không

bằng cách phân tích nguồn biến lượng của mô hình như sau:

- SS (tổng)

= ∑(Y – 𝑌̅)2

= ∑Y2 – (∑Y)2/n

= (5.38)2 +…+ (6.85)2 – (30.58)2/5

= 1.20992

- SS (mô hình)

= ∑(Y – 𝑌̅)2

= b∑(X – 𝑋̅)(Y – 𝑌̅)

= b[∑XY – (∑X)( ∑Y)/n]

= 2.8826[62.4048 – (10.12)(30.58)/5]

= 1.18004

- SS (sai lệch)

= ∑(Y – Y)2 = ∑(Y – 𝑌̅)2 – ∑(Y – 𝑌̅)2

= 1.20992 – 1.18094

= 0.02898

Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng

Nguồn biến lượng Mô hình Sai lệch Tổng Độ tự do 1 3 4 Tổng các bình phương 1.18094 0.02898 1.20992 Biến lượng 1.18094 0.00966

F = 1.18094 / 0.00966 = 122.25 ; P < 0.005 |𝑅| = 1.18094 / 1.20992 = 0.9879

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Từ kết quả trắc nghiệm F chúng ta thấy rằng, khả năng không tương thích của

mô hình toán học đã được thiết lập trong thực tế là rất nhỏ (P < 0.005), do đó, mô

hình toán học này là có thể chấp nhận được.

Từ mộ hình toán học này chúng ta có thể tính được các ?

50% tử vong → Probit Y = 5, khi đó:

5 = 0.2916 + 2.8826X

Hay X = (5 – 0.2916)/2.8826 = 1.63

Vì rằng X = log10(nồng độ . 102)

nồng độ = 10X/102 Do đó:

Hay LD50 = 101.63/102 = 0.43 g/200ml

Tương tự:

90% tử vong → Probit Y = 6.28, khi đó:

6.28 = 0.2916 + 2.8826X

X = (6.28 – 0.2916)/2.8826 = 2.08 Hay

Từ đó

LD90 = 102.08/102 = 1.20 g/200ml

Liều gây chết trung bình (được viết tắt là LD50, LC50 hay LCt50) của một chất

là một liều cần thiết giết chết phân nửa số cá thể được dùng làm thí nghiệm trong một

thời gian thí nghiệm. Thí nghiệm này được J.W. Trevan đưa ra năm 1927. Loại thuốc

có trị số LC50 càng thấp là thuốc có độ độc cấp tính càng cao. Ứng dụng trong một số

lĩnh vực như:

- Môi trường: Để đánh giá mức độ độc của các chất trong không khí và nước.

- Nông nghiệp: biểu thị độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động

vật máu nóng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh

1.5.1. Cơ chế kháng vi sinh vật

Hình 1.21 Cơ chế kháng khuẩn

Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và

làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong

các hợp chất phenolic đã được chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme như

ATPases nằm trong màng tế bào chất và được bao quanh bởi các phân tử lipid. Các

phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hưởng

đến tương tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tương tác trực tiếp của các hợp

chất lipophilic với phần kỵ nước của protein.[13,14]

1.5.2. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng

thạch

1.5.2.1. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn khảo sát

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được tăng sinh trong môi trường phù hợp. Mật

độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp

lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng là 106 cfu/ml.

Các chủng vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh trên môi trường TSB được pha

loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml. Sau đó

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

100 µl dịch này được cấy trang trên môi trường phù hợp. Đem ủ ở nhiệt độ 300C

trong 24 giờ.

Xác định mật độ các chủng vi khuẩn chỉ thị rồi tiến hành cấy trang 100 µl trên

môi trường phù hợp. Chờ cho đĩa thạch thật khô, sử dụng một ống trụ đường kính 5

mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch.

Đối với các đĩa thạch chứa vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy, chọn những vùng vi

khuẩn phát triển dầy đặc, tiến hành đục các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Dùng

kẹp vô trùng gắp từng khối thạch đặt vào trong các giếng trên đĩa đã trang các chủng

vi khuẩn chỉ thị. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau thời gian 24 giờ, đo các

vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch.[5]

1.5.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn khảo sát sau ly tâm

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Mật

độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp

lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng lần lượt là 106 cfu/ml.

Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi trong môi trường thích hợp trên tủ ấm

lắc trong 24 giờ. Sau đó, pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có

được mật độ 107 cfu/ml. Cấy chuyển 100 µl vào bình tam giác chứa môi trường thích

hợp và nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ 300C trong 24 giờ.

Đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị sau khi xác định mật độ, tiếng hành cấy

trang 100 µl trên môi trường thích hợp. Chờ cho đĩa khô, dùng một ống trụ đường

kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch.

Hút 100 µl dịch nổi sau khi ly tâm cho vào các lỗ thạch sau khi đục. Sau đó,

đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau 24 giờ đo các vòng kháng khuẩn xung quanh

lỗ thạch.[5]

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn khảo sát thông qua khả năng tạo

vòng tròng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị. Một đơn vị hoạt tính kháng khuẩn được

định nghĩa như một đơn vị hoạt tính AU (Arbitrary unit). Một AU là một đơn vị diện

tích của vùng ức chế trên mỗi đơn vị thể tích, trong trường hợp này là mm2/ml. Hoạt

tính kháng khuẩn được tính theo công thức sau (Usmiati à Marwat, 2009):

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

𝐿𝑧−𝐿𝑠 Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) = 𝑉

Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2)

Ls: diện tích lỗ (mm2)

V: thể tích mẫu cho vào (ml)

1.5.3. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục

Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp

đo độ đục được thực hiện như sau:

Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong erlen chứa 10 ml môi

trường phù hợp ở 300C trong 24 giờ, sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối, thu

lấy dịch trong. Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml

dịch sau ly tâm cho vào ống chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 200 µl vi khuẩn chỉ thị

đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 107 cfu/ml cho

vào ống nghiệm đã chứa sẵn dịch sau ly tâm vi khuẩn và môi trường TSB. Tiến hành

ủ ở 370C trong 24 giờ và đo OD600nm để xác định tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị.[5]

Đánh giá phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau

(Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012):

𝑂𝐷𝑇𝑁 𝑂𝐷𝐷𝐶

% tỷ lệ ức chế = (1 – ) x100%

1.6. Sinh vật thí nghiệm

1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii

1.6.1.1. Đặc điểm sinh học

Artemia Nauplii là tên khoa học của một loài giáp xác có tính rộng muối (từ

vài phần ngàn đến 250‰). Chúng thường sống ở biển tự nhiên hoặc được nuôi trong

ruộng muối. Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ lững

trong nước và các sinh vật cỡ như tảo và vi khuẩn.

Với chu trình biến thái ngắn, sau 10 – 15 ngày chúng có thể đạt giai đoạn

trưởng thành và tham gia sinh sản, tùy theo điều kiện môi trường Artemia có sự sinh

trưởng và sinh sản khác nhau, có dòng đơn tính, dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Khi nồng độ muối cao hơn 70‰ và dinh dưỡng kém, nhiệt độ cao thì Artemia có xu

hướng đẻ trứng bào xác.

Ấu trùng Artemia vừa mới đẻ hay mới nở có kích thước 400 - 500 µm, con

trưởng thành dài không quá 20 mm. Trong quá trình phát triển Artemia trải qua 15

lần lột xác, sau mỗi lần thay đổi cả về hình dạng lẫn kích thước. Artemia có thể sinh

sản lần đầu sau 8 ngày phát triển, thường là sau 12 – 15 ngày. Mỗi lần đẻ khoảng 300

trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4 ngày/lần. Trong điều kiện tốt Artemia sống được vài

tháng (6 tháng).[30]

Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii

1.6.1.2. Trứng bào xác

Cấu trúc gồm 2 phần vỏ trứng và phần phôi.

Vỏ trứng gồm 3 lớp: lớp chlorin, lớp màng ngoài bì và lớp màng phôi.

- Lớp chlorin cứng, màu nâu nhạt đến nâu đen. Lớp này có vai trò bảo vệ phôi

khỏi bị tác động cơ học và phóng xạ. Khi bị oxy hóa bởi thuốc tẩy, lớp này sẽ

bị phá hủy.

- Lớp màng ngoài bì có tác dụng bảo vệ phôi không bị các phân tử lớn hơn phân

tử CO2 xâm nhập vào.

- Màng phôi là một lớp trong suốt và cách biệt với phôi bởi màng nội bì. Màng

này sẽ biến thành màng nở trong quá trình trứng nở.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phôi là một phôi vị đồng nhất. Phôi sẽ ngừng trao đổi chất khi hàm lượng nước

trong trứng dưới 10%. Khi hàm lượng nước trên 10% phôi sẽ bắt đầu hoạt động và

trong điều kiện có oxy sẽ làm phá vỡ hệ enzym chuyên biệt trong trứng bào xác.[30]

1.6.1.3. Phương pháp sử dụng trứng bào xác

Sự phát triển của trứng bào xác: sau khi ấp trứng từ 1 – 2 giờ, trứng sẽ hút

nước. Sau 12 – 15 giờ vỏ trứng vỡ ra, xuất hiện tiền ấu trùng nằm trong màng nở. Khi

màng nở vỡ ra. Ấu trùng sẽ bơi tự do trong nước.

Các thông số môi trường về điều kiện nở trứng Artemia:

- Nhiệt độ: thích hợp là 25 – 30oC. Dưới 25oC trứng chậm nở. Trên 35oC trứng

ngừng trao đổi chất.

- Độ mặn: Độ mặn 5 – 35‰ sẽ cho tỉ lệ nở và hiệu xuất cao hơn. Ấu trùng cũng

chứa nhiều năng lượng hơn.

- pH: thích hợp 8 – 8,5.

- Oxy: Hàm lượng Oxy³ 2 mg/l. Do đó nên điều chỉnh tốc độ sục khí cho thích

hợp.

- Mật độ trứng ấp: Mật độ trứng ấp không nên quá 5 gr/l

- Ánh sáng: Cường độ chiếu sáng trên mặt nước 2000 lux thì thích hợp nhất.[30]

1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm

1.6.2.1. SALMONELLA

Về phân loại khoa học

Vực (domain) Liên giới(superregnum) Giới (regnum) Ngành (phylum) Lớp (class) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Bacteria Bacteria Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Salmonella

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella

Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực

khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao.

Salmonella không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhưng lên men được

dulcitol, mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa

chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite…

Để có thể gây ngộ độc, số lượng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong

1 g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thương hàn do

S.typhi, nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và

S.enteritidis. Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn

nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu

chứng thường kéo dài 2 – 7 ngày.[5]

1.6.2.2. Staphylococcus aureus

Phân loại khoa học

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Firmicutes

Lớp (class) Bacilli

Bộ (ordo) Bacillales

Họ (familia) Staphylococcaceae

Chi (genus) Staphylococcus

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng chùm

có mặt phổ biến ở khắp nơi thường thấy trên da, xoang mũi và tóc…

Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đường ruột enterotoxin bền

nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc

tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy,

nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[5]

Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng

tiết ra enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu

chuẩn để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác.

1.6.2.3. Listeria monocytogenes

Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học

của Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau:

Giới (regnum) Ngành (phylum) Lớp (class) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Listeriaceae Listeria

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1. 24. Listeria monocytogenes

Trong những năm gần đây, Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân

gây bệnh ở trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Đây là

một loại trực khuẩn gram dương, ngắn, nhỏ không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển

động xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo.

Listeria monocytogenes thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2,50C

và cao đến 440C.

Cách thức gây bệnh của Listeria monocytogenes hoàn toàn khác với các loài

vi khuẩn gây bệnh khác. Các loài vi sinh vật gây bệnh khác chỉ gây bệnh khi con

người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh là có các triệu chứng lâm sàng biểu

hiện. Ngược lại ở Listeria monocytogenes thì chỉ hiện diện với một sớ lượng nhỏ

trong thực phẩm, khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại và chờ cơ hội. Khi có điều

kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm và các mô sâu và gây bệnh. Các triệu chứng

xuất hiện từ đường tiêu hóa như tiêu chảy, sốt nhẹ. Sau đó, chúng xâm nhiễm vào các

đại thực.[5]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.6.2.4. Escherichia Coli

Phân loại khoa học

Vực (domain) Ngành (phylum) Lớp (class) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Loài (species) Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia E. Coli

Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli

E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ

biến trong tự nhiên đặc biệt trong đường tiêu hóa của con người và động vật. Hầu hết

các dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa,

chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đường tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn

tại ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và cho động vật:

- Enteropathogenic E.Coli (EPEC)

- Enterotocigenic E.Coli (ETEC)

- Enteroinvasive E.Coli (EIEC)

- Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC) hay

E.Coli O157:H&

Như vậy, có thể được phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường

sống, phân hoặc nước thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trường. Với

sự phân bố rộng rãi như vậy nên E.Coli cũng được dễ dàng phân lập từ các mẫu thực

phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nước.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con người qua con đường tiêu

hóa gây ra các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện

từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người tùy thuộc vào liều lượng,

dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng người.[5]

1.6.2.5. Pseudomonas aeruginosa

- Phân loại

Giới (regnum) Ngành (phylum) Lớp (class) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Loài (species) Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa

Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa

Là trực khuẩn gram âm, di động, không sinh bào tử, đứng một mình hay thành

đôi hoặc thành các chuỗi ngắn. Hình thể có thể thay đổi trong phase ổn định.

Có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố bao gồm: pyocyanin, fluorescein,

pyoverdin.

Thường gây bệnh nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu,

đường hô hấp. Chúng cũng gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não.[5]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 7 năm 2016 tại trung

tâm thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

- Lá sắn thu hái tại thị xã Long Khánh, tỉnh Đồng Nai.

- Lá sắn thu hái lúc 9 – 10 giờ sáng, lá trưởng thành.

Hình 2. 1. Lá cây củ đậu

2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2.3.1. Dụng cụ

- Bộ chiết Soxhlet

- Bộ lôi cuốn hơi nước

- Bể điều nhiệt

- Bếp đun cách thủy

- Cân phân tích

- Máy quang phổ UV – Vis 2000, máy lắc

- Bộ sục khí

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Pipet, micropipet, ống nhỏ giọt, đũa thủy tinh, que cấy trang

- Tủ ủ 37oC, tủ sấy 101oC, bình hút ẩm

- Ống nghiệm sạch, erlen

- Cốc thủy tinh, ly nhựa trong

- Kính đồng hồ

- Đĩa petri sạch

2.3.2. Hóa chất

- Thuốc thử Folin – Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa

- Dung dịch AlCl3 2%; nước cất

- 1% NaOH/etanol 96o

- Etanol 96o, 90o, 70o; acetone

- Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit

- Muối biển

2.4. Phương pháp

Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

- Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: thu thập, chọn lọc và nghiên cứu các

tài liệu liên quan đến cơ sở của đề tài như: tổng quan về cây củ đậu và các

hợp chất thứ cấp có trong lá, phương pháp tách chiết, phương pháp đánh

giá độc tính, kháng khuẩn, sinh vật thử nghiệm…

- Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành triển khai các nội dung

thí nghiệm, thiết kế, bố trí các nghiệm thức (xem sơ đồ), theo dõi và ghi

nhận kết quả các thí nghiệm.

- Phương pháp xử lý số liệu: dùng các phần mềm SAS, excel để tiến hành

phân tích kết quả nghiên cứu, nhằm đưa ra kết luận cho các nội dung và

các thí nghiệm nghiên cứu.

- Phương pháp so sánh, đối chiếu: từ kết qủa thực nghiệm đạt được sẽ tiến

hành so sánh với cơ sở khoa học liên quan cũng như đối chiếu với kết quả

của các công trình nghiên cứu khác nhằm đưa ra kết luận cho đề tài.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

a a s s o o n n i i g g u u r r e e a a

a l l e n o m l a S

s s a a n n o o m m o o d d u u e e s s P P

t e l h x o S

s e n e g o t y c o n o m a i r e t s i

s u e r u a s u c c o c o l y h p a t S

i l o C E c i n e g i x o t o r e t n E

o 0 9 l o n a t E

m ầ d m â g N

t ế i h C

2.5. Nội dung thí nghiệm

t t ấ ấ h h c c

g g n n ổ ổ t t

ô h k

t t ế ế i i h h c c

t ế i h c

g g n n ợ ợ ư ư l l

d i o n o v a l

e e n n o o n n e e t t o o R R

d d i i o o n n o o v v a a l l

m ệ i h g n

F F

h h c c á á t t i i ô ô m m g g n n u u D D

m m à à H H

i i i i l l p p u u a a N N a a i i m m e e t t r r A A

g g n n ổ ổ t t l l o o n n e e h h p p y y l l o o P P

h h c c á á t t p p á á h h p p g g n n ơ ơ ư ư h h P P

í h t

g n u d

i ộ N

e n o t e c A

.

1 .

2 ồ đ ơ S

u a h n c á h k

ủ c á l ừ t t ế i h c

n n ẩ ẩ u u h h k k

o a c

p á h p g n ơ ư h p c á c

h h n n í í t t c c ộ ộ đ đ ử ử h h T T

C C T T C C H H ố ố s s t t ộ ộ m m h h n n í í t t

g g n n á á h h K K

i ô m g n u d

C C T T C C H H ố ố s s t t ộ ộ m m g g n n ợ ợ ư ư l l

g n ằ b

à v

h h n n ị ị Đ Đ

u ậ đ

n ậ h n u h T

h h n n ị ị Đ Đ

u ứ c

n u ê ứ i c h g n n ê i g h n g u n d g i n ộ u N d

i ộ N

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết

2.5.1.1. Sơ đồ quy trình

Lá sắn phơi trong bóng râm

Nghiền nhỏ

Ngâm dầm

Chiết soxhlet

50 – 80oC, 8h

to phòng, 24h

Etanol 90o

Acetone

Etanol 90o

Acetone

Thu dịch chiết

Lọc

Cô dịch chiết loại dung môi

Cao chiết

Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.5.1.2. Thuyết minh quy trình

 Nguyên liệu

Lá củ đậu được thu hái vào khoảng 9 – 10 giờ sáng. Lựa chọn những lá xanh

và loại bỏ những lá vàng héo, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm. Sử dụng 100 g lá

củ đậu cho quá trình tách chiết.

 Nghiền

Sử dụng cối sứ nghiền nhỏ lá củ đậu. Quá trình nghiền sẽ phá vỡ tế bào lá, tạo

điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết.

 Tách chiết

Chiết các hợp chất có trong lá củ dậu nhờ dung môi etanol 90o và acetone, sử

dụng hai phương pháp là ngâm dầm và chiết với bộ Soxhlet, nhằm khảo sát dung môi

và phương pháp nào phù hợp với từng đối tượng lá củ đậu. Cách thực hiện :

- Ngâm dầm

Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ và 300 ml dung môi cho vào erlen

1000 ml, sử dụng hai loại dung môi là etanol 90o và acetone, đậy kín miệng và bọc

vải đen xung quanh bình erlen. Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 giờ,

trên máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng.

Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Chiết Soxhlet

Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ vào một túi vải mỏng và lấp vào hệ

thống chiết Soxhlet, bình cầu chứa 300 ml lần lượt các dung môi etanol 90o và

acetone. Phải đảm bảo hệ thống được lắp đặt kín, luôn có nước ở ống sinh hàn. Quá

trình chiết được diễn ra trong thời gian 8 giờ, nhiệt độ của quá trình chiết phụ thuộc

vào nhiệt độ bay hơi của dung môi, đối với etanol 90o là 80oC và acetone là 56oC.

Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet

 Lọc

Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch

chiết, sử dụng giấy lọc và máy hút chân không để lọc nhanh dịch chiết, thu dịch trong

để chuẩn bị quá trình loại dung môi.

 Cô dịch chiết

Nhằm thu hồi dung môi etanol 90o, acetone để tái sử dụng và thu cao chiết cho

thí nghiệm. Sử dụng bộ lôi cuốn hơi nước để tách dung môi ra khỏi dịch chiết ở nhiệt

độ 50 – 80oC, cô đến khi dịch chiết còn thể tích là V = 50 ml. Thu được cao chiết

dạng lỏng và đậm đặc.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu

2.5.2.1. Flavonoid

 Nguyên tắc

Flavonoid thường tan trong etanol và nhóm OH trong flavonoid thường tạo

phức với AlCl3, NaOH, KOH,…cho màu vàng.

 Dụng cụ và hóa chất:

- Ống nghiệm sạch

- 1% NaOH/etanol 96o

 Tiến hành:

Nhỏ khoảng 2 ml mẫu vào 6 ml 1% NaOH/etanol 96o, dung dịch sẽ có màu

vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon,

leucoantocanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho

màu đỏ đến đỏ tím.[6]

2.5.2.2. Rotenone

 Dụng cụ và hóa chất

- Kính đồng hồ

- Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit

 Tiến hành

Định tính rotenone trong bên trong lá bằng phương pháp Durham Howard

Ngâm 0,5 g lá cây củ đậu nghiền nhỏ với 5 ml chloroform khoảng 30 phút,

lọc. Phần lọc được cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc sẽ xuất

hiện màu vàng nâu và nâu tím sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit.[7]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ

Định tính rotenone trong cao chiết lá cây củ đậu

Hút 5 ml cao chiết và cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc

sẽ xuất hiện màu nâu tím và ngả màu vàng nâu sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit.

Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ

2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu

2.5.3.1. Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp cân và sấy

 Nguyên tắc: Xác định hàm lượng chất khô gián tiếp dựa vào khối lượng xác

định ban đầu (khối lượng cốc sứ hoặc đĩa petri) và khối lượng sau khi làm bay

hơi hàm lượng ẩm, nước kết tinh hoặc các tập chất bay hơi khác…bằng phương

pháp cân và sấy.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Tiến hành:

- Hút 1ml dịch mẫu vào đĩa petri sạch đã được sấy khô và biết rõ khối lượng.

Cho đĩa vào tủ sấy nhiệt độ 101oC trong 45 phút. Sau đó, cân lại đĩa petri và

ghi nhận khối lượng mới của đĩa petri.

- Tiếp tục cho đĩa petri vào tủ sấy cho đến khi khối lượng không đổi.

- Quan sát, ghi nhận và tính toán kết quả theo công thức

Hàm lượng chất khô = a – b (g/ml)

a: Khối lượng đĩa petri và 1 ml mẫu sau khi sấy khô đến không đổi.

b: Khối lượng đĩa petri ban đầu.

2.5.3.2. Định lượng polyphenol tổng số

 Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử

Folin - Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. Đo độ hấp thụ ánh sáng

dung dịch màu xanh lam ở bước sóng λ = 765 nm. Hàm lượng polyphenol

được tính toán theo đường chuẩn acid Gallic.[15]

 Đường chuẩn acid Gallic:

- Chuẩn bị các dung dịch acid Gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,2; 0,3;

0,4; 0,5 mg/ml,

- Cho 60 𝜇𝑙 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74 ml nước cất, sau đó

cho 300 𝜇𝑙 thuốc thử Folin - Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giấy

đến 8 phút cho vào 900 𝜇𝑙 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng

được giữ ở 400C trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng λ = 765 nm

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên

cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm

thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường

chuẩn acid Gallic trên.

 Thí nghiệm:

 Dụng cụ và hóa chất

- Ống nghiệm sạch

- Thuốc thử Folin – Ciocateau, Na2CO3 bão hòa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1ml mẫu

 Tiến hành

1ml H20

1 2

1ml H20 10ml H20 1ml mẫu 10-1

10-1 ĐC 120µl H2O 10-2

3 4

120µl 120µl

9,5ml H20

3 4

600µl Folin-Ciocateau

Đo OD

Sơ đồ 2. 3. Quy trình định lượng polyphenol tổng

Chuẩn bị 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml H2O.

- Ống nghiệm 1: Hút bỏ 1 ml H2O thay bằng 1 ml mẫu => pha loãng mẫu thành

nồng độ 10-1.

- Ống nghiệm 2: Hút bỏ 1 ml H2O thay bằng 1 ml mẫu ở nồng độ 10-1 để tiếp

tục pha loãng mẫu thành nồng độ 10-2. Mỗi loại cao chiết được thí nghiệm ở 2

nồng độ 10-1 và 10-2.

Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9,5 ml H2O.

- Ống nghiệm 3: Thêm vào 120 µl mẫu nồng độ 10-1.

- Ống nghiệm 4: Thêm vào 120 µl mẫu nồng độ 10-2.

- Ống nghiệm 5: Thêm vào 120 µl H2O làm mẫu đối chứng.

Sau đó, thêm vào 3 ống nghiệm mỗi ống nghiệm 600 µl thuốc thử Folin –

Ciocateau và 1,8 ml Na2CO3 bão hòa, ủ ở 40oC trong thời gian 30 phút. Đo độ hấp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

thụ ánh sáng ở bước sóng 765 nm. Quan sát, ghi nhận lựa chọn kết quả khả quan và

tính toán kết quả dựa trên đường chuẩn acid Galic.

2.5.3.3. Định lượng flavonoid tổng số

 Nguyên tắc: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3

tại bước sóng λ = 420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng (theo phương pháp

của Woisky and Salatino).

 Dựng đường chuẩn Rutin

- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng etanol 960 theo dãy nồng độ sau: 0;

0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 (mg/ml)

- Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào 6 ống nghiệm sạch

- Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, So màu ở bước sóng λ = 420 nm,

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên

cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm

thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính toán dựa theo đường

chuẩn Rutin.

 Tiến hành:

- Pha các dịch mẫu về nồng độ 0,5 mg/ml hàm lượng chất khô.

- Hút 2 ml của từng dịch mẫu vào 4 ống nghiệm sạch và 2 ml H2O vào một ống

nghiệm khác làm mẫu đối chứng. Tiếp tục hút 2 ml AlCl3 2% vào các ống

nghiệm trên. Các ống nghiệm chứa dịch mẫu sẽ xuất hiện màu vàng.

- Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Sau đó, đo độ hấp thụ ánh sáng

của dung dịch ở bước sóng λ = 420 nm.

- Quan sát, ghi nhận và tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn Rutin.

2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tính

 Dụng cụ và hóa chất:

- Bình erlen 1000 – 2000ml.

- Hệ thống sục khí

- Đèn chiếu sáng hoặc nơi có ánh sáng vừa đủ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Muối biển, nước máy hoặc nước cất

- Trứng Artemia Nauplii

 Các bước tiến hành như sau:

- Bước 1: ấp nở ấu trùng Artemia Nauplii

Cân 0,5g trứng Artemia Nauplii cho vào môi trường nước biển có độ mặn từ

15 – 350/00, pH 7,5 – 8,5, 0,5 trứng/1 lít nước biển, ấp trứng trong điều kiện sục khí

liên tục trong vòng 20 giờ ở nơi thoáng mát, có ánh sáng, nhiệt độ khoảng 28 – 290C.

Ấu trùng sau khi nở được sử dụng để thử độc tính của cao chiết.

- Bước 2: Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, đơn yếu tố, lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm

thức, mỗi ô nghiệm thức là 1 cốc nhựa chứa 30 ấu trùng Artemia Nauplii và khoảng

20 ml dịch.

Để xác định nồng độ gây chết LC50 của chế phẩm ta bố trí: cao chiết được pha

loãng thành dãy các dãy nồng độ phù hợp (tương ứng với 7 nghiệm thức).

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii

Nồng độ Đối chứng Thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 0,03 – 0,15% 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml

Ở mỗi cốc cho vào chính xác 30 con ấu trùng Artemia Nauplii và hút bỏ lần

lượt 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl dịch đã hút tương ứng với các nghiệm thức

0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% nồng độ cao chiết.

Ở mẫu đối chứng hút hoàn lại thể tích đã hút bỏ bằng etanol 90o hoặc acetone

tùy vào dung môi sử dụng để chiết, còn ở các mẫu thử nghiệm thì hút hoàn lại thể

thích đã hút bỏ bằng mẫu chứa cao chiết. Để yên trong vòng 2 giờ.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2. 6. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii

- Bước 3: Xử lí số liệu

Đếm số lượng ấu trùng Artemia Nauplii sống, ghi nhận và tìm số con chết

trong từng nghiệm thức, chia lấy giá trị trung bình cho từng nghiệm thức rồi lấy kết

quả vẽ đường chuẩn cho độc tính cao chiết và tính giá trị LC50 dựa trên phương trình

đường chuẩn % tử vong với nồng độ cao chiết và bằng phương pháp Probit.[12]

2.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

2.5.5.1. Sơ đồ quy trình

 Nguyên tắc

Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi

trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà năng tiêu

diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác

định được hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng đường kính vòng kháng khuẩn

(mm).[8]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Sơ đồ quy trình

Giống vi khuẩn

Tăng sinh trong NB

Pha loãng

Cấy trang trên NA

Đục lỗ thạch

Nhỏ cao chiết, nhỏ kháng sinh ĐC

Ủ 37oC, 24 giờ

Đo kích thước vòng kháng khuẩn và chụp hình

Sơ đồ 2. 4. Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu

2.5.5.2. Thuyết minh quy trình

 Chuẩn bị giống vi khuẩn

Chuẩn bị 5 loại vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Enterotoxigenic E.Coli, salmonella, Listeria monocytogenes.

 Chuẩn bị môi trường

Môi trường tăng sinh: sử dụng môi trường NB. Hút 10 ml NB vào 7 lọ nhỏ để

hấp khử trùng 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng sau đó cấy

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterotoxigenic E.coli,

Salmonella, Listeria monocytogenes lần lượt vào 6 lọ, còn lọ cuối dùng để set máy.

Sau đó mang đi lắc 24 giờ.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Thạch nền: sử dụng môi trường NA. Hấp khử trùng môi trường 1210C, 1 atm,

15 phút. Để nguội đến khoảng 500C đến 600C sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng.

Để nguội sau đó úp ngược đĩa pitri lại.[31]

Kháng sinh đối chứng: pha dung dịch thuốc kháng sinh Amoxicillin 1%, nếu

thuốc không tan trong nước thì hòa tan với DMSO. Dung dịch để bảo quản trong tủ

lạnh. Chuẩn bị 10 ống nước muối sinh lý 0,9%, mỗi ống 10 ml, 2 chai nước cất hấp

khủ trùng 1210C, 1 atm, 15 phút.

 Tiến hành

Lấy khoảng 2 ml sinh khối vi khuẩn đem đo OD. Mật độ vi sinh vật được tính

theo công thức:

c = A/(e.l) (cfu/ml)

A: Độ hấp thụ

e: bước sóng

l: chiều dài cuvetle

c: mật độ vi khuẩn

Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt mật độ 106 cfu/ml lên mặt

thạch NA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó tạo 6 giếng có đường kính 6 mm

trên đĩa thạch và nhỏ 100 µl cao chiết vào 3 giếng và cao chiết khác vào 3 giếng còn

lại, mẫu đối chứng sẽ thay thế cao chiết bằng kháng sinh, giữ yên trong vòng 1 giờ

để cao chiết và kháng sinh có thể khuếch tán vào môi trường thạch.

Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ủ 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc

kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm).

 Ghi nhận và xử lý số liệu

Đối với thạch đục lỗ: dùng micropipet hút hết nước nếu có trong giếng thạch,

dùng thước đo vòng kháng khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình.

Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính

vòng kháng khuẩn:

 Đường kính vòng kháng khuẩn < 8 mm: không tốt

 Đường kính vòng kháng khuẩn từ 9 - 14 mm: tốt

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Đường kính vòng kháng khuẩn 15 - 19 mm: rất tốt

 Đường kính vòng kháng khuẩn >20 mm: cực tốt

(theo Celikel và Kavas, 2008)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi

khác nhau

Sau quá trình tách chiết và thu hồi dung môi thu được 4 loại cao chiết, mỗi

loại cao chiết thu hồi được khoảng V = 50ml. Cao chiết có màu nâu, dạng lỏng, đậm

đặc do ảnh hưởng bởi một số yếu tố như nước liên kết và nước tự do, một số hàm

lượng ẩm trong lá và tỉ lệ dung môi thấp.

Cao chiết thu được phải được để trong chai, lọ tối màu hoặc bọc bằng vải có

màu đen, đậy kín miệng, gắn nhãn, bảo quản ở nhiệt độ phòng, để trong bóng râm và

tránh ánh sáng, kể cả ánh sáng trắng và màu.

Kí hiệu các loại cao chiết như sau:

- A: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp chiết Soxhlet.

- B: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp ngâm dầm.

- C: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết

Soxhlet.

- D: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp ngâm

dầm.

Hình 3. 1. 4 loại cao chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.2. Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu

3.2.1. Định tính flavonoid

 Thí nghiệm

Hình 3. 2. Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o

 Kết quả và nhận xét

Khi cho 1% NaOH/etanol 96o vào cao chiết, cao chiết từ màu nâu chuyển sang

màu vàng. Kết luận: có sự hiện diện của flavonoid có thể là flavon, isoflavon,

isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocanidin trong cao chiết.

Sự biến đổi màu sắc đậm nhạt tùy theo dung môi và phương pháp sử dụng đề

tách chiết. Quan sát màu vàng của dung dịch có thể nhận thấy cao chiết A và B có

màu vàng như nhau, cao chiết D có màu vàng nhạt hơn so với A, B và C và màu vàng

đậm hiện rõ ở cao chiết C.

Như vậy: Cao chiết C sử dụng dung môi là etanol 90o và chiết bằng phương

pháp Soxhlet có khả năng tách chiết được nhiều flavonoid nhất so với các dung môi

và phương pháp chiết thử nghiệm khác; cao chiết A và B sử dụng dung môi acetone

lần lượt chiết bằng 2 phương pháp chiết Soxhlet, ngâm dầm cho hiệu quả tách chiết

flavonoid tương đương nhau và thấp hơn C nhưng cao hơn D. D sử dụng dung môi

etanol 90o và phương pháp ngâm dầm là thấp nhất so với các các dung môi và phương

pháp khác.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.2.2. Định tính rotenone

 Thí nghiệm

Lá củ đậu

Hình 3. 3. Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit

Sau khi nhỏ H2SO4 đặc vào dịch chiết lá củ đậu với clorofrom đã được cô cạn

trên kính đồng hồ, dịch chiết chuyển sang màu vàng và tiếp tục cho vài hạt natri nitrit

vào, dịch chiết xuất hiện màu nâu tím. Kết luận: Có rotenone trong lá cây củ đậu.

Cao chiết

Hình 3. 4. Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit

Sau khi nhỏ H2SO4đđ vào 4 loại cao chiết lá củ đậu đã được cô cạn trên kính

đồng hồ, cao chiết chuyển sang màu vàng và tiếp tục cho vài hạt natri nitrit vào, cao

chiết xuất hiện màu nâu tím. Kết luận: Có rotenone trong 4 loại cao chiết.

 Kết quả

Bảng 3. 1. Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Thuốc thử Nhóm hợp chất thứ cấp

Flavonoid 1% NaOH/etanol 90o Loại cao chiết C B +++ ++ D ++ A ++ Lá +++

++ ++ ++ ++ ++ H2SO4 đặc và vài hạt natri nitrit

Rotenone Ghi chú: (-): Không có; (±): Nghi ngờ, (+): Có ít, (++): Có, (+++): Có nhiều

3.3. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết

3.3.1. Hàm lượng chất khô

 Hàm lượng chất khô trong cao chiết A:

Hàm lượng chất khô = 32,817 – 32,791 = 0,026 (g/ml)

 Hàm lượng chất khô trong cao chiết B:

Hàm lượng chất khô = 48,597 – 48,569 = 0,028 (g/ml)

 Hàm lượng chất khô trong cao chiết C:

Hàm lượng chất khô = 37,006 – 36,895 = 0,111 (g/ml)

 Hàm lượng chất khô trong cao chiết D:

Hàm lượng chất khô = 34,886 – 34,847 = 0,039 (g/ml)

 Kết quả

Bảng 3. 2. Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết

Cao chiết A B C D

0,026 0,028 0,111 0,039 Hàm lượng chất khô (g/ml)

3.3.2. Định lượng polyphenol tổng số

 Thí nghiệm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Xây dựng đường chuẩn Acid Gallic

- Acid Gallic là chất chuẩn được sử dụng để tính toán hàm lượng polyphenol

tồng số.

- Sau khi ủ ở nhiệt độ 400C, dung dịch có màu xanh lam và được đo độ hấp thu

ánh sáng tại bước sóng λ = 765 nm.

Hình 3. 5. Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic

Bảng 3. 3. Kết quả đường chuẩn Acid Gallic

1 2 3 4 5 Nồng độ AG (µg/l)

0,126 0,215 0,297 0,393 0,483 OD765nm

Tiến hành trên các loại cao chiết

Hình 3. 6. Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Kết quả

Hình 3. 7. Đường chuẩn Acid Gallic

Từ đường chuẩn trên, ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số của các cao

chiết tách chiết từ các dung môi và phương pháp khác nhau.

Bảng 3. 4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu

A B C D

323,27b ± 16,72 279,53b ± 43,88 786,25a ± 59,86 293,8b ± 53,41

Loại cao chiết Hàm lượng polyphenol tổng (mg GE/g db)

 Nhận xét:

323.27

279.53

786.25

293.8

Hình 3. 8. Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Dựa vào sơ đồ hình 3.8 nhận thấy rõ sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng

của 4 loại cao chiết. Cao chiết C có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất với 786,25

mgGE/g db và vượt hơn hẳn trong 4 loại, tiếp đến là cao chiết A có 323,27 mgGE/g

db, cao chiết D là 293,8 mgGE/g db có sự giảm nhẹ so với cao chiết A và lượng

polyphenol tổng số thấp nhất 279,53 mgGE/g db là cao chiết B.

Cao chiết C có hàm lượng polyphenol cao và gần như gấp 3 lần các cao chiết

còn lại. Có thể vì ảnh hưởng một số lí do như:

- Cao chiết C sử dụng dung môi etanol 90o để tách chiết các hợp chất thứ cấp,

dung môi này có độ phân cực cao hòa tan được nhiều polyphenol đều là hợp

chất phân cực, có thể hòa tan tốt trong dung môi phân cực.

- Phương pháp chiết Soxhlet là một phương pháp có ưu điểm là chiết kiệt được

các hợp chất thứ cấp vì sự tuần hoàn trong thiết bị giúp cho lá củ đậu được

chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết và nhiệt độ tách chiết cao hơn nhiệt độ

phòng.

Cùng phương pháp chiết kiệt đó nhưng cao chiết A lại sử dụng dung môi tách

chiết là acetone, dung môi có độ phân cực thấp, có thể hòa tan tốt một số flavonoid

có độ phân cực trung bình và thấp như rotenone…Vì vậy, hàm lượng polyphenol tổng

số trong cao chiết A thấp hơn cao chiết C.

Hai loại cao chiết còn lại là B và D sử dụng chung phương pháp ngâm dầm

nên sự chênh lệch không cao nhưng cao chiết D sử dụng dung môi etanol 90o vẫn hòa

tan được nhiều hợp chất polyphenol tổng số hơn và hàm lượng cao hơn cao chiết B.

 So sánh với cơ sở khoa học

Polyphenol tan trong etanol nóng do dung môi etanol có khả năng ức chế hoạt

tính của enzyme phenolase có sẳn trong cây, kết hợp với nhiệt độ trong quá trình chiết

có thể làm giảm và biến tính enzyme này, ngăn chặn sự thủy phân polyphenol trong

lá. Vì vậy, Phương pháp chiết Soxhlet với dung môi etanol 90o là đạt hiệu quả tốt

nhất.

 So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

So sánh với một số kết quả nghiên cứu hàm lượng polyphenol tổng có trong

lá của một số loài thực vật khác. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất

trong lá củ đậu là 786,25 mgGE/g db. Kết quả này so sánh với hàm lượng polyphenol

trong lá Diệp hạ châu được công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2014, tập số

12, số 3:412-421/J.ci. & Devel. Vol 12, No. 3:412-421, trong cùng điều kiện thí

nghiệm lớn hơn rất nhiều. Trong tạp chí này, hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất

trong lá Diệp hạ châu là 217 mgGE/g db. Nhưng khi so sánh với các hàm lượng

polyphenol tổng số còn lại là 323,27 mgGE/g db, 293,8 mgGE/g db, 279,53 mgGE/g

db thì hàm lượng polyphenol của lá củ đậu và lá Diệp hạ châu tương đương nhau.[10]

Trên cùng một tờ tạp chí, hàm lượng polyphenol của 6 loại lá cũng được công

bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372/J.ci. & Devel.

Vol 11, No. 3: 364-372. Trong tạp chí này, hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất

trong là lá Trầu không với 188,19 mgGE/g db, theo sau là lá ổi và lá trà xanh với hàm

lượng tương ứng là 146,5 mgGE/g db. Lá nhàu, lá lốt, lá khoai lang có hàm lượng

polyphenol thấp nhất 11,7, 39,3 và 60,7 mgGE/g db. So với kết quả hàm lượng

polyphenol trong lá củ đậu đều thấp hơn.[9]

Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn

trong thực vật nói chung. Đây là chất chống oxi hóa mạnh, và có khả năng kháng

khuẩn cao. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng

kháng khuẩn của cao chiết. Polyphenol bảo vệ thực vật khỏi sự tấn công của các loài

vi sinh vật, và có một số mang độc tính với côn trùng và động vật ăn cỏ.

3.3.3. Định lượng Flavonoid tổng số

 Thí nghiệm

Xây dựng đường chuẩn Rutin

- Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha loãng thành các nông độ thích hợp,

cho phản ứng với AlCl3, phản ứng cho hỗn hợp màu vàng từ nhạt đến đậm, so

màu ở bước sóng λ= 420 nm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin.

Hình 3. 9. Dung dịch Rutin chuẩn

Bảng 3. 5. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin

0,0625 0,053 0,125 0,151 0,25 0,283 0,375 0,401 0,5 0,526 Nồng độ Rutin (mg/ml) OD420nm

Mẫu thí nghiệm được pha loãng thành nồng độ 0,5mg/ml và cho phản ứng với

dung dịch AlCl3, Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính toán hàm

lượng Flavonoid tổng số.

Tiến hành trên các loại cao chiết

Hình 3. 10. Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Kết quả

Bảng 3. 6. Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết

A B C D

16,64b ± 0,26 14,93b ± 0,3 52,91a ± 2,31 16,51b ± 1,58 Loại cao chiết Hàm lượng flavonoid tổng (mgRE/g db)

Hình 3. 11. Đường chuẩn Rutin

 Nhận xét:

16.64

14.93

52.91

16.51

Hình 3. 12. Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Dựa vào sơ đồ hình 3.12 nhận thấy rõ sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng

của 4 loại cao chiết. Cao chiết C có hàm lượng flavonoid tổng số cao nhất với 52,91

mgRE/g db và gấp 3 – 4 lần các loại cao chiết còn lại. So với cao chiết C thì hàm

lượng flavonoid tổng số là 16,64 mgRE/g db trong cao chiết A giảm mạnh và tăng

nhẹ so với cao chiết D có hàm lượng flavonoid 16,51 mg RE/mg chất khô và lượng

flavonoid tổng số thấp nhất là 14,93 mgRE/g db có trong cao chiết B.

 So sánh với cơ sở khoa học

Sự chênh lệch của hàm lượng flavonoid tổng số là do ảnh hưởng bởi dung môi

và phương pháp tách chiết giống như hàm lượng polyphenol tổng số, phụ thuộc vào

độ phân cực của dung môi và phương pháp tách chiết liên tục, nhiệt độ tách chiết và

độ tinh khiết của dung môi Theo Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), flavonoid là những

hợp chất màu phenol thực vật. Hiệu quả tốt nhất vẫn là dung môi etanol 90o và phương

pháp tách chiết Soxhlet. Tùy theo mục đích chiết, sử dụng mà ta có thể lựa chọn đối

tượng thí nghiệm sao cho phù hợp, nếu muốn chiết flavonoid có độ phân cực cao nên

sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet. Ngược lại, nếu muốn

chiết flavonoid có độ phân cực thấp nên sử dụng dụng dung môi acetone và phương

pháp chiết Soxhlet.

 So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác

So sánh kết quả hàm lượng flavonoid tổng số cao nhất của lá củ đậu là 52,91

mgRE/g db với kết quả hàm flavonoid tổng số của một số loại cây như Bìm bìm, Đinh

lăng, Diếp cá, Kim tiền thảo và rau Đắng được nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp

“Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương

pháp UV – VIS” (Lưu Thúy Diễm, 2013). Trong báo cáo này, hàm lượng flavonoid

tổng số tính theo chất chuẩn Rutin là Bìm bìm 0,455 mgRE/g db, Đinh lăng 0,6498

mgRE/g db, Diếp cá 0,5355 mgRE/g db, Kim tiền thảo 0,8384 mgRE/g db và rau

đắng 0,5106 mgRE/g db là rất nhỏ so với hàm lượng flavonoid tổng số trong lá củ

đậu, lý do có sự chệnh lệch như vậy có thể là do bản chất lá củ đậu to hơn các loại

thực vật trên và sử dụng bộ phận khác nhau để thí nghiệm.[1]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Flavonoid có khả năng kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các

protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo càng có khả năng

phá vỡ màng tế bào. Và một số loại flavonoid mang độc tính như rotenone trong lá

củ đậu [32]. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng

kháng khuẩn và độc tính của cao chiết.

3.4. Khảo sát độc tính

 Thí nghiệm

- Kết quả khảo sát số ấu trùng Artemia Nauplii sống và chết theo từng nồng độ

của từng loại cao chiết.

- Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần.

 Kết quả

Bảng 3. 7. Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết

Loại cao chiết LC50

0,04% A

0,09% B

0,02% C

0,06% D Phương trình đường chuẩn y = 1.5045x + 10.068 R2 = 0.9573 y = 1.6067x + 9.8907 R2 = 0.8879 y = 1.0237x + 8.8299 R2 = 0.9255 y = 1.9234x + 11.154 R2 = 0.9772

Đường chuẩn của cao chiết A

y = 1.5045x + 10.068 R² = 0.9573

t i b o r P

ị r t á G

5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 5 4.9 4.8 4.7 4.6

-3.6

-3.5

-3.4

-3.2

-3.1

-3

-3.3 log10(NĐ)

Hình 3. 13. Đường chuẩn của cao chiết A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đường chuẩn của cao chiết C

5.8

5.7

y = 1.0237x + 8.8299 R² = 0.9255

5.6

5.5

t i n o r p

5.4

ị r t á G

5.3

5.2

5.1

-3.6

-3.5

-3.4

-3.2

-3.1

-3

-3.3 Log10(NĐ)

Hình 3. 14. Đường chuẩn của cao chiết C

 Nhận xét:

Từ bảng kết quả 3.7 đã liệt kê các nồng độ gây chết trung bình, kí hiệu là LC50

(Lethal concentration) của 4 loại cao chiết A, B, C, D lần lượt 0,04%, 0,09%, 0,02%,

0,06% tương đương với 8 µl , 18 µl, 4 µl, 12 µl cao chiết trong 20 ml nước biển. Lập

biểu đồ đường để tạo cơ sở so sánh LC50 giữa các loại cao chiết.

Biểu đồ so sánh LC50 của 4 loại cao chiết

0.12%

0.09%

0.10%

0.08%

0.06%

0.04%

0.02%

0.00%

Hình 3. 15. So sánh LC50 của 4 loại cao chiết

Từ hình 3.15 nhận thấy cao chiết C có nồng độ gây chết trung bình LC50 thấp

nhất là 0,02%, cao hơn là cao chiết A với 0,04%, cao chiết D với 0,06% và cao nhất

là cao chiết B với 0,09%. LC50 tỉ lệ nghịch với độ độc của cao chiết, nồng độ càng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

nhỏ thì cao chiết có độc tính càng mạnh. Suy ra, cao chiết C có độc tính mạnh nhất

và cao chiết B có độc tính thấp nhất trong 4 loại cao chiết.

Bảng 3. 8. Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết

A 10,4 B 25,2 C 22,2 D 23,4 Loại cao chiết LC50 (mg/L)

Tuy nhiên, kết quả với nồng độ % trên khi được quy về nồng độ (mg/L) dựa

vào hàm lượng chất khô của từng loại cao chiết lại có sự khác biệt, cao chiết A có

độc tính mạnh nhất với nồng độ 10,4 (mg/L), độc tính của 3 loại cao chiết còn lại

được xếp theo thứ tự giảm dần là C, D, B tương ứng 22,2; 23,4; 25,2 (mg/L). Lí do

của sự khác biệt này là do sự khác biệt về hàm lượng chất khô trong từng loại cao

chiết. Vì vậy, để góp phần đánh giá nồng độ LC50 được khả quan hơn, kết quả được

quy về nồng độ (mg/L).

 So sánh với cơ sở khoa học

Các flavonoid mang độc tính trong cây củ đậu là rotenone, tephrosin…Và acetone là

dung môi hòa tan tốt rotenone, etanol ít hòa tan[27]. Do đó, cao chiết sử dụng dung

môi acetone kết hợp phương pháp chiết bằng Soxhlet có khả năng chiết kiệt các hợp

chất mang độc tính trong lá củ đậu. Kết quả này góp phần rất quan trọng cho mục

đích tách chiết các hợp chất mang độc tính trong lá củ đậu, ứng dụng làm dược liệu

bổ sung vào thuốc trừ sâu.

3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết

3.5.1. Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết

 Kết quả

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.10 qua

đường kính vùng ức chế.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3. 16. Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết

Bảng 3. 9. Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết

Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

106

10,33c ± 0,58 15ab ± 2 10,67c ± 1,53 12,33bc ± 0,58 16a ± 0 A B C D Kháng sinh ĐC

 Nhận xét:

Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.2, cho thấy rằng loại cao chiết B có khả

năng ức chế tốt Enterotoxigenic E.coli, 3 loại cao chiết còn lại A, C và D khá tốt với

vi khuẩn Enterotoxigenic E.coli thường thấy trong các bệnh nhân tiêu chảy cấp.

Đường kính vòng kháng khuẩn Enterotoxigenic E.coli của cao chiết A là 10,33 mm,

cao chiết B là 15 mm, của cao chiết C là 10,67 mm và D là 12,33 mm.

 So sánh với đối chứng

So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 16mm, vòng kháng khuẩn

của cả 4 loại cao chiết đều nhỏ hơn. Tuy nhiên, vòng kháng khuẩn của cao chiết B

chỉ nhỏ hơn vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 1mm và ức chế mạnh.

 So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Kết quả vòng kháng khuẩn cao nhất là cao chiết lá củ đậu là B với 15mm, kết

quả này so với kết quả của tinh dầu tách chiết từ lá Tía tô kháng E.coli được công bố

trên Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-250/J.ci. & Devel.2015,

Vol 31, No. 2: 245-250 là 5,26 mm lớn hơn rất nhiều[3]. Vì vậy, cao chiết kháng

mạnh đối với vi khuẩn Gram (-).

3.5.2. Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết

 Kết quả

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.11

qua đường kính vùng ức chế.

Hình 3. 17. Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết

Bảng 3. 10. Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết

Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

106

11,33c ± 1,53 11,67bc ± 0,58 13,17ab ± 0,29 12bc ± 1 14,5a ± 0 A B C D Kháng sinh ĐC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Nhận xét:

Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.3, cho thấy rằng 4 loại cao chiết A, B,

C và D đều tốt với vi khuẩn Listeria monocytogenes thường thấy trong các thực phẩm

dễ nhiềm như sữa, phomat mềm, pate…không được bảo quản đúng cách gây các bệnh

tiêu chảy, sốt, nôn ói ở người. Đường kính vòng kháng khuẩn Listeria monocytogenes

của cao chiết A là 11,33 mm, cao chiết B là 11,67 mm, của cao chiết C là 13,17 mm

và D là 12 mm.

 So sánh với đối chứng

So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 14,5 mm, vòng kháng

khuẩn của tất cả 4 loại đều nhỏ hơn nhưng cao chiết C chỉ nhỏ hơn vòng kháng khuẩn

của kháng sinh đối chứng khoảng 1,3 mm. Như vậy, cả 4 loại cao chiết kháng vi

khuẩn Gram (+) ở mức tốt.

3.5.3. Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.12

qua đường kính vùng ức chế.

Hình 3. 18. Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết

Bảng 3. 11. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết

Nồng độ vi khuẩn

106

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 11,33b ± 0,58 11,5c ± 1,32 8,67c ± 0,58 10,33b ± 0,58 15a ± 0

Các loại cao chiết A B C D Kháng sinh ĐC

 Nhận xét:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.4, cho thấy rằng 3 loại cao chiết A, B,

C và D đều tốt với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa – trực khuẩn Gram âm điển

hình thường thấy trong các bệnh lý về da (trực khuẩn mủ xanh). Đường kính vòng

kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa của cao chiết A là 11,33 mm, cao chiết B là

11,5 mm, của cao chiết C là thấp nhất 8,67 mm và D là 10,33 mm.

 So sánh với đối chứng

So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng là 15 mm, vòng kháng

khuẩn của tất cả 4 loại đều nhỏ hơn rất nhiều nhưng vẫn được xếp vào loại tốt với vi

khuẩn này.

 So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác

So sánh cao chiết có vòng kháng lớn nhất là B với 11,5 mm với kết quả của

tinh dầu tách chiết từ lá Tía tô kháng Pseudomonas aeruginosa được công bố trên

Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-250/J.ci. & Devel.2015, Vol

31, No. 2: 245-250 là không hình thành vòng kháng, cao chiết vẫn nhạy cảm với

Pseudomonas aeruginosa[3]. Như vậy, cả 4 loại cao chiết kháng vi khuẩn Gram (-) ở

mức tốt đến rất tốt.

3.5.4. Không có hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết

- Salmonella

Hình 3. 19. Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Staphylococcus aureus

Hình 3. 20. Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết

Bảng 3. 12. Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết

Cao chiết A B C D Vi sinh vật

+ + + - - + + + - - + + + - -

Enterotoxigenic E.Coli Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Salmonella Staphylococcus aureus Ghi chú: ++ + + - - (-) không tốt (+) tốt (++) rất tốt (+++) cực tốt

Kết luận:

Tất cả các loại cao chiết đều kháng vi khuẩn Gam (-) tốt hơn Gam (+).

Cao chiết B sử dụng dung môi là acetone và phương pháp tách chiết ngâm

dầm có khả năng ức chế vi sinh vật vì được tách chiết ở nhiệt độ phòng và không tiếp

xúc với ánh sáng nên một số các hợp chất polyphenol, flavonoid…có khả năng kháng

khuẩn và không bị mất hoạt tính, có thể bên trong lá củ đậu các hợp chất thứ cấp có

khả năng ức chế vi sinh vật có độ phân cực thấp chiếm tỉ lệ cao hơn và dung môi

acetone hòa tan hầu hết các hợp chất có độ phân cực thấp. Cùng phương pháp ngâm

dầm, cao chiết D có khả năng ức chế vi sinh vật khá tốt.

Cao chiết C và A có khả năng ức chế vi sinh vật ở mức độ tốt như nhau nhưng

A có phần tốt hơn C. Như phần định lượng polyphenol tổng số, cao chiết C có hàm

lượng polyphenol tổng cao gấp 3 – 4 lần các cao chiết còn lại nhưng chưa hẳn chứa

nhiều hàm lượng polyphenol, flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn cao, bền, nên có

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

khả năng ức chế vi sinh vật thấp hơn B, D và do cao chiết chịu sự ảnh hưởng trực tiếp

bởi nhiệt độ chiết cao 70 – 80oC, một số loại polyphenol dễ bị mất hoạt tính và trong

quá trình chiết dịch chiết phải tiếp xúc với các loại ánh sáng trắng và màu dẫn đến

một số hợp chất thứ cấp bị quang hóa, oxy hóa. Tuy nhiên, khả năng kháng vi sinh

vật của 2 loại cao chiết C và A vẫn được xem là tốt.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua thời gian thực hiện đề tài, kết quả nghiên cứu thu được như sau:

- Tách chiết và thu được 4 loại cao chiết lá củ đậu theo các dung môi và các

phương pháp khác nhau kí hiệu như sau:

 A: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp chiết

Soxhlet.

 B: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp ngâm

dầm.

 C: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp

chiết Soxhlet.

 D: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp

ngâm dầm.

- Định tính được trong lá củ đậu có các hợp chất thứ cấp như flavonoid,

rotenone.

- Xác định được hàm lượng chất khô bên trong lá củ đậu theo từng dung môi và

phương pháp khác nhau, tùy theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn thích hợp.

- Xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong 4 loại cao chiết. Cao chiết

A là 323,27 mg GE/g db, cao chiết B là 279,53 mg GE/g db, cao chiết C là

785,25 mg GE/g db, cao chiết D là 293,8 mg GE/g db. Nếu muốn tách chiết

hàm lượng polyphenol cao nên sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp

chiết Soxhlet.

- Đã xác định được hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết. Cao

chiết A 16,64 mgRE/g db, cao chiết B là 14,93 mgRE/g db, cao chiết C là

52,91 mgRE/g db, cao chiết D là 16,51 mgRE/g db. Nếu muốn tách chiết hàm

lượng flavonoid cao nên sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết

Soxhlet.

- Đánh giá được độc tính trong từng loại cao chiết lá cây củ đậu bằng mô hình

in vitro trên Artermia Nauplli. Tính toán được nồng độ gây chết trung bình

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LC50 (mg/L) của từng loại cao chiết: cao chiết A là 10,4 (mg/L), cao chiết B là

25,2 (mg/L), cao chiết C là 22,2 (mg/L) và cao chiết D là 23,4 (mg/L), phục

vụ cho các nghiên cứu về độc chất sau này.

- Đánh được khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết là tốt với vi khuẩn Gram

(-).

4.2. Kiến nghị

Do giới hạn về mặt thời gian, điều kiện trang thiết bị cũng như điều kiện kinh

tế nên thí nghiệm vẫn chưa hoàn chỉnh. Đề hoàn thiện đề tài, người thực hiện đề tài

có một số kiến nghị như sau:

- Nghiên cứu quy trình trích ly và tinh sạch các hợp chất mang độc tính trong lá

cây củ đậu như rotenone.

- Nghiên cứu thêm về khả năng chống oxi hóa và các tác dụng khác của các chất

có trong polyphenol, flavonoid lá củ đậu.

- Thử độc tính trên các loại sâu bệnh để tạo dược liệu mang độc tính bổ sung

vào thuốc BVTV.

- Nghiên cứu khả năng kháng nấm, mốc từ lá củ đậu.

Ý nghĩa khoa học:

- Xác định thành phần hóa học , định lượng polypohenol tổng, flavonoid tổng

số, đánh giá độc tính và kháng khuẩn trên cùng một loại nguyên liệu mà chưa

có một nghiên cứu nào trước đây thực hiện.

- Tính toán được LC50, ứng dụng trong BVTV.

Ý nghĩa thực tiễn

- Ứng dụng trong viêc tạo sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học, không ảnh hưởng

đến môi trường và sức khỏe con người.

- Tận dụng phế phẩm của nhà nông

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

[1] Lưu Thúy Diễm (2013).“Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số

cao dược liệu bằng phương pháp UV – VIS”, luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học

Cần Thơ,Cần Thơ.

[2] Nguyễn Ngọc Kiểng. 1992. Một số phương pháp cần nghiên cứu khoa học, Nhà

xuất bản Tp. HCM.

[3] Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc

Duyên (2015) – Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tía tô. Tạp chí khoa học và phát

triển 2015, tập số 13, số 2:245-240.

[4] Nguyễn Thị Kim Ngân (2015). “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và

hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại

học Công nghệ TP. HCM, TP. Hồ Chí Minh.

[5] Phạm Minh Nhựt. 2014. Các phương pháp phân tích vi sinh, Trường Đại học

Công nghệ TP. HCM, TP Hồ Chí Minh.

[6] Nguyễn Phi Kim Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại

học Quốc gia TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh

[7]Trần Kim Qui (1993). “Nghiên cứu điều chế thuốc trừ sâu thảo mộc”, Trường Đại

học Tổng hợp TP.HCM, TP.Hồ Chí Minh.

[8] Nguyễn Tiến Thắng (2015). “Nghiên cứu trích ly tinh dầu của các loại bưởi ở

miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất

kem trị mụn từ tinh dầu bưởi ”, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ TP.

HCM, TP. Hồ Chí Minh.

[9] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) – Hoạt tính chống oxy hóa và ức

chế enzyme polyphenoloxydase của một số loài thực vật ăn được ở Việt Nam. Tạp chí

khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372.

[10] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) - Ảnh hưởng của điều kiện tách

chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây Diệp hạ châu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

(Phyllathus amarus) trồng tại Phú Yên. Tạp chí khoa học và phát triển 2014, tập số

12, số 3:412-421.

[11] Lê Quốc Tuấn – Độc chất học môi trường, trường Đại học Nông lâm TP.HCM,

TP.Hồ Chí Minh.

[12] Đỗ Thị Tuyến – Huỳnh Văn Thành – Nguyễn Thị Thu Hương (2014), “ Thực

hành công nghệ sản xuất sinh phẩm”, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM, TP. Hồ

Chí Minh.

Tài liệu Tiếng Anh

[13] Burt s, 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential

applications foods a review, Int. J. Food Microbiol. 94, p.223-253.

[14] Griffin Shane G s. Grant ie, Julie L Markham and David The role N. (1999), of

structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial

activity, Flavour Fragr, J., 14.322-332

[15] Singleton [1’] Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. (1999)

Analysis of total phenol and other oxidation substrates and antioxidants by means of

Folin-Ciocalteu reagent. Method Enzymol 299: 152-78.

Tài liệu Internet

[16]https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2y_c%E1%BB%A7_%C4%91%E1%B

A%ADu

[17] http://www.dieutri.vn/caythuoccodoc/30-10-2015/S7361/Cay-cu-dau.htm

[18] http://xttm.agroviet.gov.vn/Site/vi-vn/73/81/194/72949/Default.aspx

[19] http://baoquangninh.com.vn/kinh-te/201310/cu-dau-cay-thoat-ngheo-cua-nong-

dan-dong-trieu-2209347/

[20] http://2lua.vn/article/thu-bac-ty-tu-cu-dau-3516.html

[21] http://www.busta.vn/node/1213

[22]http://sonongnghiep.haiduong.gov.vn/GiaiDapKyThuat/Pages/KINHNGHI%E1

%BB%86MN%C3%82NGCAON%C4%82NGSU%E1%BA%A4T,CH%E1%BA%

A4TL%C6%AF%E1%BB%A2NGC%E1%BB%A6%C4%90%C3%82UTHU%C4

%90%C3%94NG.aspx

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[23] http://sanxuathuyhieucaiao.blogspot.com/2015/04/cach-trong-cay-cu-au.html

[24] http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/240816

[25] http://123doc.org/document/2699012-nhom-hop-chat-flavonoid-tong-quan-

hoat-tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung-dung.htm?page=7

[26] http://www.duoclieu.org/2011/11/vai-tro-va-hoat-tinh-sinh-hoc-cua.html

[27] https://en.wikipedia.org/wiki/Rotenone

[28] http://www.cesti.gov.vn/khong-gian-cong-nghe/cong-nghe-trich-ly-su-dung-

co2-sieu-toi-han-nang-gia-tri-qua-gac.html

[29] http://tai-lieu.com/tai-lieu/dai-cuong-chiet-pha-ran-va-ung-dung-cua-chiet-pha-

ran-566/

[30] http://www.vietlinh.vn/nuoi-trong-thuy-san/tom-su-post-artemia.asp

[31] http://documents.tips/documents/moi-truong-na-nb-copy.html

[32] https://issuu.com/thao1994/docs/h___p_ch___t_kh__ng_khu___n_t____th

[33] https://vi.wikipedia.org/wiki/Rotenon

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHỤ LỤC

1. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết

1.1. Hàm lượng chất khô

A

B

C

D

32.791 32.822 32.817 32.817

48.569 48.603 48.599 48.597

36.895 37.008 37.006 37.006

34.847 34.886 34.886 34.886

Cao chiết BĐ (g) L1 (g) L2 (g) L3 (g)

1.2. Hàm lượng polyphenol tổng số

x mg GE

Hàm lượng polyphenol tổng mg GE/g vật liệu

Độ lệch chuẩn

16.72

A

43.88

B

59.86

C

Loại cao chiết OD 0.244 0.265 0.262 0.221 0.237 0.182 0.157 0.155 0.173 0.191 0.174 0.143

2.34 2.58 2.54 2.08 2.26 1.65 1.37 1.34 1.54 1.75 1.56 1.21

304.2 335.4 330.2 291.2 316.4 231 760.35 743.7 854.7 341.25 304.2 235.95

53.41

D

The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HLPOLYPHENOLTS 4 A B C D Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 537455.0823 179151.6941 82.93 <.0001 Error 8 17282.5733 2160.3217 Corrected Total 11 554737.6556 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.968846 11.04775 46.47926 420.7125 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F HLPOLYPHENOLTS 3 537455.0823 179151.6941 82.93 <.0001 The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 2160.322 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 87.513 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N HLPOLYPHENOLTS A 786.25 3 C B 323.27 3 A B B 293.80 3 D B B 279.53 3 B

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.3. Hàm lượng flavonoid tổng số

Loại cao chiết

Hàm lượng flavonoid tổng mg RE/g vật liệu

Độ lệch chuẩn

A B

OD 0.674 0.685 0.687 0.569

x mg RE 0.63 0.64 0.65 0.53

16.38 16.64 16.9 14.84

0.26 0.43

2.31

0.554 0.581 0.528 0.501 0.495 0.494 0.458 0.403

0.52 0.55 0.5 0.47 0.46 0.46 0.43 0.38

14.56 15.4 55.5 52.17 51.06 17.94 16.77 14.82

1.58

The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HLFLAVONOIDTS 4 A B C D Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 3066.086700 1022.028900 506.34 <.0001 Error 8 16.147867 2.018483 Corrected Total 11 3082.234567 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.994761 5.627038 1.420733 25.24833 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F HLFLAVONOIDTS 3 3066.086700 1022.028900 506.34 <.0001 The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 2.018483 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 2.675 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N HLFLAVONOIDTS A 52.910 3 C B 16.640 3 A B B 16.510 3 D B B 14.933 3 B

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2. Khảo sát độc tính

 Cao chiết A

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

30 19 11 6 18 60 - 3.15

28 12 11 11 16.67 55.57 - 3.3

28 9 18 11 15.33 51.1 - 3.4

30 4 13 13 20 66.67 - 3.1

29 29 30 7 14 18 8 10 22 10 11 15 20.67 17.33 11.67 68.9 57.77 38.9 - 3.52 - 3.05 - 3.22 4.7181 5.0276 5.1408 5.1968 5.2533 5.4316 5.4930

Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN 1 Mẫu TN 2 Mẫu TN 3 Số con chết % chết Log10[NĐ%] Probit

Đường chuẩn

y = 1.5045x + 10.068 R² = 0.9573

t i b o r P

ị r t á G

5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 5 4.9 4.8 4.7 4.6

-3.6

-3.5

-3.4

-3.2

-3.1

-3

-3.3 log10(NĐ)

Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3

% chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit

Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5.0000

Log10(X) = (5 – 10.068)/1,5045 => X = -3,37

 LC50 = 0,04%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Cao chiết B

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35 Nồng độ cao chiết %

29 18 19 18 10.67 35.57 -3.3

30 9 11 14 18.67 62.23 -2.82

27 11 9 6 18.33 61.1 -2.7

29 4 7 4 24 80 -2.6

29 15 14 8 16.67 55.57 -3 4.6308 5.1408

28 3 8 5 22.67 75.57 -2.52 5.3107 5.2819 5.8416 5.6935

30 3 3 5 26.33 87.77 -2.46 6.1650

Đối chứng Mẫu TN 1 Mẫu TN 2 Mẫu TN 3 Số con chết %chết Log10[NĐ] Probit

Đường chuẩn

y = 1.6067x + 9.8907 R² = 0.8879

t i b o r P

ị r t á G

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

log10(NĐ)

Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3

% chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit

Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000

Log10(X) = (5 – 9,8907)/1,6067 = -3,04

 LC50 = 0,09%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Cao chiết C

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09 Nồng độ cao chiết %

29 14 15 3 18.33 61.1 -3.52

30 8 10 8 21.33 71.1 -3.15

29 5 7 7 22.67 75.57 -3.1

30 6 16 11 19 63.33 -3.4 5.2819 5.3398

28 9 10 6 19.67 65.57 -3.3 5.4016

29 30 5 10 8 7 4 11 23.33 20.67 77.77 68.9 -3.22 -3.05 5.493 5.5563 5.6935 5.7655

Đối chứng Mẫu TN 1 Mẫu TN 2 Mẫu TN 3 Số con chết %chết Log10[NĐ] Probit

Đường chuẩn

5.8

5.7

y = 1.0237x + 8.8299 R² = 0.9255

5.6

5.5

t i n o r p

5.4

ị r t á G

5.3

5.2

5.1

-3.6

-3.5

-3.4

-3.2

-3.1

-3

-3.3 Log10(NĐ)

Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3

% chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit

Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000

Log10(X) = (5 – 8,8299)/1,0237 = - 3,74

 LC50 = 0,02%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Cao chiết D

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35 Nồng độ cao chiết %

28 19 12 14 13 43.33 -3.3

27 2 1 3 25 83.33 -2.7

29 5 2 3 25.67 85.57 -2.6

28 4 5 7 22.67 75.57 -2.82

29 4 2 1 26.67 88.9 -2.52

29 9 6 13 19.67 65.57 -3

Đối chứng Mẫu TN 1 Mẫu TN 2 Mẫu TN 3 Số con chết %chết Log10[NĐ] Probit

30 2 2 1 28.33 94.43 -2.46 4.8313 5.4016 5.6935 5.9661 6.0626 6.2212 6.5893

Đường chuẩn

y = 1.9234x + 11.154 R² = 0.9772

t i b o r P

ị r t á G

-3.5

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

log10(NĐ)

Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3

% chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit

Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000

Log10(X) = (5 – 11,154)/1.9234 = -3,2

 LC50 = 0,06%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

 Bảng giá trị Probit

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3. Kháng khuẩn

3.1. Môi trường

 NB - 1,5g cao thịt

- 1,5 g cao nấm men

- 5 g pepton

- 5 g NaCl

- 1000 ml nước cất

- pH 7,4 ± 0,2.

 NA - 1,5 g cao thịt

- 1,5 g cao nấm men

- 5 g pepton

- 5 g NaCl

- 15 g agar

- 1000 ml nước cất

- pH 7,4 ± 0,2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đường kính vòng kháng khuẩn L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn

10 10 11 0.58

13 15 17 2

11 9 12 1.53

13 12 12 0.58

16 16 16 0

The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKETEC 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 77.73333333 19.43333333 13.88 0.0004 Error 10 14.00000000 1.40000000 Corrected Total 14 91.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.847384 9.195979 1.183216 12.86667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKETEC 4 77.73333333 19.43333333 13.88 0.0004 The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

3.2. Enterotoxigenic E.Coli

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.4 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.1526 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKETEC A 16.0000 3 E A A 15.0000 3 B B 12.3333 3 D B B 10.6667 3 C B B 10.3333 3 A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đường kính vòng kháng khuẩn L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn

13 10 11 1.53

12 12 11 0.58

13 13 13.5 0.29

E 14.5 14.5 14.5 0

13 12 11 1

The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 1

3.3. Listeria monocytogenes

The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKLIS 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 20.23333333 5.05833333 6.74 0.0067 Error 10 7.50000000 0.75000000 Corrected Total 14 27.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.729567 6.909777 0.866025 12.53333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKLIS 4 20.23333333 5.05833333 6.74 0.0067 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.75 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.5755 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKLIS

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A 14.5000 3 E A B A 13.1667 3 C B B C 12.0000 3 D B C B C 11.6667 3 B C C 11.3333 3 A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đường kính vòng kháng khuẩn A

L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn

11 11 12 0.58

11 10.5 13 1.32

9 8 9 0.58

10 10 11 0.58

15 15 15 0

The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKPSEU 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 64.73333333 16.18333333 29.42 <.0001 Error 10 5.50000000 0.55000000 Corrected Total 14 70.23333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.921690 6.524515 0.741620 11.36667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKPSEU 4 64.73333333 16.18333333 29.42 <.0001 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

3.4. Pseudomonas aeruginosa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.55 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3492 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKPSEU A 15.0000 3 E B 11.5000 3 B B B 11.3333 3 A B B 10.3333 3 D C 8.6667 3 C