Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng

dẫn khoa học của ThS. Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm –

Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh.

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt

nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt

nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về đồ án tốt

nghiệp của mình.

TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Võ Phương Huỳnh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy

ThS. Huỳnh Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực

hiện đồ án tốt nghiệp.

Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học

– Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức trong thời gian dài học tập.

Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp em thực hiện tốt đồ án tốt

nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này.

Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, Ba Mẹ đã luôn động viên, chăm sóc và là

chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt những năm qua.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Lê Trần Ánh Tuyết, cùng các

bạn lớp 10DSH, những người luôn động viên và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt

đồ án tốt nghiệp này.

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời

gian đọc và nhận xét đồ án này.

TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Võ Phương Huỳnh

Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2

3. Nhiệm vụ nghiên cứu............................................................................................... 2

4. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 3

5. Các kết quả đạt được của đề tài ................................................................................ 4

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ...................................................................................... 4

1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans........................................ 4

1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................................ 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 4

1.1.3. Đặc điểm sinh lý ................................................................................................ 5

1.1.4. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................................. 5

1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn A. xylosoxidans .......................................................... 6

1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S ............................................... 9

1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn A. xylosoxidans ................................................11

1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy ...................................................................11

1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green .........................................................11

1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans ........................................12

1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate .........................................................................12

1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho quá trình phản nitrate của vi khuẩn A.

xylosoxidans ...............................................................................................................15

1.2. Tổng quan về nƣớc thải chế biến thủy sản .......................................................17

i

1.2.1. Nước thải chế biến thủy sản ..............................................................................17

Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản ....................................................19

1.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học ..............................................................................21

1.4. Tổng quan về mô hình xử lý nƣớc thải MBBR.................................................22

1.4.1. Nguyên tắc hoạt động .......................................................................................22

1.4.2. Hoạt động của giá thể .......................................................................................23

1.4.3. Ưu điểm của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp MBBR ....................24

CHƢƠNG II:VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .........................................................25

2.1. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất .............................................................................25

2.1.1. Vật liệu .............................................................................................................25

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ...............................................................................................25

2.1.2.1. Thiết bị ..........................................................................................................25

2.1.2.2. Dụng cụ .........................................................................................................25

2.1.3. Hóa chất ...........................................................................................................26

2.1.3.1. Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát ................................26

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng ...........................................................................................27

2.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................27

2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................29

2.3.1. Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ..................................29

2.3.2. Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ....................................29

2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ KIT API 20 NE ...................29

2.3.4. Khảo sát sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nước

thải và môi trường Giltay cải tiến ...............................................................................29

2.3.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nước thải giàu

nitrate .........................................................................................................................30

2.3.6. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước thải

giàu nitrate .................................................................................................................31

ii

2.3.7. Tiến hành thực hiện mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm ...................32

Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp phân tích .....................................................................................34

2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................................34

2.4.1.1. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate .........................................................34

2.4.1.2. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite ..........................................................36

-, N-NH4

2.4.2. Phương pháp định lượng N-NO3

2.4.2.1. Phương pháp định lượng N-NO3

2.4.2.2. Phương pháp định lượng N-NO2

2.4.1.3. Phương pháp dựng đường chuẩn amoni .........................................................37 + ..........................................38 -, N-NO2 - ...................................................................38 - ...................................................................39 + ...................................................................39 2.4.2.3. Phương pháp định lượng N-NH4

2.4.3. Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ

KIT API 20 NE ..........................................................................................................40

2.4.3.1. Chuẩn bị ........................................................................................................40

2.4.3.2. Phương pháp ..................................................................................................41

2.4.3.3. Cách đọc kết quả ............................................................................................43

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................46

3.1. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ KIT API 20

NE ..............................................................................................................................46

3.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn ...............................................................................49

3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn nitrate ....................................................................49

3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn nitrite .....................................................................50

3.2.3. Kết quả dựng đường chuẩn amoni.....................................................................52

3.3. Sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải

và môi trƣờng Giltay cải tiến ...................................................................................53

3.4. Mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate

...................................................................................................................................56

3.5. Thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nƣớc thải giàu

iii

nitrate ......................................................................................................................58

Đồ án tốt nghiệp 3.6. Khảo sát mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm .................................62

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................65

4.1. Kết luận ..............................................................................................................65

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................67

iv

PHỤ LỤC

Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A. xylosoxidans Achromobacter xylosoxidans

C Cacbon

C/N Tỷ lệ cacbon trên nitơ

COD Nhu cầu oxy hóa học

MBBR Mô hình xử lý nước thải giá thể lơ lửng

v

N Nitơ

Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans ......................................... 6

Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hòa và khử nitrate dị hóa trong chu trình nitơ của vi khuẩn

...................................................................................................................................13

Bảng 1.3. Thành phần nước thải chế biến thủy sản .....................................................19

Bảng 2.1. Các thông số mô hình MBBR xây dựng từ thí nghiệm ................................32

Bảng 2.2. Trình tự tiến hành dựng đưởng chuẩn nitrate ..............................................35

Bảng 2.3. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrite ...............................................37

Bảng 2.4. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn amoni ..............................................38

Bảng 2.5. Các mức Mc Farland ..................................................................................40

Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn A.xylosoxidans ...................48

Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrate ............................................49

Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrite ............................................51

vi

Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn amoni ............................................52

Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn A. xylosoxidans ......................................... 5

Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn A. xylosoxidans ..................................... 8

Hình 1.3. Kết quả giải trình tự gene 16S .....................................................................10

Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank ........................................10

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của malachite green .......................................................11

Hình 1.6. Sơ đồ công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh

học hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng ........................................................................20

Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm ..............................................................28

Hình 2.2. Mô hình bioreactor có giá thể bám dính ......................................................34

Hình 2.3. Các mức Mc Farland ...................................................................................41

Hình 2.4. Bộ KIT API 20 NE và thuốc thử .................................................................41

Hình 2.5. So sánh độ đục của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước muối sinh lý với

mức Mc Farland 0,5 ...................................................................................................42

Hình 2.6. API AUX MEDIUM sau khi cho 200 µl huyền phù vào .............................42

Hình 2.7. Bộ KIT API 20 NE sau khi bơm dịch ..........................................................43

Hình 2.8. Mẫu so sánh kết quả của bộ KIT API 20 NE ...............................................45

Hình 3.1. Kết quả bộ KIT sau 24 giờ ..........................................................................46

Hình 3.2. Kết quả bộ KIT sau 48 giờ ..........................................................................47

Hình 3.3. Kết quả so sánh trên API WEB ...................................................................49

Hình 3.4. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate ....................................50

Hình 3.5. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite .....................................51

Hình 3.6. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni ....................................53

Hình 3.7. Mật độ quang của vi khuẩn .........................................................................54

Hình 3.8. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ..............................................................55

Hình 3.9. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A.xylosoxidans theo

vii

mật độ ........................................................................................................................57

Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................57

Hình 3.11. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo

thời gian .....................................................................................................................59

Hình 3.12. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................60

Hình 3.13. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo

thời gian .....................................................................................................................62

viii

Hình 3.14. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................63

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngành công nghiệp chế biến thủy sản là một ngành kinh tế mũi nhọn đi đầu

trong hội nhập kinh tế quốc tế. Bên cạnh những thành quả đạt được về kinh tế - xã hội,

ngành công nghiệp này cũng gây ra những vấn đề môi trường đáng lo ngại như gây ô

nhiễm không khí, ô nhiễm chất thải rắn,… và nghiêm trọng hơn nữa là ô nhiễm nguồn

nước.

Nước thải chế biến thủy sản chứa thành phần ô nhiễm hữu cơ như COD, BOD

và hàm lượng nitrate khá cao. Với các phương pháp xử lý nước thải hiện nay như

phương pháp xử lý hóa lý, phương pháp xử lý hóa học,… có thể xử lý hiệu quả được

COD và BOD nhưng vẫn chưa xử lý triệt để được nguồn nitrate tồn đọng trong nước

thải.

Hiện nay, các phương pháp xử lý nước thải ngày càng đi sâu vào áp dụng các

phương pháp sinh học. Đối với nước thải chế biến thủy sản, việc áp dụng phương pháp

xử lý sinh học rất thích hợp vì có hàm lượng chất hữu cơ cao, dễ phân hủy sinh học bởi

vi khuẩn. So với các phương pháp xử lý hóa lý, hóa học thì phương pháp xử lý sinh

học tiết kiệm hơn về quy mô cũng như giá thành đầu tư. Đặc biệt phương pháp xử lý

sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường – một nhược điểm mà phương pháp xử

lý hóa học hay mắc phải. Do đó, để xử lý được nguồn nitrate tồn đọng cần áp dụng các

phương pháp xử lý sinh học, ứng dụng các chủng vi khuẩn phản nitrate vào quy trình

xử lý để đạt hiệu quả xử lý cao hơn.

Trước tình hình trên, được sự cho phép của khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trường, tác giả thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn

phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nƣớc thải chế biến thủy sản

1

giàu nitrate”.

Đồ án tốt nghiệp

2. Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý nitrate của chủng vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate.

Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý

nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter

xylosoxidans.

Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo sự

phối trộn giữa tỷ lệ nước thải chế biến thủy sản : tỷ lệ môi trường Giltay cải tiến.

Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ

sung vào nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate.

Khảo sát thời gian xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter

xylosoxidans trong nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate.

Chạy mô hình MBBR phản nitrate quy mô phòng thí nghiệm.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phương pháp tổng hợp tài liệu:

- Thu thập, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan

đến đề tài.

- Lựa chọn, tổng hợp các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

- Sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate.

- Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn phản nitrate bằng bộ KIT

API 20 NE.

- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và khả năng phản

2

nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải

Đồ án tốt nghiệp chế biến thủy sản như thời gian, mật độ tế bào vi khuẩn, tỷ lệ môi trường

thích hợp để đạt hiệu quả xử lý nitrate cao và không tích lũy nitrite cũng

như phát sinh amoni.

- Dựa trên các thông số thí nghiệm tiến hành chạy mô hình xử lý nước thải

chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm.

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

- Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.

- Xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu

sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với

mức ý nghĩa 0,05.

5. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài

Tìm ra được tỷ lệ phối trộn, mật độ và thời gian xử lý thích hợp của vi khuẩn

phản nitrate Achromobacter xylosoxindans để ứng dụng vào xử lý nước thải chế biến

3

thủy sản giàu nitrate quy mô phòng thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate Achromobacter Xylosoxidans

1.1.1. Giới thiệu chung

Achromobacter xylosoxidans là vi khuẩn Gram (-), gần giống với chủng

Alcaligenes, có khả năng phản nitrate theo con đường dị hóa trong điều kiện yếm khí

(anaerobic) cho sản phẩm cuối cùng là N2, tương tự như Pseudomonas stutzeri,

Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Thiobacillus denitrificans và

Thiosphera pantotropha.

Phân loại vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans:

Giới: Vi khuẩn

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Beta Proteobacteria

Bộ: Burkhol deriales

Họ: Alcaligenaceae

Chi: Achromobacter

Loài: Achromobacter xylosoxidans

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans là:

- Vi khuẩn Gram âm (-)

- Hình que.

- Kích thước 0.4 x 0.7 – 1.0µm.

4

- Có tiên mao.

Đồ án tốt nghiệp

Gram (-) Tiên mao

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

1.1.3. Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn Achromobacter xylososidans là:

- Vi khuẩn kỵ khí tùy nghi.

- Có khả năng di động.

- Không sinh nội bào tử.

1.1.4. Đặc điểm sinh hóa

Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được thể hiện

5

trong bảng 1.1.

Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans

STT Thử nghiệm Kết quả

1 Catalase (+)

2 O/F O+/F-

3 Oxidase (+)

4 MR (-)

5 VP (-)

6 Indol (+)

7 Tạo màng biofilm (+)

1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được phân lập từ:

- Nguồn nước thải giàu nitơ như nước thải chế biến thủy sản, nước thải

chăn nuôi,…

- Nguồn nước thải nhiễm 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT).

Quy trình phân lập chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans từ nguồn nước

6

thải chế biến thủy sản được thể hiện ở hình 1.2 (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012).

Đồ án tốt nghiệp

-

Nước thải chế biến thủy sản

- tạo

Tăng sinh trong môi trường Giltay NO3

-

Định tính NO2 Quan sát MT đục, sinh khí thành Định tính khử NO3

-

Chọn ống tăng sinh đục, sinh khí, khử nitrate

Phân lập trên môi trường thạch Giltay NO3

-

Chọn ra chủng vi khuẩn thuần khiết

+

-

Tăng sinh trong môi trường Giltay NO2

+

Quan sát MT đục, sinh khí Định tính NH4 tạo thành Định tính khử NO2

7

Chọn chủng khử nitrite, sinh ít NH4

Đồ án tốt nghiệp

Test O/F và các test sinh hóa khác

-

Chọn chủng không lên men glucose

Khảo sát khả năng khử N-NO2

+

-, NO2

-, NH4

+, sinh khí,

Định tính, định lượng Xác định thể tích khí sinh ra Xác định pH môi trường NO3

-, sinh ít NH4

-

Chọn chủng khử NO3 tăng pH

Khảo sát khả năng khử N-NO3

- cao, + sinh ra ít

-, nồng độ NH4

Chọn chủng có hiệu suất xử lý N-NO3 không tích lũy N-NO2

(Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012)

8

Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans

Đồ án tốt nghiệp Mẫu nước thải được pha loãng bằng nước muối sinh lý (0,85%). Sau đó được

tăng sinh trên môi trường Giltay có chứa nguồn C là acid citric, N là KNO3 và một số

chất quan trọng khác. Dấu hiệu nhận biết sự phát triển của vi khuẩn khử nitrate là có

sinh khí trong ống durham, đục môi trường và pH môi trường giảm.

Từ các ống dương tính khử nitrate, thực hiện cấy ria sang môi trường thạch - (agar 2% - 2,5). Các khuẩn lạc riêng rẽ được tiến hành cấy ria nhiều lần Giltay NO3

trên môi trường Giltay thạch cho đến khi thu được các chủng vi khuẩn thuần khiết.

Tiến hành các test sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phản nitrate phân lập được và

khảo sát khả năng khử nitrate, nitrite của chủng vi khuẩn phân lập.

1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S

Kết quả định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết,

2013) và tra cứu trong hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey cho thấy đây là vi

khuẩn phản nitrate tiềm năng và thuộc mức độ an toàn sinh học loại 2 (Busse, HJ và

cộng sự, 2006).

Ngoài ra, vi khuẩn này cũng thể hiện nhiều khả năng sử dụng nhiều nguồn năng

lượng hữu cơ khác nhau. Đây là vi khuẩn được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới để

phân hủy các hợp chất xenobiotic như endosulfan (Li W và cộng sự, 2009), chrysene

(Chirag M và cộng sự, 2011), estradiol (Iasur-Kruh L và cộng sự, 2011), hợp chất

9

phenol (Ho YN và cộng sự , 2012), thuốc nhuộm (Manikandan N và cộng sự , 2012).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Kết quả giải trình tự chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

10

Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank

Đồ án tốt nghiệp

1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng phân hủy một số hợp chất

như PAHs, 2,4,6-tribromophenol, p-nitrophenol… (Niansheng Wan và cộng sự, 2007).

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans sử dụng p-nitrophenol như nguồn

carbon, nitơ và năng lượng duy nhất, phân hủy hoàn toàn sau 7 ngày ở điều kiện hiếu

khí (Niansheng Wan và cộng sự, 2007).

Ngoài ra, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans còn có khả năng phân hủy hợp

chất 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT) là chất có độc tính cao đối với nhiều sinh vật (Đặng

Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2009). Đối với con người, TNT được biết đến là chất gây ung

thư nhóm C, gây hỏng gan, rồi loạn chức năng cơ thể dẫn đến các bệnh về đường tiêu

hóa và hô hấp. Chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng sử dụng TNT

như nguồn nitrogen và sử dụng làm năng lượng cho quá trình sinh trưởng (Esteve và

cộng sự, 2001). Các enzyme nội bào và ngoại bào của vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans đóng vai trò quan trọng, tham gia vào quá trình phân hủy sinh học TNT.

1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green

Malachite green có tên hóa học là triphenylmetan.

Danh pháp quốc tế: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl methyl]-N, N-

dimethyl-aniline.

Công thức phân tử: C23H25ClN2

Công thức cấu tạo:

11

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của malachite green

Đồ án tốt nghiệp Malachite green thường được biết đến như một loại phẩm nhuộm màu xanh.

Ngoài ra malachite green còn được sử dụng như chất sát trùng, diệt nấm, dùng để sát

trùng ao hồ,…

Khi bị hấp thụ vào trong cơ thể dưới cơ chế tác động của cơ thể malachite green

sẽ bị biến đổi thành hai dạng quan trọng. Dạng thứ nhất là Carbinol, dạng này che phủ

tế bào rất nhanh. Khi vào bên trong tế bào Carbinol sẽ kết hợp với quá trình trao đổi

chất và biến thành dạng Leuco malachite green (LMG). Dạng này có độc tính và tồn tại

trong cơ thể lâu hơn so với dạng phẩm nhuộm malachite green.

Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng malachite green có độc tính cao đối với

những loài cá nước ngọt, ở cả tình trạng cấp tính và mãn tính (Steffens và cộng sự.,

1961). Malachite green cũng là một chất độc đối với đường hô hấp (Werth, 1985).

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng xử lý rất mạnh màu của

malachite green. Tỷ lệ xử lý khoảng 86% trong khoảng một giờ khi nồng độ của

malachite green là 2000 mg/L.

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng tẩy màu của malachite

green là nhờ các enzyme nội bào và enzyme ngoại bào. Kết quả kỹ thuật PCR cho thấy

vi khuẩn có khả năng phân hủy malachite có chứa một gene triphenylmethane TMR.

Để kiểm tra khả năng xử lý màu của chủng vi khuẩn, thí nghiệm kiểm tra tiến

hành bổ sung 100 mg/l thuốc nhuộm và tỷ lệ cấy giống là 5%. Điều chỉnh pH về 7, ủ ở nhiệt độ 370C trong khoảng 48 giờ. Sự khử màu được theo dõi bằng cách đo OD của

sinh khối tế bào ở bước sóng 538 nm.

1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate

Tìm hiểu sâu về cơ chế khử nitrate, thì vi khuẩn có thể thực hiện hai quá trình

khử nitrate theo hai mục đích khác nhau (Bảng 1.2).

- Tổng hợp năng lượng nhờ quá trình hô hấp kỵ khí mà nitrate là chất nhận

12

điện tử cuối cùng, gọi là khử nitrate dị hóa.

- thành NH4

Đồ án tốt nghiệp + để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, gọi là khử - Chuyển hóa NO3

nitrate đồng hóa.

Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa trong chu trình N của vi khuẩn

Khử nitrate dị hóa Khử nitrate đồng hóa

Đồng hóa Amoni hóa Phản nitrate (sinh tổng hợp các hợp chất (khử độc tế bào) chứa nitơ)

-

-

Khử nitrate đồng hóa Khử nitrate hô hấp

- → NO2

- → NO2

NO3 NO3

(khử tiếp) (giải phóng nitrite hoặc khử tiếp)

Khử nitrite hô hấp thành

+

+

- → NO →N2O

nitrite oxide rồi nitrous Amoni hóa làm giảm nitrite - → NH4 NO2 oxide Khử nitrite đồng hóa - → NH4 NO2 (giải phóng amoni) (đồng hóa amoni) NO2

(sinh khí)

Hô hấp khử N2O thành nitơ

N2O → N2

(sinh khí)

13

(Nguồn: Zumft WG., 1997)

Đồ án tốt nghiệp - Khử nitrate dị hóa

Sau khi khử nitrate dị hóa thành nitrite qua hô hấp kị khí, có thể xảy ra đồng

thời hai quá trình khử nitrite :

- → NO (k) → N2O (k) và cuối cùng

Phản nitrate: nhánh thứ nhất khử tiếp NO2

tạo ra N2.

Khử nitrate dị hóa amoni hóa: quá trình này còn được gọi là quá trình khử độc

tế bào.

+ là nguồn N cho quá

- Khử nitrate đồng hóa

Khử nitrate đồng hóa được diễn ra với mục đích tạo ra NH4

trình tổng hợp tế bào của vi khuẩn. Enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa nitrite thành

+) và amoniac (NH3) là NirA do gen nirA và NasB do gene nasB mã hóa.

amoni (NH4

Cả hai cơ chế khử nitrate dị hóa và khử nitrate đồng hóa, bước đầu đều khử

nitrate về nitrite nhưng enzyme xúc tác là khác nhau. Ở khử nitrate đồng hóa enzyme

xúc tác do gene nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hóa là do gene nar/nap mã hóa.

Như vậy, trong quá trình phản nitrate chỉ có quá trình khử nitrate dị hóa – hô

hấp nitrate kị khí mới có ý nghĩa xử lý N trong nước thải. Đó là cơ sở để tiến hành

phân lập chủng vi khuẩn mong muốn. Nghĩa là chủng vi khuẩn đó có khả năng khử

nitrate và khử nitrite hoàn toàn, tạo thành khí N2 và không hoặc ít tạo ra amoni +).Vì nếu lượng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì việc ứng dụng vi khuẩn (NH4

đó vào xử lý nước thải không còn ý nghĩa, ngược lại còn làm cho nước ô nhiễm

14

nghiêm trọng hơn.

Đồ án tốt nghiệp 1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho quá trình phản nitrate của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans

 Ảnh hưởng của oxy lên khả năng tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi

khuẩn Achromobacter xylosoxidans

Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được tăng sinh trong điều kiện hiếu khí

để tăng mật độ vi khuẩn và xử lý nitrate trong điều kiện thiếu khí kết hợp với giá thể

bám dính.

Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) cho thấy trong điều kiện hiếu khí khả

năng tăng trưởng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tốt hơn so với điều kiện

thiếu khí. Do đó, sinh khối nên được tăng sinh riêng và tăng cường cho hệ thống xử lý

để việc ứng dụng vi khuẩn khử nitrate hiệu quả hơn.

 Nguồn cacbon thích hợp cho khả năng phản nitrate của vi khuẩn

Achromobacter xylosixidan

Trong xử lý loại bỏ nitơ trong nước thải, nếu quá trình phản nitrate tiến hành

trước quá trình xử lý hiếu khí (tiền phản nitrate - pre-denitrification treatment), thì

nguồn năng lượng và C cho vi khuẩn phản nitrate chính là nguồn carbon hữu cơ trong

nước thải. Tuy nhiên, nếu thực hiện công nghệ hậu phản nitrate (post-denitrification),

COD nước thải đã giảm phần lớn sau quá trình bùn hoạt tính, không còn đủ cung cấp

cho vi khuẩn phản nitrate. Khi ấy một nguồn carbon bên ngoài cần được bổ sung.

Trước đây, methanol thường được bổ sung đóng vai trò này, nhưng sau này các nguồn

hữu cơ khác đã được nghiên cứu, trong đó theo nhiều tài liệu, acetate là nguồn C thích

hợp hơn cả (Huỳnh Văn Thành, 2013).

Khảo sát các môi trường để tìm ra môi trường chứa nguồn cacbon thích hợp cho

sự tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans đã

chọn ra được môi trường thích hợp là môi trường Giltay được thay thế asparagines

15

bằng pepton, citrate được thay thế bằng acetate. Môi trường này có nguồn C và N thích

Đồ án tốt nghiệp hợp cho chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans phát triển. (Lê Trần Ánh Tuyết,

2013).

 Ảnh hưởng của tỷ lệ C/N đến khả năng phản nitrate của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans

Trong quá trình phản nitrate, dù trong công nghệ tiền phản nitrate hay hậu phản

nitrate thì tỉ lệ C/N cũng được quan tâm, C là nguồn năng lượng và N là tải trọng N- -. Tỉ lệ C/N thích hợp bảo đảm năng lượng đầu vào cho vi khuẩn phản nitrate cung NO3

cấp cho chuỗi hô hấp khử hoàn toàn nitrate.

Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) sau khi xử lý cho thấy không có sự

khác biệt giữa các tỷ lệ C/N, điều này cho thấy nếu áp dụng công nghệ tiền phản nitrate

thì tỉ lệ C/N cao đến 18 không ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý, trong khi đó nếu áp dụng

công nghệ hậu phản nitrate thì tỉ lệ C/N = 4 chưa phải là tỉ lệ thấp nhất. Như vậy có thể

cung cấp năng lượng cho vi khuẩn ít hơn nữa để chuyển hóa hoàn toàn nitrate.

 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng phản nitrate của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans

Nước thải chế biến thủy sản thường chứa nồng độ muối cao.

Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans có thể tăng trưởng và chuyển hóa nitrate trong điều kiện môi trường có

muối và nồng độ muối có thể chịu đựng được là 3%.

 Ảnh hưởng của giá thể và sinh khối vi khuẩn ban đầu đến khả năng phản nitrate

của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) thì mô hình có giá thể không chứa

muối, hiệu quả xử lý dễ dàng đạt 100% sau 24 giờ.

Để tăng cường sinh học luôn phải kiểm soát nồng độ vi khuẩn ban đầu sau khi

bổ sung sinh khối vào môi trường, nhất là trong điều kiện thiếu khí khả năng tăng

trưởng của vi khuẩn hạn chế. Tuy nhiên nếu nồng độ vi khuẩn quá cao sẽ dẫn đến giá

16

thành xử lý cao.

Đồ án tốt nghiệp Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) ở nồng độ 108 cfu/ml cho hiệu quả xử

lý cao nhất (99%) sau 36 giờ xử lý.

1.2. Tổng quan về nƣớc thải chế biến thủy sản

1.2.1. Nước thải chế biến thủy sản

Ngành chế biến thủy sản là một trong những ngành gây ô nhiễm nghiêm trọng

đến môi trường. Ảnh hưởng của ngành chế biến thủy sản đến môi trường không chỉ

phụ thuộc vào loại hình chế biến, mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như quy mô

sản xuất, nguyên liệu đầu vào, mùa vụ, trình độ kỹ thuật, công nghệ và tổ chức quản lý

sản xuất,…

Một số tác động đặc trưng của ngành chế biến thủy sản gây ảnh hưởng đến môi

trường:

- Ô nhiễm không khí: mùi hôi phát sinh từ việc lưu trữ các phế thải trong quá trình

sản xuất. Khí thải Clo sinh ra trong quá trình khử trùng thiết bị, nhà xưởng chế

biến và khử trùng nguyên liệu. Khí thải từ các máy phát điện dự phòng. Trong

các nguồn ô nhiễm không khí, mùi là vấn đề chính đối với các nhà máy chế biến

thủy sản.

- Chất thải rắn: phát sinh chủ yếu từ quá trình chế biến, bao gồm các loại đầu vỏ

tôm, vỏ nghêu, da/mai mực, nội tạng mực và cá,…

- Chất thải lỏng nước thải sản xuất trong chế biến thủy sản chiếm 85 – 90% tổng

lượng nước thải. Chủ yếu phát sinh từ các công đoạn: rửa trong xử lý nguyên

liệu, chế biến, vệ sinh nhà xưởng, dụng cụ, thiết bị và nước thải sinh hoạt.

Trong các nguồn ô nhiễm, nước thải là nguồn gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi

trường bởi phát sinh thể tích nước thải lớn với nồng độ ô nhiễm cao nếu không được

xử lý thích hợp.

Nước thải chế biến thủy sản chứa các phần lớn các chất thải hữu cơ có nguồn

gốc từ động vật và có thành phần chủ yếu là protein và chất béo. Trong hai thành phần

17

này, chất béo khó bị phân hủy bởi vi sinh vật.

Đồ án tốt nghiệp Trong nước thải chứa các chất như carbon hydrate, protein, chất béo,… khi thải

vào nguồn nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử

dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ. Nồng độ oxy hòa tan giảm không

những gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của

nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp.

Các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, hạn chế độ sâu tầng nước

được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của tảo, rong

rêu,…

Nồng độ các chất nitơ, photpho cao gây nên hiện tượng bùng phát các loại tảo,

đến mức độ giới hạn tảo sẽ chết và phân hủy gây nên hiện tượng thiếu oxy. Nếu nồng

độ oxy giảm đến 0 sẽ gây ra hiện tượng thủy vực chết, ảnh hưởng đến chất lượng nước

của thủy vực. Ngoài ra các loại tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng khiến cho

bên dưới không có ánh sáng. Quá trình quang hợp của thực vật tầng dưới bị ngưng trệ.

Tất cả các hiện tượng trên gây tác động xấu đến chất lượng nước, ảnh hưởng tới hệ

thủy sinh, nghề nuôi trồng thủy sản, du lịch và cấp nước.

Tùy thuộc vào loại hình và trình độ công nghệ chế biến, đặc tính nguyên liệu và

yêu cầu về chất lượng sản phẩm mà nước thải từ các nguồn phát sinh có sự khác biệt về

thành phần, tính chất cũng như lưu lượng.

Thành phần của nước thải của một số loại hình chế biến thủy sản được thể hiện

18

trong bảng 1.3.

Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Thành phần nước thải chế biến thủy sản

Nồng độ

Thủy sản Chỉ tiêu Đơn vị Cá da trơn Tôm lạnh đông lạnh (Tra –Basa) hỗn hợp

pH - 6,5 – 9 6,5 – 7 5,5 – 9

SS mg/l 100 – 300 500 – 1200 50 – 194

COD 800 – 2000 800 – 2500 694 – 2070 mgO2/l

500 – 1500 500 – 1500 391 – 1539 BOD5 mgO2/l

mg/l 50 – 200 100 – 300 30 – 100 NTổng

mg/l 10 – 120 50 – 100 3 – 50 PTổng

mg/l Dầu và mỡ - 250 – 830 2,4 – 100

(Nguồn: Tổng cục môi trường, 2009)

1.2.2. Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản

Theo Viện nghiên cứu hải sản, hiện nay cả nước ta có 1015 cơ sở chế biến thủy

sản quy mô lớn nhỏ khác nhau. Phần lớn những nhà máy và cơ sở chế biến thủy sản ở

Việt Nam có quy mô vừa và nhỏ. Trang thiết bị và công nghệ được đánh giá là nhanh

chóng đáp ứng so với những trang thiết bị và công nghệ của những ngành công nghiệp

khác. Tuy nhiên, vẫn chậm đáp ứng nếu so sánh với trang thiết bị và công nghệ của

những quốc gia khác.

Mặc dù những nhà máy và cơ sở sản xuất đã quan tâm đến vấn đề bảo vệ môi

trường, đã thiết lập các trạm xử lý nước thải nhưng hoạt động của các trạm này còn

kém hiệu quả, không theo quy cách. Hệ thống xử lý nước thải còn chưa được hoàn

chỉnh, chất thải nguy hại tồn đọng ngày càng nhiều gây ảnh hưởng đến con người và hệ

19

sinh thái.

Đồ án tốt nghiệp Hiện nay, công nghệ xử lý nước thải đang được áp dụng phổ biến ở các nhà

máy và cơ sở chế biến thủy sản là công nghệ sinh học hiếu khí bùn hoạt tính lơ lửng

(Nguyễn Thế Đồng, 2011). Sơ đồ công nghệ bùn hoạt tính hiếu khí lơ lửng thể hiện

trong hình 1.6.

Nước thải Bể điều hòa Ngăn thu gom Song chắn rác

Bùn hoạt tính hiếu khí Bể khử trùng Bể lắng

Bể chứa bùn Nguồn tiếp nhận Tuần hoàn bùn

Bùn thải

(Nguồn: Tổng cục môi trường, 2011)

Hình 1.6. Sơ đồ công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh học

hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng

Từ hình 1.6 cho thấy công nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản trên chủ yếu

giảm COD, BOD và xảy ra quá trình amoni hóa, nitrate hóa nên nước thải đầu ra chứa

hàm lượng nitrate cao. Để khắc phục nhược điểm của công nghệ trên nên áp dụng

phương pháp xử lý sinh học, sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate để xử lý lượng

nitrate và nitrite còn tồn đọng trong nước thải.

1.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học

Nhìn chung, nước thải chế biến thủy sản thường có các thành phần ô nhiễm

vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Trong khi đó, lưu lượng nước thải tính trên một đơn vị sản phẩm cũng khá lớn, thường từ 30 – 80m3 cho một tấn thành phẩm.

20

(Lâm Minh Triết và cộng sự, 2004).

Đồ án tốt nghiệp Xây dựng hệ thống xử lý nước thải hoàn chỉnh cho bất cứ nhà máy hay cơ sở

chế biến thủy sản nào đều không đơn giản, đòi hỏi kinh phí thực hiện cũng như diện

tích xây dựng khá lớn. Điều này chính là rào cản cho việc đầu tư xử lý nước thải của

các nhà máy và cơ sở chế biến thủy sản. Vì vậy, việc áp dụng, lựa chọn các phương

pháp hợp lý để xử lý nguồn nước thải là vấn đề cấp thiết. Hiện nay, công nghệ xử lý

nước thải ngày càng chú trọng vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp công

nghệ sinh học cũng đã chứng minh hiệu quả triệt để, hơn hẳn những phương pháp xử lý

khác.

Trong nhiều phương pháp xử lý ô nhiễm, phương pháp sinh học được đặc biệt

quan tâm sử dụng. So với các phương pháp xử lý hóa lý, hóa học thì phương pháp xử

lý sinh học tiết kiệm hơn về quy mô cũng như giá thành đầu tư. Đặc biệt phương pháp

xử lý sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường – một nhược điểm mà phương

pháp xử lý hóa học thường mắc phải.

Phương pháp xử lý sinh học sử dụng một đặc điểm rất quý của vi sinh vật, đặc

điểm đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất là khả năng đồng

hóa được rất nhiều nguồn cơ chất khác nhau của vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, lipid,

đến các kim loại nặng như chì, thủy ngân,… Bản chất của phương pháp này là dựa trên

hoạt động sống của vi sinh vật (sử dụng các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng có

trong nước thải làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng) để biến đổi các hợp chất hữu cơ

cao phân tử có trong nước thải thành các hợp chất đơn giản hơn. Trong quá trình dinh

dưỡng này vi sinh vật sẽ nhận được các chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, sinh

trưởng và sinh sản, nên sinh khối được tăng lên.

Phương pháp xử lý sinh học để xử lý nước thải có thể làm sạch hoàn toàn các

loại nước thải công nghiệp chứa các loại chất bẩn hòa tan hoặc phân tán nhỏ. Do vậy,

phương pháp này thường dùng sau khi loại bỏ các tạp chất phân tán thô ra khỏi chất

21

thải.

Đồ án tốt nghiệp

1.4. Tổng quan về mô hình xử lý nƣớc thải MBBR

1.4.1. Nguyên tắc hoạt động

MBBR là từ viết tắt của cụm Moving Bed Biofilm Reactor, được mô tả một

cách dễ hiểu là quá trình xử lý nhân tạo trong đó sử dụng các vật làm giá thể cho vi

sinh dính bám vào để sinh trưởng và phát triển, là sự kết hợp giữa Aerotank truyền

thống và lọc sinh học hiếu khí.

Công nghệ MBBR là công nghệ kết hợp giữa các điều kiện thuận lợi của quá

trình xử lý bùn hoạt tính hiếu khí và bể lọc sinh học. Bể MBBR hoạt động giống như

quá trình xử lý bùn hoạt tính hiếu khí trong toàn bộ thể tích bể. Đây là quá trình xử lý

bằng lớp màng biofilm với sinh khối phát triển trên giá thể mà những giá thể này lại di

chuyển tự do trong bể phản ứng và được giữ bên trong bể phản ứng. Bể MBBR không

cần quá trình tuần hoàn bùn giống như các phương pháp xử lý bằng màng biofilm

khác, vì vậy nó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý bằng phương pháp bùn hoạt

tính trong bể, bởi vì sinh khối ngày càng được tạo ra trong quá trình xử lý.

Công nghệ MBBR là công nghệ mới nhất hiện nay trong lĩnh vực xử lý nước

thải vì tiết kiệm được diện tích và hiệu quả xử lý cao. Vật liệu làm giá thể phải có tỷ

trọng nhẹ hơn nước đảm bảo điều kiện lơ lửng. Các giá thể này luôn chuyển động

không ngừng trong toàn thể tích bể nhờ các thiết bị thổi khí và cánh khuấy. Qua đó thì

mật độ vi sinh ngày càng gia tăng, hiệu quả xử lý ngày càng cao.

Tương tự Aerotank truyền thống, bể MBBR hiếu khí cũng có một MBBR thiếu

khí (Anoxic) để đảm bảo khả năng xử lý nitơ trong nước thải. Thể tích của màng

MBBR so với thể tích bể được điều chỉnh theo tỷ lệ phù hợp, thường là <50% thể tích

bể (Lê Hồng Thái, 2013).

1.4.2. Hoạt động của giá thể

Nhân tố quan trọng của quá trình xử lý này là các giá thể động có lớp màng

22

biofilm dính bám trên bề mặt. Những giá thể này được thiết kế sao cho diện tích bề mặt

Đồ án tốt nghiệp hiệu dụng lớn để lớp màng biofilm dính bám trên bề mặt của giá thể và tạo điều kiện

tối ưu cho hoạt động của vi sinh vật khi những giá thể này lơ lửng trong nước.

Tất cả các giá thể có tỷ trọng nhẹ hơn so với tỷ trọng của nước, tuy nhiên mỗi

loại giá thể có tỷ trọng khác nhau. Điều kiện quan trọng nhất của quá trình xử lý này là

mật độ giá thể trong bể, để giá thể có thể chuyển động lơ lửng ở trong bể thì mật độ giá

thể chiếm tứ 25 – 50% thể tích bể và tối đa trong bể MBBR phải nhỏ hơn 67%. Trong

mỗi quá trình xử lý bằng màng sinh học thì sự khuếch tán của chất dinh dưỡng (chất ô

nhiễm) ở trong và ngoài lớp màng là nhân tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử

lý, vì vậy chiều dày hiệu quả của lớp màng cũng là một trong những nhân tố quan

trọng ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý.

Đặc trưng của giá thể là tính kị nước cao, khả năng bám dính sinh học cao. Chất

lượng màng sinh học tốt, khó rơi ra khỏi vật liệu, độ dày lớp biofilm ngoài 10 - 200

µm, lớp biofilm trong có độ dày thay đổi theo tải trọng. Ngoài ra còn có enzyme sinh

học kích hoạt khả năng xử lí của sinh vật trong nước thải.

Chiếm khoảng không gian ít, không bị nghẹt bùn trong khoảng thời gian dài

hoạt động. Tạo bùn nặng dễ lắng, tạo ra 40 - 80% bùn ít hơn quá trình bùn hoạt

tính. Hiệu quả xử lí 30 – 50% cao hơn quá trình bùn hoạt tính trong khi đó chi phí hoạt

động giảm ít nhất 30%.

Có thể được thả trực tiếp trong bể hiếu khí, kỵ khí, thiếu khí. Không cần phải

thay thế trong vòng 30 năm. Không bị ảnh hưởng bởi hình dạng bể, có thể sử dụng cho

tất cả các loại bể (Lê Hồng Thái, 2013).

1.4.3. Ưu điểm của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp MBBR

Mật độ vi sinh vật xử lý trên một đơn vị thể tích cao hơn so với hệ thống xử lý

bằng phương pháp bùn hoạt tính lơ lửng, vì vậy tải trọng hữu cơ của bể MBBR cao

hơn.

Chủng loại vi sinh vật xử lý đặc trưng: Lớp màng biofilm phát triển tùy thuộc

23

vào loại chất hữu cơ và tải trọng hữu cơ trong bể xử lý.

Đồ án tốt nghiệp Hiệu quả xử lý cao.

Tiết kiệm diện tích xây dựng: diện tích xây dựng của MBBR nhỏ hơn so với hệ

thống xử lý nước thải hiếu khí đối với nước thải đô thị và công nghiệp.

Dễ dàng vận hành.

Điều kiện tải trọng cao: Mật độ vi sinh vật trong lớp màng biofilm rất cao, do đó

24

tải trọng hữu cơ trong bể MBBR rất cao. (Lê Hồng Thái, 2013).

Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu - thiết bị - hóa chất

2.1.1. Vật liệu

Chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans được lấy từ Trung

tâm Thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học

Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Mẫu nước thải được lấy từ trạm xử lý nước thải của Nhà máy Chế biến thực

phẩm Tân Phú Trung. Địa chỉ: Lô C2-1, Đường D4, Quốc lộ 22, ấp Trạm Bơm, xã Tân

Phú Trung, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

2.1.2.1. Thiết bị

- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave.

- Máy đo độ hấp thụ quang học.

- Cân điện tử.

- Máy lắc.

- Tủ hút.

- Tủ ủ.

- Tủ cấy vô trùng.

- Tủ lạnh.

- Máy lắc.

- Máy nước cất.

2.1.2.2. Dụng cụ

- Đèn cồn.

- Bình định mức 100ml.

- Đũa thủy tinh.

- Dây cấy vòng.

25

- Bông không thấm.

Đồ án tốt nghiệp - Giấy lọc.

- Cốc thủy tinh: 100 ml, 250 ml, 1000 ml.

- Ống đong: 50 ml, 100 ml.

- Bình tam giác: 100 ml, 250 ml.

- Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml.

- Micro pipet: 100 µl, 1000 µl.

- Ống nghiệm.

- Đĩa petri.

- Cuvet thủy tinh.

- Enppendorf.

- Bóp cao su.

- Giấy đo pH.

2.1.3. Hóa chất

2.1.3.1. Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát

- Môi trường Giltay (Egorov NS, 1986)

Dung dịch A:

1g Asparagine (C4H8N2O3.H2O)

1g KNO3

Nước máy 0,25 l

Dung dịch B:

Citric acid 5g

1g KH2PO4

1g MgSO4.7H2O

1g CaCl2.6H2O

vết FeCl2.4H2O

26

Nước máy 0,25 l

Đồ án tốt nghiệp Hòa 0,25 l dung dịch A vào 0,25 l dung dịch B và dùng KOH 10% để chỉnh pH = 7,

sau đó thêm nước máy đến 1lít, dung dịch môi trường Giltay hoàn tất.

̶ Môi trường tối ưu tương tự môi trường Giltay khi thay Asparagine bằng Peptone

và Citric acid bằng Acetate natri.

2.1.3.2. Hóa chất sử dụng

Cồn 700 và cồn 960.

Thuốc thử: Griess A, Griess B, Diphenylamine, Nessler. (Egorov NS, 1986)

Các hóa chất dùng để định lượng nitrate, nitrite, amon. (Nguyễn Văn Phước,

2005)

Bộ KIT Test đặc điểm sinh hóa API 20NE và các thuốc thử kèm theo.

2.2. Bố trí thí nghiệm:

27

Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: (Hình 2.1)

Đồ án tốt nghiệp

Chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ( III - 8)

Nhân giống

Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans theo tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến

+)

(Xác định hàm lƣợng N-NO3

-, N-NO2

-, N-NH4

Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Giltay nitrate hoặc Glycerol

+)

(Xác định hàm lƣợng N-NO3

-, N-NO2

-, N-NH4

Khảo sát thời gian xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans trong nƣớc thải giàu nitrate

+)

(Xác định hàm lƣợng N-NO3

-, N-NO2

-, N-NH4

Chạy mô hình xử lý nƣớc thải quy mô phòng thí nghiệm

+)

(Xác định hàm lƣợng N-NO3

-, N-NO2

-, N-NH4

Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate bằng bộ KIT API 20NE

28

Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Nội dung nghiên cứu

2.3.1. Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans

Chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Vì vậy, khi sử dụng cần hoạt hóa giống bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng mới, đặt trong tủ ấm 30oC sau 24 – 48 giờ. Chủng sau khi phát triển tốt

được cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác. Nuôi ở nhiệt độ phòng, lắc

150 vòng/phút trong 12 – 24 giờ.

2.3.2. Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans

Mục đích của việc cấy chuyền và giữ giống là để bảo quản giống, tránh hiện

tượng thoái hóa giống.

Chủng giống thuần khiết Achromobacter xylosoxidans được bảo quản trong ống thạch nghiêng môi trường Giltay giữ trong tủ lạnh 4oC, sau 1 – 2 tháng phải cấy

chuyền bằng cách: dùng dây cấy vòng lấy sinh khối rồi cấy ria sang ống thạch nghiêng mới. Đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24 – 48 giờ rồi đem bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.

Hoặc giữ giống trong eppendorf sau ly tâm dưới lớp glycerol.

2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa bằng bộ KIT API 20 NE

Tiến hành khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE.

2.3.4. Khảo sát sự thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans với tỷ lệ phối

trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến

Tăng sinh chủng chọn lọc trong môi trường Giltay nitrate lỏng, lắc trên máy lắc

150 vòng/phút, trong thời gian 24 giờ. Xác định sinh khối dịch tăng sinh bằng cách đo

OD 600 nm.

Sử dụng dịch tăng sinh để tiến hành cấy giống. Thể tích môi trường 90 ml, tỷ lệ

29

cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ lửng, bổ

-, N-NH4

-, N-NO2

Đồ án tốt nghiệp sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm lượng ban + có trong nước thải. đầu của N-NO3

Tỷ lệ nước thải và môi trường tối ưu lần lượt được bố trí là 5:5, 6:4, 7:3, 8:2,

-, N-NO2

-, N-NH4

9:1, 10:0. Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện thiếu khí, không bổ sung giá thể. + và sinh khối vi khuẩn được xác định tại các thời Nồng độ N-NO3

điểm: 0 giờ và 48 giờ.

Tốc độ chuyển hóa nitrơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo

công thức (2.1) (Nguyễn Hoài Hương và cộng sự, 2013):

- cuối +

Vtrung bình = [(NO3

- đầu + NO2

- đầu + NH4

+ đầu) – (NO3

- cuối + NO2

+ cuối)] / T

NH4

-cuối, + N-NH4

-cuối, N-NO2

Trong đó, N-NO3

-đầu, N-NH4

(2.1) + cuối lần lượt là các nồng độ N - trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N-NO3 + đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu

đầu, N-NO2 vào. KgN m-3, T = thời gian chuyển hóa, giờ.

2.3.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate

Tăng sinh vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong môi trường lỏng có tỷ lệ

phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất, lắc 150 vòng/phút,

trong thời gian 24 giờ. Xác định sinh khối dịch tăng sinh bằng cách đo OD 600 nm.

Pha loãng dịch tăng sinh về nồng độ 105 ,106, 107, 108 cfu/ml.

Thí nghiệm ở điều kiện thiếu khí được thực hiện theo mô hình thiếu khí có bổ

sung 5 g giá thể. Cấy giống từ các bình mật độ giống trên vào nước thải giàu nitrate để đạt nồng độ vi khuẩn ban đầu là 105, 106, 107, 108 cfu/ml. Thể tích môi trường 90 ml tỷ

lệ cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ lửng, bổ

-, N-NH4

-, N-NO2

-,

-, N-NO2

sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm lượng ban + có trong nước thải. đầu của N-NO3

30

Sinh khối tự do được đánh giá qua đo OD 600 nm. Nồng độ N-NO3 + được xác định tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. N-NH4

Đồ án tốt nghiệp

-, N-NO2

-, N-NH4

Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có môi trường nước thải, cũng + tại các thời điểm: 0 giờ, 12 tiến hành định lượng các nồng độ N-NO3

giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.

Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo

công thức (2.1).

Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà không + và được tính toán theo công thức (2.2) (Nguyễn tích lũy nitrite và không sinh ra NH4

Hoài Hương và cộng sự, 2013):

-đầu

-cuối+ N-NO2

-cuối+ N-NH4

+cuối)/(N-NO3

-đầu+N-NO2

-cuối, N-NO2

H%= [1 -(N-NO3 +đầu)]*100 (2.2) +N-NH4

-cuối, N-NH4

+ cuối lần lượt là các nồng độ N - trong nitrate, nitrite, amoni đầu ra (môi trường sau khi nuôi cấy vi khuẩn) và N-NO3 + đầu lần lượt là nồng độ N trong nitrate, nitrite, amoni đầu

-đầu, N-NH4

Trong đó, N-NO3

đầu, N-NO2

vào.

2.3.6. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

trong nước thải giàu nitrate

Vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans được tăng sinh trong môi

trường lỏng có tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất, lắc

trên máy lắc 150 vòng/phút, trong thời gian 24h. Xác định sinh khối dịch tăng sinh

bằng cách đo OD 600 nm.

Sử dụng dịch tăng sinh cấy vào môi trường nước thải. Thể tích môi trường 90

ml, tỉ lệ cấy giống 10%. Nước thải phải được để lắng để loại bỏ những chất cặn lơ

+ có trong nước thải.

lửng, bổ sung hàm lượng carbon và nitơ theo tỷ lệ C/N = 12. Tiến hành xác định hàm

-, N-NO2

-, N-NH4

lượng ban đầu của N-NO3

-, N-NH4

-, N-NO2

Thí nghiệm được thực hiện theo mô hình thiếu khí có bổ sung 5 g giá thể. Nồng + được xác định tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 độ N-NO3

31

giờ, 48 giờ.

Đồ án tốt nghiệp

-, N-NH4

-, N-NO2

Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có nước thải, tiến hành định + tại các thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 lượng các nồng độ N-NO3

giờ, 48 giờ.

Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính theo

công thức (2.1).

+ và được tính toán theo công thức (2.2).

Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate, không tích

lũy nitrite, không sinh ra NH4

2.3.7. Tiến hành thực hiện mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm

Để ứng dụng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans vào thí nghiệm xử lý phản

nitrate cần xây dựng mô hình bioreactor thích hợp. Mô hình chọn dựa trên giá thể

bám dính theo kiểu MBBR, các thông số được xây dựng được trình bày trên bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các thông số mô hình bioreactor xây dựng từ thí nghiệm

Thông số bình thí Mô hình STT Tên thông số nghiệm nhỏ bioreactor

Chiều cao, cm 1 6,5 H

2 4,0 D

Đường kính, cm Thể tích, cm3 (ml) 3

Giá thể 4

Thể tích hình học, ml 5 100 Nhựa plastic từ ống hút 0,42 V Nhựa plastic từ ống hút

Chiều cao giá thể, cm 6 1,5 1,5

Đường kính giá thể, cm 7 0,6 0,6

Khối lượng giá thể, g 8 0,0294 0,0294

Khối lượng giá thể / bình, g 9

10

M 19,23 1177 5 19,23 1177

Bề mặt bám dính giá thể m2/kg m2/m3

32

(Huỳnh Văn Thành, 2013)

Đồ án tốt nghiệp Chọn bình hình trụ, có van lấy mẫu, có kích thước như sau làm mô hình

bioreactor (Hình 2.2):

- H = 30,7 cm

- D = 15,5 cm - V = 5793 cm3 = 5,79 L

- Cần tính lượng giá thể

- Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường có tỷ lệ phối trộn giữa nước

-, N-NO2

-, NH4

thải và môi trường Giltay cải tiến tốt nhất. Tỷ lệ cấy giống 10%, xác định + tại các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, hàm lượng N-NO3

36 giờ, 48 giờ.

-, N-NO2

-, N-NH4

- Mẫu đối chứng không tiến hành cấy giống, chỉ có môi trường nước thải, + tại các cũng tiến hành định lượng các nồng độ N-NO3

thời điểm: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.

- Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình do quá trình phản nitrate được tính

theo công thức (2.1).

- Hiệu quả phản nitrate được đánh giá dựa trên khả năng khử nitrate mà + và được tính toán theo công không tích lũy nitrite và không sinh ra NH4

33

thức (2.2).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2. Mô hình bioreactor có giá thể bám dính

2.4. Phƣơng pháp phân tích

2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn

2.4.1.1. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate

Sử dụng dung dịch Nitrate chuẩn để tiến hành dựng đường chuẩn. Dung dịch

Nitrate chuẩn (100 µg/ml) : hòa tan 0,163 g KNO3 khan (hoặc 0,137 g NaNO3 khan)

34

trong nước cất và định mức đến 1 lít.

Đồ án tốt nghiệp Cho dung dịch Nitrate chuẩn theo từng thể tích khác nhau vào các cốc 100 ml và

cô cạn. Cô cạn đến khi vừa khô nhưng không được cháy vì phản ứng tạo thành

nitrophenoldisulfonic acid chỉ xảy ra với muối nitrate ở thể rắn.

Khi mẫu đã cô cạn và nguội thì cho vào 1 ml dung dịch PDA (phenol disulfonic

acid) và lắc đều cho tan mẫu. Cho thêm 25 ml nước cất và lắc đều. Trung hòa acid dư

bằng NaOH 10% đến pH trung tính (thử bằng giấy đo pH) cho đến khi dung dịch

chuyển sang màu vàng thì dừng lại.

Chuyển dung dịch màu vàng sang bình định mức 100 ml, định mức tới vạch và

tiến hành đo độ hấp thu của phức tạo thành ớ bước sóng 410 nm trên máy đo quang.

Ghi nhận lại độ hấp thu của mẫu.

Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng

chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay

mẫu thử bằng nước cất.

Bảng 2.2. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrate

Các bình định mức số Hóa chất 0 1 2 3 4 5

0 5 10 15 20 25 Thể tích dung dịch Nitrate chuẩn (ml)

Cô cạn mẫu đến khi khô, để nguội

Thể tích dung dịch PDA (ml) 1 1 1 1 1 1

Thể tích nước cất (ml) 25 25 25 25 25 25

Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính

Chuyển vào bình định mức 100 ml – định mức tới vạch

Đo độ hấp thu các mẫu chuẩn ở bước sóng 410 nm

Độ hấp thu

Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của

35

phương trình hồi quy tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương

Đồ án tốt nghiệp quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi

quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp

thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp.

2.4.1.2. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite

Sử dụng dung dịch N-NO2 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NO2

chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ.

Dung dịch N-NO2 lưu trữ (1 ml = 250 µg N-NO2): hòa tan 1,232 g NaNO2 trong

nước cất và định mức đến 1 lít.

Dung dịch N-NO2 chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NO2 lưu trữ, sử dụng 2

ml dung dịch N-NO2 lưu trữ rồi thêm nước cất cho đến 1 lít.

Cho dung dịch chuẩn N-NO2 theo từng thể tích khác nhau và bổ sung lượng

nước cất cho đủ 25 ml vào các cốc 100 ml. Thêm vào mỗi cốc 0,5 ml dung dịch EDTA

và 0,5 ml dung dịch acid sulfanilic. Sau đó đợi khoảng 10 phút rồi cho vào mỗi cốc 0,5

ml dung dịch naphthylamine và 0,5 ml đệm acetate. Đợi khoảng 20 phút rồi tiến hành

đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 520 nm.

Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng

chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay

36

mẫu thử bằng nước cất.

Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Tiến trình dựng đường chuẩn nitrite

Các cốc mẫu Hóa chất 0 1 2 3 4 5

0 2,5 5 7,5 10 12,5 Thể tích dung dịch N-NO2 chuẩn, ml

Thể tích nước cất, ml 25 22,5 20 17,5 15 12,5

Thể tích dung dịch EDTA, ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Thể tích dung dịch acid sulfanilic, ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Đợi 10 phút

Thể tích dung dịch naphthylamine 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Thể tích dung dịch đệm acetate 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Đợi 20 phút

Đo độ hấp thu

Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của

phương trình hồi quy tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương

quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi

quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp

thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp.

2.4.1.3. Phương pháp dựng đường chuẩn amoni

Sử dụng dung dịch N-NH3 chuẩn để dựng đường chuẩn. Dung dịch N-NH3

chuẩn được pha loãng từ dung dịch N-NH3 lưu trữ.

Dung dịch lưu trữ N-NH3 (1 ml = 1 mg = 1000 µg N-NH3). Hòa tan 3,819 g

NH4Cl trong nước cất và định mức lên đến 1 lít.

Dung dịch chuẩn N-NH3 (1 ml = 10 µg N-NH3). Dung dịch chuẩn được pha

loãng từ dung dịch lưu trữ, lấy 10 ml dung dịch lưu trữ pha loãng với nước cất và định

37

mức đến 1 lít.

Đồ án tốt nghiệp Cho dung dịch chuẩn vào bình tam giác 100 ml theo từng thể tích khác nhau và

bổ sung nước cất cho đủ 50 ml. Sao đó cho vào mỗi bình 2 ml dung dịch thuốc thử

Nessler, sau đó đợi khoảng 10 phút rồi đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 430 nm.

Khi đo độ hấp thu của mẫu, nhất thiết phải tính đến độ hấp thu của mẫu trắng

chính là mẫu có chứa đủ các hóa chất và thao tác tương tự như mẫu thử, nhưng thay

mẫu thử bằng nước cất.

Bảng 2.4. Tiến trình dựng đường chuẩn amoni

Các bình mẫu Hóa chất 0 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5 Thể tích dung dịch N-NH3 chuẩn, ml 0

Thể tích nước cất, ml 50 49 48 47 46 45

Thể tích dung dịch nessler, ml 2 2 2 2 2 2

Độ hấp thu

Từ các số liệu đo được, tiến hành lập đường chuẩn, xác định các hệ số của

phương trình hồi quy tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (yêu cầu đường chuẩn phải có hệ số tương

quan R ≥ 0,99 mới là đạt yêu cầu) từ đó tính kết quả của mẫu đo từ phương trình hồi

quy tuyến tính đạt yêu cầu. Nếu trị số độ hấp thu của mẫu vượt quá các trị số đo độ hấp

thu trong dung dịch chuẩn, cần pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp.

+

2.4.2. Phương pháp định lượng N-NO3

-, N-NH4

-, N-NO2 - (Nguyễn Văn Phước, 2005)

2.4.2.1. Phương pháp định lượng N-NO3

Từ một bình mẫu nuôi cấy, lắc đều và dùng pipet vô trùng hút ra 1ml mẫu cho

vào cốc thủy tinh, thêm vào 9 ml nước cất và 1 ml dung dịch urea – acetic rồi đem cô

cạn trên bếp điện. Đợi cho mẫu thật nguội thì cho 1 ml dung dịch PDA (phenol

disulfonic acid) vào cốc mẫu, lắc cho mẫu tan đều vào acid. Đợi 10 phút rồi thêm 25

38

ml nước cất vào cốc và lắc đều, sau đó trung hòa acid dư trong mẫu bằng NaOH 10%

Đồ án tốt nghiệp (cho đến khi pH trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được),

chuyển dung dich màu vàng vào bình định mức 100 ml và định mức đến vạch.

Xác định hàm lượng nitrate trong mẫu bằng máy so màu spectrophotometer ở

bước sóng 410 nm.

Tính toán kết quả theo phương trình tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.

- (Nguyễn Văn Phước, 2005)

Từ trị số độ hấp thu (OD) của mẫu, ta tính được hàm lượng nitrate trong mẫu.

2.4.2.2. Phương pháp định lượng N-NO2

Xác định hàm lượng nitrite trong mẫu bằng phương pháp so màu, với sự bắt

màu của nitrite trong mẫu với dung dich acid sulfanilic và dung dịch napthylamine. Sử

dụng máy so màu spectrophotometer ở bước sóng 520 nm.

Từ bình nuôi cấy, lắc đều và dùng micro pipet và đầu tuýp vô trùng để hút 10 µl

mẫu cho vào cốc 100 ml, thêm 25 ml nước cất vào cốc chứa mẫu. Sau đó thêm vào cốc

0,5 ml dung dịch acid sulfanilic và 0,5 ml dung dịch EDTA, đợi 10 phút rồi thêm tiếp

0,5 ml napthylamine và 0,5 ml đệm acetate vào cốc chứ mẫu, đợi 20 phút, lắc mẫu thật

đều và tiến hành đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 520 nm.

Tính hàm lượng nitrite trong mẫu theo phương trình tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.

+ (Nguyễn Văn Phước, 2005)

Dựa vào trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng nitrite trong dung dịch.

2.4.2.3. Phương pháp định lượng N-NH4

Từ bình mẫu nuôi cấy, lắc đều, dùng pipet vô trùng hút 3ml mẫu cho vào cốc

thủy tinh và thêm 297 ml nước cất vào để pha loãng mẫu, từ mẫu pha loãng 100 lần ấy

ta khuấy đều và hút ra 3 bình tam giác, mỗi bình 50 ml mẫu đã được pha loãng và tiến

hành thêm lần lượt các hóa chất như sau: thêm 0,5 ml dung dịch ZnSO4 và 0,25 ml

dung dịch NaOH 6N và 50 ml mẫu, đợi cho mẫu kết tủa và lọc mẫu bằng giấy lọc. Mẫu

sau khi lọc thêm vào 1 ml dung dịch Na2S2O3 N/70, 1 giọt dung dịch EDTA và 2 ml

dung dịch thuốc thử Nessler, đợi 10 phút rồi đem đo độ hấp thu ở bước sóng 430 nm.

39

Tính hàm lượng amoni trong mẫu theo phương trình tuyến tính 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.

Đồ án tốt nghiệp Dựa vào trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng amoni trong dung dịch

mẫu nuôi cấy.

2.4.3. Phương pháp khảo sát các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn

Achromobacter xyosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE

Tiến hành định danh chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans

bằng bộ KIT API 20 NE.

2.4.3.1. Chuẩn bị:

Tăng sinh chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong môi trường Giltay

lỏng, lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.

Cấy trang vi sinh vật lên môi trường Giltay agar, ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5.

Mỗi nồng độ cấy trang trên 3 đĩa.

Chuẩn bị nước cất vô trùng. Dầu khoáng (parafirm oil): sấy ở nhiệt độ 1500C trong khoảng 1 giờ.

Chuẩn bị nước muối sinh lý 0.85%.

Chuẩn bị Mc Farland để so sánh. Ở đây sử dụng Mc Farland ở mức 0.5 để so

sánh. Các mức Mc Farland thể hiện ở bảng 2.6 và hình 2.4.

Bảng 2.5. Các mức Mc Farland

0.5 1 2 3 4

0.05 ml 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml 1% BaCl2

40

9.95 ml 9.9 ml 9.8 ml 9.7 ml 9.6 ml 1% H2SO4

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Các mức Mc Farland

Hình 2.4. Bộ KIT API 20 NE và thuốc thử

2.4.3.2. Phương pháp:

Nhỏ nước cất vô trùng vào khay.

Lấy khuẩn lạc từ đĩa cấy trang trên môi trường Giltay cho vào nước muối sinh

41

lý để tạo huyền phù. So sánh độ đục tương đương với Mc Farland mức 0.5

A.xylosoxidans Mc Farland 0.5

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.5. So sánh độ đục của chủng vi khuẩn A.xylosoxidans trong nước muối

sinh lý với mức Mc Farland 0.5

Lấy khoảng 200𝜇𝑙 huyền phù cho vào API AUX MEDIUM. Sau đó mới bơm

vào kit.

42

Hình 2.6. API AUX MEDIUM sau khi cho 200µl huyền phù vào

Đồ án tốt nghiệp

Các test NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, PNPG chỉ bơm dịch vào

tube, không bơm vào cupule.

Các test từ GLU đến PAC thì bơm dịch vào cả tube và cupule. Chú ý là mực

nước phải phẳng hoặc hơi lồi lên. Cupule không quá ít cũng không quá nhiều.

Bổ sung dầu khoáng vào cupule của GLU, ADH, URE Đóng nắp khay lại, ủ ở nhiệt độ 290C trong khoảng 24 giờ và 48 giờ, sau đó tiến

hành đọc kết quả.

Hình 2.7. Bộ KIT API 20 NE sau khi được bơm dịch

2.4.3.3. Cách đọc kết quả

 Sau 24 giờ: Đọc kết quả của NO3, TRP và GLU trước.

GLU: không cần sử dụng thuốc thử.

- Xanh dương chuyển sang xanh lá là phản ứng âm tính (-).

- Vàng là phản ứng dương tính (+).

NO3:

- Nhỏ 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào cupule, sau 5 phút nếu xuất

hiện màu đỏ là phản ứng dương tính.

- Nếu âm tính, cho thêm 2 – 3 mg bột Zn vào cupule. Sau 5 phút,

nếu cupule không màu rồi chuyển sang hồng đỏ thì phản ứng âm

43

tính (-).

Đồ án tốt nghiệp

TRP:

- Nhỏ 1 giọt JAMES vào cupule, xuất hiện màu hồng trong cupule

là phản ứng dương tính (+).

- Không màu hoặc vàng nhạt là phản ứng âm tính (-).

 Sau 48 giờ: Đọc các kết quả còn lại.

Assimilation: quan sát sự phát triển của vi khuẩn, cupule bị đục là phản

ứng dương tính. Cupule trong suốt là phản ứng âm tính

ADH:

- Vàng là phản ứng âm tính (-).

- Cam/hồng/đỏ là phản ứng dương tính (+).

URE:

- Vàng là phản ứng âm tính (-).

- Hồng/đỏ là phản ứng dương tính (+).

ESC:

- Vàng là phản ứng âm tính (-).

- Xám/nâu/đen là phản ứng dương tính (+).

GEL:

- Không có sự khuếch tán sắc tố đen là phản ứng âm tính (-).

- Có sự khuếch tán sắc tố đen là phản ứng dương tính (+).

PNPG:

- Không màu là phản ứng âm tính(-).

- Vàng là phản ứng dương tính (+).

Từ GLU đến PAC:

- Trong suốt, không màu là phản ứng âm tính (-).

- Đục, mờ là phản ứng dương tính (+).

 Ghi nhận kết quả và so sánh kết quả với hình mẫu của bộ KIT (Hình 2.8).

44

Đồ án tốt nghiệp

45

Hình 2.8. Mẫu so sánh kết quả của bộ KIT API 20 NE (Nguồn: Api Web)

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

bằng bộ KIT API 20 NE

Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE:

 Sau 24 giờ, đọc kết quả của NO3, TRP và GLU (Hình 3.1).

NO3:

- Trước khi nhỏ thuốc thử: không màu, có bọt khí.

- Khi nhỏ NIT 1 và NIT 2 vào, thì không chuyển sang màu hồng. Sau đó cho

kẽm vào, xuất hiện bọt khí quanh kẽm và không đổi màu.(+)

TRP:

- Nhỏ thuốc thử JAMES vào, có màu vàng nhạt. (-)

- GLU: có màu xanh lá cây. (-).

Hình 3.1. Kết quả của bộ KIT sau 24 giờ

 Sau 48 giờ, đọc các kết quả còn lại (Hình 3.2).

- ADH: Vàng (-).

- URE: Cam (-).

- ESC: Nâu (+).

- GEL: Không khuếch tán sắc tố đen (-).

46

- PNPG: Trắng (-).

GLU, GNT, CAP, ADI, MLT, CIT, PAC: Đục (+).

ARA, MNE, MAN, NAG, MAL: Trong (-).

Đồ án tốt nghiệp -

-

Hình 3.2. Kết quả của bộ KIT sau 48 giờ

Kết quả của các thử nghiệm đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn

47

Achromobacter xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE được thể hiện trong bảng 3.1.

Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans bằng bộ KIT API 20 NE

STT Thử nghiệm Kết quả

1 (+) NO3

2 TRP (-)

3 GLU (-)

4 ADH (-)

5 URE (-)

6 ESC (+)

7 GEL (-)

8 PNG (-)

GLU

9 (+)

ARA

10 (-)

MNE

11 (-)

MAN

12 (-)

NAG

13 (-)

MAL

14 (-)

GNT

15 (+)

CAP

16 (+)

ADI

17 (+)

MLT

18 (+)

CIT

19 (+)

PAC

20 (+)

So sánh kết quả ghi nhận được với kết quả của bộ KIT API 20 NE trên hệ thống

so sánh API WEB cho thấy chủng vi khuẩn trên có kết quả trùng lắp 94,5 % (số kiểu

48

sinh học 1440477) với chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Kết quả được thể

Đồ án tốt nghiệp hiện trên hình 3.3. Kết quả này phù hợp với kết quả định danh bằng giải mã trình tự

gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013).

Hình 3.3. Kết quả so sánh trên API WEB

3.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn

3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn nitrate

Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 410 nm. (Bảng

- bằng đồ thị.

3.2).

Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NO3

(Hình 3.3).

Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn

- (mg/ml)

Độ hấp thụ quang N-NO3

1 0 0

2 0,196 0,5

3 0,403 1

4 0,599 1,5

5 0,852 2

49

6 1,021 2,5

Đồ án tốt nghiệp Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường

chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan.

1.2

1 y = 0.415x - 0.007 R² = 0.998

0.8

0.4

0.6

m n 0 1 4 D O

0.2

0

0 2 3 1

-, mg/ml

N-NO3

Hình 3.4. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate

Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình y = 0,415x – 0,007 với y là

độ hấp thụ quang, x là nồng độ.

3.2.2. Kết quả phương trình đường chuẩn nitrite

Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 520 nm. (Bảng

- bằng đồ thị.

3.3).

Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NO2

50

(Hình 3.4).

Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn

- (mg/ml)

Độ hấp thụ quang N-NO2

0 0 1

0,05 0,136 2

0,1 0,266 3

0,15 0,381 4

0,20 0,515 5

0,25 0,639 6

Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường

chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan.

0.7

0.6 y = 2.541x + 0.005 R² = 0.999 0.5

0.4

0.3

m n 0 2 5 D O

0.2

0.1

0

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

- , mg/ml

N-NO2

Hình 3.5. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite

Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình 2,541x + 0,005 với y là độ

51

hấp thụ quang, x là nồng độ.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.3. Kết quả phương trình đường chuẩn amoni

Đo độ hấp thụ quang của 6 mẫu dung dịch chuẩn ở bước sóng 430 nm. (Bảng

+ bằng đồ thị.

3.4).

Biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ N-NH4

(Hình 3.5).

Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn

+ (mg/ml)

Độ hấp thụ quang N-NH4

0 1 0

0,026 2 0,2

0,052 3 0,4

0,085 4 0,6

0,114 5 0,8

0,143 6 1

Sau khi đo được độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường

52

chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy tương quan.

Đồ án tốt nghiệp

y = 0.144x - 0.002 R² = 0.998

m n 0 3 4 D O

0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

+, mg/ml

NH4

Hình 3.6. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni

Sau khi thiết lập đường chuẩn ta được phương trình y = 0,144x – 0,002 với y là

độ hấp thụ quang, x là nồng độ.

3.3. Sự thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn

giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến

Thí nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích tìm ra được tỷ lệ phối trộn phù

hợp, giúp cho quá trình thích nghi và tăng sinh khối của vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans có hiệu quả tốt nhất. Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện thiếu khí

với các tỷ lệ phối trộn giữa nước thải và môi trường Giltay cải tiến như sau 5:5, 6:4,

7:3, 8:2, 9:1, 10:0.

Khảo sát khả năng thích ứng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo

thời gian dựa vào lượng sinh khối tự do được đo ở bước sóng 600 nm trong từng thời

điểm 0 giờ và 48 giờ của từng tỷ lệ phối trộn. Kết quả thí nghiệm trình bày trên hình

53

3.7.

Đồ án tốt nghiệp

Mật độ vi khuẩn

8.600

8.500

)

8.400

8.300

8.200

m n 0 0 6 D O

0h

8.100

48h

( g o L

8.000

7.900

5 : 5

6 : 4

7 : 3

8 : 2

9 : 1

10 : 0

Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng, ml

Hình 3.7. Mật độ vi khuẩn

Kết quả hình 3.7 thể hiện sinh khối của vi khuẩn trong các tỷ lệ phối trộn. Ở tỷ

lệ phối trộn 5:5 vi khuẩn tăng trưởng tốt nhất, thể hiện qua lượng sinh khối tạo ra sau

48 giờ cao nhất so với các tỷ lệ phối trộn còn lại. Tại thời điểm 0 giờ, mật độ quang của

vi khuẩn ở tỷ lệ 5:5 là 8,152; sau 48 giờ đã tăng lên đến 8,511.

Khả năng chuyển hóa nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosixidans được

đánh giá qua tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của vi khuẩn trong từng tỷ lệ phối trộn.

54

Kết quả được thể hiện trên hình 3.8.

Đồ án tốt nghiệp

Tốc độ chuyển hóa

1.316

1.400

1.200

0.956

1.000

ờ i g /

0.800

3

0.607

0.593

m

0.600

/ g

0.312

0.400

0.200

0.047

0.000

5 : 5

6 : 4

7 : 3

8 : 2

9 : 1

10 : 0

Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng

Hình 3.8. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình

Kết quả hình 3.8 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans ở từng tỷ lệ phối trộn khác nhau. Tốc độ chuyển hóa giảm dần từ tỷ lệ 5:5 đến tỷ lệ 10:0. Tốc độ chuyển hóa ở tỷ lệ 5:5 đạt 1,316 g/m3/giờ

cao nhất trong các tỷ lệ phối trộn, điều này chứng tỏ khả năng chuyển hóa nitơ của vi

khuẩn Achromobacter xylosoxidans mạnh nhất ở tỷ lệ phối trộn 5:5 giữa nước thải và

môi trường Giltay cải tiến.

Từ những kết quả trên cho thấy, tỷ lệ phối trộn 5:5 giữa nước thải và môi trường

Giltay cải tiến thì vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng trưởng tốt nhất và thể

55

hiện khả năng chuyển hóa nitơ tốt nhất so với các tỷ lệ phối trộn khác.

Đồ án tốt nghiệp 3.4. Mật độ vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải

giàu nitrate

Để tăng cường sinh học luôn phải kiểm soát mật độ vi khuẩn khi bổ sung sinh

khối vào môi trường, nhất là trong điều kiện thiếu khí khả năng tăng trưởng của vi

khuẩn hạn chế. Tuy nhiên nếu mật độ vi khuẩn quá cao sẽ dẫn đến giá thành xử lý cao.

khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo thời gian dựa vào hàm lượng N-NO3

Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện thiếu khí có bổ sung giá thể với mật độ vi khuẩn khảo sát là 108, 107, 106 và 105 cfu/ml. Đánh giá khả năng phản nitrate của vi - -, N-NO2 + được xác định trong từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ , N-NH4

250

200

10^4

10^4

của từng mật độ vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm trình bày trên hình 3.9.

L / g m

L / g m

150

, -

, -

2

3

10^5

10^5

100

-

-

10^6

10^6

O N N

O N N

50

10^7

10^7

40 35 30 25 20 15 10 5 0

0

10^8

10^8

0h

12h

24h

36h

48h

0h

12h

24h

36h

48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

56

(a) (b)

200

100%

Đồ án tốt nghiệp

%

,

80%

150

ý l

10^4

10^4

60%

L / g m

100

, +

10^5

4

10^5

40%

H N

50

10^6

10^6

20%

ử x ả u q u ệ i H

10^7

10^7

0

0%

10^8

10^8

0h

12h

24h

36h

48h

0h

12h

24h

36h

48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

(c) (d)

-, (c) Biến đổi N-

Hình 3.9. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn Achromobacter

-, (b) Biến đổi N-NO2

+, (d) Hiệu quả xử lý.

xylosoxidans theo mật độ. (a) Biến đổi N-NO3

NH4

Tốc độ chuyển hóa

6.000

5.493

5.000

4.000

ờ i g /

2.925

3

2.583

3.000

2.283

m

2.058

/ g

2.000

1.000

0.000

10^4

10^5

10^6

10^7

10^8

Mật độ vi khuẩn

Hình 3.10. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình

Theo kết quả hình 3.9 (a) có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate ở các mật độ

vi khuẩn khác nhau được bổ sung vào nước thải (Bảng phụ lục B). Sự chuyển hóa - là 166,63 mg/L ở 0 nitrate thể hiện rõ ràng nhất ở mật độ 108, từ hàm lượng N-NO3

57

giờ đã giảm còn 51,81 mg/L ở 36 giờ và chỉ còn lại 1,69 mg/L sau 48 giờ. Ở các mật

Đồ án tốt nghiệp độ còn lại thì sự chuyển hóa nitrate diễn ra chậm hơn so với mật độ 108, điển hình ở - từ 173,61 mg/L lúc 0 giờ giảm còn 148,67 mg/L sau mật độ 107 thì hàm lượng N-NO3 - của mật độ 108 ở khoảng thời gian tương 48 giờ xử lý vẫn cao hơn hàm lượng N-NO3

đương.

- và sinh N-NH4

NO2

Kết quả hình 3.9 (b), (c) cho thấy ở các mật độ vi khuẩn nhau thì sự tích lũy N- - + cũng khác nhau. Ở mật độ 108 sự chuyển hóa hàm lượng N-NO2 - từ 6,72 mg/L ở lúc 0 giờ đã giảm còn 4,536 hiệu quả nhất, cụ thể hàm lượng N-NO2

mg/L ở lúc 24 giờ và hết hoàn toàn sau 36 giờ xử lý. Trong khi đó ở các mật độ khác - vẫn còn lại lần lượt là 3,070 mg/L; 104, 105, 106, 107 đến 48 giờ hàm lượng N-NO2

6,513 mg/L; 0,925 mg/L; 18,142 mg/L. Sự chuyển hóa amoni ổn định nhất ở mật độ + từ 92,756 mg/L lúc 0 giờ giảm còn 39,753 mg/L ở lúc 24 giờ 109, hàm lượng N-NH4 và chỉ còn lại 0,747 mg/L sau 48 giờ xử lý. Trong khi đó ở các mật độ khác 104, 105, - vẫn còn lại lần lượt là 28,741 mg/L; 16,797 106, 107 đến 48 giờ hàm lượng N-NO2

mg/L; 2,986 mg/L; 0,747 mg/L.

Kết quả hình 3.9 (d) cho thấy hiệu quả xử lý ở các mật độ vi khuẩn, trong đó mật độ 108 đạt hiệu quả xử lý 99% sau 48 giờ xử lý, cao nhất trong các mật độ vi

khuẩn. Hình 3.10 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của các mật độ vi khuẩn, trong đó mật độ 108 có tốc độ chuyển hóa đạt 5,493 g/m3/giờ cao nhất so với các mật

độ khác, phù hợp với các thông số của các nghiên cứu khác (Huỳnh Văn Thành, 2013).

Kết luận của thí nghiệm này là qua khảo sát ở các mật độ vi khuẩn thì mật độ vi khuẩn 108 có khả năng chuyển hóa nitrate tốt nhất so với các mật độ còn lại, đồng thời

đạt hiệu quả xử lý và tốc độ chuyển hóa cao nhất trong các mật độ khảo sát.

3.5. Thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nƣớc

thải giàu nitrate

Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu thời gian xử lý hoàn toàn

lượng nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong môi

58

nước thải giàu nitrate có bổ sung giá thể. Đánh giá khả năng phản nitrate của vi khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

-, N-NO2

-, N- + được xác định trong từng thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ. Kết

Achromobacter xylosoxidans theo thời gian dựa vào hàm lượng N-NO3

NH4

250

200

200

150

quả thí nghiệm được trình bày trên hình 3.11.

L / g m

L / g m

150

, -

, -

2

3

100

100

Đối chứng

Đối chứng

-

-

50

O N N

O N N

50

Khảo sát

Khảo sát

0

0

0h

12h 24h 36h 48h

0h 12h 24h 36h 48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

100%

(a) (b)

%

,

80%

ý l

L / g m

60%

, +

4

40%

Đối chứng

Đối chứng

-

20%

H N N

Khảo sát

Khảo sát

ử x ả u q u ệ i H

0%

70 60 50 40 30 20 10 0

0h 12h 24h 36h 48h

0h 12h 24h 36h 48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

(c) (d)

-, (c) Biến đổi N-

Hình 3.11. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn Achromobacter

-, (b) Biến đổi N-NO2

+, (d) Hiệu quả xử lý.

xylosoxidans theo thời gian. (a) Biến đổi N-NO3

59

NH4

Đồ án tốt nghiệp

Tốc độ chuyển hóa

6.000

4.874

5.000

4.000

ờ i g /

3

3.000

m

/ g

2.000

0.709

1.000

0.000

Đối chứng

Khảo sát

- của vi

Hình 3.12. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình sau 48 giờ

Kết quả hình 3.11 (a) cho thấy ở mẫu khảo sát khả năng khử N-NO3

khuẩn Achromobacter xylosoxidans có hiệu quả tăng dần theo thời gian thích nghi. Có

sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate giữa các thời gian xử lý, ở thời điểm 36 giờ và 48 - giờ hàm lượng nitrate được chuyển hóa tốt nhất (Bảng phụ lục B). Hàm lượng N-NO3

giảm dần từ 0 giờ cho đến 24 giờ, và giảm mạnh nhất tại thời điểm 36 giờ và 48 giờ. - là 178,55 mg/L, sau 24 giờ thì còn lại 57,23 Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NO3

mg/L, và giảm mạnh còn 2,53 mg/L ở 48 giờ.

- cũng giảm dần theo thời gian, nhưng - ở mẫu đối

Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO3

chậm hơn so với mẫu khảo sát. Tại thời điểm 0 giờ thì hàm lượng N-NO3

chứng là 187,23 mg/L, đến 48 giờ sau đó giảm còn 7,83 mg/L. Sở dĩ hàm lượng N- - trong mẫu đối chứng giảm là do chính trong nước thải cũng có sẵn một số vi NO3

khuẩn có khả năng phản nitrate, những vi khuẩn này khi gặp điều kiện thích hợp (điều

60

kiện thiếu khí, môi trường có bổ sung giá thể) sẽ phát huy khả năng phản nitrate.

Đồ án tốt nghiệp

- và sinh N-NH4

thì vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có tích lũy N-NO2

- và N-NH4

điểm 12 giờ và 24 giờ nhưng với hàm lượng thấp. Sau đó lượng N-NO2

Kết quả hình 3.11 (b) và (c) cho thấy ở mẫu khảo sát, trong quá trình thích nghi + tại thời + - ở được chuyển hóa và giảm mạnh ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ. Hàm lượng N-NO2

mẫu khảo sát là 9,97 mg/L lúc 0 giờ, trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng

lên 71,13 mg/L ở 24 giờ, nhưng sau đó giảm còn 2,16 mg/L ở 36 giờ và giảm hết hoàn + ở mẫu khảo sát tại thời điểm 0 giờ là 49,46 mg/L, toàn ở 48 giờ. Hàm lượng N-NH4

trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng lên 61,96 mg/L ở 12 giờ, nhưng sau đó

giảm còn 2,24 mg/L ở 36 giờ và còn lại 1,49 mg/L ở 48 giờ thấp hơn hàm lượng N- + được phép có trong nước thải sau xử lý ở cột A (QCVN 11 : 2008/BTNMT). Có NH4

sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrite và amoni của vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans ở các khoảng thời gian xử lý, ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ vi khuẩn thể

hiện khả năng chuyển hóa nitrite và amoni tốt nhất (Bảng phụ lục B). Qua đó thấy

được khả năng khử nitrate, không tích lũy nitrite và sinh ít amoni của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans trong môi trường nước thải giàu nitrate.

- tại thời điểm 0 giờ là 0 mg/L, sau 48 giờ + tại thời điểm 0 giờ là 31,91 mg/L, sau

Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO2

đã tăng lên đến 237,5 mg/L. Hàm lượng N-NH4

24 giờ đã tăng lên đến 58,42 mg/L, sau 48 giờ đã giảm còn lại 7,84 mg/L. Kết quả này

-.

cho thấy một số vi khuẩn có sẵn trong nước thải trong quá trình tăng trưởng gây tích

lũy lượng N-NO2

Kết quả hình 3.11 (d) cho thấy hiệu quả xử lý của mẫu khảo sát vượt trội hơn

mẫu đối chứng rất nhiều. Hiệu quả xử lý của mẫu khảo sát đạt 98% tại thời điểm 48 giờ

trong khi mẫu đối chứng chỉ đạt 16% tại thời điểm tương ứng

Kết quả hình 3.12 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của mẫu đối chứng

61

và mẫu khảo sát. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình của mẫu khảo sát cao hơn so với mẫu đồi chứng, mẫu khảo sát chuyển hóa được 4,874 g/m3/giờ trong khi mẫu đối chứng chỉ đạt 0,709 g/m3/giờ.

Đồ án tốt nghiệp Kết luận của thí nghiệm này là mẫu khảo sát có bổ sung vi khuẩn phản nitrate

Achromobacter xylosoxidans có khả năng xử lý nitrate theo thời gian tốt hơn mẫu đối

chứng không bổ sung vi khuẩn. Khả năng xử lý nitrate của chủng vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans thể hiện mạnh nhất ở thời gian từ 36 giờ đến 48 giờ.

3.6. Khảo sát mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm

Mô hình được xây dựng nhằm mục đích bước đầu ứng dụng vi khuẩn

-, N-NO2

-, N-NH4

Achromobacter xylosoxidans vào việc xử lý nguồn nước thải chế biến thủy sản giàu +) nitrate. Thí nghiệm được bố trí với tổng hàm lượng nitơ (N-NO3

ban đầu ≈ 341.04mg/l. Kết quả xử lý của mô hình bioreactor được thể hiện ở hình

50

300

250

40

200

3.13.

L / g m

L / g m

30

, -

, -

2

3

150

20

Đối chứng

Đối chứng

-

-

100

O N N

O N N

Khảo sát

Khảo sát

10

50

0

0

0h

12h 24h 36h 48h

0h

12h

24h

36h

48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

62

(a) (b)

Đồ án tốt nghiệp

%

,

ý l

L / g m

, +

4

Đối chứng

Đối chứng

-

H N N

Khảo sát

Khảo sát

ử x ả u q u ệ i H

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0h

12h

24h

36h

48h

0h

12h

24h

36h

48h

Thời gian, giờ

Thời gian, giờ

(c) (d)

-, (b)

+, (d) Hiệu quả xử lý.

Hình 3.13. Kết quả động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans sau khi chạy mô hình bioreactor. (a) Biến đổi N-NO3 - , (c) Biến đổi N-NH4 Biến đổi N-NO2

Tốc độ chuyển hóa

25.0

20.6

20.0

15.0

13.1

y à g n

/

3

m

9.1

Đối chứng

8.6

10.0

7.4

/ g

6.9

6.7

6.2

Khảo sát

5.0

0.0

12h

24h

36h

48h

Thời gian, giờ

63

Hình 3.14. Tốc độ chuyển hóa nitơ ở từng thời điểm

- của

Đồ án tốt nghiệp Kết quả hình 3.13 (a) cho thấy ở mẫu khảo sát khả năng chuyển hóa N-NO3

vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng dần theo thời gian. Theo số liệu xử lý

(Bảng phụ lục B). Hàm lượng N-NO3

thống kê, có sự khác biệt về sự chuyển hóa nitrate giữa các khoảng thời gian xử lý - giảm mạnh từ 0 giờ cho đến 12 giờ, và giảm - là 246,75 mg/L, mạnh nhất tại thời điểm 24 giờ. Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NO3

sau 24 giờ thì còn lại 3,98 mg/L, và giảm còn 1,81 mg/L sau 48 giờ xử lý. Sở dĩ, hàm

lượng nitrate trong thời gian đầu giảm mạnh là do trong giai đoạn thích nghi với môi

trường vi khuẩn sử dụng nguồn nitrate làm năng lượng cho quá trình tăng trưởng và

phát triển, vì vậy lượng nitrate được vi khuẩn chuyển hóa nhiều.

- cũng giảm dần theo thời gian, trong - được chuyển đổi chưa

Ở mẫu đối chứng, hàm lượng N-NO3

khoảng thời gian đầu từ 0 giờ đến 24 giờ thì hàm lượng N-NO3

nước thải ít nên quá trình chuyển hóa N-NO3

mật độ vi khuẩn đã đủ lớn nên sự chuyển hóa N-NO3

- giảm mạnh. Tại thời điểm 0 giờ thì hàm lượng N-NO3

đạt cao như mẫu khảo sát, do trong giai đoạn này mật độ vi khuẩn có sẵn trong mẫu - diễn ra chậm, sau thời điểm 24 giờ thì - diễn ra nhanh hơn làm hàm - ở mẫu đối chứng lương N-NO3

là 265,78 mg/L, đến 24 giờ sau đó giảm còn 110,12 mg/L và sau 36 giờ thì còn lại 7,95

mg/L.

khuẩn Achromobacter xylosoxidans có tích lũy N-NO2

hàm lượng thấp. Sau đó lượng N-NO2

Kết quả hình 3.13 (b) cho thấy ở mẫu khảo sát, trong quá trình thích nghi thì vi - tại thời điểm 12 giờ nhưng với - được chuyển hóa và giảm mạnh ở thời điểm 24 - ở mẫu khảo sát giờ và 36 giờ, sau đó tăng nhẹ ở thời điểm 48 giờ. Hàm lượng N-NO2

là 4,34 mg/L lúc 0 giờ, trong thời gian thích nghi của vi khuẩn đã tăng lên 18,15 mg/L

ở 12 giờ, nhưng sau đó giảm còn 0,84 mg/L ở 24 giờ và giảm còn 0,74 mg/L ở 36 giờ.

có thể làm giảm hàm lượng N-NO3

-. Hàm lượng N-NO2

64

Ở mẫu đối chứng, tuy trong nước thải có sẵn một số vi khuẩn có khả năng phản nitrate, - nhưng theo thời gian, sự phát triển của một số vi - tại thời điểm 0 giờ là 0,66 khuẩn này làm tích lũy nhiều N-NO2

Đồ án tốt nghiệp mg/L nhưng sau 36 giờ đã tăng lên đến 47,42 mg/L, sau 48 giờ thì giảm còn 29,07

+ ở mẫu khảo sát giảm dần

mg/L, hàm lượng này cao hơn nhiều so với mẫu khảo sát.

Kết quả hình 3.13 (c) cho thấy hàm lượng N-NH4

theo thời gian. Theo số liệu xử lý thống kê, có sự khác biệt về sự chuyển hóa amoni + là 89,96 mg/L, giữa các khoảng thời gian xử lý. Tại thời điểm 0 giờ hàm lượng N-NH4

xử lý thấp hơn hàm lượng N-NH4

sau đó giảm còn 22,96 mg/L ở 24 giờ và giảm mạnh chỉ còn lại 0,75 mg/L sau 48 giờ + được phép có trong nước thải đầu ra cột A là 10 + tại thời mg/L (QCVN 11: 2008/BTNMT). Đối với mẫu đối chứng, hàm lượng N-NH4

+ được phép có trong nước thải đầu ra cột A (QCVN 11: 2008/BTNMT).

điểm 0 giờ là 76,52 mg/L sau 48 giờ đã giảm còn lại 11,20 mg/L vẫn cao hơn hàm + của mẫu khảo sát tại thời điểm xử lý tương tự và cao hơn hàm lượng N- lượng N-NH4

NH4

Kết quả trên hình 3.13 (d) cho thấy ở thời điểm 12 giờ, hiệu quả xử lý nitơ của

giờ hiệu quả mẫu khảo sát đạt 97% với hàm lượng N-NO3

- và sinh 0,75mg/L N-NH4

còn 1,81mg/L, tích lũy 6,35mg/L N-NO2

- và sinh 11,20 mg/L N-NH4

mẫu đối chứng đạt 30%, mẫu khảo sát đạt 73% cao hơn so với mẫu đối chứng. Sau 48 - giảm từ 246,75 mg/L xuống +. Trong khi đó ở - giảm từ 265,8 mg/L N- +. mẫu đối chứng hiệu quả xử lý đạt 87%, với hàm lượng N-NO3 - xuống còn 3,37 mg/L , tích lũy 29,07 mg/L N-NO2 NO3

Kết quả trên hình 3.14 thể hiện tốc độ chuyển hóa nitơ của mẫu đối chứng và

-, N-NO2

từng mốc thời gian xử lý, có sự khác biệt về tốc độ chuyển hóa nitơ (N-NO3

mẫu khảo sát theo từng thời điểm khác nhau. Dựa vào kết quả xử lý thống kê xét theo -, +) giữa mẫu khảo sát và mẫu đối chứng, cụ thể như sau: tại thời điểm 12 giờ, tốc N-NH4 độ chuyển hóa ở mẫu đối chứng là 8,6 g/m3/giờ, ở mẫu khảo sát là 20,6 g/m3/giờ, từ kết

quả trên cho thấy tại thời điểm 12 giờ mẫu khảo sát chuyển hóa hàm lượng nitơ nhanh

65

hơn mẫu đối chứng. Ở các thời điểm còn lại 24 giờ, 36 giờ, và 48 giờ tốc độc chuyển hóa nitơ của mẫu đối chứng là 7,4 g/m3/giờ; 6,7 g/m3/giờ; 6,2 g/m3/giờ và ở mẫu khảo sát là 13,1g/m3/giờ; 9,1g/m3/giờ; 6,9 g/m3/giờ. Ở từng thời điểm, tốc độ chuyển hóa

Đồ án tốt nghiệp của mẫu khảo sát đều cao hơn mẫu đối chứng, qua đó thấy được khả năng chuyển hóa

nitơ của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate.

Từ các kết quả trên thấy được khả năng chuyển hóa nitơ ở mẫu khảo sát có bổ

sung vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans tốt hơn ở mẫu đối chứng

không bổ sung vi khuẩn. Do đó, nên ứng dụng chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosixidans vào mô hình xử lý nước thải giàu nitrate để rút ngắn thời gian xử lý và đạt

66

hiệu quả hơn.

Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Đề tài: “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter

xylosoxidans trong xử lý nƣớc thải giàu nitrate” đạt được một số kết quả sau:

- Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans bằng bộ KIT TEST API 20 NE và tra cứu trên hệ thống API WEB cho

thấy chủng vi khuẩn được nghiên cứu là chủng vi khuẩn phản nitrate tiềm năng thuộc

loài Achromobacter xylosoxidans.

- Tỷ lệ phối trộn giữa nước thải giàu nitrate và môi trường Giltay cải tiến

thích hợp để vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tăng trưởng và thể hiện khả năng

chuyển hóa nitrate tốt nhất là tỷ lệ 5:5.

- Thời gian để chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans xử lý nguồn

nitrate trong nước thải hiệu quả nhất là sau 48 giờ xử lý trong điều kiện thiếu khí, tỷ lệ

cấy giống 10%, môi trường có bổ sung giá thể với tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình là 4,874 g/m3/giờ.

- Mật độ vi khuẩn thích hợp bổ sung vào nước thải giàu nitrate để chuyển hóa nitrate tốt nhất là 108 cfu/ml sau 36 giờ xử lý trong điều kiện thiếu khí, tỷ lệ cấy

giống 10%, môi trường có bổ sung giá thể với tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình là 5,493 g/m3/giờ.

- Sau khi chạy mô hình bioreactor quy mô phòng thí nghiệm, chủng vi

- sau 48 giờ xử lý, tích lũy 6,35 mg/L hàm lượng N-NO2

khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng chuyển hóa 244,94 mg/L hàm lượng + - và sinh rất ít N-NH4 N-NO3

67

(<1 mg/L). Hiệu quả xử lý cao nhất đạt 97%.

Đồ án tốt nghiệp

4.2. Kiến nghị

Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ tiến hành khảo sát trên một nguồn nước thải

từ Nhà máy Chế biến thực phẩm Tân Phú Trung, trong quy trình xử lý nước thải của

nhà máy đã có bổ sung một số vi khuẩn để xử lý nitrate nên kết quả khảo sát giữa mẫu

nước thải có bổ sung chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans và mẫu

nước thải không bổ sung vi khuẩn chưa thể hiện rõ được hiệu quả xử lý nitrate của vi

khuẩn Achromobacter xylosoxidans. Do đó, tác giả kiến nghị khảo sát trên nhiều nguồn

nước thải giàu nitrate khác để thấy rõ hơn khả năng phản nitrate của chủng vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans.

Cần khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế vi khuẩn và điều kiện thích ứng của

vi khuẩn trong nước thải giàu nitrate.

Thiết kế bioreactor dạng MBBR theo mô hình thiếu khí có giá thể và có hệ

thống thu khí hoàn chỉnh.

Cần khảo sát điều kiện tối ưu để áp dụng mô hình lớn hơn để xử lý nước thải

68

giàu nitrate.

Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1] Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy (2009). Đặc điểm

của vi khuẩn phân lập từ xử lý sinh học tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2,4,6 –

Trinitrotoluen, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(3), 389 – 396.

[2] Huỳnh Văn Thành (2013). Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý loại bỏ nitơ trong

nước thải chế biến thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Kỹ Thuật Môi Trường, Trường Đại

Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.

[3] Lâm Minh Triết, Nguyễn Thanh Hùng, Nguyễn Phước Dân (2008). Xử lý nước thải

đô thị và công nghiệp, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

[4] Lê Trần Ánh Tuyết (2013). Định danh vi khuẩn phản nitrate và khảo sát các yếu tố

ảnh hưởng đến quá trình phản nitrate của vi khuẩn nhằm ứng dụng trong xử lý

nước thải giàu nitrate, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí

Minh, TP. Hồ Chí Minh.

[5] Nguyễn Hoài Hương, Huỳnh Văn Thành (2013), Hiệu quả phản nitrate trong môi

trường giàu nitrate của vi khuẩn phân lập từ nước thải chế biến thủy sản, Tạp chí

Khoa học và Công nghệ.

[6] Nguyễn Thế Đồng (2011). Tài liệu kỹ thuật hướng dẫn đánh giá sự phù hợp của

công nghệ xử lý nước thải và giới thiệu một số công nghệ xử lý nước thải đối với

ngành Chế biến thuỷ sản, Dệt may, Giấy và bột giấy. Hà Nội, Tổng Cục Môi

Trường.

[7] Nguyễn Thị Hồng Đào (2012), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate xử lý

nitơ trong nước thải chế biến thủy sản, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Công

Nghệ TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.

[8] Nguyễn Văn Phước (2005), Thí nghiệm Hóa Kỹ Thuật Môi Trường – Phần I : Phân

tích chất lương nước, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

69

[9] Quy chuẩn Việt Nam QCVN 11:2008/BTNMT. Nước thải chế biến thủy sản.

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu tiếng nƣớc ngoài

[10] Esteve NA, Caballero A, Ramos JL (2001), Biological degradation of 2,4,6 –

Trinitrotuoluen, Microbiol Mol Biol Rev 65, 335 – 352.

[11] Busse, HJ. & Stolz, A . (2006), Achromobacter, Alcaligenes and related genera.

In The Prokaryotes: a Handbook on the Biology of Bacteria, 3rd edn, edited by

M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer & E. Stackebrandt, New

York: Springer, 675–700.

[12] Chirag M., Ghevariya, Jwalant. Bhatt K., Bharti P., Dave (2011), Enhanced

chrysene degradation by halotolerant Achromobacter xylosoxidans using

Response Surface Methodology, Bioresource Technology, Volume 102, Issue 20,

9668–9674.

[13] Ho YN (2012), Selection and application of endophytic bacterium Achromobacter

xylosoxidans strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants,

Journal of Hazardous Materials, 15: 43–49.

[14] Iasur-Kruh L, Yitzhak Hadar, Dror Minz (2011), Isolation and bioaugmentation

of an estradiol-degrading bacterium and its integration into a mature biofilm, Eur

J Clin Microbiol Infect Dis, 30:973-80.

[15] Manikandan N, Kuzhali SS, Kumuthakalavalli R (2012). Biodegradation of

Textile Dye by Using Achromobacter xylosoxidans GRIRKNM11 Isolated from

Dye Polluted Site, J Environ Anal Toxicol 2:160.

[16] Niansheng Wan, Ji – Dong Gu, Yan Yan (2007). Degradation of p – nitrophenol

by Achromobacter xylosoxidans Ns isolated from Wetland sedimen, Int Biodeter

Biodegr 59 (2), 90 – 96.

[17] Li W, Dai Y, Xue B, Li Y, Peng X, Zhang J, Yan Y. (2009). Biodegradation and

detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter

70

xylosoxidans strain CS5. J Hazard Mater, 167:209-16.

Đồ án tốt nghiệp [18] Smets BF, Hong Y, Esteve AN (2007), TNT biotransfomation when chemistry

confronts mineralization, App Microbiol Biotechnol 76, 267 – 277.

[19] Steffens, W.Leider, U.Hattop, W.H (1961), Moglichkeiten und Gefahrn derr

Anwendung von Malachite green in der fischerci, Zeritshrift fur Fisherie 10, 745 –

771.

[20] Wang J, Qiao M, Ding J, Zhang KQ, Huang X (2011), Decolorizing activity of

malachite green and its mechanisms involved in dye biodegradation by

Achromobacter xylosoxidans MG 1, Microbiol Biotechnol, 20 (4), 220 – 227.

[21] Werth G (1958), Die erzeugung von storugen in erbgefuge und von tumoren durch

experimenttelle of websanoxio, Arzn Forsh 8, 725 – 744.

Tài liệu internet

[22] http://localhost/servlet/Identify?action=prepareNew&stripId=3

[23] http://microbiology.mtsinai.on.ca/manual/tech/tech04_03.pdf

[24] http://sites.google.com/site/xulynuocthaisinhhoat/home/cong-nghe-xu-ly-nuoc-

71

thai-mbbr

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

+, MẬT ĐỘ

-, NO2

-, NH4

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐO OD ĐỊNH LƯỢNG NO3

QUANG VI KHUẨN, TÍNH TOÁN HIỆU QUẢ XỬ LÝ, TỐC ĐỘ CHUYỂN HÓA

TRONG CÁC MÔ HÌNH KHẢO SÁT

1. Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo tỷ

lệ phối trộn giữa nƣớc thải và môi trƣờng Giltay cải tiến

- Mật độ quang của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong các môi trường

phối trộn, đo ở bước sóng 600 nm.

Tỷ lệ nƣớc thải : môi trƣờng Giltay cải tiến Thời gian 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0

0,13 0,223 0,136 0,176 0,177 0,216 0 giờ

0,297 0,252 0,251 0,187 0,154 0,139 48 giờ

- Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình.

Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ)

5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1 10 : 0

3,882 0,956 0,607 0,593 0,312 0,047

2. Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ

sung vào nƣớc thải giàu nitrate

- Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni và hiệu quả xử lý nitơ của các mật độ vi khuẩn

1

theo thời gian.

Đồ án tốt nghiệp

NO3 NO2 Giờ

- mg/L 106

104 105 107 108 104 105 107 108

- mg/L 106

165,54 178,80 167,23 173,61 166,63 0,212 0,310 0,625 1,712 6,72 0

3,060 7,349 0,35 12 188,31 207,95 230,48 159,64 136,99 0,585 1,486

77,47 165,42 0,354 1,535 5,952 5,609 4,54 24 226,02 120,48 79,52

0 36 218,43 214,94 221,45 218,92 51,81 10,43 18,595 22,963 34,848

1,69 3,070 6,513 0,925 18,142 0 48 107,95 113,37 160,60 148,67

NH4 Giờ 104 105 107 108 104

+ mg/L 106

Hiệu quả xử lý 107 106 105 108

83,611 81,558 86,224 101,34 92,756 0% 0% 0% 0% 0% 0

75,959 81,372 81,185 75,213 76,706 6% 12% 24% 12% 20% 12

57,109 73,72 69,8 53,19 39,753 14% 25% 39% 51% 21% 24

163,3 69,8 90,703 94,436 36,953 57% 16% 32% 26% 67% 36

28,741 16,797 2,986 0,747 0,747 44% 48% 35% 39% 99% 48

- Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình

Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) 106 105 107 104 108

3,882 0,956 0,607 0,593 0,312

3. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong

nƣớc thải giàu nitrate

- Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni, hiệu quả xử lý nitơ của mẫu đối chứng (ĐC)

2

và khảo sát (KS) theo thời gian.

Đồ án tốt nghiệp - mg/L

- mg/L

+ mg/L

Hiệu quả xử lý NO2 NO3 NH4 Giờ ĐC KS ĐC KS ĐC KS ĐC KS

187,23 178,55 0 9,97 31,91 49,46 0% 0% 0

186,14 109,76 1,57 46,39 30,98 61,69 0% 8% 12

114,22 57,23 31,24 71,13 58,42 47,4 7% 26% 24

7,83 2,41 159,39 2,16 19,41 2,24 15% 97% 36

7,83 2,53 237,5 0 7,84 1,49 16% 98% 48

- Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình.

Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ)

Đối chứng Khảo sát

0,709 4,874

4. Chạy mô hình xử lý nƣớc thải quy mô phòng thí nghiệm

- Hàm lượng nitrate, nitrite, amoni và hiêu quả xử lý nitơ của mẫu đối chứng

(ĐC) và khảo sát (KS) sau khi chạy mô hình.

- mg/L

- mg/L

+ mg/L

Hiệu quả xử lý NO3 NO2 NH4 Giờ ĐC KS ĐC KS ĐC KS ĐC KS

265,78 246,75 0,66 4,34 76,52 88,96 0% 0% 0

157,11 47,23 7,96 18,15 75,0 28,37 30% 73% 12

110,12 3,98 8,22 0,84 47,03 22,96 52% 92% 24

7,95 2,29 47,42 0,74 46,66 11,38 70% 96% 36

3,37 1,81 29,07 6,35 11,2 0,75 87% 97% 48

3

- Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình.

Đồ án tốt nghiệp

Tốc độ chuyển hóa (g/m3/giờ) Giờ Đối chứng Khảo sát

0 0 0

14,8 20,6 12

7,4 13,1 24

6,7 9,1 36

6,2 6,9 48

5. Giá trị các thông số làm cở sở tính toán các giá trị tối đa cho phép trong nƣớc thải chế biến thủy sản (QCVN 11:2008).

Giá trị C STT Thông số Đơn vị

1 2 3 A 6 – 9 30 50 B 5,5 - 9 50 80 - mg/l mg/l

4 50 100 mg/l

5 6 10 30 20 60 mg/l mg/l

7 10 20 mg/l

4

8 9 pH BOD5 ở 20oC COD Tổng chất rắn lơ lửng (TSS) Amoni (tính theo N) Tổng nitơ Tổng dầu, mỡ động thực vật Clo dư Tổng Coliforms 2 5000 mg/l MPN/100ml 1 3000

Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

1. Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ

sung vào nƣớc thải giàu nitrate

Multifactor ANOVA - Ham luong nitrate

Analysis of Variance for Ham luong nitrate – Type III Sums of Squares

Source of Df Mean

Square

Sum Squares 56029.4 74633.9 117669. 3142.26 251475. P- F- Value Ratio 222.89 0.0000 296.90 0.0000 117.02 0.0000 4 14007.3 4 18658.5 16 7354.32 50 62.8452 74

155.483 Stnd. Error Lower Limit Count Mean 75 Upper Limit

181.493 2.04687 177.382 185.605 166.168 2.04687 162.057 170.279 171.213 2.04687 167.102 175.325 154.988 2.04687 150.877 159.099 103.551 2.04687 99.4401 107.663 170.521 2.04687 166.41 174.633 183.647 2.04687 179.536 187.759 132.387 2.04687 128.275 136.498 185.558 2.04687 181.447 189.669 105.301 2.04687 101.189 109.412 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15

5

MAIN EFFECTS A:Mat do B:Thoi gian INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrate with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Mat do 10^5 10^6 10^7 10^8 10^9 Thoi gian 0 gio 12 gio 24 gio 36 gio 48 gio Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 4.57694 158.757 177.143 167.95 3

Đồ án tốt nghiệp

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 187.71 4.57694 178.517 196.903 224.177 4.57694 214.984 233.37 218.393 4.57694 209.2 227.586 109.237 4.57694 100.044 118.43 187.666 178.473 4.57694 169.28 4.57694 195.947 214.333 205.14 4.57694 111.127 129.513 120.32 215.34 4.57694 206.147 224.533 111.567 4.57694 102.374 120.76 167.23 4.57694 158.037 176.423 226.587 4.57694 217.394 235.78 4.57694 70.3269 88.7131 79.52 223.937 4.57694 214.744 233.13 167.986 158.793 4.57694 149.6 182.606 173.413 4.57694 164.22 159.44 4.57694 150.247 168.633 77.9933 4.57694 68.8003 87.1864 218.877 4.57694 209.684 228.07 145.217 4.57694 136.024 154.41 165.54 4.57694 156.347 174.733 139.36 4.57694 130.167 148.553 169.116 159.923 4.57694 150.73 51.2433 4.57694 42.0503 60.4364 4.57694 -7.50308 10.8831 1.69

Homogeneous Groups

Mean 103.551 2.04687 X 154.988 2.04687 X 166.168 2.04687 X 171.213 2.04687 X 181.493 2.04687 X

10^5,12 gio 10^5,24 gio 10^5,36 gio 10^5,48 gio 10^6,0 gio 10^6,12 gio 10^6,24 gio 10^6,36 gio 10^6,48 gio 10^7,0 gio 10^7,12 gio 10^7,24 gio 10^7,36 gio 10^7,48 gio 10^8,0 gio 10^8,12 gio 10^8,24 gio 10^8,36 gio 10^8,48 gio 10^9,0 gio 10^9,12 gio 10^9,24 gio 10^9,36 gio 10^9,48 gio Multiple Range Tests for Ham luong nitrate by Mat do Method: 95.0 percent LSD LS Count LS Mat do Sigma 10^9 15 10^8 15 10^6 15 10^7 15 10^5 15 Contrast Sig. Difference +/-

6

10^5 - 10^6 * 15.3253 Limits 5.81421

Đồ án tốt nghiệp

-5.04533

* 10.28 * 26.5053 * 77.942 * 11.18 * 62.6167 * 16.2253 * 67.662 * 51.4367 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421 5.81421

10^5 - 10^7 10^5 - 10^8 10^5 - 10^9 10^6 - 10^7 10^6 - 10^8 10^6 - 10^9 10^7 - 10^8 10^7 - 10^9 10^8 - 10^9

Multifactor ANOVA - Ham luong nitrite

Analysis of Variance for Ham luong nitrite - Type III Sums of Squares Source Df Mean of

Square

Sum Squares 1303.61 1466.77 1711.99 21.1233 4503.49 P- F- Value Ratio 771.43 0.0000 867.99 0.0000 253.27 0.0000 4 325.903 4 366.694 16 106.999 50 0.422465 74

Stnd. Count Mean Error 5.32836 75 Lower Upper Limit Limit

7

MAIN EFFECTS A:Mat do B:Thoi gian INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrite with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Mat do 10^5 10^6 10^7 10^8 10^9 Thoi gian 0 gio 12 gio 2.90173 0.167822 2.56465 3.23882 5.7426 0.167822 5.40552 6.07968 2.48973 0.167822 2.15265 2.82682 13.2776 0.167822 12.9405 13.6147 2.23013 0.167822 1.89305 2.56722 1.86087 0.167822 1.52378 2.19795 2.55607 0.167822 2.21898 2.89315 15 15 15 15 15 15 15

Đồ án tốt nghiệp 2.92007 0.167822 2.58298 3.25715 13.8286 0.167822 13.4915 14.1657 5.4762 0.167822 5.13912 5.81328 15 15 15

0.21 0.375262 - 24 gio 36 gio 48 gio Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 3 0.96373 8

0.54373 8 0.375262 - 1.33707 10^5,12 gio 3 0.58333 3

0.17040 4 0.375262 - 1.1014 10^5,24 gio 3 0.34766 7

0.40607 1

10.2977 0.375262 9.54393 11.0514 0.375262 2.31626 3.82374 3.07 1.05874 0.375262 - 0.305 10^5,36 gio 10^5,48 gio 10^6,0 gio 3 3 3

0.44873 8

3 10^6,12 gio 1.48267 0.375262 0.72892 2.2364 9

3 10^6,24 gio 1.52833 0.375262 0.77459 2.28207 6

18.8903 0.375262 18.1366 19.6441 6.50667 0.375262 5.75293 7.2604 0.62 0.375262 - 1.37374 10^6,36 gio 10^6,48 gio 10^7,0 gio 3 3 3

0.13373 8

0.375262 2.29926 3.80674 0.375262 2.15826 3.66574

0.375262 - 10^7,12 gio 10^7,24 gio 10^7,36 gio 10^7,48 gio 3 3 3 3

3.053 2.912 5.63767 0.375262 4.88393 6.3914 0.97973 0.226 8 0.52773 8

3 10^8,0 gio 1.70533 0.375262 0.95159 2.45907

6

8

3 3 3 10^8,12 gio 10^8,24 gio 10^8,36 gio 0.375262 6.58926 8.09674 7.343 0.375262 4.69026 6.19774 5.444 34.3173 0.375262 33.5636 35.0711

10^8,48 gio 10^9,0 gio 10^9,12 gio 3 3 3 Đồ án tốt nghiệp 17.5783 0.375262 16.8246 18.3321 0.375262 5.71026 7.21774 6.464 1.07207 0.375262 - 0.31833 3

0.43540 4

10^9,24 gio 10^9,36 gio 3 3 0.375262 -

4.36833 0.375262 3.6146 5.12207 0.75373 0.0 8

3 10^9,48 gio 0.0 0.75373 8 0.375262 -

0.75373 8 0.75373 8

Multiple Range Tests for Ham luong nitrite by Mat do Method: 95.0 percent LSD Mat do Count LS LS Sigma Homogeneous Groups

XX X X X 15 15 15 15 15 Mean 2.23013 0.167822 X 2.48973 0.167822 2.90173 0.167822 5.7426 0.167822 13.2776 0.167822

- *

0.476706 0.412 -

0.476706 -10.3759 * -

* 0.6716 0.476706 -

* 3.25287 0.476706 -

0.476706 -7.535 * -

* 3.51247 0.476706 -

9

10^9 10^7 10^5 10^6 10^8 Contrast Sig. Difference +/- Limits 0.476706 -2.84087 10^5 10^6 10^5 10^7 10^5 10^8 10^5 10^9 10^6 10^7 10^6 10^8 10^6 10^9

Đồ án tốt nghiệp

- * -10.7879 0.476706

- 0.2596 0.476706

* 11.0475 0.476706 -

10^7 10^8 10^7 10^9 10^8 10^9 Multifactor ANOVA - Ham luong amoni Analysis of Variance for Ham luong amoni - Type III Sums of Squares Source Df Mean of

Square

MAIN EFFECTS A:Mat do B:Thoi gian Sum Squares 7732.46 67517.3 4 1933.12 4 16879.3

P- F- Value Ratio 144.62 0.0000 0.0000 1262.7 7 106.91 0.0000 22864.4 668.346 98782.5 16 1429.02 50 13.3669 74

64.7191 Stnd. Error Count Mean 75 Upper Limit Lower Limit

10

INTERACTIONS AB RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Mat do 10^5 10^6 10^7 10^8 10^9 Thoi gian 0 gio 12 gio 24 gio 36 gio 48 gio 81.1477 0.943996 79.2516 83.0437 63.5794 0.943996 61.6833 65.4755 65.5702 0.943996 63.6741 67.4663 64.1765 0.943996 62.2805 66.0726 49.1216 0.943996 47.2255 51.0177 87.9409 0.943996 86.0449 89.837 77.9873 0.943996 76.0912 79.8833 58.3039 0.943996 56.4079 60.2 90.2553 0.943996 88.3593 92.1514 9.10793 0.943996 7.21186 11.004 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15

Đồ án tốt nghiệp

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 78.8736 87.3531 71.6576 80.1371 53.2429 61.7224 158.752 167.232 22.0132 30.4928 75.0169 83.4964 76.6339 85.1134 69.2936 77.7731 64.9386 73.4181 10.8152 19.2948 81.2376 89.7171 76.6342 85.1138 64.0676 72.5471 86.2149 94.6944 -1.50209 6.97742 95.0482 103.528 70.9106 79.3901 48.8879 57.3674 88.3299 96.8094 -3.49275 4.98675 88.3296 96.8091 72.9012 81.3808 34.8289 43.3084 31.8422 40.3218 -3.49275 4.98675 83.1133 2.11084 75.8973 2.11084 57.4827 2.11084 162.992 2.11084 26.253 2.11084 79.2567 2.11084 80.8737 2.11084 73.5333 2.11084 69.1783 2.11084 2.11084 15.055 85.4773 2.11084 80.874 2.11084 68.3073 2.11084 90.4547 2.11084 2.73767 2.11084 2.11084 99.288 75.1503 2.11084 53.1277 2.11084 92.5697 2.11084 2.11084 0.747 92.5693 2.11084 77.141 2.11084 39.0687 2.11084 2.11084 36.082 2.11084 0.747

LS Sigma Homogeneous

Groups

Mean 49.1216 0.943996 X 63.5794 0.943996 64.1765 0.943996 65.5702 0.943996 81.1477 0.943996 X X X X

11

Mat do by Thoi gian 10^5,0 gio 10^5,12 gio 10^5,24 gio 10^5,36 gio 10^5,48 gio 10^6,0 gio 10^6,12 gio 10^6,24 gio 10^6,36 gio 10^6,48 gio 10^7,0 gio 10^7,12 gio 10^7,24 gio 10^7,36 gio 10^7,48 gio 10^8,0 gio 10^8,12 gio 10^8,24 gio 10^8,36 gio 10^8,48 gio 10^9,0 gio 10^9,12 gio 10^9,24 gio 10^9,36 gio 10^9,48 gio Multiple Range Tests for Ham luong amoni by Mat do Method: 95.0 percent LSD Count LS Mat do 10^9 15 10^6 15 10^8 15 10^7 15 10^5 15 Contrast Sig. Differen +/-

Đồ án tốt nghiệp

ce Limits

- * 17.5683 2.68146

- * 15.5775 2.68146

- * 16.9711 2.68146

- * 32.0261 2.68146

- -1.9908 2.68146

- 2.68146 10^5 10^6 10^5 10^7 10^5 10^8 10^5 10^9 10^6 10^7 10^6 10^8

- 0.59713 3

- * 14.4578 2.68146

- 1.39367 2.68146

* 16.4486 2.68146 -

* 15.0549 2.68146 -

10^6 10^9 10^7 10^8 10^7 10^9 10^8 10^9 2. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong

nƣớc thải giàu nitrate

Multifactor ANOVA - ham luong nitrate Analysis of Variance for ham luong nitrate - Type III Sums of Squares Source Df Mean of

Square

Sum Squares 156740. 14437.8 171178. P- F- Value Ratio 67.85 0.0000 4 39185.1 25 577.511 29

12

MAIN EFFECTS A:thoi gian RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for ham luong nitrate with 95.0 Percent Confidence Intervals Lower Upper Stnd.

Đồ án tốt nghiệp

Limit Count Mean 85.156 30 Error Limit

6 6 6 6 6 182.488 9.8108 162.283 202.694 9.8108 127.264 167.676 147.47 85.3017 9.8108 65.0959 105.507 9.8108 -14.9858 25.4258 5.22 9.8108 -14.9058 25.5058 5.3

Homogeneous Groups

Mean 5.22 5.3 85.3017 9.8108 147.47 9.8108 182.488 9.8108 X X X

Level GRAND MEAN thoi gian 0 gio 12 gio 24 gio 36 gio 48 gio Multiple Range Tests for ham luong nitrate by thoi gian Method: 95.0 percent LSD LS Count LS thoi Sigma gian 9.8108 X 36 gio 6 48 gio 6 9.8108 X 24 gio 6 12 gio 6 6 0 gio Contrast

Sig. Differen ce +/- Limits

* 35.0183 28.5753 * 97.1867 28.5753 * 177.268 28.5753 * 177.188 28.5753 * 62.1683 28.5753 * 142.25 28.5753 * 142.17 28.5753 * 80.0817 28.5753 * 80.0017 28.5753 28.5753 -0.08

0 gio - 12 gio 0 gio - 24 gio 0 gio - 36 gio 0 gio - 48 gio 12 gio - 24 gio 12 gio - 36 gio 12 gio - 48 gio 24 gio - 36 gio 24 gio - 48 gio 36 gio - 48 gio Multifactor ANOVA - Ham luong nitrite Analysis of Variance for Ham luong nitrite - Type III Sums of Squares Source Df Mean of

13

Sum Squares Square F- Ratio P- Value

Đồ án tốt nghiệp

11213.5 75.1788 11288.6 4 2803.36 10 7.51788 14 372.89 0.0000

25.2999 Stnd. Error Count Mean 15 Lower Upper Limit Limit

9.91067 1.58302 6.38347 13.4379 45.1923 1.58302 41.6651 48.7195 69.2313 1.58302 65.7041 72.7585 1.58302 -1.3622 5.6922 2.165 1.58302 -3.5272 3.5272 0.0 3 3 3 3 3

Homogeneous Groups

Mean 0.0 2.165 9.91067 1.58302 X 45.1923 1.58302 X 69.2313 1.58302 X

MAIN EFFECTS A:Thoi gian RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrite with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Thoi gian 0 gio 12 gio 24 gio 36 gio 48 gio Multiple Range Tests for Ham luong nitrite by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD LS Count LS Thoi Sigma gian 1.58302 X 48 gio 3 1.58302 X 36 gio 3 0 gio 3 12 gio 3 24 gio 3 Contrast Sig. Differenc +/- Limits

e -35.2817 4.98822 *

-59.3207 4.98822 *

14

0 gio - 12 gio 0 gio - 24 gio 0 gio - 36 * 7.74567 4.98822

Đồ án tốt nghiệp

* 9.91067 4.98822

* -24.039 4.98822

* 43.0273 4.98822

* 45.1923 4.98822

* 67.0663 4.98822

* 69.2313 4.98822

2.165 4.98822

gio 0 gio - 48 gio 12 gio - 24 gio 12 gio - 36 gio 12 gio - 48 gio 24 gio - 36 gio 24 gio - 48 gio 36 gio - 48 gio

Multifactor ANOVA - Ham luong amoni

Analysis of Variance for Ham luong amoni - Type III Sums of Squares Source Df Mean of

Square

Sum Squares 12785.0 2526.33 15311.3 P- F- Value Ratio 31.63 0.0000 4 3196.24 25 101.053 29

Upper Limit Lower Limit Stnd. Error

15

MAIN EFFECTS A:Thoi gian RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 29.699 30 GRAND MEAN Thoi gian 0 gio 12 gio 24 gio 36 gio 48 gio 4.10392 31.7328 48.6372 40.185 46.3483 4.10392 37.8961 54.8005 52.2567 4.10392 43.8045 60.7089 5.10167 4.10392 -3.35054 13.5539 4.60333 4.10392 -3.84887 13.0555 6 6 6 6 6

Đồ án tốt nghiệp

Homogeneous Groups

Mean 4.60333 4.10392 X 5.10167 4.10392 X 40.185 4.10392 X 46.3483 4.10392 XX 52.2567 4.10392 X

Multiple Range Tests for Ham luong amoni by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD LS Count LS Thoi Sigma gian 48 gio 6 36 gio 6 6 0 gio 12 gio 6 24 gio 6 Contrast Sig. Differenc +/- Limits

e -6.16333 11.9532 0 gio - 12 gio * -12.0717 11.9532 0 gio - 24 gio * 35.0833 11.9532 0 gio - 36 gio * 35.5817 11.9532 0 gio - 48 gio -5.90833 11.9532 12 gio - 24 gio * 41.2467 11.9532 12 gio - 36 gio * 41.745 11.9532 12 gio - 48 gio 11.9532 * 47.155 24 gio - 36 gio * 47.6533 11.9532 24 gio - 48 gio 0.498333 11.9532 36 gio - 48 gio 3. Chạy mô hình xử lý nƣớc thải quy mô phòng thí nghiệm

Multifactor ANOVA - Ham luong nitrate 12h

Analysis of Variance for Ham luong nitrate 12h – Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-

Square

1.47043 2 0.735217 0.49 Value 0.6732

5664.15 1 5664.15 3740.07 0.0003

3.0289 5668.65 2 1.51445 5

16

MAIN EFFECTS A:nitrate12(1).lap lai B:nitrate12(1).Thi nghiem RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

Count Mean

Lower Upper Limit Limit

2 2 2 77.5483 78.19 77.47 76.985 Stnd. Error 0.870187 74.4459 81.9341 0.870187 73.7259 81.2141 0.870187 73.2409 80.7291

108.273 0.710505 105.216 111.33 46.8233 0.710505 43.7663 49.8804 3 3

LS Sigma Homogeneous Count LS Groups

Mean 46.8233 0.710505 X 108.273 0.710505 X 3 3

Đồ án tốt nghiệp Table of Least Squares Means for Ham luong nitrate 12h with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN 6 nitrate12(1).lap lai 1 2 3 nitrate12(1).Thi nghiem Doi chung Khao sat Multiple Range Tests for Ham luong nitrate 12h by nitrate12(1).Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD nitrate12(1).Thi nghiem Khao sat Doi chung Contrast

Sig. Differen ce * 61.45 +/- Limits 4.32333 - chung

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong nitrate 24h Analysis of Variance for Ham luong nitrate 24h - Type III Sums of Squares Source Df Mean Square F-Ratio P- of

Sum Squares 13.5825 17245.3 12.5809 17271.4 2 6.79127 1 17245.3 2 6.29047 5 Value 1.08 0.4809 2741.49 0.0004

17

MAIN EFFECTS A:lap lai B:Thi nghiem RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

57.5517 Stnd. Error Lower Limit Upper Limit

1.77348 47.7943 63.0557 1.77348 51.0443 66.3057 1.77348 50.9243 66.1857

55.425 58.675 58.555 111.163 1.44804 104.933 117.394 1.44804 -2.29042 10.1704 3.94 2 2 2 3 3

LS Sigma Homogeneous Count LS

Groups

1.44804 X

Mean 3.94 111.163 1.44804 X

Đồ án tốt nghiệp Table of Least Squares Means for Ham luong nitrate 24h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 6 GRAND MEAN lap lai 1 2 3 Thi nghiem Doi chung Khao sat Multiple Range Tests for Ham luong nitrate 24h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Khao sat 3 3 Doi chung Contrast

Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 107.223 8.81114

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - ham luong nitrate 36h Analysis of Variance for ham luong nitrate 36h - Type III Sums of Squares Df Mean Source of

Square

Sum Squares 51.5094 0.3648 0.1344 52.0086 1 51.5094 2 0.1824 2 0.0672 5 P- F- Value Ratio 766.51 0.0013 0.2692 2.71

18

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED)

Lower Upper Limit Limit Stnd. Count Mean Error 5.1 6

8.03 0.149666 7.38604 8.67396 2.17 0.149666 1.52604 2.81396 5.42 0.183303 4.63131 6.20869 4.82 0.183303 4.03131 5.60869 5.06 0.183303 4.27131 5.84869 3 3 2 2 2

LS Sigma Homogeneous Count LS Groups

0.149666 X 0.149666 Mean 2.17 8.03 X

Đồ án tốt nghiệp Table of Least Squares Means for ham luong nitrate 36h with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for ham luong nitrate 36h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Khao sat 3 3 Doi chung Contrast Sig. Differen ce

+/- Limits 0.9107 - chung * 5.86

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - ham luong nitrate 48h Analysis of Variance for ham luong nitrate 48h - Type III Sums of Squares Df Mean Source of

19

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem B:Lap lai RESIDUAL TOTAL Sum Squares 3.84 0.0192 0.0192 3.8784 P- F- Value Ratio 400.00 0.0025 0.5000 1.00 Square 1 3.84 2 0.0096 2 0.0096 5

Đồ án tốt nghiệp

Lower Upper Limit Limit Stnd. Count Mean Error 2.57 6

3 3 2 2 2 3.37 0.0565685 3.12661 3.61339 1.77 0.0565685 1.52661 2.01339 2.3519 2.65 0.069282 2.2319 2.53 0.069282 2.2319 2.53 0.069282 2.9481 2.8281 2.8281

LS Sigma Homogeneous Count LS

Groups

0.0565685 X 0.0565685 Mean 1.77 3.37 X

(CORRECTED) Table of Least Squares Means for ham luong nitrate 48h with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for ham luong nitrate 48h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Khao sat 3 3 Doi chung Contrast

Sig. Differen ce * 1.6 - chung

+/- Limits 0.34421 2

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong nitrie 12h Analysis of Variance for Ham luong nitrie 12h - Type III Sums of Squares Df Mean Source of

Square

20

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem B:Lap lai RESIDUAL Sum Squares 290.037 1.63738 1.25861 1 290.037 2 0.818688 1.30 2 0.629305 P- F- Value Ratio 460.89 0.0022 0.4346

Đồ án tốt nghiệp

5 292.933

Stnd. Error Lower Upper Limit Limit

5.87297 19.7783

0.560939 8.00547 12.8325

3 3 2 2 2 3.90233 0.458005 1.9317 17.8077 0.458005 15.837 11.5895 0.560939 9.17597 14.003 10.419 10.5565 0.560939 8.14297 12.97

LS Sigma Homogeneous Count LS Groups

Mean 3.90233 0.458005 X 3

17.8077 0.458005 X

TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrie 12h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 10.855 6 GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong nitrie 12h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Doi chung Khao sat 3 Contrast Sig. Differenc

+/- Limits e -13.9053 2.7869 - * chung

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong nitrte 24h Analysis of Variance for Ham luong nitrte 24h - Type III Sums of Squares Df Mean Source F-Ratio P- of

Square

21

MAIN EFFECTS A:thi nghiem Sum Squares 82.3992 1 82.3992 Value 0.0000 51478.0 5

Đồ án tốt nghiệp

2 0.004802 3.00

B:lap lai RESIDUAL 0.009604 0.00320133 2 0.0016006 0.2500

7 5 82.412

Stnd. Count Mean Error 4.5255 6 Lower Upper Limit Limit

TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrte 24h with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN thi nghiem Doi chung Khao sat 3 3

3

8.23133 0.0230988 8.13195 8.33072 0.0230988 0.72028 0.91905 0.81966 7 4.5745 0.0282902 4.45278 4.69622 4.4765 0.0282902 4.35478 4.59822 4.5255 0.0282902 4.40378 4.64722 2 2 2

lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong nitrte 24h by thi nghiem Method: 95.0 percent LSD thi nghiem Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

0.819667 0.0230988 X 8.23133 0.0230988 X

Khao sat 3 Doi chung 3 Contrast Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 7.41167 0.14055 3

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong nitrite 36h

Analysis of Variance for Ham luong nitrite 36h - Type III Sums of Squares Df Mean Source F-Ratio P- of

Square Value

22

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem Sum Squares 3294.4 1 3294.4 22425.42 0.0000

Đồ án tốt nghiệp

0.4507 0.358097 0.293809 3295.05 2 0.179049 1.22 2 0.146905 5

24.1538 Stnd. Error Lower Limit Upper Limit

47.586 48.5381 0.221288 46.6339 0.721667 0.221288 -0.230457 1.67379 24.3505 23.8095 24.3015 0.271021 23.1844 0.271021 22.6434 0.271021 23.1354 25.5166 24.9756 25.4676 3 3 2 2 2

B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrite 36h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 6 GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong nitrite 36h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS Mean LS Sigma Homogeneous

Groups

0.721667 0.221288 X 47.586 0.221288 X

3 Khao sat Doi chung 3 Contrast

Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 46.8643 1.34651

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong nitrite 48h Analysis of Variance for Ham luong nitrite 48h - Type III Sums of Squares Df Mean Source F-Ratio P- of

Square

23

MAIN EFFECTS A:Lap lai Sum Squares 0.996379 2 0.49819 2.43 Value 0.2914

Đồ án tốt nghiệp

797.323 0.409744 798.729 1 797.323 2 0.204872 5 3891.81 0.0003

Stnd. Error Lower Upper Limit Limit

17.218 0.320056 15.8409 18.5951 17.8575 0.320056 16.4804 19.2346 18.2015 0.320056 16.8244 19.5786 29.2867 0.261325 28.1623 30.4111 6.23133 0.261325 5.10694 7.35572 2 2 2 3 3

B:Thi nghiem RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong nitrite 48h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 17.759 6 GRAND MEAN Lap lai 1 2 3 Thi nghiem Doi chung Khao sat Multiple Range Tests for Ham luong nitrite 48h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS LS Sigma Homogeneous

Groups

Mean 6.23133 0.261325 X 29.2867 0.261325 X

3 Khao sat Doi chung 3 Contrast

Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 23.0553 1.59013

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong amoni 12h Analysis of Variance for Ham luong amoni 12h - Type III Sums of Squares Df Mean Source of

Square

24

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem Sum Squares 956.849 1 956.849 P- F- Value Ratio 412.65 0.0024

Đồ án tốt nghiệp

4.84 0.1711 22.468 4.63763 983.954 2 11.234 2 2.31882 5

39.9983 Stnd. Error Lower Upper Limit Limit

52.6267 0.879169 48.8439 56.4094 0.879169 23.5872 31.1528 27.37 1.07676 42.735 1.07676 38.63 1.07676 38.63 38.1021 47.3679 33.9971 43.2629 33.9971 43.2629 3 3 2 2 2

B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni 12h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 6 GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong amoni 12h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS LS Sigma Homogeneous

Groups

0.879169 X

Mean 27.37 52.6267 0.879169 X

3 Khao sat Doi chung 3 Contrast

Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 25.2567 5.34963

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong amoni 24h Analysis of Variance for Ham luong amoni 24h - Type III Sums of Squares Df Mean Source F-Ratio P- of

Square Value

25

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem Sum Squares 882.821 1 882.821 4299.11 0.0002

Đồ án tốt nghiệp

0.9000 2 0.20535 5 0.0456333 2 0.0228167 0.11 0.4107 883.278

35.0233 Stnd. Error Lower Upper Limit Limit

46.0276 48.279 21.7676 24.019

47.1533 0.26163 22.8933 0.26163 0.320429 33.5213 36.2787 34.9 0.320429 33.7063 36.4637 35.085 0.320429 33.7063 36.4637 35.085 3 3 2 2 2

B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni 24h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 6 GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong amoni 24h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS

LS Sigma Homogeneous Groups

Mean 22.8933 0.26163 X 47.1533 0.26163 X

3 Khao sat Doi chung 3 Contrast

Sig. Differen ce * 24.26 +/- Limits 1.59198 - chung

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong amoni 36h Analysis of Variance for Ham luong amoni 36h - Type III Sums of Squares Df Mean Source of

Square

26

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem Sum Squares 1993.63 1 1993.63 P- F- Value Ratio 237.96 0.0042

Đồ án tốt nghiệp

0.14 0.8807 2.2707 16.756 2012.66 2 1.13535 2 8.37802 5

Lower Upper Limit Limit Stnd. Error

B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni 36h with 95.0 Percent Confidence Intervals Count Mean Level 28.805 6 GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat 47.0333 1.67113 39.843 54.2236 10.5767 1.67113 3.3863 17.767 3 3

8

Lap lai 1 2 29.675 2.04671 20.868 38.4813

7

2 2 28.37 2.04671 19.563 37.1763 7

3 2 28.37 2.04671 19.563 37.1763 7

Multiple Range Tests for Ham luong amoni 36h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS LS Sigma Homogeneous Groups

Mean 10.5767 1.67113 X 47.0333 1.67113 X

3 Khao sat Doi chung 3 Contrast Sig. Differen ce +/- Limits

- chung * 36.4567 10.1686

27

Doi Khao sat Multifactor ANOVA - Ham luong amoni 48h Analysis of Variance for Ham luong amoni 48h - Type III Sums of Squares

Đồ án tốt nghiệp

Source of Df Mean F-Ratio P-

Square Value

Sum Squares 167.587 0.1875 0.1875 167.962 1 167.587 2 0.09375 2 0.09375 5 1787.60 0.0006 0.5000 1.00

Stnd. Count Mean Error 6.035 6 Lower Limit Upper Limit

11.32 0.176777 10.5594 12.0806 0.75 0.176777 -0.0106087 1.51061 6.16 0.216506 5.22845 6.16 0.216506 5.22845 5.785 0.216506 4.85345 7.09155 7.09155 6.71655 3 3 2 2 2

MAIN EFFECTS A:Thi nghiem B:Lap lai RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Table of Least Squares Means for Ham luong amoni 48h with 95.0 Percent Confidence Intervals Level GRAND MEAN Thi nghiem Doi chung Khao sat Lap lai 1 2 3 Multiple Range Tests for Ham luong amoni 48h by Thi nghiem Method: 95.0 percent LSD Thi nghiem Count LS LS Sigma Homogeneous Groups

Mean 0.75 11.32 0.176777 X 0.176777 X

Khao sat 3 Doi chung 3 Contrast

Sig. Differen ce * 10.57 +/- Limits 1.07566 chung -

28

Doi Khao sat

+ của mẫu đối chứng (ĐC) và khảo sát

-, NO2

Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH -, NH4 Kết quả xác định hàm lượng NO3

(KS) khi chạy mô hình xử lý nước thải quy mô phòng thí nghiệm.

-

-

+

Giờ NO3 NO2 NH4

0

29

12

Đồ án tốt nghiệp

24

30

36

Đồ án tốt nghiệp

31

48