Đồ án tốt nghiệp: Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcenscens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN TỪ VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

:TRẦN LÂM TÚ QUYÊN

MSSV: 1051110139 Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

Đồ án tốt nghiệp

LỞI CẢM ƠN

Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ,

truyền đạt những kiến thức nền tảng, những kinh nghiệm quý báu cho em trong

suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp.

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoài Hương, người

cô đáng kính, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em về nội dung cũng như các kỹ

năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em có thể hoàn thành đồ

án tốt nghiệp của mình.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án tại

phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường

Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã dành thời

gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp của em.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ, thương yêu và

dành cho con những điều tốt đẹp nhất trong suốt quá trình học tập cũng như trong

cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Sinh viện thực hiện

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả là

trung thực.

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về

nội dung đồ án của mình. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM không liên quan

đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện.

TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Đồ án tốt nghiệp

Mở Đầu

1. Tính cấp thiết của đề tài

Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật

có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất

hoạt tính sinh học. Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành

y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự. 2003). Kể từ khi phát hiện và

thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như

một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. các ứng

dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát

hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy

ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân

chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).

Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết

xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm

thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm ,... Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên

đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng

phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên

quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và

ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu

được quan tâm.

So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh

vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự

nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý

khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời

gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc

động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự

đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì

hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng.

Đồ án tốt nghiệp

Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp

sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)

(C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996;

Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).

Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu

nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử

dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt

chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và

cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng

sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997).

Dựa trên cơ sở lợi ích rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ việc

nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƢỜNG

DINH DƢỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN

TỪ VI KHUẨN S. MARCESCENS SH1” được tiến hành nhằm tìm ra được môi

trường và điều kiện nuôi cấy để tổng hợp ra prodigiosin cao nhất.

2. Mục tiêu của nghiên cứu

Khảo sát các loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất.

Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao nhất.

3. Ý nghĩa khoa học

Tìm ra được môi trường nuôi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất.

Thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều

nhất.

4. Ý nhĩa thực tiễn

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược

phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao. Thành công của đề tài sẽ góp

phần vào việc tìm được môi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất

và ứng dụng hợp chất prodigiosin.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử

nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ

sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh.

Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá

trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp

1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử

sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự

quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng

các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được

xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc

vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp

chế biến cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất

tự nhiên có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa. Ngành

công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong

thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và

vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự

nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như:

carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin,

violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác

cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như có

thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997).

Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất

cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams

và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus,

Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lượng lớn hợp

Đồ án tốt nghiệp

chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây

chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi,

actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc

sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của

mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật.

Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật

Hợp chất thứ Vi sinh vật Ứng dụng Kiểu tác động ức chế cấp

Penicillium notatum, Ức chế tụ cầu Ức chế tạo polymer

Penicillium khuẩn, nhiễm vách tế bào vi khuẩn,

chrysogenum Penicillin trùng kỵ khí, ức chế hấp thu amino

giang mai, hen acid và protein, ức chế

suyễn. tạo enzyme

Streptomyces griceus Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một

Gram âm và ram số amino acid vào

dương. Trị bệnh protein, tác động lên

Streptomycin lao, bệnh viêm hệ enzyme của vi

màng não, ho gà khuẩn tham gia

chuyển pyruvate vào

chu trình Creb…

Steptomyces Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu sinh

venezuelae bệnh lỵ, sốt cao, tổng hợp protein vi

sốt phát ban khuẩn liên quan đến

peptidyl transferase Chloramphenicol trong tiểu đơn vị

Ribosome 50s, ngăn

không cho tạo liên kết

peptide

Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces Ức chế phổ rộng Ức chế tổng hợp

aureomycin Tetracilin vi khuẩn Gram protein

âm, Gram dương

Streptomyces Chữa bệnh do tụ ức chế vi khuẩn Gram

erythraeus cầu khuẩn âm và Gram dương Erythromycin streptococcal gây

Streptomyces fradiae Tác dụng vi Hơi độc

Neomycin khuẩnn Gram âm

và Gram dương

Streptomyces Điều trị lao, ức Tác động giống như

kanamycetius chế vi khuẩn streptomycin và Kanamycin Gram âm và neomycin

Gram dương

Streptomyces Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách Cycloserine lavendulae tế bào

1.2. Tổng quan prodigiosin

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trưng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc

từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin được tìm thấy ở

dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế

bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).

Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn

như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,

Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và

các xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và

Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc

hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin.

Hình 1.1. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp

bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến

bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,

mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).

Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-

methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và

trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng

sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006).

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo

thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với

nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,

1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là

tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước. Prodigiosin

có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong

chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari

và cộng sự, 2006).

Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Trọng lƣơng Danh pháp Loài Tên sắc tố phân tử và prodigiosin công thức

2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da C20 Serratia marcescens Prodigiosin methoxy prodigiosene H25 N30

2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da Serratia marcescens Norprodigiosin hydroxy-prodigiosene C10 H23N3O

Nocardia 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) Nonylprodigiosin methoxyprodigiosene C23H31 N3O madurae

Đồ án tốt nghiệp

Nocardia 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) Cyclononylprodigiosin melhoxy-prodigiosene C23H33 N3O Madurae

Nocardia Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da (Actinomadura) cyl-prodigiosin Methoxy-prodigiosene C25H33N3O pellctieri

Streptomyces

longisporusruber và 2-Undecyl-6- 393,6 Da Nocardia Undccylprodigiosin Rnethoxyprodigiosene C25 H35 N3O (Actinomadura)

pelletieri

2,4-(9-Ethylnonano) Streplonlyces 391,6 Da Metacycloprodigiosin -6- longisporusruber C25H33N3O methoxyprodigiosene

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin

1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi

khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin

là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme như

DNA gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của

tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009).

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng

một số vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,

Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella

pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin

Đồ án tốt nghiệp

đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram

âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).

1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư

Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng

tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và

cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc

này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung

thư. Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh

lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào

Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình

khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn,

bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự,

2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào

ung thư thông qua nhiều cơ chế.

Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin

chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính.

Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của

các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thư của

prodigiosin được mô tả cụ thể như sau:

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,

2011)

Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng

của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa

nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào

HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự

hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).

Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy

của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm

của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,

nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin

được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX

trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tương tự như vậy, các nghiên

cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự

hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và

cộng sự, 2007).

Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP

cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer

và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng

Đồ án tốt nghiệp

cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong

tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).

Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư,

prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng

chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,

undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế

CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra

ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách

giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2

và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và

p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của Soto-

Cerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu

sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.

Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu

dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống

di căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô

hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự,

2005). Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế

của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình

down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và

cộng sự, 2005).

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế

bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận,

buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế

bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng

tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế

bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng

thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005).

1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch

Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả

bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và

metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự

ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế

bào lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được

chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG,

MAMPDM, nonylprodigiosin,…

Bảng 1.3. Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch

(Hwanmook và cộng sự, 2003)

Khả năng tồn tại (%) Prodigiosin Ngay thứ (nM) Ngày thứ hai Ngày thứ ba nhất

0 79 77 93 Đồi chứng

3 86 79 96

10 82 79 89

30 70 81 89

100 70 70 82

300 14 18 68 Thử nghiệm

1000 14 14 74

3000 9 8 61

10 000 4 4 32

30 000 4 4 4

Đồ án tốt nghiệp

1.3. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin

1.3.1. Điều kiện tổng hợp prodigiosin

Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hóa quá trình sản xuất proodigiosin

bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho

thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất

prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của

prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và

quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric

acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận

được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.

Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng

khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như

Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa,

prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng

nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể

ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.

Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất

prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi

trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72

mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.

San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn

carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa,

nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt

côn trùng.

Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ

chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas

Đồ án tốt nghiệp

sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự

cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy

LD50 khoảng 50 μg/ml.

1.3.2. Cơ chế tổng hợp prodigiosin

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon

lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp.

ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC

274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).

Prodigiosin được hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole

(MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn

xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít

thông tin về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ

việc mô tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm

pyrrole của MBC. Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy

(Williams và Qadri, 1980).

Hình 1.3. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001).

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các

chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

Đồ án tốt nghiệp

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi

khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là

một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di

truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã

hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống

nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng

sự, 1984).

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 được biểu hiện

trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử

nghiệm), mặc dù nó đã không được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn

khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và

cộng sự, 2000). Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định

bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng

LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều

thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine

lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp.

carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực

hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000).

Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia

và Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm

gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô

tả ở hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein

còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức

hợp. Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể

hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và

cộng sự, 2001).

1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai

đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ tươi

Đồ án tốt nghiệp

của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn

(Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH,

độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trường ảnh hưởng

đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự,

1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005).

Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với

nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004).

Hơn nữa, môi trường thông thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi

các chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng

(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất

dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan

trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự,

1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có

tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin.

Hình 1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi

Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)

Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên

các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone

glycerol broth,... Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả

năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan

Đồ án tốt nghiệp

sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều

thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều

prodigiosin hơn. Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone

glycerol broth có hoặc không có bổ sung đường cũng không thể làm được

điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các

loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy

Khanafari và cộng sự, 2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon

trong quá trình sản xuất sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là

môi trường này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose

làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng môi trường sesame

broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo. Maltose và glucose được thêm vào

nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient

broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong môi trường peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon. Rõ

ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất

prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường

lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin

thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn

như SDS vào môi trường nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất

prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005).

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các

môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

STT Môi trƣờng sử dụng Nhiệt độ Tác giả

280C 300C 370C

1 Môi trường dextrose bổ sung 13,0 - - Pruss and

casein Matsummura,

1996

Ethanol và nguồn carbon 3,0 - - Mandarville, 2

2001

Canh dinh dưỡng 0,52 0,354 0,111 Giri and cs, 2004 3

Cang pepton glycerol 0,302 0,569 0,111 Giri and cs, 2004 4

Môi trường hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri and cs, 2004 5

Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5% 1,836 0,79 0,104 Giri and cs, 2004 6

maltose

7 Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5% 1,698 0,29 0,104 Giri and cs, 2004

glucose

Môi trường hạt mè bổ sung 9,43 8,56 1,63 Giri and cs, 2004 8

0,5% maltose

Môi trường hạt mè bổ sung 1,47 1,16 0,42 Giri and cs, 2004 9

0,5% glucose

Môi trường dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri and cs, 2004 10

Môi trường hạt đậu phộng 38,75 25,98 1,49 Giri and cs, 2004 11

Môi trường dầu đậu phộng 0,559 0,111 Giri and cs, 2004 2,89 12

Môi trường từ dừa 1,39 0,1736 Giri and cs, 2004 1,94 13

Môi trường dầu dừa 0,05 0,117 Giri and cs, 2004 1,42 14

Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens. Hiển thị kháng khuẩn, chống

ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong

quá trình cấy ghép . Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế

bào có nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại

Đồ án tốt nghiệp

tràng không có độc tính đáng kể trong các dòng tế bào ác tính. Vì vậy, prodigiosin

được sản xuất mang tính thương mại trên toàn thế giới, điều đó được thể hiện trong

bảng 1.5.

Bảng 1.5. Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology,

Merck Millipore, Biovision incorporated)

ĐỘ ST GÍA THÀNH TINH THÔNG SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG T SẢN PHẨM SẠCH

Hoạt động như

một mTORC1 - Độ hòa tan : DMSO hoặc 95 $/ 250 𝜇g và mRTOC2

ức chế chất = 2000000 Ethanol - Nhiệt độ lưu trữ: -200C phát triển phức ≥ 95% VNĐ/ 250 𝜇g 1 - Điều kiện vận chuyển : gói gel, tạp. Chỉ sử HPLC 355 $/ 1 mg = tránh không khí ánh sáng. dụng cho 7100000 VNĐ/ - Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ nghiên cứu, 1mg đậm không sử dụng

cho người

- Trạng thái vật lý: rắn Hoạt động như - Có nguồn gốc từ: Serratia một kháng marcescens sinh. Chỉ sử 349 $/500 𝜇g - Độ hòa tan: Hòa tan trong dụng cho 2 = 6980000 >95% ethanol, methanol, DMF hoặc nghiên cứu, DMSO. Tan trong nước hạn chế VNĐ/ 500 𝜇g không sử dụng - Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C cho điều trị ở - Điểm nóng chảy: 151-152ºC người.

3 - Nguồn: marcescens Serratia Một ứng dụng 159 GBP/200 𝜇g >95%

Đồ án tốt nghiệp

= 3975000 HPLC - Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm hợp chất tế

- Lưu trữ dài hạn: -20 ° C bào thẩm thấu VNĐ/ 200 𝜇g

- Độ hòa tan: Hòa tan trong có hiển thị ức

ethanol, methanol, DMF hoặc chế miễn dịch

DMSO. Tan trong nước hạn chế. và chống khối

- Đóng gói khí trơ u đặc tính

không phân

biệt tình trạng

p53 và kháng

đa thuốc.

1.3.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin

1.3.4.1. Thu nhận và tinh sạch

Các sắc tố không tan trong nước mà tan trong dầu thường được chiết xuất bằng

dung môi hữu cơ pha nước như: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp của

các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thường có

chứa một lượng nước đáng kể, do đó, có thể được loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ

hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các

dung môi. Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để

xác định các chất màu. Quang phổ sẽ được thực hiện, lưu giữ và sau đó tiến hành so

sánh với các phổ chuẩn (Amaya. 2001).

Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây được đề xuất là nên thực hiện để xác định một

hợp chất chưa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994).

- Phổ khả kiến (𝜇max ).

- Sắc ký lớp mỏng (Rf).

- Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lưu mẫu).

- Phương pháp phổ khối (khối lượng phân tử).

Đồ án tốt nghiệp

- NMR (chuyển hóa về mặt hóa học).

Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh

sạch prodigiosin như sau:

- Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) được chiết xuất từ

môi trường nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và

petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong một cốc nước sôi (hay trong một

bể cách thủy) và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky,

1980).

- Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất được chiết

xuất bằng acetone, hòa với một ít ethyl acetate, và được sấy khô bằng natri sulfat.

Các chất chiết xuất được hòa tan và được thực hiện quét từ bước sóng 200 – 700

nm. Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5:

0,5 đã được sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với

các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng. Cột silicagel có kích thước từ 80 – 100 mesh đã

được sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết

cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó được tiếp

tục phân tích để xác định trọng lượng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ

khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết được đem phân tích quang phổ khối cho

thấy chúng có trọng lượng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004).

- Prodigiosin được chiết xuất bằng cách lắc môi trường nuôi cấy tế bào

Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml

methanol) và dịch trong suốt được làm cho bay hơi trong chân không. Sắc ký lỏng

cao áp của các chiết xuất được thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và

methanol. Các sắc tố thu được sẽ được rửa giải trong methanol và phân tích

bởi phương pháp phổ khối (ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chưa tinh khiết đã thu

được sẽ tiếp tục được thực hiện phương pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil

C18 (250x4 mm, 10 vm) đã được sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến

100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc

Đồ án tốt nghiệp

rửa giải được theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS

(Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003).

- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trường được lấy

từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã

acid hóa (pH 3,0) được thêm vào IAB. Các sắc tố được chiết xuất bằng

cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ,

rồi đem cô đặc và ly tâm. Sau đó, nó được thu bằng cách sử dụng nước và

chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dưới của

pha chloroform và được cô đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin được phân tách

bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó được rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl

acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố cô đặc đã được tách ra bởi việc sử dụng hỗn

hợp chloroform: methanol 95:5 (v/v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của

prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã được thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc

tố chưa tinh khiết sẽ tiếp tục được thực hiên phương pháp TLC (với tỷ lệ

dung môi chloroform: methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế

bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đó, nó được tách rửa với hỗn hợp

methanol: nước (7:3, v/v) đã được điều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N HCl với tốc độ

dòng chảy là 20 ml/ phút. Một lưới thép không gỉ lớn với kích thước lỗ 0,5 cm đã

được sử dụng như sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các

prodigiosin đỏ sản xuất ra được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử

dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã được acid hóa

(0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối

lượng phân tử của chất màu tinh khiết được xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu được ghi nhận sau khi hòa tan trong

CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã được đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl)

tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố được ghi nhận (Song và cộng sự, 2006).

1.3.4.2. Định lượng

Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất

tại bước sóng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy,

Đồ án tốt nghiệp

nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra được thu nhận trong methanol đã

acid hóa (với 0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ được ước tính bằng cách đo độ

hấp thụ ở bước sóng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt

và Williams, 1968).

Tổng số các sắc tố được ước tính theo công thức sau (Chen và cộng sự, 2006;

Williams và cộng sự, 1960):

TP(µg/L)=

𝐀𝐱𝐃𝐱𝐕𝟏 𝟕.𝟎𝟕𝐱𝟏𝟎^𝟒𝐱𝐕𝟐

Trong đó:

- TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu được (μg/L).

- A: Độ hấp thụ của sắc tố được chiết xuất trong methanol ở 535 nm.

- D: Hệ số pha loãng.

- V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trường ban đầu. - 7.07×104: Hệ số hấp thụ của prodigiosin.

1.4. Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens

Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin được biết đến là một hợp chất tự nhiên

có thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và được sản xuất bởi các vi sinh vật

như Vibrio psychroerythrus (D’ Aoust và Gerber, 1974), Serratia marcescens,

Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964).

Đặc trưng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ không có khả năng

khuếch tán prodigiosin nên khuẩn lạc có màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự,

1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một

tác nhân gây bệnh cơ hội ở người với những chủng không sản xuất sắc tố gây đe

dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố

phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ

không tan trong nước này lại được báo cáo là có hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng

sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự,

1997). Các prodigiosin tốt nhất được biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn

với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng

Đồ án tốt nghiệp

sản xuất một chất hòa tan trong nước, có màu đỏ hồng tím superoxidase dismutase

(Hardjito và cộng sự, 2002).

Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu không có màu, màu đầu tiên xuất

hiện gần đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S.

marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã

phân lập được sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nó như

là một loại thuốc nhuộm cho mục đích thương mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết

nó quá nhạy cảm với ánh sáng khi được sử dụng thực tế (Furstner, 2003).

Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, có thể phát

triển tốt trong điều kiện môi trường kỵ khí và hiếu khí. Nó phát triển tốt trên các

môi trường tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau như một nguồn carbon duy

nhất. Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các môi

trường và phát hiện ra trên môi trường từ hạt đậu phộng làm tăng một lượng đáng

kể prodigiosin.

Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường lỏng

của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin và

serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Ngoài ra, prodigiosin thường nằm

trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như sodium

dodecyl sulface (SDS) cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và

Chen, 2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi

chủng phi lâm sàng (non-clinical) có ý nghĩa khoa học và quan trọng, có một mối

quan hệ giữa quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đó,

sản xuất sắc tố do chủng phi lâm sàng của S.marcescens đã được quan tâm

nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả

năng gây bệnh. Đặc điểm sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và

cộng sự, 2002), chịu ảnh hưởng của cả hai yếu tố di truyền và môi trường. Sản

xuất các sắc tố tan trong nước được tăng cường bằng cách bổ sung polymyxin B

(Suzuki và cộng sự, 2001), gramicidin và valinomycin vào môi trường tăng trưởng

(Hardjito và cộng sự, 2002).

Đồ án tốt nghiệp

Không nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp dẫn

các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sư công nghệ sinh học. Gần đây, prodigiosin

đã được xem là hiệu quả như một tác nhân kiểm soát sinh học với tảo có hại trong

môi trường biển tự nhiên, do đó, prodigiosin phải sản xuất với số lượng lớn để có

thể đáp ứng nhu cầu trong tương lai (Someya và cộng sự, 2001).

1.5. Tổng quan về Serratia marcescens

1.5.1. Phân loại Serratia marcescens

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan

với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi

Serratia là Serratia marcescens.

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:

- Giới: Bacteria

- Ngành: Proteobacteria

- Lớp: Gramma proteobacteria

- Bộ: Enterobacteriales

- Họ: Enterobacteriaceae

- Chi: Serratia

- Loài: Serratia marcescens

1.5.2. Đặc điểm của Serratia marcescens

1.5.2.1 Đặc điểm sinh lý

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia

marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC

và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng

chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia

marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

Hình 1.6. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012)

Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo

thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5-

30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

Đồ án tốt nghiệp

1.5.2.2 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường có oxy hoặc trong

trường hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên

men để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatase,

peroxidase,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi

trường oxy hóa.

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ

Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và

gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định

Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như

nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân

casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết

tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia

marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-

NH) trong casein. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens được thể

hiện qua bảng 1.6 sau:

Bảng 1.6. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010)

STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả

1 Di động +

2 Indole -

3 Methyl Red -

4 Voges Proskauer +

5 Citrate +

6 Dnase +

7 Catalase +

8 Oxidase -

9 Urease -

Đồ án tốt nghiệp

10 Gelatinase +

11 Chitinase +

12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang acid, không

sinh khí và không sinh H2 S

- 13 Hydrogen sulphide peoduction

+ 14 Lysine decarboxylase

+ 15 Ornithine decarboxylase

+ 16 Lên men glucose

+ 17 Lên men sucrose

+ 18 Lên men sorbitol

+ 19 Lên men fructose

- 20 Lên men xylose

- 21 Lên men rhaminose

- 22 Lên men lactose

- 23 Lên men arabinose

1.5.2.3. Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nước, trong đất, trong

thực vật, côn trùng, cũng như trong ống tiêu hóa của người và động vật có xương

sống.

- Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông

và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể

đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc

khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).

- Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài

côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm

ưu thế. Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm

Đồ án tốt nghiệp

năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm

trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất

là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của

chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).

Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong

các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong

báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.

1.5.3. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens

Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của

Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của

Serratia marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh.

Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát

Pyricularia oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng Serratia marcescens.

Nghiên cứu của Gursharan và cộng sự (2007) đã sử dụng chitin, nấm,… làm

chất nên cho quá trình sản xuất enzyme chitinase bởi Serratia marcescens GG5.

Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây

nhiễm Serratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu

trùng Galleria mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng.

1.5.4. Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens

1.5.4.1. Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi

khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), được biết đến như là một yếu

tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này

bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI),

uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó,

khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin

và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).

Đồ án tốt nghiệp

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup

A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT

(Grimont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc

A2/6 thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC

(Grimont, 1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp

prodigiosin đã được biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự,

1984). Các dòng được tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn

MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick,

2006). Prodigiosin được biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của

cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể

người, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát

hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997).

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-

carboxymethylmuconic semialdehyde acid, được sản xuất từ sự phân tách 3,4-

dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias

và cộng sự, 1988). Enzyme này được cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các

chủng Serratia marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a,

đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc

tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006).

1.5.4.2. Biosurfactants

Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia

marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động như một chất thấm. Chất

thấm này được sản xuất với số lượng lớn ở 30°C nhưng không được sản

xuất ở37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trưởng. Ba aminolipid, từ

W1 đến W3, có các hoạt động thấm ướt và đã được tách bằng sắc ký lớp mỏng

(Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 được xác định là

serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trước đó đã từng được phát hiện bởi

Wasserman và cộng sự (1961).

Đồ án tốt nghiệp

1.5.4.3. Acid béo

Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens

là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic

acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong

đó, ntetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).

1.5.4.4. Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease,

chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải

có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát

sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và

cộng sự, 1989).

Serratia marcescens có khả năng tiết ra các loại enzyme:

- Thủy phân casein không phải là một đặc điểm chung và do đó rất hữu ích

trong việc phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đường ruột và tập

hợp Pseudomonadaceae.Serratia marcescens sử dụng các enzyme ngoại bào được

gọi là protease để phá vỡ các lien kết peptide (CO-NH) trong casein.

- Tương tự như vậy, một loại enzyme ngoại bào được gọi là gelatinase phân

hủy gelatin, một loại protein không đầy đủ mà thiếu trytopan. Thủy phân gelatin

biến đổi protein thành các acid amin.

- Enzyme Catalase.

- Enzyme Esculinase.

- Enzyme Dnase.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm

2.1.1. Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 08/04/2014 đến ngày 12/07/2014.

2.1.2. Địa điểm

Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học –

Thực phẩm- Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn vi sinh vật

Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là hai chủng Serratia marcescens do

Nguyễn Hoàng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng EPN, tại phòng Thí Nghiệm

Công Nghệ Sinh Học, khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Đại học

Công nghệ TP. HCM. Trong đó, chủng SH1 được phân lập từ Heterorhabditis

indica CP 16 (H.CP 16) và chủng SS1 được phân lập từ Steinernema

quangdongsense XT (S.XT). Được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

có số đăng kí trên genbank là KF534508.1.

2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng

2.2.2.1. Môi trường nuôi cấy ( thành phần môi trường xem phụ lục)

- Môi trường Nutrient agar;

- Môi trường Nutrient broth;

- Môi trường Peptone glycerol broth;

- Môi trường Mac Conkey;

Đồ án tốt nghiệp

- Môi trường Triple sugar iron agar;

- Môi trường Tryptone broth;

- Môi trường Citrate broth;

- Môi trường huyền phù đậu phộng;

- Môi trường huyền phù đậu phông gelatin;

- Môi trường huyền phù đậu phộng pepton;

- Môi trường huyền phù đậu phông với các loại đường;

- Môi trường huyền phù đậu phộng pepton dầu hướng dương;

2.2.2.2. Hóa chất sử dụng

- KIT API 20E (Biomerieux)

- Hóa chất nhuộm Gram;

- H2O2; NaCl; HCl; NaOH;

- Thuốc thử Kovac’s;

- Thuốc thử Griess A và Griess B;

- Thuốc thử oxidase;

- Nước muối sinh lý 0,85%;

- Ethanol 96%;

2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm,

máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thường, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, kính hiển vi…

Đồ án tốt nghiệp

Dụng cụ

Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm,

đĩa petri, Eppendorf, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, …

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Khẳng định các chủng vi sinh vật nghiên cứu thuộc loài Serratia

marcescens qua khảo sát đặc điểm nuôi cấy, có sử dụng KIT API 20E .

- Chọn chủng có khả năng tổng hợp prodigiosin cao nhất.

- Xác định điều kiện nhân giống.

- Xác định môi trường nuôi cấy.

- Xác định điều kiện nuôi cấy..

2.4. Phƣơng pháp luận

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thường trễ hơn pha tăng

trưởng tế bào. Dịch môi trường và và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ

prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trước đó của các tác giả

ngoài nước để xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng

phân lập của phòng thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Để đạt được mục tiêu của đề tài, người thực hiện tiến hành với các nội dung

theo sơ đồ hình 2.1. Các công việc được tiến hành theo các trình tự sau:

Đồ án tốt nghiệp

2.5.1. Kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens

Từ các chủng vi khuẩn đã được phân lập trong phòng thí nghiệm, tiến hành

nhân giống cấp 1 bằng môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ

phòng.

Sau đó, thu dịch vi khuẩn, tiến hành pha loãng và cấy trang trên môi trường đĩa

thạch Mac Conkey và NB. Để nhiệt độ phòng trong 24 giờ, kiểm tra khuẩn lạc trên

thạch đĩa (có khi để thêm 24 giờ), sau đó tiến hành tới các kiểm tra sinh hóa theo sơ

đồ sau:

Hình 2.2. Sơ đồ kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens

Đồ án tốt nghiệp

2.5.1.1. Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ thuần khiết

Khả sát hình thái khuẩn lạc

Cấy ria chủng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường Mac, NA. Dùng

dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát

dưới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và

10X.

Nhuộm Gram

Tăng sinh chủng vi khuẩn phân lặp được và hai chủng đối chứng là E.

coli và Bacillus subtilis trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/phút trong tối.

Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn gram

âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím.

Thử nghiệm TSI

Pha các thành phần môi trường TSI trong nước cất, trộn đều, đun nóng

và thỉnh thoảng lắc. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử

nghiệm và đối chứng E. coli vào sâu vào phần sâu của ống thạch nghiêng cách đáy

ống nghiệm khoảng 1cm, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng.

Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 370C trong 24 giờ. Ghi

nhận sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng và sự tạo thành màu đen

bởi FeS.

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Pha môi trường Tryptone Broth. Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của chủng vi

sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Tryptone Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ.

Trước khi bổ sung thuốc thử Kovac’s bổ sung 1 ml petroleum ether, lắc đều để

tách indol trên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch

nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm khả năng khử nitrat

Pha môi trường Nitrate Broth. Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của

chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Nitrate Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ.

Ta dùng phương pháp thử nghiệm trên lame, sau thời gian ủ, lấy một

giọt canh trường nuôi cấy đặt lên lame sạch. Nhỏ một giọt thuốc thử Griess A và

một giọt thuốc thử Griess B lên giọt canh trường. Theo dõi sự hình thành màu

hồng, nếu màu hồng không hình thành ta cho thêm một ít bụi kẽm vào để kiểm tra

nitrate.

Thử nghiệm Citrate

Mục đích

Xác định khả năng của một số VSV sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất

cho hoạt động trao đổi chất.

Nguyên tắc

Sự biến dưỡng citrate bởi VSV sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt

khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate thường dùng ammonium làm

nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh NH3 làm kiềm hóa môi

trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi

trường.

Tiến hành

Chuẩn bị môi trường Simmons Citrate Agar với chỉ thị là bromothymol blue.

Dùng que cấy vô trùng cấy ria khuẩn lạc đặc trưng chủng vi sinh vật lên

bề mặt môi trường SCA trong đĩa thạch. Ủ ở 300 C trong 24-48 giờ

Phản ứng (-): môi trường giữ nguyên màu xanh lục.

Phản ứng (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương.

Khả năng di động

Mục đích

Xác định khả năng di động của VSV.

Nguyên tắc

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt

VSV. Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động

của VSV vào bên trong môi trường thạch mềm.

Tiến hành

- Cấy đâm sâu VSV vào môi trường thạch mềm (0,5% agar).

- VSV di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy.

- VSV không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục.

Thử nghiệm catalase

Mục đích

Định tính khả năng sinh enzyme catalase của VSV.

Catalase

Nguyên tắc

H2O2 H2O + 1/2 O2(bọt khí).

Tiến hành

- Tạo vết bôi VSV để trên lam kính sạch.

- Nhỏ 1-2 giọt H2O2 30%. Quan sát sau 1-2 giây.

Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện.

Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

2.5.1.2. Tiến hành thí nghiệm khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E

Sau khi kiểm tra sinh hóa cho thấy độ thuần khiết và các hoạt tính của vi sinh

vật vẫn còn, tiến hành khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E theo quá

trình sau:

Tiến hành - Pha môi trường NB tăng sinh 2 giống vi sinh vật là SS1 và SH1. Ủ 300C lắc

150 vòng/ phút, trong 20-24 giờ sao cho khi thu canh trường OD600nm khoảng 0,582

- Pha môi trường NA và nước muối sinh lý 0,85% để cấy trang, thu khuẩn lạc

- Tiến hành làm Mc Faland theo hướng dẫn tài liệu

Dung dịch BaCl2 1% (w/v) : cân 1.000g BaCl2.2H2O cho vào 50ml nước cất,

khuấy đến khi tan rồi định mức 100ml.

Đồ án tốt nghiệp

Dung dịch H2SO4 1% (v/v): hút 1ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào bình định

mức 100ml, sau đó dùng nước cất định mức về 100ml.

Bàng 2.1. Các mức Mc Faland

2 3 4 Nồng độ 0.05 1

0.2 0.3 0.4 0.05 0.1 BaCl2 1% (ml)

9.8 9.7 9.6 9.95 9.9 H2SO4 1% (ml)

- Sau 24h, kiểm tra có khuẩn lạc đặc trưng hay không. Nếu có tiến hành test

định danh API 20E

- Dùng pipetman đã chuẩn bị (hấp khử trùng) hút nước cất vô trùng vào khay

nhựa để bộ KIT đạt độ ẩm nhất định

- Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng cho vào nước muối sinh lý cho đến khi đạt độ

đục so với Mc Faland có nồng độ =3

- Dùng pipetmen hút nước muối sinh lý đã có vi khuẩn vào từng phản ứng của

bộ KIT như sau:

 Đối với ONPG, TDA, IND, GLU cho đến ARA: cho dịch vào sao cho đầy

cupble.

 Đồi với ADH, LDC, ODC, H2S, URE: cho dịch vào không được đầy cupble,

sao đó cho dầu khoáng vào ngập cả cupble và tube (đổ cho lồi lên).

 Đối với CIT, VP, GEL: cho dịch vào sao cho đầy cả cupble và tube (đổ cho

lồi lên).

- Ghi lại tên người thực hiện, ngày và giờ sau khi cấy xong. - Ủ bộ KIT ở nhiệt độ 370C, từ 18-24 giờ. Sau đó đọc kết quả.

- Đọc kết quả

 Sau 18giờ: đọc tất cả các phản ứng và hiện tượng của các test ( trừ TDA,

IND, VP), rồi sau đó ghi nhận lại kết quả bằng cách : dương tính (+), âm tính (-).

 Sau 24 giờ: đọc lại tất cả các phản ừng và hiện tượng của các test kể cả TDA,

IND, VP, rồi sau đó ghi nhận lại kết quả bằng cách: dương tính (+), âm tính (-).

 Sau khi đọc kết quả test API dò các hệ số bằng phần mếm ứng dụng sẽ kết

luận được hai giống SH1 Và SS1 thuộc giống vi sinh vật nào.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2. Đánh giá và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp prodigiosin

cao

Sau khi khẳng định là S. marcescens bằng KIT API 20E, tiến hành thí nghiệm

đánh giá và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp prodigiosin cao.

Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:

Hình 2.3. Sơ đồ chọn chủng có khả năng tổng hợp prodigiosin cao

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành thí nghiệm

- Bước 1 (nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết

cũng như khẳng định là S. macescens, tiến hành nhân giống cấp 2 trong môi trường

NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng.

- Bước 2: thu canh trường, pha loãng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vi

khuẩn vào môi trường NB, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vòng/phút ủ tối trong vòng

48 giờ, ở nhiệt độ phòng.

- Bước 3: thu canh trường, tiến hành trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl

(95:5) theo sơ đồ sau:

- Bước 4: gom 3 dịch vừa trích ly vào bình định mức 50 (ml), định mức bằng

Hình 2.4. Sơ đồ trích ly canh trường từ môi trường nuôi cấy thu prodigiosin

hỗn hợp dung môi Ethanol:HCl (95:5), lấy 1ml màu thu được vào ống nghiệm và

thêm 4ml dung môi Ethanol:HCl (95:5), quét phổ hấp thụ ở bước sóng 400-700nm,

dùng hỗn hợp Ethanol:HCl (95:5) làm mẫu trắng. Xác định OD (λmax) các mẫu vừa

được quét phổ ở trên. Dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem phụ lục B) xác định hàm

lượng prodigiosin có trong mẫu.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.3. Xác định điều kiện nhân giống

Thí nghiệm này được trình bày qua sơ đồ hình 2.4:

Hình 2.5. Sơ đồ xác định điều kiện nuôi cấy tế bào trong giai đoạn nhân giống

Thuyết minh sơ đồ:

Nhân giống cấp 1 và cấy giống thực hiện tương tự như thí nghiệm trên (bước 1)

(2.6.2).

- Thí nghiệm xác định pH nhân giống Thu canh trường, giống cấp 1 pha loãng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vào

môi trường NB được điều chỉnh pH: 6,2; 7,2; 8,2, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc 150

vòng/phút trong vòng 24 giờ, ở nhiệt độ phòng.

- Thí nghiệm xác định vận tốc lắc khi nhân giống

Thu canh trường, giống cấp 1 pha loãng sao cho OD600nm ≈ 0,7. Cấy giống vi

khuẩn vào môi trường NB, tỷ lệ cấy giống 1%, lắc ở các vận tốc sau: không lắc,

150 vòng/phút, 180 vòng/phút, trong vòng 24 giờ, ở nhiệt độ phòng.

Đồ án tốt nghiệp

- Sau thời gian thí nghiệm, đo OD600nm canh tường, dựa vào đường chuẩn tế

bào (xem phụ lục B) tính toán được mật độ tế bào, chọn điều kiện nào cho mật độ tế

bào cao nhất. Từ đó xác định được những điều kiện nhân giống để sử dụng cho các

thí nghiệm tiếp theo.

2.5.4. Xác định môi trường lên men thu prodigiosin

Sau khi xác định được được các điều kiện nhân giống cho mật độ tế bào cao,

tiến hành thí nghiệm xác định môi trường lên men thu prodigiosin. Quy trình xác

định môi trường được thể hiện qua sở đồ sau:

Hình 2.6. Sơ đồ xác định môi trường lên men thu prodigiosin

Đồ án tốt nghiệp

2.5.4.1. Xác định môi trường MT1 lên men thu prodigiosin

Ở môi trường cơ bản (MT0) thành phần chủ yếu là đậu phộng nguyên chất.

được sơ chế bằng cách luộc chin và tiến hành theo các bước sau: cân 50g đậu

phộng, luộc bỏ vỏ, bổ sung nước để đạt 250g, xay nhuyễn.

- Điều chế môi trường thí nghiệm MT1: từ môi trường cơ bản MT0 bổ sung

nước như sau:

5ml MT0 + 15ml nước (đậu phộng 5%)

10ml MT0 + 10ml nước (đậu phộng10%)

15ml MT0 + 15ml nước (đậu phộng 15%)

20ml MT0 + 0ml nước (đậu phộng 20%)

Môi trường pepton glycerol làm đồi chứng

- Nhân giống và cấy giống thực hiện theo quy trình trong thí nghiệm chọn

chủng có khả năng tổng hợp prodigiosin cao (bước 1 ở mục 2.6.2).

- Cấy giống cấp 2 vào môi trường lên men MT1 thu prodigiosin giống như

bước 2 ở thí nghiệm 2.6.3. Các điều kiện lên men thu prodigiosin giống như các

điều kiện ở các thí nghiệm trên như tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc 150 vòng/phút,

nhiệt độ phòng.

- Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5)

theo sơ đồ sau:

Dịch 1 + Dịch 2

Hình 2.7. Sơ đồ trích ly prodigiosin từ canh trường nuôi cấy có chứa đậu phộng

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1 và dịch 2 vừa trích ly vào bình

định mức 50 (ml) định mức về 50 ml bằng hỗn hợp dung môi Ethanol:HCl (95:5),

tiến hành đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định

hàm lượng prodigiosin trong mẫu.

Từ đó, tìm ra được môi trường có hàm lượng đậu phộng khô cho quá trình lên

men thu prodigiosin cao nhất sao với các môi trường còn lại để tiến hành cho các thí

nghiệm tiếp theo.

2.5.4.2. Xác định nguồn nito bổ sung vào môi trường MT1 để được MT2

Sau khi xác định hàm lượng đậu phộng khô trong môi trường MT1 lên men thu

prodigiosin cao nhất, xác định nguồn nito bổ sung vào để được môi trường MT2.

Ở môi trường MT2 này nguồn nito được bổ sung theo các tỉ lệ khác nhau: 0%

(đối chứng), 2,5 %, 5%, 10% (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần). Tiến hành theo các

bước sau:

- Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở

thí nghiệm chọn chủng có khả năng tổng hợp prodigiosin cao (2.6.2). Nhân giống

cấp 2 vào môi trường MT2 lên men thu prodigiosin giống với thí nghiệm trên

(2.6.3). Các điều kiện: tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc là 150 vòng/phút, nhiệt độ

phòng, ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức.

- Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5)

- Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào

giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm điều chế môi trường MT1.

- Từ đó, tìm ra được môi trường có bổ sung hàm lượng nitơ cho quá trình lên

đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu.

men thu prodigiosin cao nhất sao với các môi trường còn lại để tiến hành cho các thí

nghiệm tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.4.3. Xác định nguồn lipid, đánh giá và tuyển chọn các nguồn đường bổ sung vào

môi trường MT2 để được môi trường MT3

Sau khi xác định nguồn nito bổ sung vào môi trường MT1 để được MT2, có

khả năng lên men thu prodigiosin cao nhất so với các môi trường khác, tiến hành thí

nghiệm tiếp theo là xác định nguồn lipid và các nguồn đường bổ sung vào để được

môi trường MT3.

Ở môi trường MT3 này nguồn lipid được bổ sung theo các tỉ lệ khác nhau và bổ

sung các nguồn đường được thể hiện qua hình 2.5. Các bước được thực hiện theo

trình tự sau:

- Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở

thí nghiệm 2.6.2. Nhân giống cấp 2 vào môi trường MT3 lên men thu prodigiosin

giống với thí nghiệm trên (2.6.3). Các điều kiện: tỉ lệ cấy giống 1%, vận tốc lắc 150

vòng/phút, nhiệt độ phòng, ủ tối, điều được cố định ở các nghiệm thức.

- Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5)

- Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào

giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4.

- Từ đó, tìm ra được môi trường có bổ sung hàm lượng lipid và nguồn đường

đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu.

cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất sao với các môi trường còn lại để

tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.5. Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin

Sau tất cả các quá trình nghiên cứu tìm ra được môi trường để tổng hợp

prodigiosin cao nhất, tiếp theo tiến hành thí nghiệm xác định điều kiện trên môi

trường mới này nhằm tìm ra điều kiện tốt nhất cho quá trình lên men tổng hợp

prodigiosin. Các điều kiện được trình bày qua sở đồ sau:

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.8. Sơ đồ xác định điều kiện lên men trên môi trường tổng hợp MT3

Đồ án tốt nghiệp

2.5.5.1. Xác định tỉ lệ cấy giống trên môi trường tổng hợp MT3

Ở thí nghiệm này, tỉ lệ cấy giống sẽ thay đổi qua nhiều giá trị, còn các điều

kiện: vận tốc lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng, ủ tối, điều được được cố định ở các

nghiệm thức. Quá trình này được thể hiện qua sơ đồ sau:

- Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở

thí nghiệm 2.6.2. Các bước nhân giống cấp 2 lên men thu prodigiosin thực hiện như

thí nghiệm trên. Các điều kiện: vận tốc lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng,ủ tối, điều

được cố định ở các nghiệm thức nhưng có sự thay đổi về tỉ lệ cấy giống : 1%, 3%,

5%, 7% (trong đó tỉ lệ 1% là đối chứng, vì các thí nghiệm trên đều sử dụng tỉ lệ

này).

- Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5)

- Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào

giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4.

- Từ đó, tìm ra được tỉ lệ cấy giống cho quá trình lên men thu prodigiosin cao

đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu.

nhất sao với các tỉ lệ còn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.5.2. Xác định vận tốc lắc cho quá trình tổng hợp prodigiosin

Sau khi tìm ra tỉ lệ cấy giống, tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xác định số vòng

lắc cho quá trình tổng hợp prodigiosin. Khi chọn được số vòng lắc thích hợp sẽ kích

thích quá trình tăng trưởng tế bào và đồng thời sinh tổng hợp prodigiosin.

Ở thí nghiệm này: tỉ lệ cấy giống (lấy tỉ lệ tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm

trên), nhiệt độ phòng, ủ tối, điều được cố định, còn số vòng lắc được thay đổi ở các

vận tốc khác nhau đã trình này qua sơ đồ hình 2.7

Các bước nhân giống và cấy giống tiếp theo thực hiện quy trình giống như ở thí

nghiệm 2.6.2. Các bước nhân giống cấp 2 lên men thu prodigiosin thực hiện như ở

thí nghiệm 2.6.4. Các điều kiện: vận tốc lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng,ủ tối,

điều được cố định ở các nghiệm thức nhưng có sự thay đổi vận tốc lắc: không lắc,

150 vòng/phút, 180 vòng/phút, 180/150 vòng/phút ( 24 giờ đầu lắc 180 vòng/phút,

Đồ án tốt nghiệp

24 giờ tiếp theo giảm còn 150 vòng/phút), (trong đó sử dụng vận tốc lắc 150

vòng/phút làm đối chứng vì các thí nghiệm trước đều dung vận tốc này)

Sau 48 giờ, tiến hành thu mẫu và trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5)

giống như quy trình trích ly ở thí nghiệm 2.6.4.

Sau khi trích ly, tiến hành xác đo OD (λmax) hợp chất thu được và dựa vào

đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong mẫu.

Từ đó, tìm ra được vận tốc lắc cho quá trình lên men thu prodigiosin cao nhất

sao với các vận tốc còn lại để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.5.6. Phương pháp theo dõi động học quá trình tổng hợp prodigiosin

Mục đích

Khi nói về sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập tới sinh

trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của một loài

Nguyên tắc

Dựa vào sự thay đổi vè tốc độ sinh trưởng và khối lượng sinh khồi hình thành

mà biết được quá trình động học của tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn nào.

Tiến hành

- Tăng sinh chủng vi khuẩn được chọn trong môi trường NB 24 giờ, lắc

150 vòng/phút trong tối, ở nhiệt độ phòng.

- Sử dụng môi trường tối ưu đã được nghiên cứu ở trên để khảo sát đường cong

tăng trưởng. Mỗi bình 20 ml môi trường, mật độ cấy giống 1%, lắc 180 vòng/phút,

bao tối, ủ ở nhiệt độ phòng.

- Cứ 2 giờ lấy mẫu 1 lần, theo dõi liên tiếp trong 72 giờ. Theo dõi thông số là

nồng độ sắc tố tổng hợp được. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Vẽ đường cong tăng

trưởng và đường cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật.

- Các thông số từ đường cong tăng trưởng được tính như sau: Tốc độ tổng hợp

sắc tố = (P-P0)/(t-t0) với P là nồng độ sắc tố (mg/ml).

Đồ án tốt nghiệp

2.6. Phƣơng pháp phân tích

2.6.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin

Mục đích

Xác định được lượng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đưa ra kết luận

cho thí nghiệm.

Nội dung

Nồng độ hợp chất prodihiosin được xác định dựa vào đường chuẩn hợp chất và

giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin.

2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các số liệu thô được xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion

XV. Các số liệu sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng

LSD với mức ý nghĩa 0,05.

Các số liệu được tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office

Excel 2007. Các biểu đồ cũng được thể hiện bằng phần mềm này.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1. Kết quả sau khi kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S. marcescens

3.1.1. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của chủng vi sinh vật

Hình thái khuẩn lạc

Vi khuẩn được cấy trên môi trường MacConkey có hình thái khuẩn lạc tròn,

màu đỏ, có quần sáng bao quanh và làm đổi màu môi trường MacConkey

(Hình 3.1). Hai chủng vi khuẩn này được Nguyễn Hoành Anh Kha (2013) phân lập

từ Heterorhabditis indica CP 16 và từ Steinernema quangdongsense XT lần lược

được đặt tên là SH1 và SS1.

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi sinh vật được phân lập trên MacConkey A B Chủng SS1 và SH1 tạo khuẩn lạc tròn, lồi, màu đỏ, có quầng sáng bao quanh và

làm đổi màu môi trường xung quanh (Hình 3.1).

Cả hai chủng SS1 và SH1 đều tổng hợp sắc tố đỏ trên môi trường NA

làm cho khuẩn lạc có màu đỏ (Hình 3.1) như theo mô tả của các tài liệu về khả

năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006;

Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng

sự, 2011). Khuẩn lạc của chủng SS1 tròn, lồi, có trạng thái nhớt trên môi

trường NA và kích thước khuẩn lạc 2,5-3,0 mm. Khuẩn lạc của chủng SH1 cũng

tròn, lồi, có trạng thái nhớt trên môi trường NA và PGA nhưng kích thước khuẩn

lạc nhỏ hơn chủng SS1, từ 1,5-2,0 mm.

Nguyên nhân của sự đổi màu môi trường xung quanh vì hai chủng SS1 và

SH1 đều không có khả năng sử dụng đường lactose trong môi trường nên sử

Đồ án tốt nghiệp

dụng peptone là nguồn carbon chính, chính vì thế đã làm tăng pH của môi trường và

làm đổi màu chỉ thị neutral red từ đỏ sang vàng.

SH1 SS1

Khuẩn lạc SH1 trên môi trường NA Khuẩn lạc SS1 trên môi trường NA

Khuẩn lạc SH1 soi nghiêng trên NA Khuẩn lạc SS1 soi nghiêng trên NA

Hình 3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc chủng SS1 và SH1 trên môi trường NA

Kết quả hình thái nhuộm Gram

Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách

đơn giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram

dương.

Sau khi tiến hành nhuộm kết quả cho thấy hai chủng phân lập được có lớp

peptidoglycan mỏng nên không giữ được phức hợp crystal violet – iodine sau khi

tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai

chủng phân lập được là Gram âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens

(Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012). Có thể

thấy ở bảng 3.2, tế bào SS1 và SH1 bắt màu hồng, hình que ngắn. Đối chứng E.

Đồ án tốt nghiệp

coli là vi khuẩn gram âm hình que, đối chứng Bacillis subtilis là vi khuẩn gram

dương hình que.

Chủng SS1 Gran (-) Chủng SH1 Gram (-)

Đồi chứng E.coli Gram (-) Đối chứng Bacillus subtilis Gram (+)

Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SS1 cùng với đối chứng E.coli

và Bacillus subtilis

Đặc điểm sinh hóa của chủng SS1 và SH1

Sau khi làm thuần chủng vi sinh vật trên môi trường MacConkey, tiến hành

lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định

môt số tính chất sinh hóa tiêu biểu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1. Các thử nghiệm sinh hóa

Chủng VSV TSI Indol Nitrat Citrat Catalase

SH1 Nghiêng vàng, sâu - + + +

vàng, không sinh

hơi, không sinh H2S

SS1 Nghiêng vàng, sâu - + + +

vàng, không sinh

hơi, không sinh H2S

Trong môi trường TSI có hai nguồn đường, vì vậy kết quả của kiểm tra này chủ

yếu xem xét vi sinh vật có thể sử dụng nguồn đường nào. Từ kết quả nhận thấy rằng

S. marcescens có thể sử dụng cả hai loại đường trong môi trường TSI nên làm thay

đổi pH trong môi trường dẫn đến thay đổi màu chỉ thị phenol red, tuy nhiên không

có khả năng sinh khí và không có khả năng sinh H2S. điều này phù hợp với đặc

điểm sinh hóa của S. marcescens đã được ghi nhận trước đó.

Với hai chủng thử nghiệm SS1 và SH1 vì không có hệ enzyme

tryptophanase nên không tạo ra indol, thuốc thử Kovac’s vẫn giữ nguyên

màu vàng trong lớp dung môi hữu cơ . Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên

cứu về S. marcescens.

Với mẫu SS1 và SH1 cũng thấy có sự khử nitrate thành nitrite tạo ra màu hồng

đậm trên giọt canh trường khi cho thuốc thử Griess A và Griess B vào. Điều này

hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về S. marcescens.

Với mẫu SS1 và SH1 cũng thấy có sự biến dưỡng citrate tạo CO2 làm kềm hóa

môi trường,vì vậy làm thay đổi màu thuốc thử chuyển từ màu xanh lục qua màu

xanh dương . Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về S. marcescens.

Có hiện tượng sủi khí khi ta cho H2O2 30% vào sinh khối trên lame, sở dĩ như

vậy do SH1 và SS1 là một vi sinh vật hiếu khí tùy nghi nên có hệ enzyme catalase

Đồ án tốt nghiệp

phát triển để thực hiện các phản ứng giải độc trong tế bào. Kết quả dương tính ở

ESS1 và SH1 giống với các nghiên cứu trước.

Tóm lại từ các kiểm tra sinh hóa trên phù hợp với các nghiên cứu được ghi nhận

trước đó, là tiền đề tiến hành định danh chủng vi khuẩn SS1 và SH1 bằng KIT API

20E.

3.1.2. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux)

- Từ kết quả bảng 3.3., tiến hành định danh chủng vi khuẩn bằng KIT API 20E.

- Sau 18 giờ ủ bộ KIT, tiến hành đem ra đọc kết quả: đọc tất cả các phản ứng và

hiện tượng của các test ( trừ TDA, IND, VP). (Xem hình phụ lục A)

- Sau 24 giờ, tiến hành đọc hết tất cả các phản ứng và hiện tượng của bộ KIT

API 20E bằng cách so màu với các chỉ tiêu đưa ra trong phần mềm API web rồi dựa

vào bảng phần trăm ( Xem phụ lục B) ghi nhận lại kết quả bằng cách: dương tính

(+), âm tính (-). (Xem hình phụ lục A)

- Từ kết quả ghi nhận ở các phản ứng và hiện tượng của KIT API 20E được

trình bày cụ thể qua bảng 3.4. như sau:

Bảng 3.2. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SS1 và SH1

STT Tên phản ứng SS1 SH1

1 (+) ONPG (+)

2 (-) ADH (-)

3 (+) LDC (+)

4 (+) ODC (+)

5 (+) CIT (+)

6 (-) (-) H2S

7 (-) URE (-)

8 (-) TDA (-)

9 (-) IND (-)

Đồ án tốt nghiệp

10 VP (+) (+)

11 GEL (+) (+)

12 GLU (+) (+)

13 MAN (+) (+)

14 INO (+) (+)

15 SOR (+) (+)

16 RHA (-) (-)

17 SAC (+) (+)

18 MEL (-) (-)

19 AMY (+) (+)

20 ARA (-) (-)

21 OX (-) (-)

22 (+) (+) NO2

23 (-) (-) N2

24 McC (+) (+)

- Từ bảng 3.2., tiến hành dò kết quả đối chứng với phần mềm API web ta được

các thông số quan trọng sau (xem hình phụ lục A)

+ Trắc đồ: 530772153

+ Phân loại: Serratia marcescens

+ Phần trăm chứng minh: 97,4%

Từ đây, khẳng định được rằng chủng SH1 và SS1 là Serratia marcescens.

3.2. Kết quả đánh giá và tuyển chọn khả năng tổng hợp prodigiosin của hai

chủng SS1 và SH1

- Sau 48 giờ tăng sinh trên môi trường NB, tiến hành trích ly canh trường

bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5), thu được sắc tố màu đỏ. Sau đó dựa và phương

pháp xác định phổ hấp thụ của sắc tố để tìm ra λmax nhằm khẳng định hợp chất sắc

tố thu được là prodigiosin và từ đó dùng λmax đo OD, dựa vào đường chuẩn sắc tố

tính ra hàm lượng prodigiosin có trong mẫu.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.4. Sắc tố sau khi trích ly

Trong dung môi Ethanol:HCl (95:5), phổ hấp thụ λmax= 534nm và 535nm, giá

trị này tương đồng với các báo cáo về λmax của prodigiosin trong dung môi Ethanol

96%, cả hai đều hấp thụ cao nhất ở bước song 535nm (Giri và cộng sự, 2004;

Krishna, 2008; Ramina và Samira, 2008; Song và cộng sự, 2006). Điều này tạo cơ

sở tin tưởng hợp chất thu được là prodigiosin.

Vậy chọn bước song cao nhất λmax=535nm cho các thí nghiệm tiếp theo.

Phổ SS1 Phổ SH1

Hình 3.5. Kết quả quét quang phổ của hợp chất trong dung môi Ethanol:HCl (95:5)

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi có kết quả quét quang phổ, lấy λmax= 535nm tiến hành đo OD hợp chất

prodigiosin và dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem phụ lục B) tính hàm lượng

prodigiosin có trong mẫu. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp sắc tố của hai củng

SS1 và SH1 được biễu diễn trong hình 3.3.

4.57a

n

3.14b

i s o i g i

) l

SS1

m / g m

(

SH1

d o r p g n ợ ƣ

l

m à H

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

SS1 SH1 Chủng vi sinh vật

Hình 3.6. Khả năng tổng hợp prodigiosin của hai chủng vi sinh vật SS1 và SH1

Từ kết quả trong hình 3.3, người thực hiện nhận thấy rằng trong cùng các điều

kiện nuôi cấy (môi trường NB, tỉ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ

phòng) thì chủng SH1 cho hàm lượng prodigiosin cao hơn chủng SS1. Vì vậy, từ

kết quả của thí nghiệm này, chọn chủng SH1 cho quá trình lên men thu prodigiosin

ở các thí nghiệm tiếp theo.

3.3. Xác định điều kiện nhân giống

Quá trình này được thực hiện vì các nghiên cứu trước đó của các bài báo nước

ngoài cho nhiều kết quả khác nhau vì nhiều lý do, mà chủ yếu là các điều kiện môi

trường. Vì vậy người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này với mục đích tìm ra

được điều kiện nuôi cấy phù hợp với môi trường phòng thí nghiệm tại Việt nam.

3.3.1. Đánh giá yếu tố pH ảnh hưởng mật độ tế bào

Đồ án tốt nghiệp

Để tiến đến mục tiêu, người thực hiện đề tài tiến hành nuôi cấy chùng vi khuẩn

SH1 trên các khoảng pH 6,2; 7,2; 8,2 trong môi trường NB. Sau 24 giờ, tiến hành

đo OD600nm, dựa vào đường chuẩn tế bào tính ra mật độ tế bào trong canh trường.

8.90

Phương trình đường chuẩn tế bào xem phụ lục B. kết quả được trình bày hình 3.7.

8.80

8.70

8.60

8.79a 8.75a 8.73a

o à b ế t

8.50

8.40

8.30

8.20

ộ đ t ậ m g o L

8.10

8.00

6,2

8,2

7,2 Giá trị pH

Hình 3.7. Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn SH1 ở các pH khác nhau

Quá trình tăng trưởng của vi sinh vật rất nhạy cảm với pH, mỗi vi sinh vật thích

ứng với khoảng pH khác nhau. Vì vậy, tìm ra được pH phù hợp sẽ giúp cho quá

trình tăng trưởng tế bào của vi sinh vật phát triển tốt hơn

Qua nghiên cứu này, người thực hiện nhận thấy rằng, pH ở giá trị 7,2 cho mật độ tế bào cao nhất là 8,79 ≈ 6,2x108 (cfu/ml). Tuy nhiên, các giá trị pH cho mật độ

tế bào không khác nhau nhiều. Từ đó cho thấy, khoảng pH của vi khuẩn Serratia

marcescens khá rộng nên không bị ảnh hưởng trong khoảng pH từ 6,2 đến 8,2.

3.3.2. Đánh giá số vòng lắc ảnh hưởng mật độ tế bào

Để tiến đến mục tiêu, người thực hiện đề tài tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn

SH1 trong các điều kiện sau: kỵ khí không lắc, hiếu khí lắc 150 vòng/phút, hiếu khí

lắc 180 vòng/phút trong môi trường NB. Sau 24 giờ, tiến hành đo OD600nm, dựa vào

đường chuẩn tế bào tính ra mật độ tế bào trong canh trường. Phương trình đường

chuẩn tế bào xem phụ lục B. kết quả được trình bày hình 3.8 sau:

Đồ án tốt nghiệp

8.79a 8.63b

7.17c

o à b ế t

ộ đ t ậ m g o L

10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00

150v/phút 180v/phút kỵ khí

Vận tốc lắc ( vòng/phút )

Hình 3.8. Log mật độ tế bào qua các điều kiện nuôi cấy

Mỗi VSV cần điều kiện oxi và số vòng lắc khác nhau. Có loại hiếu khí, có loại

kị khí hoặc cũng có loại hiếu khí tùy nghi. Vì vậy, tìm ra được điều kiện hô hấp và

số vòng lắc phù hợp bản chất của mỗi vi sinh vật sẽ giúp quá trình tăng trưởng vi

sinh vật ổn định và tốt hơn.

Theo nghiên cứu của Krishna (2008) thì tế bào sản xuất tối đa ở tốc độ lắc 150

vòng/ phút còn ở nghiên cứu của Wei và cộng sự (2005) là 200 vòng/phút. Như vậy,

trong các điều kiện ở nghiên cứu này thì điều kiện lắc 150 vòng có oxi là cho log

mật độ tế bào cao nhất và điều này đúng với nghiên cứu của Krishma (2008).

Qua nghiên cứu này người thực hiện nhận thấy rằng điều kiện lắc 150 vòng/phút có oxi cho log mật độ tế bào cao nhất là 8,79 ≈ 6,2x 108 (cfu/ml). Từ

đây, chọn điều kiện lắc 150 vòng/phút có oxi cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.4. Xác định môi trƣờng lên men thu prodigiosin

3.4.1. Xác định môi trường MT1 lên men thu prodigiosin

Để thực hiện mục tiêu của đề tài thì công việc cần làm là lựa chọn được nồng

độ huyền phù đậu phộng làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens sản

xuất prodigiosin cho hàm lượng cao nhất. Người thực hiện đề tài tiến hành tạo môi

Đồ án tốt nghiệp

trường huyền phù đậu phộng là MT1, nuôi cấy chủng vi khuẩn SH1 với các điều

kiện tối ưu khảo sát ở trên, sau 48 giờ thu canh trường nuôi cấy, trích ly bằng dung

môi Ethanol:HCl (95:5) được hợp chất prodigiosin.

1 2 3 4 5 6

Hình 3.9. Hợp chất prodigiosin sau khi trích ly từ môi trường MT1 bằng hỗn hợp

dung môi Ethanol:HCl (95:5)

Đậu phộng có nguồn lipid, protein và nguồn carbon đều cao, vì vậy môi trường

đậu phộng là môi trường lý tưởng cho sự tăng trưởng tế bào và kích thích để sinh

tổng hợp prodigiosin.

Theo bảng 1.4 nghiên cứu của Chidambaram và Perumalsamy (2009) về việc so

sánh hàm lượng prodogiosin trong các môi trường và nhiệt độ khác nhau, tác giả

cho thấy hàm lượng prodigiosin trong môi trường đậu phộng nguyên hạt ở nhiệt độ 280C cho hàm lượng cao nhất đạt 38,75 (mg/ml), tuy vậy tác giả không đề cập hoặc

không có bài báo nào nói về khối lượng đậu cần bổ sung là bao nhiêu nên người

thực hiện đề tài tiến hành xác định môi trường gồm đậu phộng và nước (MT1) đã

nêu rõ ở phương pháp.

Sau các quá trình lên men, trích ly, đo OD và xác định hàm lượng prodigiosin

trong mẫu, kết quả được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.10.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Hàm lượng prodigiosin thu được từ các môi trường có hàm lượng dịch

nghiền đậu phộng khác nhau

Tỉ lệ đậu phộng khô trong MT1

Hàm lượng 5% 10% 15% 20% PG

prodigiosin 4,05b±0,44 9,91a±2,47 10,71a±1,64 7,45a±2,78 3,99b±0,19 (mg/ml)

(Các giá trị có các chữ cái giống nhau ở cùng một dòng thì không có sự khác biệt

theotrắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05)

Qua bảng 3.8 cho thấy:

Theo nghiên cứu Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013), môi trường pepton glycerol

cho tổng hợp prodigiosin cao nhất. Nhưng trong nghiên cứu này, ở môi trường thí

nghiệm MT1 (cách làm và nồng độ đã nêu ở phương pháp), nồng độ đậu phộng

càng cao cho giá trị hàm lượng prodigiosin càng lớn nhưng khi nồng độ quá cao ở

mức 20% đậu khô vào môi trường thì làm cản trở oxi dẫn đến giảm tốc độ tăng

trưởng tế bào từ đó ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp prodigiosin, nhưng nhìn

chung vẫn cao hơn môi trường pepton gelycerol ( môi trường đối chứng).

300

Đồ án tốt nghiệp

268.4 248.4

n

250

i s o i g i

200

186.7

) g n ứ h c i ố đ

150

i ớ v

101.5 100

d o r p g n ợ ƣ

100

l

o s

(

m à H

10%

15%

20%

Hàm lƣợng đậu khô trong môi trƣờng MT1 (%)

Hình 3.10. Hàm lượng prodigiosin thu được trong môi trường MT1 với các hàm

lượng đậu phộng khác nhau

- Từ kết quả bảng 3.6 và hình 3.7, nhận thấy rằng hàm lượng đậu khô 10% và

15% cho hàm lượng prodigiosin cao nhất đạt 9,91 và 10,71 (mg/ml) và cao hơn so

với đối chứng là 48,4% và 68,4%. Tuy nhiên hai giá trị này không khác nhau, nên

ngưởi thực hiện quyết định chon hàm lượng đậu phộng khô cho tổng hợp

prodigiosin là 10% vì mang tính kinh tế.

3.4.2. Xác định nguồn nitơ bổ sung vào môi trường cơ bản MT1 để được MT2

3.4.2.1. Bổ sung gelatin

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong học

Enterobacteriaceae bởi đạc điểm tiết enzyme gelatinase (Giri và cộng sự, 2004)

phân giải gelatin tạo ra các hợp chất cung cấp cho quá trình tăng trưởng tế bào, vì

vậy việc bổ sung gelatin vào môi trường đậu phộng nhằm cung cấp thêm dưỡng

chất cho vi khuẩn tăng trưởng và sinh tổng hợp prodigiosin. Prodigiosin là pyrrole

alkaloid. Tiền chất của vòng pyrrole là amino acid Proline. Các tác giả đã nghiên

Đồ án tốt nghiệp

cứu cho thấy bổ sung proline làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. Proline có

nhiều trong gelatin (theo Williams và Quadri, 1980)

Sau 48 giờ tăng sinh, lấy mẫu để trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5),

sau đó đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố (xem ở phụ lục B) xác định hàm

lượng prodigiosin có trong mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.11.

Bảng 3.4. Hàm lượng prodigiosin trong môi trường MT1 có bổ sung gelatin

Môi trƣờng MT1 + gelatin

Hàm lượng MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10%

prodigiosin 5,36a±1,36 3,96b±0,47 2,81c±1,33 0,51d±0,21 (mg/ml)

120

n

100 100

i s o i g i

73.9 80

d o r p

) g n ứ h c i ố đ

52.4 60

i ớ v

g n ợ ƣ

l

o s

% 20 9.5

(

m à H

MT1 MT1 + 5% MT1 + 10%

MT1 + 2,5% Hàm lƣợng gelatin bổ sung vào MT1 (%)

Hình 3.11. Kết quả hàm lượng prodigiosin trong môi trường MT1 bổ sung gelatin

Kết quả trên hình 3.8 cho thấy hàm lượng prodigiosin cao ở môi trường không

bổ sung gelatin hoặc bổ sung hàm lượng gelatin ít, vì sau khi khuấy tan trong nước

gelatin trở nên cô đặc nên làm môi trường trong trạng thái kết dính làm cản trở khả

năng truyền khối oxi trong môi trường, vì vậy mà hàm lượng prodigiosin giảm.

Đồ án tốt nghiệp

Qua kết quả thí nghiệm trên, người thực hiện đề tài thấy rằng không nên bổ

sung thêm gelatin vào môi trường huyền phù đậu phộng, mà nếu được thì bổ sung

peptone thay cho gelatin. Mẫu trước và sau khi trích ly và sau khi trích ly được thể

hiện trên hình 3.12.

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

Hình 3.12. Mẫu trong môi trường MT1 (10%) bổ sung gelantin trước và sau khi

trích ly thu prodigiosin

3.4.2.2. Bổ sung peptone

Trong hầu hết các môi trường dinh dưỡng đều có mặt pepton, vì đây là nguồn

dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Vì vậy việc bổ sung

pepton vào môi trường huyền phù đậu phộng nhằm cung cấp thêm dưỡng chất cho

vi khuẩn Serratia marcescens dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin.

Sau 48 giờ, thu mẫu tiến hành trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5), sau

đó đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng prodigiosin trong

mẫu thu được.Kết quả bổ sung hàm lượng pepton vào môi rường huyền phù đậu

phộng được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.13.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5. Hàm lượng prodigiosin .trong môi trường MT1 có bổ sung peptone

Môi trƣờng MT1 + peptone

Hàm lượng MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10%

160.7

prodigiosin 13,31c±2,01 17,64b±0,5 20,02a±0,62 21,39a±0,48 (mg/ml)

n

150.4

132.5

i s o i g i

100

) g n ứ h c i ố đ

i ớ v

d o r p g n ợ ƣ

l

o s

(

m à H

MT1 MT1 + 2,5% MT1 + 5% MT1 + 10%

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Hàm lƣợng pepton bổ sung vào MT1 (%)

Hình 3.13. Hàm lượng prodigiosin khi bổ sung peptone vào môi trường

huyền phù đậu phộng.

Từ kết quả ở bang 3.5 và hình 3.13, người thực hiện đề tài nhận thấy rằng việc

bổ sung peptone vào môi trường huyền phù đậu phộng làm tăng hàm lượng

prodigiosin so với môi trường không bổ sung là rất lớn, với việc bổ sung 5% và 10% pepton cho hàm lượng prodigiosin đạt 20,02a±0,62 và 21,39 ± 0,48 (mg/ml),

tăng 50,4% và 60,7% so với đối chứng là môi trường MT1 không bổ sung peptone,

cao hơn tất cả môi trường trong bảng 1.4 (chỉ trừ môi trường hạt đậu phộng)

(Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Vì hàm lượng prodigiosin ở 5% và 10% pepton không khác nhau nhiều nên

người thực hiện đề tài quyết định chọn môi trường MT2 = MT1 (10% đậu phộng) +

5% pepton cho thí nghiệm tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

3.4.3. Kết quả xác định nguồn lipid và các nguồn đường bổ sung vào môi trường

MT2 để được môi trường MT3

3.4.3.1. Xác định nguồn lipid bổ sung vào môi trường MT2:

Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl

(95:5), sau đó đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng

prodigiosin trong mẫu thu được.Kết quả bổ sung nguồn lipid vào môi trường MT2

được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.11.

Bảng 3.6. Hàm lượng prodigiosin trong môi trường MT2 có bổ sung Lipid

Môi trƣờng MT2 + % dầu hƣớng dƣơng

Hàm lượng

prodigiosin (mg/ml) MT2 6,79b±1,25 MT2 + 1% 9,01a±1,03 MT2 + 2% 9,81a±0,21

160

)

144.5 % 132.5 140

120

g n ợ ƣ

100

l

100

( u ẫ m g n o r t

ó c n

i s o i g i

m à h m ă r t n ầ h P

d o r p

MT2 MT2 + 1% MT2 + 2%

Tỉ lệ dầu hƣớng dƣơng bổ sung vào môi trƣợng MT2 (%) Hình 3.14. Hàm lượng prodigiosin khi bổ sung dầu hướng dương vào môi

trường MT2

Từ kết quả bảng 3.6 và trong hình 3.14, người thực hiện đề tài nhận thấy rằng

khi bổ sung dầu hướng dương vào môi trường huyền phù đậu phộng peptone thì

hàm lượng prodigiosin tăng so với môi trường không bổ sung, ở môi trường bổ

Đồ án tốt nghiệp

sung 1% (≈0,2ml) và 2% (≈0,4ml) hàm lượng prodigiosin đạt 9,01a±1,03 và 9,81a±0,21 ,tăng 32,5% và 44,5% so với đối chứng, tuy nhiên hai kết quả không sai

khác nhau nên chọn tỉ lệ dầu hướng dương bổ sung là 1% vì tính kinh tế.

Theo thí nghiệm Chidambaram và Perumalsamy (2009) nêu rõ vai trò của các

acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có

thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Vì vậy,

kết quả đạt được đúng với thí nghiệm của Chidambaram và Perumalsamy (2009)

cho nên người thực hiện đề tài quyết định lấy kết quả bổ sung 1% dầu hướng dương

vào môi trường đậu phộng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.3.2. Xác định nguồn đường bổ sung vào môi trường MT2:

Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu tiến hành trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl

(95:5), sau đó đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng

prodigiosin trong mẫu thu được.Kết quả bổ sung các nguồn đường vào môi trường

MT2 được thể hiện trong bảng 3.7 và hình 3.15.

Bảng 3.7. Hàm lượng prodigiosin trong môi trường MT2 có bổ sung nguồn đường

Môi trƣờng cơ bản MT2 + % dầu hƣớng dƣơng

MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 + MT2 Sorbitol malnitol mantose sucrose tinh bột

Hàm lượng

7,03a± 2,12c± 3,23b± 2,81b± 2,44b± 2,68b± prodigiosin

1,39 0,07 0,49 1,12 0,93 0,12 (mg/ml)

Đồ án tốt nghiệp

120 100 100

g n ợ ƣ

l

)

60 45.9 40 38.1 % 34.7

(

30.2 40

g n ờ ƣ r t i ô m g n o r t n

i s o i g i

m à h m ă r t n ầ h P

MT2 MT2 +

d o r p

MT2 + Man MT2 + Mal MT2 + Suc MT2 + TB Sor

Môi trƣờng MT2 và các nguồn đƣờng

Hình 3.15. Kết quả hàm lượng prodigiosin trong mỗi loại đường

Qua kết quả ở hình 3.15 cho thấy rằng hàm lượng prodigiosin ở môi trường

không thêm đường là cao nhất so với tất cả các môi trường bổ sung đường, và ở môi

trường bổ sung Sorbitol cho hàm lượng prodigiosin thấp nhất.

Theo Khanafari và cộng sự (2006), quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia

macecens giảm bởi glucose và các loại đường lên men được khác do có sự giảm pH

trong canh trường nuôi cấy, vì vậy kết quả ở thí nghiệm này đúng với kết quả của

Khanafari và cộng sự. Từ đây, người thực hiện đề tài quyết định không bổ sung

đường vào môi trường huyền phù đậu phộng peptone.

Như vậy trong số các nguồn cacbon bổ sung, 1% dầu hướng dương làm tăng

hàm lượng prodigiosin cao nhất (32,5% so với đối chứng). Do đó môi trường lên

men thu prodigiosin được chọn là MT3 = MT1 (10% đậu phộng) + 5% peptone +

1% dầu hướng dương. Môi trường MT3 được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.

Đồ án tốt nghiệp

3.5. Xác định điều kiện lên men tổng hợp prodigiosin

3.5.1. Xác định tỉ lệ cấy giống trên môi trường MT3

Tỉ lệ cấy giống rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tăng trưởng tế

bào vả sản xuất sắc tố.

Sau 48 giờ tăng sinh, thu mẫu, tiến hành trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl

(95:5), sau đó đo OD535nm và dựa vào đường chuẩn sắc tố xác định hàm lượng

prodigiosin trong mẫu thu được. Kết quả tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến quá trình

tổng hợp prodigiosin được thể hiện trong bảng 3.8 và hình 3.16.

Bảng 3.8. Hảm lượng prodigiosin trong môi trường MT3 qua các tỉ lệ cấy giống

Tỉ lệ cấy giống

Hàm lượng 1% 3% 5% 7% prodigiosin

140

(mg/ml) 8,24b±0,58 9,4a± 0,12 7,03c±0,54 5,57d ± 0,52

n

114 120 100

i s o i g i

100 85

80 68

) g n ứ h c i ố đ

i ớ v

d o r p g n ợ ƣ

l

o s

(

m à H

1% 3% 5% 7%

Tỉ lệ cấy giống

Hình 3.16. Kết quả hàm lượng prodigiosin qua các tỉ lệ cấy giống

Đồ án tốt nghiệp

Trong nghiên cứu này, quan sát thấy tỉ lệ cấy giống ảnh hưởng đến quá trình

sản xuất prodigiosin của chủng SH1. Một loạt các thử nghiệm tỉ lệ cấy giống 1%,

3%, 5%, 7% cho thấy sự khác biệt về hàm lượng prodigiosin, kết quả thấy rằng ở tỉ lệ cấy giống 3% ≈ 3,84x108 (cfu/ml) cho hàm lượng prodigiosin là cao nhất đạt 9,4

± 0,12 (mg/ml).

Vì vậy, từ kết quả nghiên cứu này người thực hiện đề tài quyết định chọn tỉ lệ

cấy giống 3% làm các thí nghiệm tiếp theo và là tỉ lệ cấy giống tốt nhất.

3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của vận tốc lắc đến quá trình tổng hợp prodigiosin

trên môi trường MT3

Mỗi vi sinh vật có các điều kiện oxi khác nhau, có chủng hiếu khí, có chủng

kị khí hoặc cũng có chủng kỵ khí tùy nghi, vì vậy biết được điều kiện nào là cần

thiết sẽ góp phần làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật.

Oxy ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp prodigiosin bởi S.marcescens, đã có sự

ghi nhận prodigiosin sản xuất ở tốc độ lắc 150 vòng/phút (Krishna, 2008) và 200

vòng/phút (Wei và cộng sự, 2005).

Từ đây, người thực hiện đề tài đã thí nghiệm các vòng lắc và cho kết quả ở bảng

3.9 và hình 3.17.

Bảng 3.9. Hàm lượng prodigiosin trong môi trường MT3 qua các vận tốc lắc

Vận tốc lắc (vòng/phút)

Không lắc 150 180 180/150

Hàm lượng

prodigiosin

(mg/ml) 2,75d±0,35 3,65c± 0,23 5,06b±0,31 6,11a ± 0,07

Đồ án tốt nghiệp

167

n

139

i s o i g i

100

) g n ứ h c i ố đ

i ớ v

d o r p g n ợ ƣ

l

o s

(

m à H

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

không lắc 150 180 180->150

Vận tốc lắc (vòng/phút)

Hình 3.17. Kết quả hàm lượng prodigiosin qua các vận tốc lắc

Kết quả ở hình 3.17 cho thấy có sự khác biệt về hàm lượng prodigiosin thu

được ở các vận tốc lắc khác nhau. Không lắc hiển nhiên hàm lượng prodigiosin tổng

hợp chỉ bằng 75% so với đối chứng 100%, giảm 25%. Ở tốc độ lắc 180 vòng/phút

hàm lượng prodigiosin tăng 39% so với đối chứng 150 vòng/phút. Điều này cho

thấy trong môi trường chứa huyền phù đậu phộng độ nhớt cao hơn môi trường lỏng

thông thường nên nhu cầu oxy cũng cao hơn. Khi giữ nguyên vận tốc lắc 180

vòng/phút trong 24 giờ đầu và giảm còn 150 vòng/phút ở 24 giờ sau hàm lượng

prodigiosin cao nhất tăng 67% so với đối chứng. Có thể giải thich rằng: vì

prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp xảy ra trong hai pha: pha tăng

trưởng và pha tổng hợp. Trong pha tăng trưởng cần cung cấp oxy cho tế bào, mà độ

nhớt trong môi trường NB thấp trong khi đó độ nhớt môi trường đậu phộng cao hơn

gấp nhiều lần so với NB chình vỉ vậy để thu sinh khối tốt hơn cần tăng vận tốc lắc

lên 180 vòng/phút. Ở giai đoạn sau, quá trình tổng hợp prodigiosin là có sự gắn kết

protein lên trên lớp màng ngoài của tế bào (Allen và công sự, 1983), vì vậy nếu vận

tốc lắc lớn sẽ ảnh hưởng đến sự gắn kết này nên cần giảm vận tốc xuống 150

Đồ án tốt nghiệp

vòng/phút. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các kết quả đã được nghiên cứu

trước đó.

Vì vậy, từ kết quả nghiên cứu này người thực hiện đề tài quyết định chon điều

kiện 24 giờ đầu lắc 180 vòng/phút 24 giờ sau lắc 150 vòng/phút làm thí nghiệm tiếp

theo .

3.6. Động học quá trình tổng hợp prodigiosin trên môi trƣờng MT3

Kết quả khảo sát động học tổng hợp prodigiosin của chủng vi khuẩn SH1 được

thể hiện ở hình 3.18

Kết quả tính toán được tốc độ sinh trưởng cực đại μmax = 0,157 (h-1) trong pha log từ 4 giờ đến 12 giờ. Thời gian thu prodigiosin là từ 36 giờ nhưng không trễ hơn 48 giờ. Trong khi đó sự tổng hợp prodigiosin bắt đầu tứ 10 giờ nhưng chỉ thực

sự mạnh từ 36 – 48 giờ với tốc độ tổng hợp prodigiosin cực đại qpmax= 0,3

(mg/ml/h).

Quá trình tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật xảy ra không song song với

quá trình tổng hợp sinh khối, mà trễ pha. Như vậy chỉ khi tế bào đi vào pha cân

bằng động quá trình tổng hợp mạnh prodigiosin mới thực sự bắt đầu. Đến 48 giờ thì

quá trình tổng hợp sinh khối bắt đầu giảm mạnh trong khi đó quá trình tổng hợp

prodigiosin vẫn còn nằm pha cân bằng. Chỉ sau 54 giờ thì sắc tố giảm mạnh có thể

do pH môi trường thay đổi làm cho cấu trúc sắc tố thay đổi.

9.00

10.5

Đồ án tốt nghiệp

) l

8.00

) l

m / g m

/

7.00

m u f c

9.5 6.00

g o L

(

9 5.00

( u ẫ m g n o r t n

4.00

o à b ế t

8.5

i s o i g i

3.00 8 2.00

ộ đ t ậ m g o L

d o r p g n ợ ƣ

7.5

l

1.00

0.00 7

m à H

0 20 40 60 80

Series2

Series1

Thời gian (giờ)

Log mật độ tế bào Hàm lượng prodigiosin(mg/ml)

Hình 3.18. Đường cong tăng trưởng tế bào và tổng hợp prodigiosin của SH1 trong môi trường MT3

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Điều kiện nhân giống chủng Serratia marcescens trên môi trường NB có pH

nằm trong khoảng 6,2 đến 8,2, có điều kiện hiếu khí lắc 150 vòng/phút và có tỉ lệ

cấy giống là 1%.

Trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trường huyền phù đậu phộng

MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin là 248,4% so với môi trường peptone

glycerol là 100%

Bổ sung gelatin không làm tăng mà giảm prodigiosin tổng hợp đáng kể do tăng

độ nhớt môi trường.

Bổ sung peptone 5% vào môi trường MT1 (10%) làm tăng hàm lượng

prodigiosin tổng hợp lên đến 150,4%, tăng 50,4% so với môi trường MT (10%).

Trong số các nguồn C bổ sung, đường không làm tăng prodigiosin tổng hợp,

trong khi đó bổ sung dầu hướng dương 1% làm tăng prodigiosin tổng hợp lên đến

132,5%, tăng 32,5% so với môi trường MT2 (MT1 bổ sung 5% peptone).

Tỉ lệ cấy giống 3% tương đương 3,84x108 (cfu/ml) là tỉ lệ cho hàm lượng

prodigiosin tăng 14% so với tỉ lệ 1% làm đối chứng.

Vận tốc pha tăng trưởng (24 giờ đầu) là 180 vòng/phút và pha tổng hợp (24 giờ

sau) là 150 vòng/phút làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp lên đến 167%, tăng

67% so với vận tốc 150 vòng/phút làm đối chứng.

Đường cong tăng trưởng tế bào và tổng hợp prodigiosin cho thấy có thể nuôi

cấy vi khuẩn thu prodigiosin trong môi trường chứa 10% huyền phù đậu phộng 5%

pepton và 1% dầu hướng dương, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ

đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút. Thời điểm thu hồi prodigiodin có thể bắt đầu

từ 36 giờ và kết thúc không muộn hơn 48 giờ.

Kết hợp tất cả yếu tố trên là điều kiện tốt nhất cho quá trình nuôi cấy chủng

SH1 sản xuất prodigiosin.

Đồ án tốt nghiệp

4.2. Kiến nghị

Cần nghiên cứu thêm một số vấn đề sau:

- Khảo sát thêm các nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy để sản xuất

prodigiosin nhiều hơn.

- Thử nghiệm môi trường và điều kiện nuôi cấy thu được điều kiện kiểm soát

nhiệt độ hoặc để hàm lượng prodigiosin tổng hợp được ổn định.

- Tối ưu hóa quy trình trích ly và tinh sạch prodigiosin.

- Khảo sát kháng nấm trên nhiều loại nấm bệnh khác phù hợp hơn

- Prodigiosin thu được là dạng thô, vì vậy cần nghiên cứu quá trình tinh sạch

prodigiosin về dạng tinh để có giá trị cao hơn.

- Prodigiosin sau khi được tinh sạnh đem thử nghiệm khả năng diệt tế bào ung

thư.

- Prodigiosin sau khi được tinh sạnh đem khảo sát khả năng miễn dịch.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Nguyễn Hiếu Dân, (2013). Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia

marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng

prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn này. Đồ án tốt nghiệp.

Nguyễn Hoàng Anh Kha, (2013). Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng

hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN. Đồ án tốt nghiệp.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Amaya D.B.R. (2001). A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research,

ILSI Press, United States of America, pp. 1 -71.

Aguilera M.M. and Smart J.R. (1993). Development, reproduction, and

pathogenicity of Steinernema scapterisci in monoxenic culture with different

species of bacteria, J. Invertebr, Pathol, 62: 289-294.

Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr

(2006). Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens,

Online Journal of Biological Sciences, 6 (1): 1-13.

Bauernfeind J.C. (1981) Natural food colors. Carotenoids as Colorants and

Vitamin A Precursors, Bauernfeind J.C., Academic Press, New York, 1-45.

Bizio B. (1823). Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo

Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina Biblioteca Italiana o sia

Giornale di Letteratura, Scienze e Arti, 30: 275-295.

Brigida P.V. de Q. and Itamar S. de M. (2006). Antagonism of Serratia

marcescens towards Phytophithora parasitica and its effects in promoting

the growth of Citru s, Brazilian Journal of Microbiology, 37: 448-450.

Casullo de Araújo, Helvia W., K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki.

"Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewable-

resources as a low cost substrate." Molecules 15.10 (2010): 6931-6940.

Đồ án tốt nghiệp

Chang, Chia-Che, et al. "Development of natural anti-tumor drugs by

microorganisms." Journal of bioscience and bioengineering 111.5 (2011):

501-511.

Chidambaram K.V., Perumalsamy L. (2009). An Insightful Overview on Microbial

Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, Vol. 5(3): 49-61.

Counsell J.N., Jeffries G.S. and Knewstubb C.J. (1979). Some other natural colors

and their applications, Natural Colors for Foods and Other Uses, Counsell

J.N. and Dunastable J.A., Eds Applied Science, London, 122-151.

Dauenhauer S.A., Hull R.A. and Williams R.P. (1984). Cloning and expression in

Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin

biosynthesis, Journal of Bacteriology, 158: 1128-1132.

David R. Caprette (2012). Enterobacteriaceae: Serratia marcescens. Rice

University. Houston, Texas, US.

Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E. Ibarra (2012).

Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae

(Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella

(Lepidoptera: Pyralidae) Larvae, Florida Entomologist, 95(1):120-127.

Feng J.S., Webb J.W. and Tsang J.C. (1982). Enhancement by sodium dodecyl

sulfate of pigment fonnation in Serratia marcescens O8, Appl, Environ,

Microbiol, 43: 850-853.

Florencio J.A., Soccol C.R., Furianetto L.F., Bonfim T.M.B., Krieger N., Baron M.

and Fontana J.D. (1998). A factorial approach for a sugarcane juice-

based low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by

the red yeast Phaffia rhodozyma, Bioprocess Eng, 19,161-164.

Fodor A., Fodor A.M., Forst S., Hogan J.S., Klein M.G., Lengyel K., Saringer G.,

Stackebrandt E., Taylor R.A.J. and Lehoczky E. (2010). Comparative

analysis of antibacterial activities of Xenorhabdus species on related and

non-related bacteria in vivo, J. Microbiol, Antimicrob, 2: 36-46.

Đồ án tốt nghiệp

Furstner A. (2003). Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin

alkaloids: A survey of the last 2500 years, Chem Int Ed Engl, 42: 3582-3603

Khanafari, Anita, Mahnaz M. Assadi, and Fatemeh A. Fakhr. "Review of

prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens." Online Journal of

Biological Sciences 6.1 (2006): 1.

Gargallo D., Loren J.G., Guinea J., Vinas M. (1987). Glucose-6-phosphate

dehydrogenase alloenzymes and their relationship to pigmentation in

Serratia marcescens, Appl Environ Microbiol, 53: 1983-1986.

Gaughran E.R.L. (1969). From superstition to science the history of a

bacterium,Transactions of the New York Academy of Sciences, 31:3-24.

Gauthier, M. J. "Alteromonas rubra sp. nov., a new marine antibiotic-producing

bacterium." International Journal of Systematic Bacteriology 26.4 (1976):

459-466.

Gillen A.L. and Gibbs R. (2011). Serratia marcescens: The Miracle Bacillus,

Department of Biology and Chemistry, Liberty University.

Giri, Anuradha V., et al. "A novel medium for the enhanced cell growth and

production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil." BMC

microbiology 4.1 (2004): 11.

Goldschmidt M.C. and WiIliams R.P. (1968). Thiamine-induced Formation of

the Monopyrrole Moiety of Prodigiosin, J. Bacteriol, 96: 609-616.

Grimont, Patrick AD, and Francine Grimont. "The genus Serratia." Annual Reviews

in Microbiology 32.1 (1978): 221-248.

Gulani, Chandni, Sourav Bhattacharya, and Arijit Das. "Assessment of process

parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia

marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing

potentials." Malaysian Journal of Microbiology 8.2 (2012): 116-122.

Han S.B., Park S.H., Jeon Y.J., Kim Y.K., Kim H.M., Yang K.H. (2001).

Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - 2Rα

Đồ án tốt nghiệp

expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen

induced arthritis, J Pharm Exp Ther, 299: 415-425.

Hardjito L., Huq A., Colwell R.R. (2002). The influence of environmental

conditions on the production of pigment by Serratia marcescens, Biotechnol

Bioprocess Eng, 7: 100-104.

Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T.,

Leeper J. and Salmond P.C. (2004). The Serratia gene cluster encoding

biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain

dependent genome context variation, Microbiol, 150: 3547-3560.

Helvia W.C. de A., Fukushima K. and Gallba M.C.T. (2010). Prodigiosin

Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as

a Low Cost Substrate, Molecules, 15: 6931-6940.

Hiroaki M., Hiroyuki A., Masakatsu F., Takeji S., Teisuya T. (1996). Industrial

production of optically active intermediate in the synthesis of dialtizem

with lipase, Seibutsu kogaku, 74: 273-288.

Kataoka T., Magae J., Kasamo K., Yamanishi H., Endo A., Yamasaki M., Nagai K.

(1992). Effects of prodigiosin 25-c on cultured cell lines: Its similarity to monovalent polyether ionophores and vacuolar type H+-ATP ase inhibitor, J

Antibiot, 45: 1618-1625.

Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin,

pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13.

Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD

dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology

Cochin University of Science and Technology, Kerala, India.

Lawanson A.O. and Sholeye F.O. (1975). Inhibition of prodigiosin formation

in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-440.

Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine

sources, Appl Microbiol, 12: 13-17.

Đồ án tốt nghiệp

Iranshahi M., Shahverdi A.R., Mirjani R., Amin G., Shafiee A. (2004).

Umbelliprenin from Ferula persica roots inhibits the red pigment

production in Serratia marcescens, Z Naturforsch, 59: 506-508.

Johnson E.A., Lewis M.J. and Grau C.R. (1980). Pigmentation of Egg Yolks

with Astaxanthin from the Yeast Phaffia rhodozyma. Poultry Science,

59,1777-1782.

Malpartida F., Niemi J., Navarrete R. and Hopwood D.A. (1990). Cloning and

expression in a heterologous host of the complete set of genes for the

biosynthesis of the Streptomyces coelicolor antibiotic undecylprodigiosin,

Gene, 93: 91-99.

Mandarville R.A. (2001). Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the

prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218.

Ortega-Estrada, María De Jesús, et al. "Phoresis between Serratia marcescens and

Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of

Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae." Florida

Entomologist95.1 (2012): 120-127.

Pérez-Tomás R. and Viñas M. (2010) New insights on the antitumoral properties of

prodiginines, Curr. Med. Chem., 17: 2222-2231.

Pfander H., Riesenz R. and Nigglil U. (1994). HPLC and SFC of carotenoids

- scope and limitations, Pure Appl, Chem. 66: 947-954.

Phonnok, Sirinet, Wanlaya Uthaisang-Tanechpongtamb, and Benjamas Thanomsub

Wongsatayanon. "Anticancer and apoptosis-inducing activities of microbial

metabolites." Electronic Journal of Biotechnology 13.5 (2010): 1-2.

Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis

after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia

marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709.

Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia

marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok,

vol 12: 268-274.

Đồ án tốt nghiệp

Rosenzwcig W.D. and Stotzky G. (1980). Prodigiosin and the inhibition of

Aspergillus niger by Serratia marcescens in soil, Soil Bioi. Biochent, 12: 295-

296.

Shahitha S. and Poornima K. (2012). Enhanced Production of Prodigiosin

Production in Serratia Marcescens, Journal of Applied Pharmaceutical

Science, 02 (08): 138-140.

Slater H., Crow M., Everson L. and Salmond G.P.C. (2003). Phosphate availability

regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in

Serratia via both quorum sensing-dependent andindependent pathways, Mol.

Microbiol, 47: 303-320.

Tariq A.L. and John J.P. (2010). Molecular Characterization of Psychrotrophic

Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir,

Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(3): 364-369.

Thomson R.H. (1962a). Melanins, Comparative Biochemist'y, Florkin M. and

Mason H.S., Vol. III: Constituents of Life. Part A, Academic Press, New

York, 727-753.

Turner J.M. and Messenger A.J. (1986) Occurrence, biochemistry, and physiology

of phenazinc pigment production, Adv. Microbial Physiol, 27, 211-275.

Venil, Chidambaram Kulandaisamy, and Perumalsamy Lakshmanaperumalsamy.

"An insightful overview on microbial pigment, prodigiosin." Electronic

Journal of Biology 5.3 (2009): 49-61.

Wei Y.H., Chen W.C. (2005). Enhanced production of prodigiosin-like pigment

from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil

supplementation strategies, J Biosci Bioeng, 99: 616-622.

Williams R.P., Gott C.L. and Qadri S.M.H. (1971). Induction of pigmentation in

non proliferating cells of Serratia marcescens by addition of single

amino acids, J. Bacteriol, 106,444-448.

Williams R.P. (1973). Biosynthesis of prodigiosin, a secondary metabolite of

Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 25: 396-402.

Đồ án tốt nghiệp

Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L.,

Leeper F.J., Salmond P.C. (2005). Biosynthesis of the red antibiotic,

prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amyl-

pyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing

enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in

Streptomyces, Mol Microbiol, 56: 971-989.

Williamson N.R., Fineram P.C., Leeper F.J., Salmond G.P.C. (2006). The

biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines. Nat. Rev. Microbiol, 4:

887-899.

Zhang J., Shen Y., Liu J. and Wei D. (2005). Antimetastatic effect of prodigiosin

through inhibition of tumor invasion, Biochem. Pharmacol., 69: 407-414.

TÀI LIỆU WEB

http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/prodigiosin-serratia-

marcescens,EMD_BIO-529685

http://www.scbt.com/datasheet-202298-prodigiosin.html

http://www.biovision.com/prodigiosin-6686.html

http://www.bioaustralis.com/productorder.php?prodid=BIA-

P1194&name=Prodigiosin&searchtermf=Antitumor

http://www.biomerieux-

usa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?doc=USA_PRD_LST_G_PRD_USA_5&

pubparams.sform=0

http://localhost/jsp/ident/index.jsp