BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHITOSAN SẢN XUẤT TỪ CHITIN THU HỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LACTIC
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện
: Nguyễn Thị Thanh Nhật
MSSV: 1151110236 Lớp: 11DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung bài đồ án tốt nghiệp là do tự bản thân thực hiện. Các
thông tin thứ cấp sử dụng trong luận án là có nguồn gốc và trích dẫn rõ ràng, không
sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, các số liệu trích dẫn trong bài là trung thực. Tôi
hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Nhật
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. Để
hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý
Thầy Cô giảng dạy tại khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường – Thực Phẩm đã
tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và những kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới Cô Nguyễn Hoài
Hương, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và truyền đạt cho tôi những kiến
thức chuyên nghành trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Tuyến công tác tại Viện Sinh học Nhiệt
Đới, và Cô Ngọc Yên trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã cung cấp cho tôi mẫu
chitosan thương mại, bạn Vân Hương, Tuyết Mai lớp 11DSH05 đã cung cấp chủng
nấm Aspergillus flavus CĐP1 để tôi có thể thực hiện đồ án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, thầy Dũng đã hỗ trợ về thiết bị hóa chất, vật
tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Xin cảm ơn sự giúp đỡ rất nhiệt
tình của các cộng sự, cảm ơn đến những người bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong
thời gian thực hiện đồ án này.
Sau cùng, tôi xin kính chúc quý Thầy Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi
Trường – Thực Phẩm thật nhiều sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của
mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Chúc các bạn dồi dào sức khỏe và
thành công trong sự nghiệp tương lai.
Mặc dù đã cố gắng hết sức để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song bài
đồ án vẫn còn nhiều thiếu sót do còn hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm. Vì vậy
tôi mong nhận được sự đóng góp, phê bình của Quý Thầy, Cô giáo.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 6
1.1. Tổng quan về tôm sú ........................................................................................ 6
1.1.1. Cấu tạo của vỏ tôm ..................................................................................... 6
1.2. Tổng quan về chitin – chitosan ....................................................................... 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan ........................................................... 7
1.2.2. Cấu trúc của chitin – chitosan ................................................................... 9
1.2.3. Tính chất của chittin – chitosan .............................................................. 10
1.2.4. Ứng dụng của chitosan ............................................................................ 15
1.2.5. Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống ................................ 18
1.2.6. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay ...................................... 19
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic ....................................................................... 23
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................. 23
1.3.2. Đặc tính chung ......................................................................................... 24
1.3.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ..................................................................... 25
1.3.4. Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin.............................................................................................................. 29
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 31
2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 31
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 31
2.1.2. Thời gian thực hiện .................................................................................. 31
2.1.3. Vật liệu ...................................................................................................... 31
2.2. Phương pháp luận .......................................................................................... 32
2.3. Phương pháp thí nghiệm ............................................................................... 33
i
2.3.1. Thu thập mẫu và nguyên liệu .................................................................. 33
Đồ án tốt nghiệp
2.3.2. Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm .............................................................................................................................. 34
2.3.3. Quy trình lên men kéo dài ........................................................................ 35
2.3.4. Phương pháp tiến hành ........................................................................... 37
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA .................................................... 45
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng. ....................................... 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 48
3.1. Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm .............................. 48
3.2. Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ đường 20% ............................................................................................................. 49
3.3. Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ ml, 10 ngày. ............................ 50
3.4. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm .................................................. 51
3.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1 ........................................................................................ 53
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương ............................................................................................................... 58
Kết luận .................................................................................................................. 69
Kiến nghị ................................................................................................................ 69
ii
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 70
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ATP: Adenosine triphosphate
Ctv : cộng tác viên
LAB : Lactic Acid Bacteria
NSC : ngày sau cấy
PDA : Potato dextrose agar
UV: Ultraviolet
iii
DD: dung dịch
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Stt Bảng Nội dung Trang
1 42 2.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
2 48 3.1 Thành phần hóa học nguyên liệu vỏ tôm
Các thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi 3 49 3.2 chitin của chủng L5 vởi tỉ lệ rỉ đường 20%
Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic chủng
4 3.3 L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16x 106 cfu/ml, 10 50
ngày
Hiệu quả khử protein (%) của quá trình lên men lactic
5 3.4 chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16 x 106 50
cfu/ml, 10 ngày
So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men lactic và 6 51 3.5 chitosan thương phẩm
7 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm (%) 53
Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ,
8 3.7 khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu 58
chitosan lên men lactic
Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ,
9 3.8 khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương 61
phẩm 1
Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ,
10 3.9 khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương 63
phẩm 2
iv
11 3.10 So sánh nồng độ chitosan 2,0g/l giữa mẫu chitosan lên men 65
Đồ án tốt nghiệp
và mẫu chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài
v
rễ, khối lượng hạt của hạt đậu tương.
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Stt Hình Nội dung Trang
1 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 9
2 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 10
Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ 3 1.3 20 vỏ đầu tôm
Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu
4 1.4 tôm bằng phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại 21
học Nottingham Trent ( 1998).
Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện 5 1.5 22 nghiên cứu công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010
6 1.6 Con đường lên men glucose 27
7 2.1 Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm 33
Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm xác định thành phần trong nguyên 8 2.2 34 liệu
Quy trình lên men bằng phương pháp lên men lactic sử 9 2.3 36 dụng rỉ đường
Sơ đồ thí nghiệm kích hoạt nảy mầm của hạt đậu nành, hạt 10 2.4 47 đậu phộng của dung dịch chitosan ở các nồng độ.
Kết quả thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương 11 3.1 52 pháp lên men lactic sử dụng rỉ đường
Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA
12 3.2 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 54
vi
của mẫu chitosan lên men lactic.
Đồ án tốt nghiệp
Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA
13 3.3 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 55
của mẫu chitosan thương phẩm 1.
Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA
14 3.4 có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 56
của mẫu chitosan thương phẩm 2.
Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy
15 3.5 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 59
đối với mẫu chitosan lên men lactic.
Ảnh hưởng của chitosan đến kích thích nảy mầm của hạt 16 3.6 59 giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic
Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy
17 3.7 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 61
đối với mẫu chitosan thương phẩm 1
Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễcủa hạt giống đậu 18 3.8 62 tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1
Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy
19 3.9 mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương 63
đối với mẫu chitosan thương phẩm 2
Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu 20 3.10 64 tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2
Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng
67 kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan lên 21 3.11 men lactic
Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng
22 3.12 68
vii
kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương
Đồ án tốt nghiệp
phẩm 1
Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng
23 3.13 69 kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương
viii
phẩm 2
Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nước ta có nguồn thủy sản dồi dào, lượng vỏ giáp xác phế liệu hàng năm
rất lớn (năm 2005 là 70.000 tấn) trong đó có vỏ tôm.
Tôm là mặt hàng chủ lực của thủy sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh.
Theo báo cáo của bộ thủy sản, sản lượng tôm năm 2012 cả nước có 1,529 cơ sở sản
xuất tôm sú giống, sản xuất được hơn 37 tỷ con giống và có 185 cơ sở sản xuất tôm
chân trắng giống, sản xuất được gần 30 tỷ giống. Hiện nay có 30 tỉnh/thành nuôi
tôm nước lợ, đã thả nuôi 657,523 ha; đạt sản lượng 476,424 tấn. Trong đó diện tích
nuôi tôm sú chiếm 94,1% và 67,2% sản lượng. Tương ứng với sản lượng tôm hằng
năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm thải ra môi trường.
Hiện nay ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên
quy mô lớn, chủ yếu là làm thức ăn gia súc hay thải ra môi trường gây ô nhiễm tình
trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách là nghiên cứu sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng
phế liệu để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu tái
sử dụng vỏ tôm như làm thức ăn gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp
chất quý trong vỏ tôm như chitin carotenoid.
Hiện nay chitin - chitosan và các sản phẩm nhận được từ chitin – chitosan
được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực của đời sống như y học, nông nghiệp,
bảo vệ môi trường... đặc biệt là trong y học chitin - chitosan được coi là polymer
dược phẩm.
Chitosan có nhiều ứng dụng trong các nghành công, nông nghiệp, y dược và
bảo vệ môi trường. Trong y dược, từ chitosan vỏ tôm cua có thể sản xuất
glucosamine, một dược chất quý đang phải nhập khẩu ở nước ta. Ngoài ra còn sản
xuất các loại dược liệu khác như: da nhân tạo, chỉ phẫu thuật tự hoại… cũng được
nghiên cứu sản xuất từ chitin – chitosan. Chitosan còn được dùng sản xuất kem
chống khô da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da. Trong công
1
Đồ án tốt nghiệp
nghiệp, từ chitosan có thể chế tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị công nghiệp như: vải
col dùng cho may mặc, vải chịu nhiệt, chống thấm…. Chitosan làm tăng độ bền của
giấy, tăng cường độ bám dính của mực in. Chitosan được sử dụng trong sản xuất
sơn chống mốc và chống thấm. Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo
quản quả, hạt mang lại hiệu quả cao. Trong công nghệ môi trường hiện nay chitosan
được sử dụng để xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu quả như xử lý nước thải trong
công nghiệp nhuộm vải, xử lý nước trong công nghiệp nuôi tôm, cá. Đặc biệt từ
chitosan có thể sản xuất ra màng mỏng để bao gói thực phẩm, màng này có thể thay
cho PE, màng chitosan có thể tự phân hủy trong môi trường tự nhiên nên vấn đề này
rất có ý nghĩa quan trọng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường. Trong công
nghệ sinh học, chitosan dùng làm chất mang cố định enzyme và cố định tế bào…
Từ khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin - chitosan như đã nói trên mà nhiều nước
nghiên cứu sản xuất ra sản phẩm này, trong khi đó sản phẩm này đang phải nhập
khẩu ở nước ta.
Các quy trình sản xuất chitin – chitosan trước đây là quy trình xử lý vỏ tôm
bằng phương pháp hóa học dùng nhiều hóa chất gây ô nhiễm môi trường. Nhưng
hiện nay bên cạnh quy trình hóa học xuất hiện quy trình sản xuất chitin – chitosan
bằng sinh học dựa trên vi khuẩn lactic, cho hiệu quả cao, thân thiện với môi trường.
Quy trình ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất chitin – chitosan đã được bắt
đầu chú ý ở Việt Nam.
Năm 2008 – 2014 đề tài nghiên cứu “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin –
chitosan từ vỏ tôm bằng lên men lactic” đã được nghiên cứu và hoàn thành tại Khoa
Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ
Tp.HCM. Căn cứ vào kết quả đạt được của đề tài và nhu cầu thực tiễn về khả năng
ứng dụng và những hiệu quả khác mang lại của chitosan, người thực hiện đề tài
quyết định thực hiện đề tài “Ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng
phương pháp lên men lactic” trong khóa luận tốt nghiệp này.
2
Đồ án tốt nghiệp
2. Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở
Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp...đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men
lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn so với
phương pháp xử lý hóa học (Rao và Stevens2005; Prameela và cộng sự 2010)
Tại Trường Đại học Công Nghệ tp.HCM đã có các nghiên cứu về lên men
lactic vỏ tôm từ năm 2012
Nguyễn Thị Ngọc Thu 08DSH: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với
quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus xác định tỉ lệ nước là 2,5:1 với vỏ
tôm nguyên liệu và thời gian lên men 96 giờ
Lê Thị Hồng Thủy 09 DSH: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem
chua cho quá trình lên lactic thu hồi chitin từ vỏ đầu tôm” cho thấy vi khuẩn LAB
phân lập được mang kí hiệu L5 cho kết quả lên men vỏ đầu tôm tốt nhất; khảo sát
ảnh hưởng của tỉ lệ đường lên quá trình lên men lactic kết quả cho thấy lượng
đường cho kết quả tốt nhất là 20% và không thể giảm hơn nữa; ảnh hưởng của mật
độ giống lên quá trình lên men lactic cho thấy mật độ giống cho kết quả lên men tốt
nhất là 3,16x106 cfu/g.
Dương Quốc Xuân 10DSH: “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin – chitosan
từ vỏ tôm bằng lên men lactic đạt hiệu quả cao”. Đề tài đã xác định được thời gian
lên men lactic vỏ đầu tôm thu hồi chitin – chitosan cho kết quả tốt nhất là 7- 10
ngày, có thể thay thế nguồn đường glucose bằng rỉ đường sau xử lý cho hiệu quả
khử khoáng và hiệu quả khử protein là triệt để.
3. Mục đích nghiên cứu
Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi chitin – chitosan bằng phương
pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường.
3
Đồ án tốt nghiệp
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Thực hiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp
lên men lactic với nguồn đường rỉ đường.
Ứng dụng của chitosan : khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến khả năng ức
chế nấm Aspergillus flavus CĐP1, khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của
chitosan lên hạt giống đậu tương và hạt giống đậu phộng.
5. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp luận
Để đạt được mục đích về tính ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu
hồi bằng phương pháp lên men lactic, khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả
năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1, sau đó khảo sát ảnh hưởng của chitosan
đến khả năng kích thích nảy mầm hạt giống.
b. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị
Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
So sánh một số đặc tính tính chất vật lý giữa chitosan lên men lactic và
chitosan thương phẩm
Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus
CĐP1.
So sánh hiệu quả kháng nấm của 2 nguồn chitosan: lên men lactic và
thương phẩm
Khảo sát nồng độ chitosan thích hợp để kích thích nảy mầm hạt giống đậu
tương và đậu phộng một cách tốt nhất.
So sánh hiệu quả của 2 nguồn chitosan kích thích nảy mầm hạt giống: từ lên
men lactic và thương phẩm.
4
Đồ án tốt nghiệp
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị , nội dung đồ án tốt nghiệp gồm
3 chương như sau :
Chương 1: Tổng quan
Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
5
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tôm sú
1.1.1. Cấu tạo của vỏ tôm
Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính:
- Lớp biểu bì ( epicucle)
- Lớp màu
- Lớp canxi hóa
- Lớp không bị canxi hóa
Lớp màu : tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của
vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khứ hoặc những
không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,
là con đường cho canxi thẩm thấu vào.
Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng
bị biến đổi bởi fucxxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các vỏ
còn lại, bắt màu với anilin xanh. Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động
của acid hơn là các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa
polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin. Lớp epicuticle liên kết với
một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường acid đậm
đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng.
Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều
khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi.
Lớp không bị canxi hóa: trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương
đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có
canxi và quinine.
6
Đồ án tốt nghiệp
1.1.2. Thành phần hóa học của vỏ tôm
Protein : thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở 2 dạng :
dạng tự do và dạng liên kết.
Dạng tự do : dạng này là tồn tại ở phần thịt từ một số tôm bị biến đổi và vứt
đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm.
Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu
nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn.
Dạng phức tạp : ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với
chittin, canxicacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo
proteincarotenoit,… như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
• Chitin : tồn tại dưới dạng liên kết bởi những những liên kết đồng hóa
trị với các prrotein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất
khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.
mặc dù không nhiều nhưng trong quá
• Canxi : trong vỏ, đầu tôm, … có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ
yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3( PO4)2
trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó
khăn cho quá trình khử khoáng. Sắc tố trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố
nhưng chủ yếu là astaxanthin.
• Enzyme : Hoạt độ enzyme protesae của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị
hoạt độ/ gam tươi. Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và
của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu.
Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần
khác như : nước, lipid, photpho.
1.2. Tổng quan về chitin – chitosan
1.2.1. Lịch sử phát hiện chitin – chitosan
Chitin đã được phát hiện bởi Heri braconnot vào năm 1881. Lần đầu tiên
ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại
7
Đồ án tốt nghiệp
nấm. Hợp chất do Braconnot phân lập được còn rất nhiều tạp chất nhưng không
khẳng định đây không phải là gỗ.
Đến năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánh
cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua. Từ đó, Odier cho rằng
đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác côn trùng.
Vào năm 1843 sự tồn tại của nitơ trong phân tử chitin đã được Lassaigne
chứng minh.
Năm1876, Ledderhose thủy phân vỏ tôm hùm bằng dung dịch HCl và nhận
được một muối Clorua của amin 6C. Ông đề nghị cấu trúc
hay NaOH
CHO.(CHOH)4.CH2NH2.HCl.
Năm 1894, Winterstein phát hiện ra khi xử lý nấm với H2SO4
rồi thủy phân trong HCl thì đều thu được cùng loại monosaccharide và acid acetic.
Tuy nhiên, ông ta vẫn gọi hợp chất này là “ cellulose”. Cũng trong năm này, khi đun
chitin trong dung dịch KOH ở 1080C, Hope – Seyler thu được một hợp chất mới có
số nguyên tử giống như trong chitin và gọi nó là chitosan.
Năm 1912, Brach và Furth nhận thấy tỉ lệ acid acetic và glucosamine là 1:1,
ông gọi nó là “ polymer mono acetyl glucosamine”.
Năm 1928, Meyer và Mark dựa trên phổ nhiễu xạ tia X kết luận rằng chitin
và chitosan nằm ở dạng liên kết 𝛽 ( 1 → 4) giữa các mắt xích pyranoz.
Vào năm 1948, Matsusshima cũng đã có một phát minh sản xuất
glucosamine từ vỏ cua.
Năm 1950, người ta đã sử dụng tia X để phân tích nhằm nghiên cứu sâu
hơn sự hiện diện của chitin trong nấm và trong thành tế bào.
Và đến năm 1951, quyển sách đầu tiên viết về chitin được xuất bản. Bấy
giờ, người ta đã phát hiện tiềm năng của các polymer thiên nhiên này.
8
Đồ án tốt nghiệp
Vào năm 1978, một hội nghị đầu tiên nói về chitin và chitosan diễn ra tại
Mỹ và thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của
chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành
công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là : Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn
Độ, Pháp. Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm, và
đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know ( năm
1991) thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh,
Đức. Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin,
chitosan.
1.2.2. Cấu trúc của chitin – chitosan
Chitin là sự kết hợp giữa liên kết 𝛽 (1 → 4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy
- 𝛽 − 𝐷 – glucose ( N- acetylglucosamine )
Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9% là N (Black và
Schwartz, 1950). Nó có cấu trúc giống cellulose vì có gốc acetamide ( -NH-CO-
CH3) ở vị trí C2.
Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, sự khác biệt duy nhất giữa
chitosan và chitin là ở vị trí C2, ở đó nhóm ( -NH2) thay thế nhóm ( -COCH3)
Chitosan là một polymer tuyến tính 𝛼 ( 1 → 4) − 2 − 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜 − 2 −
𝑑𝑒𝑜𝑥𝑦 − 𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑝𝑦𝑟𝑎𝑛𝑜𝑠𝑒.
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin.
9
Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan
1.2.3. Tính chất của chittin – chitosan
1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitin
Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên và đứng hàng
thứ hai chỉ sau cellulose. Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo và vách tế bào
nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp xác…
Trong các nguyên liệu này, chitin liên kết chặt chẽ với protein, lipid và các muối vô
cơ ( CaCO3 ) và các sắc tố màu ( astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin…)
Chitin là 1 polysaccharide chứa nito, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan
trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete,
rượu…. Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat
liti ( LiSCN) và muối thyoxyanat canxi ( Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo.
Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm
tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau.
Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay
Khi đun nóng trong Ca(ClO)2… có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin.
môi trường kiềm đậm đặc chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan. Chitin không
hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năng ứng dụng bị hạn
chế. Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa chitosan để tạo ra sản phẩm
chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
10
Đồ án tốt nghiệp
1.2.3.2. Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitosan
a. Tính chất vật lý của chitosan
Chitosan là dẫn xuất của chitin, nó được tạo thành bởi phản ứng deacetyl
chitin. Khi chitin được xử lý với các chất kiềm đặc ở nhiệt độ cao 1200C trong dung
dịch, nó sẽ bị loại nhóm acetyl và bị phân hủy khác nhau để cho ra sản phẩm là
chitosan. Vậy chitosan không phải là một chất đơn thuần mà nó là một nhóm sản
phẩm của chitin bị loại nhóm acetyl từng phần ( Attila E, Pavlath và Dominic
W.S.Wong, 1996)
Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn xốp, nhẹ, hình vảy,
màu trắng ngà, không mùi, không vị hay được dùng nhiều nhất trong y tế và trong
thực phẩm. Chitosan được khám phá bởi Roughet vào năm 1859, và nó được đặt tên
là chitosan bởi nhà khoa học người đức Hoppe Seyler vào năm 1894. Chitosan là
polymer hữu cơ tự nhiên duy nhất mang điện tích dương, điều này tạo cho chitosan
những thuộc tính đặc biệt nhất.
Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính
tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ
chitin, đặc biệt là chitosan đã được chú ý như một loại vật liệu mới có tính ứng
dụng trong các ngành công nghiệp như dược, y học, thực phẩm, xử lý nước thải.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm, hoặc các
dung môi hữu cơ khác nhưng hòa tan được trong dung dịch acid loãng như: acid
acetic, acid formic, acid lactic, HCl, HI, HNO3… tạo thành dung dịch keo nhớt
trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch acid acetic 1 - 1,5%. Chitosan kết hợp
với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào,
enzyme.
Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ.
Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic cũng cho
thấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o-amino
benzoate và cũng có một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan
11
Đồ án tốt nghiệp
phenylacetate… Còn muối của chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong
nước.
Bản chất điện ly cao phân tử của chitosan trong dung dịch acid : Trong
dung dịch acid, những nhóm amin của chitosan bị proton hóa và thể hiện bản chất
của chất điện ly cao phân tử. Trong dung dịch loãng không có mặt chất điện ly, chỉ
số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch chitosan. Đây là đặc trưng của
những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăng kích thước sợi
khi pha loãng dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đoạn mạch. Lực đẩy này có
thể bị khử mất nằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân tử thấp có tác
dụng che những phần mang điện trên mặt polymer. Và đồng thời, chỉ số độ nhớt
cũng giảm theo nồng độ chitosan cho trước. Chitosan có khả năng tích điện dương
do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và
acid mật.
Chitosan là chất có độ nhớt cao. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của
lực ion, pH và nhiệt độ…
Mức độ deacetylation ( DDA): là độ chuyển hóa chitin thành chitosan. Quá
trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với
nhóm amin hoạt động hóa học cao. Mức độ deacetylation là một đặc tính quan
trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và
khả năng ứng dụng của chitosan sau này. Thông thường mức độ deacetylation
chitosan đạt khoảng 85 – 95 %. Chitosan có mức độ deacetylation khoảng 75 % trở
lên thường được gọi là chitosan. Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DDA
( degree of deacetylation ) hơn 70 %. Có rất nhiều phương pháp để xác định mức
độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm : thử ninhydrrin, chuẩn độ điện thế, quang
phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI…
Khối lượng phân tử trung bình ( MW) : được xác định qua độ nhớt của
dung dịch chitosan và có giá trị biến đổi từ 100000 – 500000 g/mol ( Li, 1997;
12
Đồ án tốt nghiệp
Onsoyen và Skaugrud, 1990) tùy theo từng loại chitosan. Thông thường, nhiệt độ
cao sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Giới hạn nhiệt
độ là 2800C, sự phân hủy do nhiệt độ có thể xảy ra và mạch polymer nhanh chóng
bị phá vỡ, do đó khối lượng phân tử giảm. Nguyên nhân quá trình depolymer là sử
dụng nhiệt độ cao và acid như HCl, H2SO4 dẫn đến thay đổi khối lượng phân tử.
Độ nhớt là nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan.
Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao. Một số nhân
tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ
dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sản xuất chitosan và
tính chất của nó. Ví dụ, độ nhớt của chitosan tăng khi thời gian khử khoáng tăng.
Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này
giảm, tuy nhiên nó lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm, việc tăng này đưa đến
định nghĩa về độ nhớt bên trong của chitosan, đây là một hàm phụ thuộc của mức
độ ion hóa của lực ion.
trong
b. Tính chất hóa học của chitosan:
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3
các mắt xích N-acetyl- D-glucosamine và nhóm-OH, nhóm – NH2 trong các mắt
xích D-glucosamine có nghĩa là chúng vừa là ancol vừa là amin. Phản ứng hóa học
có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế -N, hoặc các
dẫn xuất thế O-, N-.
Mặt khác chitosan là những polyme mà các monome được nối với nhau bởi
các liên kết 𝛽 − 1 − 4 − 𝑔𝑙𝑦𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑒, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất
hóa học như acid, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân.
Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:
- Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân
phụ thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời
gian phản ứng. Những kết quả cho thấy:
13
Đồ án tốt nghiệp
- Trong môi trường H2SO4 sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình N-
Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử.
- Trong môi trường HF, chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn
chitin, tạo thành hỗn hợp các oligome sau 19h ở 200 C.
- Trong môi trường acid khác như HCl, H3PO4... sự thủy phân cũng xảy
ra ở những mức khác nhau.
Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên xem làmột polycationic
(pH<5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein,
aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm
amino (NH2) ( Knorr, 1984; Muzzanelli, 1996).
➢Các phản ứng của nhóm –OH
- Dẫn xuất sunfat
- Dẫn xuất O - axyl của chitin/chitosan
- Dẫn xuất O - tosyl hóa chitin/chitosan
➢Phản ứng ở vị trí N
- Phản ứng N - acetyl hóa chitosan
- Dẫn xuất N - sunfat chitosan
- Dẫn xuất N - glycochitosan
- Dẫn xuất acroleylen chitosan
- Dẫn xuất aroleylchitosan
➢Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N
- Dẫn xuất O, N - cacboxymetyl chitosan
- Dẫn xuất N,O-caboxychitosan
- Phản ứng cắt đứt liên kết 𝛽 − (1 − 4) − 𝑔𝑙𝑦𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑒
- Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan
Chitosan phản ứng với iot trong môi trường H2SO4 cho phản ứng
lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan
14
Đồ án tốt nghiệp
1.2.4. Ứng dụng của chitosan
1.2.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp
Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong
một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và
bảo vệ thực vật.
➢ Mỹ phẩm:
Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các
ứng dụng mỹ phẩm như aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo
hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo
nhớt khi được trung hòa acid. Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt hơn.
Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm tốt. Chitosan cũng có thể hấp thụ các
chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng liên kết
chung với gốc amino của chitosan.
Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh
vực mỹ phẩm bao gồm:
- Tóc : dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc,
- Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt,
mascara
- Chăm sóc răng : kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su ...
➢ Xử lý nước
Do tính chất polycatinic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác
nhân kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn.Weltroswki và cộng sự sử dụng chitosan N_
benzyl dẫn xuất của sulphonat như các chất hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong
môi trường acid. Năm 1999, Bhavani và dutta sử dụng chúng như chất hấp thụ loại
bỏ màu từ nước thải xưởng nhuộm.
Ngoài ra, chitosan còn dùng để laoị khỏi chất thải các chất như: kim loại
nặng, asen, plutonium, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyde, kể cả dầu mỏ và
dầu khí.
15
Đồ án tốt nghiệp
➢ Công nghiệp giấy
Do có cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung
vào làm nguyên liệu sản xuất giấy.Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời
việc in trên giấy cũng tốt hơn.
Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin- chitosan được sử dụng
trong nghành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm.
➢ Chế biến thực phẩm
Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không
độc đối với động vật máu nóng. Các hạt tinh tinh thể chitin siêu nhỏ có tính chất
nhũ hóa, làm dày và tạo gel cho thực phẩm. Nó còn được sử dụng như chất xơ trong
thực phẩm nướng. Việc sử dụng này giải quyết các vấn đề như màu sắc, mùi vị và
hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ. Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi
khuẩn, kháng nấm cản trở sự hoạt động của enzyme.
1.2.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp
➢ Xử lý hạt
Hạt giống xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề
mặt hạt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy
và nâng cao độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể
sâu hại rễ, vi khuẩn gây bệnh và nấm mốc.
➢ Chất mang trong sản xuất phân bón :
Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón và chất
điều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan được sử dụng
như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ các hợp chất mong muốn
trong đất. Chitosan bị phân hủy sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự
phóng thích các chất. Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và
thời gian bón lặp khi sử dụng làm chất mang.
➢ Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau
quả tươi
16
Đồ án tốt nghiệp
Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây.
NOCC ( N,O- Carboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của
chitosan với acid monochloroacetic. Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung
dịch NOCC hòa tan lên trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch.
Kết quả tạo ra màng bán thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong
tốt như việc làm giảm sự mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của
trái.
➢ Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan
Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm mà cả
nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu
tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường,
nhiệt độ. Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với
các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên
quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ
lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dương. Khi bổ sung chitosan
+. Trong chitosan lên các vị trí mang điện âm ở trên
vào môi trường, tế bào vi khuẩn chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Nhờ
tác dụng của những nhóm NH3
màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào làm cho quá
trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Chitosan cũng có tác động sinh
học và thấm hút chất dinh dưỡng của vi khuẩn và có thể ức chế sự phát triển của
chúng.
Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi
các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động
của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt
thành tế bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên
quan đến ion quan trọng.
1.2.4.3. Ứng dụng y sinh
Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo
vì có độ thấm phù hợp và độ bền cao.
17
Đồ án tốt nghiệp
➢ Mô nhân tạo
Chitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một
số ứng dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép.
Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung
ương, ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp.
Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho
thấy tốc độ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường.
➢ Điều trị bỏng
Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác
sinh học. Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng
dịch nước của chitosan acetate. Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu
oxy tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy. Ngoài ra lớp
màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các
enzyme trong cơ thể nên không cần phẫu thuật loại bỏ.
➢ Da nhân tạo
Do nhiều tính chất : tạo màu, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước,
diệt khuẩn, làm mau lành vết thương,… hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để
sản xuất da nhân tạo phục vụ cho y học
➢ Màng bao thuốc
Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là
chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc.
1.2.5. Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống
Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự
tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc
trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt. Một trong những hoạt tính sinh học
quan trọng của chitosan trên thực vật đó là sự kích thích nảy mầm. Trong đậu phộng
hạt giống được bao lớp màng chitosan sẽ làm tăng cường khả năng nảy mầm của
hạt giống ( Zhou và cộng sự, 2002 trích dẫn bởi Batool Mahdavi và Asghar Rahimi,
18
Đồ án tốt nghiệp
2013). Chitosan có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và làm tăng năng suất đậu tương (
Dũng và Thắng, 2002).
Các nhà khoa học Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ ( Đại Học Khoa Học
Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội) và Nguyễn Văn Hoan ( Đại Học Nông Nghiệp 1) đã sử
dụng các có hoạt tính sinh học cao từ chitin để kích thích nảy mầm những hạt lúa
giống quốc gia DH 60 đã bảo quản được 19 – 21 tháng. Đồng thời khi sử dụng các
chất có hoạt tính sinh học này còn có khả năng kích thích cho sự sống của hạt giống
cao hơn, chất lượng cây mầm tốt hơn, góp phần nâng cao giá trị gieo trồng của hạt
giống.
Viện Khoa học nông nghiệp Miền Nam và Trung tâm công nghệ sinh học
Thủy sản cùng tham gia nghiên cứu tác dụng của chitosan lên một số loại hạt dễ mất
khả năng nảy mầm và góp phần thúc đẩy tăng trưởng, phát triển cây trồng ngoài
đồng. Kết quả là có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì khả năng nảy mầm
tốt của hạt giống cà chua và hạt đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 – 12 tháng trong
điều kiện bình thường
Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu dùng
chitosan trong việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất.
Trong những vùng mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống
được bọc nang bằng chitosan sẽ nâng cao được hiệu suất thu hoạch lên 20 % so với
không dùng chitosan.
1.2.6. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay
1.2.6.1. Tình hình sản xuất chitin-chitosan
Vỏ đầu tôm chứa 3 thành phần chủ yếu chitin, protein và khoáng chủ yếu là
CaCO3. Để thu nhận chitin, phải khử khoáng và khử protein và khử màu. Để được
chitosan cần loại bỏ gốc acetyl .Sơ đồ tổng quát công nghệ thu hồi chitin từ vỏ, đầu
tôm và sản xuất chitosan được trình bày trên hình 1.3.
19
Vỏ, đầu tôm
Khử protein
Khử khoáng
Chitin
Loại gốc acetyl
Chitosan
Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.3. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm
20
Đồ án tốt nghiệp
Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước Ấn Độ, Nhật Bản, Anh,
Pháp, Thái Lan...
Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng
phương pháp thuần túy hóa học của Robert, Đại học Nottingham Trent ( 1998).
Nhận xét: Đây là quy trình tổng hợp từ cả quy trình sản xuất trước đó. Sản
phẩm chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được
loại bỏ sạch trong quá trình tẩy màu. Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong
chitin thấp.Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hóa chất
nồng độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thánh sản xuất, đồng thời nếu quá
trình xử lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường.
21
Đồ án tốt nghiệp
1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học
Hiên nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người
quan tâm. Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm đang
được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Thay vì sử dụng các hóa chất với nồng độ
cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại
thành công trong vấn đề này.
Hình 1.5. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu
công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010
Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để
ủ tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không
cho các vi sinh vậy gây hôi thối phát triển. Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân
hủy một phần protein còn lại trong nguyên liệu. Ngoài ra, có thể sử dụng các
22
Đồ án tốt nghiệp
enzyme thủy phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao
hơn. Ngoài ra, Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) cũng nghiên cứu và tìm
được quy trình thu nhận chitin từ đầu – vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp enzyme
sử dụng dịch ép vỏ dứa phế thải chứ proteinase bromelain và giàu các acid hữu cơ,
có tác dụng loại các chất khoáng và protein trong đầu – vỏ tôm. Phương pháp này
có ưu điểm không cần aicd để loại khoáng tiêu tốn ít xút cho loại protein, hiệu quả
thu hồi chitin cao ít gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này mất nhiều
thời gian thực hiện quy trình thu nhận enzyme từ vỏ dứa.
So sánh hiệu quả xử lý hóa học và sinh học : chất lượng chitin sản xuất
bằng phương pháp hóa học có hàm lượng khoáng và protein thấp hơn nhiều so với
xử lý bằng phương pháp sinh học.
Theo Bhaskar (2010) thì phương pháp sinh học cho hiệu quả khử protein là
92 % khử khoáng 78 %. Theo Rao (2000), thì hiệu quả khử khoáng có thể đạt 86 %
và hiệu quả khử protein cao nhất có thể đạt 86 %.
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.3.1. Khái niệm
Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có một sự
thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn
như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp,
không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản
phẩm chứa lactic, acid lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi
chất và kết thúc của quá trình lên man carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong
thực phẩm lên men, aicd hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một
số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer,
1987).
Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng
giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lacic được Pasteur
tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học
23
Đồ án tốt nghiệp
(generally recognized as safe – GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực
phẩm và có đóng góp trong hệ si sinh vậy có ích của con người.
1.3.2. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase
âm tính và là những vi khuẩn kỵ khí chịu oxy, trao đổi chất chủ yếu bằng con
đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn latic có thể len men được các đường
monosaccharid, đường disaccharide, protein tan, pepton và acid. Phần lớn chúng
không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác.
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm. Các tế bào hình
cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực
khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic
trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các
trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 - 3%) liên cầu
khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 - 4 (cầu khuẩn
không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực
khuẩn ở vùng pH 5,5 - 6.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa
nhiệt là 40 - 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50 C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì
hầu hết chúng bị chết sau 10 - 30 phút.
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong
không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên
các loại rau, quả, sữa, thịt, ...).
24
Đồ án tốt nghiệp
1.3.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
1.3.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau.
Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như
cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết
khác như vitamin, muối vô cơ...
a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các
monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza,
maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng
cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa
nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các
nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm
men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, ... Hiện nay cao nấm men là
nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công
nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
c. Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của
tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn
lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường
các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai
tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men...
25
Đồ án tốt nghiệp
d. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác
Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất
hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của
vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối
citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo
quả các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động
quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid axetic
dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn
lactic.
e. Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,
photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình
tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
f. Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa
sống được trong môi trường không có oxy.
Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với
điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn
toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36
hoặc 38 ATP.
Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó
lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.
26
Đồ án tốt nghiệp
1.3.3.2. Quá trình trao đổi chất
Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng
lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh
học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường).
LAB có khả năng lên men các loại đường hexcose (glucose, mannose, galactose,
fructose...), disaccharide (lactose, saccharose...), pentose (arabinose, xylose,
ribose...) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng
đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm
thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng
khác nhau (Owen R. Fennema và cộng sự, 2004).
Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic
làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.6).
Hình 1.6. Con đường lên men glucose
27
Đồ án tốt nghiệp
(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)
(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)
Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate
aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5.
Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-
phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde
dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase.
a. Lên men lactic đồng hình.
Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận
chuyển đường tự do (transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi
glucokinase (cần 1 ATP). Một số loài sử dụng phosphoenolpyruvate : sugar
phosphotransferase system (PTS), mỗi phosphoenolpyruvate là một phần tử cho
phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một liên kết phosphate có năng lượng cao
để hoạt hóa phân tử đường.
Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-
Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm
III Lactobacilli, Oenococci và Weissella) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và
nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và
glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2
vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy,
pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+ do đó
NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm
cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men
lactic đồng hình.
b. Lên men lactic dị hình.
Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường
pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose
28
Đồ án tốt nghiệp
monophosphate, con đường 6-phosphogluconate và được gọi chung là 6-
phosphogluconate / phosphoketolase (6-PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự
khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon
tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate
(GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường
glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các
chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và
acetaldehyde. Khi quá trình này tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm khác như
CO2, ethanol... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình.
Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường
glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy
nhiên cần chú ý nhận xét trên không phải đúng cho tất cả các trường hợp (Owen R.
Fennema et al. 2004).
1.3.4. Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi
chitin
Lên men acid lactic là một trong những phương pháp lên men được sử dụng
trong quy trình sinh học để khử khoáng của chitin. Nó thu hồi chitin bằng cách thủy
phân protein liên kết với chitin trong vỏ đầu tôm (Zakaria et al. 1998, George et al.
1999)
Nghiên cứu của Kandra Prameela và cộng sự 2010 cũng nghiên cứu thành
công sử dụng các chủng lactobacillus lên men lactic thu hồi chitin từ phế thải tôm.
Các tác giả dựa trên khả năng tổng hợp acid lactic của vi khuẩn lactic thông
thường nồng độ acid lactic đạt pH 2 – 3 để khử khoáng.
Các tác giả khác trên thế giới sử dụng Lactobacillus plantarum(Rao et al.
2000;Prameela et al.2010), Pediococcus acidolactici (Bhaskar et Prameela et
al.2010). Các vi khuẩn probiotic LAB và vi khuẩn lên men thịt sữa như
Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, Lactobacillusbulgaricus, Pediococcus
acidilactici,và Streptococcusthermophilus cũng được sử dụng.
29
Đồ án tốt nghiệp
Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease đáng kể, nhất là vi khuẩn lactic lên
men thịt. Lê Thị Hồng Thủy phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua dựa
trên khả năng lên men lactic đồng hình và hoạt tính protease của vi khuẩn để áp
dụng vào xử lý vỏ, đầu tôm thu chitin.
Tùy vào hoạt tính protease của vi khuẩn lactic mà có cần bổ sung enzyme
hay vi sinh vật phân hủy protein hay không, vì ngoài hoạt tính protease, nhiều vi
khuẩn và nấm mốc như Bacillus spp., Aspergillus oryzae còn có hoạt tính chitinase
sẽ cắt ngắn mạch chitin, là điều không phải luôn luôn mong muốn cho sản phẩm
cuối cùng chitosan, nhất là khi muốn có chitosan có khả năng tạo màng. Thậm chí
Waldeck, 2006 phải sử dụng công nghệ di truyền để tạo Bacillus lichenformis
không sinh chitinase mà chỉ có protease để khử protein trong vỏ tôm thu chitin,
chitosan có độ nhớt cao.Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72(12):7879 Jens
Waldeck, Gabriele Daum, Bernward Bisping andViscous ChitinShrimp Shell Waste
To Obtain Highly Strains Capable of Deproteinization of Bacillus licheniformis.
Như vậy sử dụng vi khuẩn lactic vừa lên men lactic mạnh vừa có hoạt tính
protease cao để lên men lactic thu nhận chitin từ vỏ đầu tôm là phương pháp đỡ tốn
kém và an toàn môi trường nhất. Tuy nhiên các thông số kỹ thuật của quá trình lên
men cần được hoàn thiện.
30
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học
– Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại học Công nghệ Tp. HCM.
2.1.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ 25/ 5/ 2015 đến tháng 16/8/ 2015.
2.1.3. Vật liệu
2.1.3.1. Mẫu thí nghiệm
Vi khuẩn lên men lactic L5 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM
cung cấp.
Chủng nấm Aspergillus flavus CĐP1 do bạn Vân Hương và Tuyết Mai lớp
11DSH05 cung cấp.
Nguyên liệu vỏ tôm của đề tài này thu được từ chợ Bà Chiểu.
Mẫu chitosan thương phẩm 1 : ngoại nhập từ Úc
Mẫu chitosan thương phẩm 2 từ công ty TNHH Hùng Tiến, QuậnBình
Thủy, Cần Thơ.
2.1.3.2. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh ( Brlad France )
- Tủ ủ ( Memmert Germany )
- Máy chạy Kjeldahl
- Tủ lạnh Toshiba
- Autoclave (Huxky Đài Loan)
- Máy đo quang (hach-Germany)
31
Đồ án tốt nghiệp
- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)
- Cân phân tích (Orbital Germany)
- Bếp từ (Billy-England)
- Máy nước cất.
2.1.3.3. Dụng cụ
- Ống nghiệm có nắp và không có nắp
- Đĩa petri
- Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml
- Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml
- Ống đong 100 ml
- Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml.
- Ống ly tâm lớn, ống ly tâm eppendorf
- Que cấy, que gắp, que trang, que đục lỗ thạch
- Chai thủy tinh 100 ml.
- Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml.
- Đũa thủy tinh
- Giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa
- Bông thấm nước, bông không thấm nước
- Bao nilong hấp, dây thun, giấy gói.
2.2. Phương pháp luận
Mục tiêu : Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp
lên men lactic trong xử lý kích thích nảy mầm hạt giống.
Nội dung 1: Lên men kéo dài
- Tiến hành thực hiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ đầu tôm
bằng lên men lactic sử dụng nguồn rỉ đường, thời gian lên men 10 ngày.
- Phân tích % acid lactic, N- amine, N-protein, hiệu quả khử khoáng,
hiệu quả khử protein.
32
Đồ án tốt nghiệp
Nội dung 2 : So sánh hiệu quả thu hồi chitosan của phương pháp lên men
lactic so với mẫu chitosan thương phẩm.
Nội dung 3 : Tiến hành thực hiện ứng dụng chitosan phương pháp lên men
lactic và mẫu chitosan thương phẩm.
- Khảo sát khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 của
chitosan bằng phương pháp lên men lactic ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0
g/l; 4,0 g/l tại mức pH= 5,5
- Xác định nồng độ tối ưu .
- So sánh khả năng ức chế nấm của chitosan bằng phương pháp lên
men lactic và chitosan thương phẩm.
Nội dung 4:
- Khảo sát kích thích sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng của
chitosan theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm ở các nồng độ
tương ứng.
- Xác định nồng độ tối ưu
- So sánh khả năng kích thích nảy nầm chitosan lên men lactic so với
mẫu chitosan thuơng phẩm.
2.3. Phương pháp thí nghiệm
2.3.1. Thu thập mẫu và nguyên liệu
Nguyên liệu vỏ tôm của đề tài này thu được từ chợ Bà Chiểu. Quá trình
chuẩn bị vỏ tôm được trình bày
Vỏ tôm
Rửa sơ
Xay nhuyễn ≤ 2 mm
Bảo quản ở -40 C Tiến hành thí nghiệm
Hình 2.1. Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm
33
Đồ án tốt nghiệp
Vỏ tôm sau khi thu nhận được rửa sơ loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ,
… sau đó được xay nhuyễn ( ≤ 2 mm ) và bảo quản -40 C. Quá trình này cần làm
nhanh để tránh vỏ tôm bị hư hỏng.
2.3.2. Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm
Tiến hành : 100 g vỏ tôm đã qua xử lý được thêm nước cất, sau đó đem ly
tâm 4000 vòng / phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần. Phần dịch sau hai lần ly tâm được
trộn lẫn và định mức tới 500 ml gọi là dịch D, rắn sau ly tâm gọi là R.
Vỏ tôm đã xử lý
(100g)
Khuấy trộn Nước
Ly tâm 4000 vòng, 10
phút
Rắn sau ly tâm Thu dịch
Khuấy trộn Nước
Ly tâm 4000 vòng,
10 phút
Thu dịch Rắn R
Định mức 500ml
Dịch D
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm xác định thành phần trong nguyên liệu
34
Đồ án tốt nghiệp
Các yêu cầu thí nghiệm như sau :
1.Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm.
2.Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch trích ly bằng phương pháp
Nito formol.
3.Xác định hàm lượng nito tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp
Kjeldahl.
4. Xác định hàm lượng N- protein hòa tan có trong vỏ tôm bằng phương
pháp Bradford.
2.3.3. Quy trình lên men kéo dài
Sử dụng nguồn đường rỉ đường sau xử lý để lên men với thời gian 10 ngày
ở 370C Giống : vi khuẩn Lactic L5 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM
cung cấp.
Môi trường lên men bằng đường mật rỉ
- 500 g vỏ tôm
- 2,5 % NaCl
- Hàm lượng rỉ đường 20%
- Tỉ lệ nước: đầu tôm là 2,5 : 1
- Tỷ lệ cấy giống (so với mật độ giống được xác định bằng giá trị OD là
0,4)
35
Đồ án tốt nghiệp
Lên men lactic ( 20% đường khử; giống 3,16 x
Vỏ tôm
106 cfu/g; nước : đầu tôm – 2,5 :1; 2,5% NaCl Rỉ đường xử lý 370C; 10 ngày
Chitin
Ngâm NaOH = 1:10 (w/v), (40%, 1000C, 5h)
Rửa trung tính
Khử màu bằng H2O2
Phơi khô tự nhiên
Chitosan
Hình 2.3. Quy trình thu hồi chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic sử
dụng rỉ đường
36
Đồ án tốt nghiệp
Sau lên men lactic mẫu được rửa lại nằng nước cất 3 lần và hoàn lại thể tích
ban đầu và xác định các thông số:
• Xác định các thông số chitin :
1. Độ ẩm
2. Xác định hàm lượng khoáng của chitin
3. Xác định hàm lượng N amin có trong dịch trích ly bằng phương pháp
Nito formol
4. Xác định hàm lượng Nito tổng có trong chitin bằng phương pháp
Kjeldahl.
5. Xác định hàm lượng N- protein hòa tan có trong chitin bằng phương
pháp Bradford
6. Xác định lượng acid lactic
7. Xác định hiệu quả khử khoáng
8. Xác định hiệu quả khử protein
• Xác định thông số chitosan
1. Độ hòa tan
2. Độ nhớt
3. Mức độ deacetylation
2.3.4. Phương pháp tiến hành
2.3.4.1. Xác định độ ẩm
Tiến hành : Cân khối lượng mẫu muốn xác định độ ẩm m1. Cân khối lượng
của chén và mẫu m2. Sấy trong tủ sấy 105o C đến khối lượng không đổi. Làm nguội
trong bình hút ẩm 30 phút. Cân được khối lượng mo.
37
Đồ án tốt nghiệp
Tính kết quả :
X = [(m2 – mo) *100] /m1
Trong đó:
X : Hàm lượng ẩm của mẫu (%)
m2 : Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)
mo: Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
m1: Khối lượng mẫu thử trước khi nung (g)
2.3.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu cần phân tích
Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ. Sau đó lấy chén ra và làm nguội
trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g
(mo). Cân khoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã
biết khối lượng với độ chính xác 0,001 g.
Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 1050 C trong 2 – 3 giờ để cho nước có
trong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào trong lò nung và nung ở nhiệt độ 500
– 550 độ C trong 2 giờ.
Lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng
m2.
Hàm lượng tro thô của mẫu Rx được tính bằng % theo công thức:
X = [(m2 – mo) *100]/m1
Trong đó:
X : Hàm lượng tro thô của mẫu (%)
m2 : Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
mo : Khối lượng chén (g)
m1: Khối lượng mẫu thử trước khi nung (g)
38
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4.3. Xác định hàm lượng nito amin có trong dịch sau lên men
Tiến hành :
Lấy 4 ml dịch trịch ly cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất tới
ngấn bình, lắc đều. Dùng pipet lấy 10 ml, 15 giọt chỉ thị hỗn hợp sau đó cho từng
giọt NaOH 0,1 N đến khi dung dịch có màu phớt xanh, cho tiếp 5 ml formol trung
tính, chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu
xanh tím.
Tiến hành xác định mẫu trắng, thay 10 ml dịch pha loãng bằng 10 ml nước
cất
Kết quả:
(𝑛2− 𝑛1 )×0,0007×100×1000×500 (4×10×100)
Namin =
Với:
n1 : Thể tích NaOH chuẩn mẫu trắng (ml)
n2 : Thể tích NaOH mẫu thí nghiệm (ml)
0,0007: Số gam nito tương ứng với 1ml NaOH 0,05 N
100: Dung tích bình định mức (ml)
500: Số ml dung dịch mẫu Dx ban đầu
4: Thể tích mẫu nguyên
10: Thể tích mẫu pha loãng
100: Số gam nguyên liệu ban đầu
39
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4.4. Xác định hàm lượng N tổng số có trong mẫu cần phân tích
Vô cơ hóa mẫu
Cân 0,1g mẫu bột vỏ tôm cần xác định N tổng, cho vào bình Kjeldahl,
cho tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị
oxy -hóa).
Cho thêm vào 0,2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt
bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. Trong khi đun,
theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như
trong suốt thì có thể lắc nhẹ để kéo hết các phần tử ở trên thành bình còn chưa bị
oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn.
Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước
cất vô đạm tráng lại bình kjeldahl và định mức đến vạch.
Cất đạm
Chuyển 50 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có
sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng.
Tiếp tục cho vào bình cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển
sang màu xanh lá mạ (thêm 5 ml NaOH 45% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển
hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1N
và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho
ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh
hàn có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %. Sau khi cất đạm 20
– 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu
ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ
thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
40
Đồ án tốt nghiệp
Chuẩn độ
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1 N cho đến khi mất
màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ, ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử
dụng.
Kết quả:
Khối lượng N tổng số có trong mẫu được tính theo công thức:
N (g) = {[1,41*(V1 – V2) *100/a] *2/1000}*10/100
Trong đó:
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH 0,1 đã chuẩn độ
a: số g nguyên liệu đem vô cơ hóa mẫu
1,42: hệ số cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương
đương với 1,42mg Nitơ.
2.3.4.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan trong dịch trích ly bằng phương pháp
Bradford
Nguyên tắc :
Các protein khi phản ứng xanh Coomassie (Coomassie Brilliant blue –
CBB) sẽ hình thành hợp chất có màu khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng
595nm, cường độ màu tỷ lệ với protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ
nhạy cao cho phép phát hiện tới vài g protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời
gian.
41
Đồ án tốt nghiệp
Tiến hành :
Lập đồ thị đường chuẩn
Bảng 2.1. Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Ống nghiệm ĐC Mẫu 1 2 3 4 5
Dung dịch BSA 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 - (0,1 mg / ml)
Nước cất (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1 -
Mẫu phân tích
pha loãng hệ số - - - - - - 1
F (ml)
Nồng độ BSA 0 10 20 30 40 50 - (μg/ml)
Thuốc thử 2 2 2 2 2 2 2 Bradford (ml)
Để yên trong 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng 595
nm, lấy mẫu đối chứng làm mẫu trắng.
Kết quả:
Từ kết quả đo OD vẽ ra đồ thị đường chuẩn albumin dạng y = ax + b
Hàm lượng N protein (mg/g) = [(y-b)/a]*500/100/6,25
Trong đó :
y là kết quả OD của mẫu thí nghiệm
a và b là hai hằng số trong đường chuẩn albumin.
500: số ml dịch Dx
100: số g nguyên liệu ban đầu
6,25: hệ số chuyển đổi từ protein hòa tan sang N protein
42
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4.6. Xác định lượng acid lactic
Xác định lượng acid lacic sinh ra trong quá trình lên men lactic thu hồi
chitin.Cho 10ml dịch Dx vào bình tam giác, cho thêm 3 giọt phenolphthalein.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch có pH = 8,3.
% khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức:
% acid lactic = VNaOH /10*50/10*0,1/1000*90*100
Trong đó:
VNaOH: Thể tích NaOH 0.1N chuẩn độ được
10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ
0,1: Nồng độ NaOH dùng chuẩn độ
1000: Hệ số chuyển đổi ra g
90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90mg lacid lactic trong
dịch Dx.
2.3.4.7. Xác định hiệu quả khử protein và khử khoáng bằng phương pháp lên men
lactic
Hiệu quả khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như
mô tả của Prameela K. và cộng sự (2010) :
[𝐴𝑜×𝑂]−[𝐴𝑅 × 𝑅] [𝐴0 ×𝑂]
% DM = × 100
[𝑃0×𝑂]− [𝑃𝑅 × 𝑅] [𝑃0 ×𝑂]
% DP = × 100
Với:
% DM: Tỷ lệ phần trăm khử khoáng
% DP: Tỷ lệ phần trăm khử protein
Po và Pr: Nồng độ protein trước và sau lên men
43
Đồ án tốt nghiệp
Ao và Ar: % tro trong mẫu trước và sau lên men.
O và R: Khối lượng mẫu trước và sau lên men.
2.3.4.8. Xác định độ hòa tan chitosan
Cân 0,25 g chitosan hoà tan trong 50 ml acid acetic 1%, khuấy đều trong 15
phút, lọc thu cặn (nếu còn), rửa bằng nước cất, sấy khô và cân lại.
Độ hòa tan, %:
X (%) = [(M – m) x 100] / M
Trong đó M là khối lượng của chitosan trước hòa tan (g), m là khối lượng
chitosan còn dư sau phản ứng hoà tan (g).
2.3.4.9. Xác định độ nhớt chitosan và phân tử lượng trung bình
Cân 0,25 g chitosan hòa tan trong 50 ml acid acetic 5 % và 0,1 M KCl. Lấy
25 ml hỗn hợp dung dịch trên cho vào nhớt kế Ostwald, đo thời gian dung dịch
chitosan chạy từ vạch A xuống vạch B. Thực hiện tương tự với nước cất. Đo độ
nhớt động học v/t = vH2O/ t H2O
Do đó ( cp) = ( vH2O/ t H2O ) * t (vH2O ở 300 C = 0,801 cp)
Độ nhớt đặc trưng và phân tử lượng trung bình của chitosan có mối liên hệ
theo công thức mô tả của Chang (1997):
’ ( cp) = K * Ma
’ : Độ nhớt đặc trưng của polyme
’ = / C
Trong đó :
C: nồng độ chitosan (g / 100 ml )
K= 3,04 x 10-5; ∝= 1,26
44
Đồ án tốt nghiệp
2.3.4.10. Xác định độ deacetylation chitosan
Cân 0,5 g chitosan hòa tan trong 25 ml HCl 0,1M định mức lên tới 100 ml
bằng nước cất. Thêm KCl điều chỉnh cường độ ion đến 0,1. Tiến hành chuẩn độ dd
chitosan bằng dung dịch NaOH 0,05 M và xác định điểm tương đương bằng cách
đo điện thế dung dịch.
Từ đó xác định được DDA % của chitosan (Broussignac, 1968)
DDA (%) = (1−161 ×𝑄) (1+42 ×𝑄)
𝑚
Với Q = (𝑁 ×∆𝑉)
∆𝑉 : Thể tích dd NaOH giữa 2 điểm uốn (lít)
𝑁: Nồng độ đương lượng NaOH (0,05M/)
𝑚: Khối lượng chitosan.
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus
CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA
Nghiên cứu nhằm xác định nồng độ chitosan và pH tối ưu nhất để ức chế sự
phát triển của nấm gây bệnh. Chọn đĩa nấm thuần sau khi phân lập.
Chuẩn bị môi trường PDA kết hợp với chitosan ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5
g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 4,0 g/l và được điều chỉnh pH bằng NaOH để thu được mức pH
tương ứng là 5,5.
Sau khi chuẩn bị xong, dung dịch được đun cách thủy ở nhiệt độ khoảng từ
85 – 900C trong 35 phút để tạo điều kiện cho agar tan hoàn toàn và không làm mất
hoạt tính của chitosan.
Tiến hành cấy nấm dùng ống kim loại khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và
đục lỗ có đường kính 6 mm sang môi trường PDA có dịch chitosan và theo dõi sự
phát triển của nấm sau 24 h và quan sát liên tục trong vòng 7 ngày, đo kích thước
vòng nấm phát triển so với đĩa đối chứng (môi trường PDA không bổ sung
chitosan) để xác định nồng độ tối ưu.
45
Đồ án tốt nghiệp
Công thức tỷ lệ ức chế nấm
𝐷𝑎
% Hoạt lực ức chế nấm: I (%) = 𝐷𝑎−𝐷𝑏 x 100
Với : Da : Đường kính nấm phát triển trên đĩa đối chứng (mm )
Db: Đường kính nấm phát triển của nấm thử nghiệm (mm)
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu
nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng.
Thí nghiệm được tiến hành như mô tả của Batool Mahdavi, Asghar Rahimi
(2013)
Hạt giống được ngâm trong dung dịch chitosan với các nồng độ tương ứng
( 0 g/l; 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0 g/l; 2,0 g/l; 5,0 g/l tan trong dung dịch acid acetic 1 %).
pH của dung dịch được điều chỉnh đến pH = 6,0 bằng NaOH 1 % tròng vòng 3 h.
Sau đó để khô để tạo màng chitosan.
Hạt được rửa bằng nước cất và phơi khô ở nhiệt độ phòng.
Hạt được đặt trong lớp đĩa petri có chứa giấy lọc thấm ẩm. Mỗi đĩa đặt 25
hạt. Sau đó đặt đĩa trong buồng tăng trưởng. Sau 7 ngày quan sát bắt đầu kiểm tra
các chỉ tiêu : số lượng hạt nảy mầm, trọng lượng của hạt, chiều dài của rễ non.
46
Đồ án tốt nghiệp
Hạt giống (đậu nành, đậu phộng)
Lựa chọn
Nhúng vào dung dịch chitosan
0,5 g/l 0,1 g/l 1,0 g/l 2,0 g/l 5,0 g/l
Để khô ở nhiệt độ phòng
Rửa bằng nước cất
Hạt giống được đặt vào đĩa petri có chứa giấy lọc ẩm
Đặt ở buồng tăng trưởng ở nhiệt độ 20 ± 10C
Xác định các chỉ tiêu: số lượng hạt nảy mầm, trọng lượng của hạt, chiều dài của rễ non
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm kích hoạt nảy mầm của hạt đậu nành, hạt đậu phộng của
dung dịch chitosan ở các nồng độ.
47
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm
Để thuận tiện cho các tính toán về sau và xác định hiệu suất quá trình lên men
việc xác định các thành phần hóa học trong vỏ tôm là điều cần thiết vì vậy ta tiến
hành xác định các thành phần hóa học của vỏ đầu tôm nguyên liệu, kết quả được thể
hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học nguyên liệu vỏ tôm
Nguyên liệu vỏ Thành phần Đơn vị tôm
Ẩm độ % khối lượng tươi 79,56 ± 0,31
Khoáng % khối lượng tươi 18,88 ± 0,18
N tổng số (bã vỏ 6,15 ± 0,59 mg/ g tôm)
N amin( dịch trích mg/ g 6,24 ± 0,62 ly)
N protein ( dịch mg/ g 0,027 ± 0,0013 trích ly)
So với kết quả đồ án của Dương Quốc Xuân (2014) ẩm độ 77,43 %; khoáng
24,3 %; N tổng số 6,11 mg/ g, Namin 7,35 mg/ g ta thấy quả kết quả ẩm độ,
khoáng, nitơ tổng số, N amin của nguyên liệu vỏ đầu tôm bảng 3.1 trên tương
đương với kết quả của Dương Quốc Xuân (10DSH).
48
Đồ án tốt nghiệp
3.2. Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ
đường 20%
Bảng 3.2. Các thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin của
chủng L5 vởi tỉ lệ rỉ đường 20%
Thành phần Đơn vị Kết quả
Không có mùi thối Mùi
4,8 pH
Ẩm độ % khối lượng 85,15 ± 2,0
Khoáng % khối lượng 3,78 ± 0,15
N tổng số ( bã vỏ mg/ g 3,23 ± 0,44 tôm)
N amin( dịch trích mg/ g 26,40 ± 1,4 ly)
N protein ( dịch mg/ g 0,0343 ± 0,0024 trích ly)
Nồng độ acid lactic (% ) 5,64 ± 0,0687
Kết quả cho thấy N tổng số có trong vỏ tôm giảm từ 6,15 mg/ g (bảng 3.1)
xuống còn 3,23 ( bảng 3.2) giảm xuống 2 lần so với ban đầu; % hàm lượng khoáng
trong vỏ tôm từ 18,88 % (bảng 3.1) giảm xuống còn 3,78 % ( bảng 3.2) giảm 4,99
lần so với thành phần nguyên liệu ban đầu, N amin cao hơn so với ban đầu. Điều
này cho thấy trong quá trình lên men hoạt tính enzyme protease sinh ra đã hòa tan
protein trong vỏ đầu tôm thành Namin và Nprotein có trong dịch đồng thời enzyme
tiếp tục thủy phân Nprotein có trong dịch thành Namin làm cho hàm lượng Namin
trong dịch trích ly tăng lên đáng kể.
49
Đồ án tốt nghiệp
3.3. Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ
rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ ml, 10 ngày.
Bảng 3.3. . Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ
đường 20%, mật độ giống 3,16x 106 cfu, 10 ngày
Khối lượng KL mẫu ban HS khử % Khoáng đầu % Khoáng sau đầu ( g) khoáng ( %) mẫu sau ( g)
18,8 500 3,78 144 94,2093
Bảng 3.4. Hiệu quả khử protein (%) của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ
đường 20%, mật độ giống 3,16 x 106 cfu/ml , 10 ngày
% N tổng số KL mẫu ban % N tổng số Khối lượng HS khử protein
đầu đầu ( g) sau mẫu sau ( g) ( %)
0,62 500 0,32 144 85,1355
Dựa vào bảng 3.3 và bảng 3.4 nhận thấy hiệu quả khử khoáng của quá trình
lên men lactic thu hồi chitin từ vỏ đầu tôm đạt 94,2 %; hiệu quả khử protein đạt
85,1 %. Hiệu suất khử protein và khử khoáng của quá trình lên men cao chứng tỏ
quá trình lên men lactic thu hồi chitin đạt hiệu quả tốt.
50
Đồ án tốt nghiệp
3.4. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương
pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm
Bảng 3.5. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men lactic và chitosan
thương phẩm
Phương pháp lên Chitosan thương Chitosan thương Thông số men lactic phẩm 1 phẩm 2
Độ hòa tan (%) 91,9a ± 0,89 90,9a ± 0,27 87,6b ± 0,72
Độ nhớt (cp) 1,02a ± 0,059 1,72b ± 0,10 2,76c ± 0,84
576350c ± MW (g/mol) 262027a ± 11952,3 406441b ± 14043,9 3835,34
Độ
deacetylation 94,8a ± 0,27 97,5b ± 0,130 97,4b ± 0,24
chitosan (%)
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
dòng
Dựa vào bảng 3.5 có thể nhận thấy độ hòa tan giữa mẫu chitosan lên men
lactic và chitosan thương phẩm 1 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Trong khi
đó mẫu chitosan thương phẩm 2 có sự khác biệt so với mẫu chitosan lên men lactic
và mẫu chitosan thương phẩm 1 với mức ý nghĩa ∝ = 0,05. Độ nhớt và khối lượng
phân tử trung bình giữa chitosan lên men lactic với thương phẩm 1 và thương phẩm
2 cũng có sự khác nhau với mức ý nghĩa ∝ = 0,05.
Độ deacetylation chitosan có sự khác biệt giữa mẫu chitosan lên men bằng
phương pháp lactic với mẫu chitosan thương phẩm 2 và mẫu chitosan thương phẩm
1 với mức ý nghĩa ∝ = 0,05, sự khác biệt không chênh lệch nhiều ( Độ
51
Đồ án tốt nghiệp
deacetylation chitosan lên men lactic là 94,8 %, chitosan thương phẩm 2 là 97,4 %,
chitosan thương phẩm 1 là 97,5 %).
Độ nhớt của chitosan lên men lactic là 1,02 cp thấp hơn so với mẫu chitosan
thương mại 1(1,72 cp), chitosan thương phẩm 2(2,76 cp) do độ hòa tan của mẫu lên
men lactic cao hơn so với chitosan thương mại, độ deacetylation của chitosan lên
men lactic thấp thì độ nhớt sẽ thấp. Điều này phù hợp với đặc điểm tính chất của
chitosan.
Kết quả thu nhận chitosan sản xuất từ chitin bằng phương pháp lên men
lactic được thể hiện như hình 3.1
.
Hình 3.1. Kết quả thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men
lactic sử dụng rỉ đường
A : Chitin B : Chitosan C: Chitosan sau khi tẩy màu bằng H2O2
52
Đồ án tốt nghiệp
3.5. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus
flavus CĐP1
Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm (%)
Nồng độ Chitosan thương Chitosan thương Chitosan lên
chitosan (g/l) phẩm 1 phẩm 2 men lactic
0,1 g/l 34,85a ± 0,95 34,46a ± 0,47 33,64a ± 1,12
0,5 g/l 36,29a± 0,93 35,28a ±0,75 34,61a ± 1,09
1,0 g/l 39,08b ± 0,76 41,19b ±0,41 37,13b ± 0,57
2,0 g/l 39,79bc ± 1,03 39,89c ± 0,75 41,67bc±0,41
4,0 g/l 41,29c± 0,37 42,48c ± 0,14 40,42c ± 1,0
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
cột
53
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.2. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung
chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan lên men lactic.
A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l
C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l
E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l
54
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.3. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung
chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 1.
A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l
C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l
E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l
55
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.4. Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA có bổ sung
chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 2.
A: Đối chứng chỉ cấy nấm không có chitosan B : Chitosan nồng độ 0,1 g/l
C : Chitosan nồng độ 0,5 g/l D : Chitosan nồng độ 1,0 g/l
E: Chitosan nồng độ 2,0 g/l F: Chitosan nồng độ 4,0 g/l
Qua kết quả bảng xử lý số liệu trên Statgraphics bảng 3.6 người thực hiện đề
tài thấy :
Ở mẫu chitosan thí nghiệm lên men lactic tại nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l cho tỉ
lệ ức chế nấm bệnh là cao nhất. Mặt khác, ở điều kiện pH = 5,5 kết quả ức chế nấm
với nồng độ chitosan 2,0 g/l và 4,0 g/l không có sự khác biệt về mặt thống kê ( nồng
độ 2,0 g/l tỷ lệ ức chế nấm chiếm 39,89 %, nồng độ 5,0 g/l chiếm 40,42 %). Trên
thực tế, nếu xét về mặt kinh tế thì ở pH = 5,5 kết hợp với 4,0 g/l thì giá thành cao
hơn so với 2,0 g/l. Bên cạnh đó, kết quả không khác nhiều so với nồng độ 2,0 g/l .
56
Đồ án tốt nghiệp
Do vậy dựa trên kết quả thí nghiệm ta chọn nồng độ 2,0 g/l là nồng độ tối ưu để ức
chế nấm trên môi trường PDA có bổ sung chitosan của mẫu chitosan lên men lactic.
Tương tự ở mẫu chitosan thương phẩm 1 và mẫu chitosan thương phẩm 2
cũng cho tỷ lệ ức chế nấm cao nhất tại nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l. Sự chênh lệch
giữa nồng độ 2,0 g/l và 4,0 g/l của thương phẩm 1 và sự chênh lệch giữa nồng độ
2,0 g/l và 4,0 g/l của thương phẩm 2 không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thông kê.
Như vậy, mẫu chitosan thương phẩm 1 và mẫu chitosan thương phẩm 2 khi bổ sung
nồng độ chitosan 2,0 g/l cho khả năng ức chế nấm là tốt nhất.
Nhìn chung, khi bổ sung chitosan ở các nồng độ từ 1,0 g/l đến 4,0 g/l ở 3
mẫu chitosan đều cho kết quả ức chế nấm tương đối tốt, phần mép tản nấm mọc sát
thạch mọc yếu, sợi nấm mọc bung lên tập trung ở phần giữa đĩa peptri. Qua đó
người thực hiện đề tài có thể thấy việc sử dụng chitosan ở nồng độ cao hơn đem lại
sự ức chế nấm hiệu quả. Với kết quả nồng độ chitosan 2,0 g/l thì chitosan có khả
năng ức chế sự phát triển của nấm gần như là tốt nhất sau khi theo dõi 7 ngày ủ.
Dựa vào bảng số liệu và kết quả xử lý thống kê phụ lục D2, có thể nhận
thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l khả năng ức chế nấm giữa mẫu chitosan lên men sinh
học và chitosan thương phẩm 1 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Khả năng
kháng nấm là khoảng 40 % ở mẫu chitosan thí nghiệm và chitosan thương phẩm 1.
Tại nồng độ 2,0 g/l này mẫu chitosan thương phẩm 2 có tỷ lệ ức chế nấm phát triển
tốt hơn so với 2 mẫu chitosan còn lại, sự chênh lệch tỷ lệ ức chế giữa chitosan
thương phẩm 2 với chitosan lên men lactic và chitosan thương phẩm 1 cũng không
quá lớn ( ở nồng độ 2,0 g/l chênh lệch 1,78 % so với thương phẩm 1 và 1,88 % so
với mẫu chitosan lên men lactic).
57
Đồ án tốt nghiệp
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu
tương
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic
Chiều dài rễ Nồng độ chitosan Tỷ lệ hạt nảy Khối lượng hạt
(g/l) mầm (%) (g) (cm)
Đối chứng 66,7a ± 2,31 4,03a ± 0,06 0,30a ± 0,012
0,1 69,3a ± 2,30 5,17b ± 0,29 0,33ab ± 0,004
0,5 74,7b ± 2,31 5,89c ± 0,07 0,31b ± 0,01
1,0 76,0b ± 4,0 6,03c ± 0,15 0,34b ± 0,02
2,0 78,7bc ± 2,31 6,93d ± 0,12 0,40c ± 0,01
5,0 82,7c ± 2,29 7,17d ± 0,15 0,39c ± 0,02
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
cột
58
8.0
90.0
80.0
7.0
) g ( t ạ h
70.0
6.0
60.0
5.0
g n ợ ư l i ố h k
tỷ lệ nảy mầm (%)
50.0
, )
4.0
% m ầ m y ả n
40.0
chiều dài rễ (cm)
3.0
ệ l ỷ t
30.0
m c ( ễ r i a d
khối lượng hạt (g)
2.0
20.0
u è i h c
1.0
10.0
0.0
0.0
0.0 0.1 0.5
1.0
2.0
5.0
nồng độ (g/l)
Đồ án tốt nghiệp
.Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic
Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan lên chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối với
mẫu chitosan lên men lactic
59
Đồ án tốt nghiệp
Qua hình 3.6 và kết quả bảng xử lý số liệu 3.7 người thực hiện đề tài có thể
kết luận như sau:
Với mẫu chitosan lên men lactic ta thấy tại nồng độ chitosan 2,0 g/l; 5,0 g/l
cho ra tỷ lệ nảy mầm và chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất. Nồng độ giữa 2,0
g/l và 5,0 g/l không có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa ∝ = 0,05 . Mặt khác, nếu
xét về mặt kinh tế sử dụng nồng độ 2,0g/l sẽ tiết kiệm hơn so với nồng độ 5,0 g/l. Vì
vậy dựa trên thí nghiệm chọn 2,0 g/l là nồng độ chitosan bổ sung cho tỷ lệ nảy mầm
và chiều dài rễ là tối ưu nhất.
Qua đó có thể kết luận rằng tại mẫu chitosan lên men lactic tại nồng độ 2,0 g/l
cho tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ và khối lượng hạt là tốt nhất. Và rõ rệt nhất là sự
kích thích tăng chiều dài rễ của chitosan lên men lactic.
60
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 1
Nồng độ Tỉ lệ hạt nảy mầm Chiều dài rễ Khối lượng hạt chitosan
(%) (cm) (g) (g/l)
Đối chứng 69,3a ± 2,31 4,13a ± 0,15 0,30a ± 0,01
0,1 73,3ab ± 2,30 4,27 a± 0,06 0,29a± 0,006
74,7b ± 2,29 4,33a ± 0,05 0,35b ± 0,02 0,5
1,0 77,3bc ± 2,31 4,83b ± 0,15 0,36b ± 0,01
2,0 82,7cd ± 4,62 5,87c ± 0,15 0,35b ± 0,01
5,0 81,3d ± 2,31 6,07c ± 0,12 0,36b ± 0,01
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
90.0
7.0
80.0
6.0
) g ( t ạ h
70.0
5.0
%
60.0
4.0
50.0
g n ợ ư l i ố h k
tỷ lệ nảy mầm (%)
, )
m ầ m y ả n
40.0
3.0
chiều dài rễ (cm)
30.0
ệ l ỷ t
khối lượng hạt (g)
2.0
m c ( ễ r i à d
20.0
1.0
10.0
u ề i h c
0.0
0.0
0.0
0.1
0.5
1.0
2.0
5.0
nồng độ (g/l)
cột
Hình 3.7. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1
61
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối
với mẫu chitosan thương phẩm 1
Dựa vào bảng kết quả bảng 3.8 và hình 3.7 ta thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l;
5,0 g/l cho kết quả tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất. Giữa
nồng độ 2,0 g/l và 5,0 g/l không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ∝ = 0,05.
Do đó để tiết kiệm hơn về mặt kinh tế cho nên chọn 2,0 g/l là nồng độ tốt nhất để
kích thích nảy mầm hạt đậu tương.
62
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 2
Nồng độ chitosan Tỉ lệ hạt nảy Khối lượng hạt Chiều dài rễ (cm) mầm(%) (g) (g/l)
Đối chứng 69,3a ± 2,31 4,13a ± 0,32 0,29a ± 0,014
0,1 72,0ab ± 4,0 5,37b ± 0,32 0,30a ± 0,010
0,5 73,3ab ± 2,31 5,9 c± 0,10 0,31a ± 0,017
1,0 76,0b ± 4,0 6,20c ± 0,26 0,39b ± 0,02
2,0 82,7c ± 2,31 7,17d ± 0,21 0,43c ± 0,01
5,0 84,0c ± 4,0 7,27d ± 0,25 0,41bc± 0,03
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
100.0
9.0
90.0
8.0
) g ( t ạ h
80.0
7.0
70.0
6.0
)
60.0
%
g n ợ ư l i ố h k
5.0
(
, )
tỷ lệ nảy mầm (%)
50.0
4.0
chiều dài rễ(cm)
40.0
m ầ m y ả n
3.0
m c ( ễ r i à d
khối lượng hạt(g)
30.0
ệ l ỷ t
2.0
u ề i h c
20.0
1.0
10.0
0.0
0.0
0.0
0.1
2.0
5.0
0.5 1.0 nồng độ (g/l)
cột
Hình 3.9. Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2
63
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.10. Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu tương đối
với mẫu chitosan thương phẩm 2
Tương tự dựa vào bảng kết quả bảng thấy rằng tại nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l
cho kết quả tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt là tốt nhất . Giữa nồng độ
2,0 g/l và 5,0 g/l không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ∝ = 0,05. Do đó để
tiết kiệm hơn về mặt kinh tế cho nên chọn 2,0 g/l là nồng độ tốt nhất để kích thích
nảy mầm hạt đậu tương.
Như vậy qua ba thí nghiệm trên ba mẫu chitosan : chitosan lên men lactic,
chitosan thương phẩm 1, chitosan thương phẩm 2 đều cho kết quả nồng độ 2,0 g/l là
tối ưu nhất, kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương là tốt nhất. Và ảnh hưởng rõ rệt hơn
cả của chitosan là sự tăng chiều dài rễ.
64
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.10. So sánh nồng độ chitosan 2,0g/l giữa mẫu chitosan lên men và mẫu
chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt đậu
tương.
Nồng độ 2,0g/l
Mẫu chitosan Tỷ lệ nảy mầm Khối lượng hạt Chiều dài rễ (cm) (%) (g)
Chitosan 78,7a ± 2,31 6,93a ± 0,12 0,40a ± 0,01 sinh học
Chitosan thương 82,7a ± 4,62 5,87b ± 0,15 0,35b ± 0,01 phẩm 1
Chitosan thương 82,7a ± 2,31 7,17a ± 0,21 0,43c ± 0,01 phẩm 2
Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa ∝ = 0,05 trong cùng một
cột
Qua bảng kết quả xử lý số liệu 3.10 người thực hiện đề tài có thể nhận xét
rằng:
Tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương giữa mẫu chitosan lên men lactic so với mẫu
chitosan thương phẩm không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ta thấy chiều dài rễ
giữa mẫu chitosan lên men sinh học và chitosan thương phẩm 2 không có sự khác
biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa ∝ = 0,05. Bên cạnh đó, khối lượng giữa 3
mẫu chitosan có sự khác biệt với nhau tuy nhiên sự khác biệt ấy không có sự chênh
lệch nhiều ( mẫu chitosan lên men lactic chênh lệch 0,05 g so với chitosan thương
phẩm 1 và chênh lệch với chitosan thương phẩm 2 là 0,03 g). Từ kết quả thu được
có thể nói rằng tại nồng độ 2,0 g/l ở mẫu chitosan lên men lactic cho kết quả tỷ lệ
nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt ở mức tương đương so với kết quả các mẫu
chitosan thương phẩm.
65
Đồ án tốt nghiệp
3.7. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu
phộng
Khảo sát này nhằm mục đích xác định ảnh hưởng màng bao chitosan tới
khả năng nảy mầm của hạt đậu phộng. Từ đó đưa ra kết luận về khả năng kích thích
sự nảy mầm của chitosan lên hạt đậu phộng.
Sau thời gian 7 ngày khảo sát, kết quả ảnh huởng của chitosan mẫu lên men
lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng được thể hiện qua hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy
mầm hạt đậu phộng
Kết quả cho thấy rằng, thí nghiệm đều không quan sát được sự nảy mầm
của hạt đậu phộng. Tại mỗi nồng độ thí nghiệm chitosan bao hạt đậu phộng đều có
hiện tượng nhiễm nấm mốc, nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l ít nhiễm nấm trên hạt đậu
phộng. Nồng độ chitosan càng cao thì làm chậm sự nhiễm nấm trên hạt đậu phộng.
66
Đồ án tốt nghiệp
So với kết quả của Bin Zhang, Dong-Feng Wang, Hai-Yan Li, Ying Xu, Li Zhang
(2009), phương pháp thử nghiệm đánh giá hoạt động chống Aspergillus flavus của
chitosan trên hạt đậu phộng vẫn cho thấy Aspergillus flavus có thể nảy mầm và tăng
trưởng bình thường, màng bao chitosan không khống chế được sự ức chế và phát
triển của Aspergillus flavus trên hạt đậu phộng.
Thí nghiệm không thành công có thể do giai đoạn kích hoạt nảy mầm hạt
đậu phộng ở dạng ủ trên môi trường ẩm nên xảy ra hiện tượng nhiễm nấm làm ảnh
hưởng đến sự kích hoạt phôi hạt đậu phộng nảy mầm.
Hình 3.12. Ảnh huởng của chitosan mẫu chitosan thương phẩm 1 khả năng kích
hoạt nảy mầm hạt đậu phộng
67
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.13. Ảnh huởng của chitosan thương phẩm 2 tới khả năng kích hoạt nảy
mầm hạt đậu phộng của mẫu
Qua hình 3.12 và hình 3.13 nhận thấy rằng thí nghiệm của mẫu thương
phẩm 1 và thương phẩm 2 đều không quan sát được sự nảy mầm của hạt đậu phộng.
Tại mỗi nồng độ chitosan các hạt đậu phộng đều có hiện tượng nhiễm nấm mốc.
Nồng độ 2,0 g/l; 5,0 g/l ít nhiễm nấm trên hạt đậu phộng. Nồng độ chitosan càng
cao thì khả năng giảm số lượng hạt đâu phộng nhiễm nấm là ít nhất.
Như vậy, qua ba kết quả thí nghiệm trên ba mẫu chitosan: lên men lactic,
thương phẩm 1 và thương phẩm 2 đếu cho thấy nồng độ chitosan càng cao thì sự
nhiễm nấm của hạt đậu phộng càng ít và đều không thấy có sự nảy mầm của hạt đậu
phộng.
68
Đồ án tốt nghiệp
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Thông số của chitosan sau khi deacetylation chitosan 94,8 % thu hồi từ
chitin bằng phương pháp lên men lactic cho độ hòa tan khoảng 93,2 %; độ nhớt
1,02 cp; khối lượng phân tử trung bình là 262027 g/mol.
Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng
nấm Aspergillus flavus cho ra kết quả như sau:
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus flavus của mẫu
chitosan lên men lactic cho thấy tại nồng độ chitosan 2,0 g/l có khả năng ức chế
nấm tốt nhất với tỷ lệ ức chế 39,89 % tương đương với chitosan thương phẩm.
Trong ứng dụng chitosan bao hạt giống, chitosan sinh học có tác
dụng kích thích nảy mầm hạt giống đậu tương tại các nồng độ thí nghiệm tốt hơn so
với mẫu đối chứng không bao, và tốt nhất ở nồng độ 2,0 g/l; làm tăng tỷ lệ nảy mầm
từ 66,7% lên 78,7 %, ảnh hưởng rõ rệt đến kích thích sự tăng chiều dài rễ của hạt
giống thêm 1,72 % ( từ 4,02 cm lên 6,93cm); khối lượng hạt nảy mầm lên 1,33% từ
0,3 g đến 0,40 g. Kết quả tương tự với mẫu chitosan thương phẩm.
Khi bao hạt giống đậu phộng cho nảy mầm có sự xuất hiện nấm mốc ít
nhất ở nồng độ chitosan bao gói là 2,0 – 5,0 g/l. Kết quả tương tự với mẫu chitosan
thương phẩm
Kiến nghị
Nghiên cứu kết hợp với các hóa chất bảo quản khác cho hiệu quả cao hơn
trong từng lĩnh vực sản xuất và xuất khẩu.
Nghiên cứu thêm về các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tạo màng
chitosan lên các loại hạt giống cây trồng.
Ứng dụng chitosan để bảo quản hạt giống và các loại quả khác. Nghiên cứu
dùng màng chitosan bảo quản các sản phẩm thủy sản như cá, mực, thịt …
69
Đồ án tốt nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Lê Nguyễn Đoan Duy, Nguyễn Thị Kim Tuyến, Lương Tố Lan, Nguyễn Công
Hà (2014). Nghiên cứu ứng dụng chitosan để ức chế nấm Colletotrichum
Gloeosporioides phân lập từ xoài cát hòa lộc bị bệnh thán thư. Tạp chí
Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 4, 154-161.
[2] Lê Thu Hiền, Lê Thị Lan Oanh (1994). Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của
chitosan và vi lượng đến sinh trưởng và phát triển của mạ lúa CR203. Tạp
chí Sinh học, số 2.
[3] Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ, Nguyễn Văn Hoen (2001). Nghiên cứu tác
dụng của các chất có hoạt tính sinh học cao từ chitin đối với sự nảy mầm
hạt thóc giống.Tạp chí Hóa học, số 3, 23 – 26.
[4] Nguyễn Hoài Hương, Nguyễn Thị Ngọc Thu (2013). Thu nhận chitin từ vỏ đầu
tôm sú bằng phương pháp lên men lactic. Kỷ yếu hội thảo Khoa học khoa
MT-CNSH 2013 Ứng dụng Khoa học Công nghệ vì mục tiêu phát triển bền
vững, 31/05/2013,TpHCM, 247-260.
[5] Võ Thị Mai Hương, Trần Thị Kim Cúc (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của
chitosan oligosaccharadie lên sinh trưởng và năng suất cây lạc giống lạc
L14. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 73,số 4. 125- 134.
[6] Lê Thanh Long, Nguyễn Hiền Trang (2014). Nghiên cứu khả năng kháng nấm
mốc Aspergillus flavus trên ngô của một số hoạt chất có nguồn gốc tự
nhiên.Tạp chí khoa học trường Đại học Huế, số 6.
[7] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (3/2015). Sản xuất các
chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản. NXB Nông Nghiệp.
[8] Võ Hồng Thi, Thái Văn Nam, Nguyễn Hoài Hương (2014). Thực hành hóa
phân tích. Trường Đại học Công Nghệ TpHCM.
70
Đồ án tốt nghiệp
[9] Dương Quốc Xuân (2014). Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin từ vỏ tôm bằng
lên men lactic. Luận văn (Đại học). Khoa Công nghệ sinh học – Thực
phẩm- Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TpHCM.
Tài liệu tiếng Anh
[10] Batool Mahdavi, Asghar Rahimi (2013). Seed priming with chitosan improves
the germination and growth performance of ajowan (Carum copticum)
under salt stress. EurAsian Journal of BioSciences, Eurasia J Biosci 7, 69-
76 .
[11] Bin Zhang, Dong-Feng Wang∗, Hai-Yan Li, Ying Xu, Li Zhang (2009).
Preparation and properties of chitosan–soybean trypsininhibitor blend film
with anti-Aspergillus flavus activity. Industrial crops and products 29
(2009), 541 – 548.
[12] Chatterjee, S., Adhya, M., Guha, A.K., Chatterjee, B.P., 2005. Chitosan from
Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization.Process
Biochemistry 40, 395–400.
[13] Dzung NA, Thang NT (2002) Effects of oligoglucosamine prepared by enzyme
degradation on the growth of soybean. In: Suchiva VK, Chandrkrachang S,
Methacanon P, Peter MG (eds.), Advances in Chitin Science, Bangkok,
463-467.
[14] Entsar S.Abdou, Khaled S.A. Nagy, Maher Z. Elsabee (2008). Extraction and
characterization of chitin and chitosan from local sources. Bioresource
Technology 99 (2008) , 1359–1367.
[15] Islem Younes, Sabrine Sellimi, Marguerite Rinaudo, Kemel Jellouli, Moncef
Nasri. Influence of acetylation degree and molecular weight of
homogeneous chitosans on antibacterial and antifungal activities(2014).
International Journal of Food Microbiology,185 (2014), 57 – 63.
71
Đồ án tốt nghiệp
[16] Khalid Ziani, Beatriz Ursúa , Juan I. Maté. Application of bioactive coatings
based on chitosan for artichoke seed protection. Crop Protection 29 (2010)
853 – 859.
[17] Makarova, K.; Slesarev, A.; Wolf, Y.; Sorokin, A.; Mirkin, B.; Koonin,
E.;Pavlov, A.; Pavlova, N. et al. (Oct 2006). Comparative genomics of the
lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (42): 15611–6.
[18] Owen R. Fennema et al (2004).Lactic Acid Bacteria.Food Science and
Teachnology.
[19] Ravi Kumar, M.N.V., 2000. A Review of chitin and chitosan
pplications.Reactive and Functional Polymers 46, 1–27.
[20] Rafael de Oliveira Pedro, Mirelle Takaki, Teresa Cristina Castilho Gorayeb,
Vanildo Luiz Del Bianchi, Jõao Cláudio Thomeo, Marcio José Tieraa, Vera
Aparecida de Oliveira Tieraa (2013). Synthesis, characterization and
antifungal activity of quaternary erivatives of chitosan on Aspergillus
flavus. Microbiological Research 168 (2013), 50–55.
72
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường sử dụng trong các thí nghiệm
A.1. Thành phần môi trường MRS – Broth
Glucose 20 g
Peptone 10 g
Beef extract powder 8,0 g
Sodium acetate 5,0 g
Yeast extract 4,0 g
2,0 g K2HPO4.3H2O
0,2 g MgSO4.7H2O
0,05 g MnSO4.H2O
Triamonium citrate 2,0 g
Tween 80 1 ml
Nước cất 1000 ml
A.2. Thành phần môi trường Potato Dextrose Agar ( PDA)
D – glucose
20 g
Agar
20 g
Dịch chiết khoai tây 1000 ml
1
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC B: Xử lý rỉ đường
Rỉ đường sau khi thu nhận từ nhà máy đường, 100 ml rỉ đường được thêm vào 20ml
H2O và 5 ml H2SO4 đậm đặc. Sau đó gia nhiệt đến 900 C trong bể điều nhiệt trong
vòng 20 phút. Chỉnh pH của môi trường lên 6,5 bằng CaO giữ trong 1 giờ. Ly tâm
bỏ tủa. Xác định đường khử trong dịch đường. Bảo quản lạnh.
Nồng độ
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
mg/ml
0
0,300
0,650
0,994
1,342
1,639
OD 540nm
1.8
1.6
y = 1.6664x - 0.0124 R² = 0.9993
1.4
1.2
1
Series1
0.8
Linear (Series1)
0.6
0.4
0.2
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
-0.2
Từ kết quả đường chuẩn glucose ta tính được lượng đường trong 1ml rỉ đường là
0,465g. Tính được lượng rỉ đường cần cho vào là 215,05 ml rỉ đường tương ứng
2
20% rỉ đường so với đầu tôm.
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC C: Kết quả đường kính tản nấm Aspergillus flavus của chitosan trên
môi trường PDA có bổ sung chitosan bằng phương pháp lên men lactic và chitosan
pH = 5,5
Nồng độ chitosan
4,0 g/l
ĐC
0,1 g/l
0,5 g/l
1,0 g/l
2,0 g/l
ĐK
tản
24,8±0,3
24,5±0,1
30,3±1,7
nấm (cm)
36,2±3,2
21,7±0,6
24,6±1,1
Mẫu
3NSC
chitosan
thương
ĐKtản
45,7 ± 0,3
40,7± 0,7
phẩm 1
nấm (cm)
68,9±1,0
44,2 ± 0,3
42,2 ± 0,2
41,7±0,3
7NSC
ĐK
tản
nấm (cm)
35,3±0,6
28,0±0,8
25,2±0,3
25,1±0,1
23,3±0,3
25,9±1,8
Mẫu
3NSC
chitosan
thương
ĐK
tản
39,9±
phẩm 2
nấm (cm)
69,4±1,0
45,2 ± 0,3 44,9 ± 0,1
40,8 ±0,8
40,5±0,5
0,12
7NSC
ĐKtản
nấm (cm)
Mẫu
39,6±1,7
45,3±0,5
34,2±0,3
31,5±0,5
35,2±2,3
39,2±1,2
chitosan
3NSC
lên men
ĐK
tản
sinh học
40,7± 0,7
nấm (cm)
68,9 ± 1,0 45,7 ± 0,2
45,1 ± 0,2
43,8 ± 0,8
41,7±0,3
7NSC
3
thương phẩm ở các nồng độ 0,1 g/l; 0,5 g/l; 1,0g/l; 2,0g/l; 4,0 g/l tại mức pH = 5,5
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC D: : Kết quả xử lý số liệu Statgraphics
D1. So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương
pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm
ANOVA Table for DDA by Mau chitosan
Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value
Squares Square
Between 14.4222 2 7.21111 146.50 0.0000
groups
Within 0.295334 6 0.0492224
groups
Total (Corr.) 14.7176 8
Method: 95.0 percent LSD
Mau Count Mean Homogeneous
chitosan Groups
X 3 94.785 1
2
X 3 97.435 3
7
X 3 97.504 2
2
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
1.48523E11 2
7.42614E1
627.92
0.0000
groups
0
4
ANOVA Table for MW by Mw.MAU
Within groups 7.09597E8
6
1.18266E8
Total (Corr.) 1.49232E11 8
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for MW by Mw.MAU
Mw.MAU Count Mean
Homogeneous
Groups
X
3
262027.
1
X
3
406441.
2
X
3
576350.
3
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
4.56995
2
2.28498
469.35
0.0000
groups
Within groups 0.0292101
0.00486835
6
Total (Corr.) 4.59916
8
ANOVA Table for do nhot by mau
Multiple Range Tests for do nhot by mau
mau Count Mean Homogeneous
Groups
3
1.02108 X
1
3
1.72431 X
2
3
2.75619 X
3
5
Method: 95.0 percent LSD
Đồ án tốt nghiệp
ANOVA Table for dohoatan by mau
Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value
Squares Square
Between 30.0361 2 15.0181 32.23 0.0006
groups
Within 2.79599 6 0.465999
groups
Total (Corr.) 32.8321 8
Multiple Range Tests for dohoatan by mau
mau Count Mean Homogeneous
Groups
2
3
87.6089 X
1
3
90.8922 X
3
3
91.8837 X
Method: 95.0 percent LSD
D2. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng ức chế nấm của mẫu
chitosan lên men sinh học và chitosan thương phẩm
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
83.3922
4
20.848
29.22
0.0000
groups
Within groups 7.13465
10 0.713465
Total (Corr.) 90.5268
14
6
ANOVA Table for %ucchenam tp1 by nong do
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for %ucchenam tp1 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
do
Groups
0.1
3
34.8459 X
0.5
3
36.2885 X
1
3
39.0784 X
2
3
39.7969 XX
4
3
41.2969 X
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
175.282
4
43.8205
111.36
0.0000
groups
Within groups 3.93498
10 0.393498
Total (Corr.) 179.217
14
ANOVA Table for %ucchenam tp2 by nong do
Multiple Range Tests for %ucchenam tp2 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
Groups
do
3
34.4666 X
0.1
3
35.2785 X
0.5
3
41.1926 X
1
3
41.6688 XX
2
7
Method: 95.0 percent LSD
4
3
42.4783 X
Đồ án tốt nghiệp
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
110.666
4
27.6666
31.71
0.0000
groups
Within groups 8.72382
10 0.872382
Total (Corr.) 119.39
14
ANOVA Table for % ucchenamthinghiem by nong do
Multiple Range Tests for % ucchenamthinghiem by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
do
Groups
0.1
3
33.6448 X
0.5
3
34.6122 X
1
3
37.1331 X
2
3
39.8881 X
4
3
40.4158 X
8
Method: 95.0 percent LSD
Đồ án tốt nghiệp
D2. So sánh nồng độ chitosan : 2,0g/l; 4,0g/l giữa chitosan lên men lactic và
mẫu chitosan thương phẩm lên khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus
Multiple Range Tests for %uchenam2gl by mau
mau Count Mean Homogeneous
Groups
1
3
39.7969 X
3
3
39.8881 X
2
3
41.6688 X
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
6.68278
2
3.34139
5.56
0.0430
groups
Within groups 3.60579
0.600966
6
8
Total (Corr.) 10.2886
ANOVA Table for %uchenam2gl by mau
Multiple Range Tests for %uchenam4gl by mau
mau Count Mean Homogeneous
Groups
3
40.4158 X
3
3
41.2969 XX
1
3
42.4783 X
2
9
Method: 95.0 percent LSD
Đồ án tốt nghiệp
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
6.42599
2
3.213
4.84
0.0561
groups
Within groups 3.98469
0.664115
6
Total (Corr.) 10.4107
8
ANOVA Table for %uchenam4gl by mau
D3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ,
khối lượng hạt của hạt đậu tương của mẫu lên men bằng phương pháp lên men
lactic và các mẫu chitosan thương phẩm
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
380.444
5
76.0889
9.51
0.0007
groups
Within groups 96.0
12 8.0
Total (Corr.) 476.444
17
ANOVA Table for ti le nay mamtp1 by nong do
Multiple Range Tests for ti le nay mamtp1 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
Groups
do
3
69.3333 X
0
3
73.3333 XX
0.1
3
74.6667 X
5
3
77.3333 XX
1.0
10
Method: 95.0 percent LSD
5.0
3
81.3333 XX
2.0
3
82.6667 X
Đồ án tốt nghiệp
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
10.825
5
2.165
144.33
0.0000
groups
Within groups 0.18
12 0.015
Total (Corr.) 11.005
17
ANOVA Table for cdai retp1 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
do
Groups
0
3
4.13333 X
0.1
3
4.26667 X
0.5
3
4.33333 X
1.0
3
4.83333 X
2.0
3
5.86667 X
5.0
3
6.06667 X
Multiple Range Tests for cdai retp1 by nong doMethod: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
0.0136764
5
0.00273529 21.47
0.0000
groups
Within groups 0.00152899 12 0.00012741
5
11
ANOVA Table for khoi luong hat tp1 by nong do
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for khoi luong hattp1 by nong do
nong
Count Mean
Homogeneous
Groups
do
X
0.1
3
0.29666
7
X
0.3
3
0
X
0.35
3
0.5
X
0.35333
3
2.0
3
X
0.36
3
1.0
0.36146 X
3
5.0
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
527.111
5
105.422
9.88
0.0006
groups
Within groups 128.0
12 10.6667
Total (Corr.) 655.111
17
ANOVA Table for tile nay mamtp2 by nong do
Multiple Range Tests for tile nay mamtp2 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
Groups
do
3
69.3333 X
0
XX
3
72.0
0.1
12
Method: 95.0 percent LSD
0.5
3
73.3333 XX
X
1.0
3
76.0
2.0
3
82.6667 X
X
5.0
3
84.0
Đồ án tốt nghiệp
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
20.7028
5
4.14056
63.16
0.0000
groups
Within groups 0.786667
12 0.0655556
Total (Corr.) 21.4894
17
ANOVA Table for cdai retp2 by nong do
Multiple Range Tests for cdai retp2 by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
Groups
do
4.13333 X
3
0
5.36667 X
3
0.1
X
5.9
3
0.5
X
6.2
3
1.0
7.16667 X
3
2.0
7.26667 X
3
5.0
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
13
ANOVA Table for khoi luong hattp2 by nong do
Between
0.0616906
5
0.0123381 66.93
0.0000
groups
Within groups 0.00221204 12 0.00018433
7
Total (Corr.) 0.0639026
17
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for khoi luong hattp2 by nong do
nong
Count Mean
Homogeneous
do
Groups
X
0
3
0.29161
2
X
0.1
3
0.29963
7
X
0.5
3
0.30625
7
X
1.0
3
0.39745
7
XX
5.0
3
0.41120
5
X
2.0
3
0.43347
6
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
522.667
5
104.533
14.70
0.0001
groups
14
ANOVA Table for tilenaymamthinghiem by nong do
Within groups 85.3333
12 7.11111
Total (Corr.) 608.0
17
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for tilenaymam by nong do
nong
Count Mean Homogeneous
do
Groups
0
3
66.6667 X
0.1
3
69.3333 X
0.5
3
74.6667 X
X
1.0
3
76.0
2.0
3
78.6667 XX
5.0
3
82.6667 X
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
0.0291208
5
0.00582416 41.92
0.0000
groups
Within groups 0.00166741 12 0.00013895
1
Total (Corr.) 0.0307882
17
15
ANOVA Table for khoi luong hatthinghiem by nong do
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for khoi luong hatthinghiem by nong do
nong
Count Mean
Homogeneous
do
Groups
X
0
3
0.30024
5
XX
0.5
3
0.31716
4
X
0.1
3
0.33143
8
X
1.0
3
0.33680
1
X
5.0
3
0.40305
6
X
2.0
3
0.40320
2
Method: 95.0 percent LSD
D4. So sánh nồng độ chitosan 2,0 g/l; 5,0 g/l giữa mẫu chitosan lên men và
mẫu chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt
của hạt đậu tương.
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
32.0
2
16.0
1.50
0.2963
groups
Within groups 64.0
10.6667
6
Total (Corr.) 96.0
8
16
ANOVA Table for %tilenaymam2g/l by mau
Đồ án tốt nghiệp
Multiple Range Tests for %tilenaymam2g/l by mau
Method: 95.0 percent LSD
mau Count Mean Homogeneous
Groups
X 3 3 78.666
7
X 2 3 82.666
7
X 1 3 82.666
7
ANOVA Table for %tilenaymam 5g/l by mau
Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value
Squares Square
Between 10.6667 2 5.33333 0.60 0.5787
groups
Within 53.3333 6 8.88889
groups
Total (Corr.) 64.0 8
Multiple Range Tests for %tilenaymam.5g/l by mau
Method: 95.0 percent LSD
mau Count Mean Homogeneous
Groups
X 1 3 81.333
17
3
Đồ án tốt nghiệp
X 3 3 82.666
7
X 2 3 84.0
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
2.88222
2
1.44111
54.04
0.0001
groups
Within groups 0.16
0.0266667
6
8
Total (Corr.) 3.04222
ANOVA Table for chieudaire2g/l by mau
Multiple Range Tests for chieudaire2g/l by mau
mau Count Mean Homogeneous
Groups
1
3
5.86667 X
3
3
6.93333 X
2
3
7.16667 X
Method: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
0.0083815
2
0.00419075 40.15
0.0003
groups
Within groups 0.000626208 6
0.00010436
8
Total (Corr.) 0.00900771 8
18
ANOVA Table for khoilluonghat2g/l by mau
Đồ án tốt nghiệp
mau Count Mean
Homogeneous
Groups
X
1
3
0.35333
3
X
3
3
0.40320
2
X
2
3
0.42649
2
Multiple Range Tests for khoilluonghat2g/l by mauMethod: 95.0 percent LSD
Source
Sum
of
Df Mean
F-Ratio
P-Value
Squares
Square
Between
0.00629455 2
0.00314727 7.02
0.0268
groups
Within groups 0.00268893 6
0.00044815
5
Total (Corr.) 0.00898348 8
ANOVA Table for khoiluonghat 5g/l by mau
mau Count Mean
Homogeneous
Groups
1
3
0.36146 X
XX
3
3
0.40305
6
X
2
3
0.42526
6
19
Multiple Range Tests for khoiluonghat 5g/l by mauMethod: 95.0 percent LSD
