Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Phạm Khánh Hưng

MSSV: 105111082

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CẢM ƠN

Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việc

làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cách

làm việc một mình cũng như trong tập thể. Tuy có những thành công và cũng không

tránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths. Phạm

Minh Nhựt. Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đã

giúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học. Những lời khuyên, kinh

nghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp

em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống. Em cảm ơn thầy!

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang. Chính lòng

nhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của một

người làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quá

trình làm đồ án. Em cảm ơn chị rất nhiều!

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinh

học – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths. Huỳnh Văn Thành đã tạo điều

kiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thí

nghiệm.

Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thời

gian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn.

Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quá

trình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua. Xin gửi lời cảm ơn đến

hai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viên

trong suốt quá trình làm đồ án.

Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánh

bên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian

qua. Con xin chân thành cảm ơn mọi người!

Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014

Sinh viên

Phạm Khánh Hưng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết

quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ công

trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu của

mình.

Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014

Sinh viên,

Phạm Khánh Hưng

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của con

người ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhu

cầu ăn uống của con người cũng được nâng cao. Cũng từ đó, công tác bảo quản thực

phẩm luôn là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói

riêng. Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâm

nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người.

Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiều

phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,

việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, do sự

thiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng các

hóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định. Trong khi

đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu,

đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian.

Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng

phương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môi

trường.

Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảo

quản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thì

hướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và

đặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. Do đó, việc

nghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thực

phẩm ngày được quan tâm phát triển.

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm.

Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản

thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng không xa lạ với

chúng ta, đó là vi khuẩn lactic, những vi khuẩn này được con người chúng ta sử

Đồ án tốt nghiệp

dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay. Bacteriocin là hợp chất

kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩn

Gram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh

mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Ngoài bacteriocin,

các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môi

trường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic,

acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng

và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thực

phẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừng

khẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao.

Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sát

yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi

khuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống. Kết quả đã phân lập

được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền

thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định được

thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng

khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L.

plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính

kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa được

xác định. Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

các hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể

làm tiền đề cho các ứng dụng sau này.

Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt”. Nghiên cứu

này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chất

bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực

Đồ án tốt nghiệp

phẩm. Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công

nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí

Minh.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả

bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum

SC01.

3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum SC01.

- Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn

Lactobacillus plantarum SC01.

4. Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất

kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang

(2013).

- Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus

plantarum SC01 đối với thịt heo.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan vi khuẩn lactic

1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

1.1.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic

Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thích

được quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic.

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên tách

được acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của

chuỗi phản ứng của quá trình lên men.

Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt

động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic.

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt

tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt,

2001).

Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu.

Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881

(Nguyễn Lân Dũng, 2002).

Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn. Do đó, các

chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao. Trong

đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và

Streptococcus.

Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩm

chính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat.

Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau,

củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc

miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt, trong sản các sản

phẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi

Đồ án tốt nghiệp

khuẩn lactic. Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút

các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998).

Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau:

- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L. bulgarius, L. helviticus, L.

casei, L. ferment, L. brevis. Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải

tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose.

- Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau

quả, trái cây: L. plantarum, L. delnikii, L. ferment, L. brevis.

- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L. acidophilus, S.

faecalis, S. bovis, S. salivanius, S. pyogenes.

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái

Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra

hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường,

điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi.

- Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính

khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài.

Hình 1.1. Tế bào Streptococcus

- Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu

khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Tế bào Pediococcus

- Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình que, có lúc

lại có hình ovan.

Hình 1.3. Tế bào Bifidobacterium

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5

– 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung.

Hình 1.4. Tế bào Leuconostoc

Đồ án tốt nghiệp

- Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que

ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm).

Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến

nhất.

Hình 1.5. Tế bào Lactobacillus

1.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa

Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thống

nhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm

này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau.

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử.

Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên men

được saccharose và một số khác không lên men được maltose. Một số vi khuẩn

lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài

L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột).

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổng

hợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase.

Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thành

phần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP. Các LAB chỉ có thể tạo

ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn

Đồ án tốt nghiệp

cacbon. Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng có

thể phát triển trong điều kiện hiếu khí.

Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là con

đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate. Con

đường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó con

đường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol,

acetate… (Khalid, 2011).

1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển được +. Vi khuẩn lactic trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4

cần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển.

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn

(glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các

polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbon

khác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau.

Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic là

monosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào

và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic...

(Tortora và Funke, 1992).

Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp

được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và

phát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có

một số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ.

Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm

(Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994):

- Nhóm cần phức hợp các acid amin.

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon.

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy

nhất.

Đồ án tốt nghiệp

Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton,

peptit, cazein...

Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng. Các vi

khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai

trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả

năng sinh tổng hợp được vitamin. Vitamin thường được bổ sung vào môi trường

bằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men...

Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acid

pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin... Các acid nicotinic và acid pantotenic

đặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998).

Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ,

độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy.

Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng có

ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩn

này. Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng:

- Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin...

- Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin...

- Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic.

Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic. Chúng vừa có vai trò

cung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các

acid amin tự do.

Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người ta

thường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vai

trò là chất đệm. Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạt

tính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch.

Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt là

magiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic.

Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi

có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom. Mangan và magiê còn là

Đồ án tốt nghiệp

yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme. Magiê còn có tác dụng làm tăng khả

năng hấp thu đường của vi khuẩn lactic. Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng

làm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần Thanh

Thủy, 2003).

1.1.3. Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic. Tùy

theo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lên

men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình.

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic

và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng,

2002).

Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men

lactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phương

thức trên.

1.1.3.1. Lên men lactic đồng hình

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acid

lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB

(Embden – Meyerhof – Parnas). Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân

tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớn

trong công nghiệp thực phẩm.

Vi khu ẩn lactic

Phương trình tóm tắt:

Lên men đồng hình

C6H6O6 + 2ADP + 2Pv 2CH3-CHOH-COOH + 2ATP

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình

Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.

acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricus, L .casei, Streptococus, S. cremoris, S.

thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

1.1.3.2. Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid

lactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,

etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành các

sản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997).

Phương trình tóm tắt:

2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q

Trong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol

20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%.

Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat).

Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và

trizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con

đường PP. Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra

tương tự như lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật,

môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999).

Đồ án tốt nghiệp

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides,

L. oenos, L. cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Bifidobacterium bifidum.

Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2

như sự lên men lactic dị hình thông thường.

Hình 1.7. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình

1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

1.2.1. Phân loại

Theo Orla – Jensen (1919) và Bergey (1923) vi khuẩn Lactobacillus

plantarum thuộc:

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Lactobacillales

Họ: Lactobacillaceae

Chi: Lactobacillus

Loài: Lactobacillus plantarum

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

L. plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 –

1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm. Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic và đã được giải mã hoàn toàn. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năng

chịu nồng độ NaCl 5,5 %.

Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng

lên men.

- Nhóm I chỉ lên men hexose duy nhất thành axid lactic và không thể lên men

gluconate hay pentoses.

- Nhóm II vừa có thể lên men hexose thành axid lactic, vừa có thể lên men

gluconate hay pentose.

- Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2.

Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa

của con người. L. plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong

quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải… L.

plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như

một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến.

L. plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid. Chúng không có

khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường

khác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid. Việc sinh ra NO giúp ngăn

chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter

pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011).

L. plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy. Khi có oxy, L. plantarum

có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide. Khi không có oxy, L. plantarum sẽ

lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình).

L. plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng. Mangan giúp cho L. plantarum

chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2.

H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganese

cofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983).

Đồ án tốt nghiệp

L. plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều

kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non. Kí

sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng

tích cực đến tế bào vật chủ.

L. plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên

men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn

(Molin, 2010).

1.2.3. Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum

Cũng như các chủng LAB khác, L. plantarum đều trải qua quá trình lên men

lactic. Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo ra

chiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic,

ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic,

acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của

nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm.

Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con

đường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và

diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate.

Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L. plantarum,

plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh

tổng hợp protein nhờ ribosome. Trong tế bào L. plantarum có mang các gene mã

hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins. Qua quá trình

phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo ra

plantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn.

1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum sản sinh ra

1.3.1. Plantaricin

Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L. plantarum sản xuất ra ít nhất 6

bacteriocins khác biệt. Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền

chất có chứa glycine. L. plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen

PlnE và PlnF. Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và

Đồ án tốt nghiệp

PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt

(PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai

vùng điều hòa PlnC và PlnD. Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L.

plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với

L. plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và

Propionobacteria.

Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau. Chúng gồm

30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương

tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau. Các bacteriocins hoạt động

với tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ. Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻ

hoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả.

Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide

phân lập từ L. plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh. Các gen cấu trúc chỉ

ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motif

đôi. Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino. Plantaricin S được coi là kiểm

soát quá trình lên men và bảo quản ô liu. Một bacteriocin gồm hai peptide khác là

plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Các thành phần

lantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự

(Zacharof và Lovitt, 2012).

1.3.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác

Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L.

plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản

sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus…

Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho

vi khuẩn bị mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đường

phân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các

Đồ án tốt nghiệp

anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ức

chế sinh trưởng hoặc có thể chết.

Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con

đường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong quá trình tăng trưởng

hiếu khí của L. plantarum. Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác

động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát

triển. Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các

vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị

tiêu diệt.

1.4. Bacteriocin và quá trình thu nhận, tách chiết, tinh sạch các hợp chất

kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic

1.4.1. Hợp chất bacteriocin

Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên vào năm 1925 trong quá trình

nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự

phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi

khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt vi

khuẩn E. coli.

Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ở

riboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin có hoạt tính

kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số

vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng

sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật.

Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động

của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống…Các

bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp. Đặc tính diệt

khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi

các dung môi hữu cơ. Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷ

phân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính. Do có bản chất protein nên

Đồ án tốt nghiệp

bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể

người và các vấn đề sức khoẻ khác.

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên, việc

phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Bacteriocin được phân loại với

nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng

và trì nh tự chuỗi amino acid. Bacteriocin được chia thà nh 3 lớp:

- Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (<

5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic

bacteriocin lớp I được chia thành 2 lớp phụ:

+ Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất. Nisin

thuộc nhóm này.

+ Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện

âm hoặc không tích điện. Đại điện: Meracidin.

Hình 1.8. Bacteriocin lớp I

- Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên,

ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường. Nhóm này được chia thà nh 3

lớ p nhỏ:

Đồ án tốt nghiệp

+ Lớ p IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại

diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P. Các

bacteriocin nhóm này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp.

+ Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, những

peptid này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là:

Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK.

+ Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin không

đồng nhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau. Đại diện:

Divergicin A và Acidocin B.

- Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, không

bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khả

năng bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Đại diện gồm có Acidofilicin

A và Lactacins A, B.

- Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành

phần lipid và cacbohydrate. Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức

năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch.

1.4.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus,

Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram

âm kém vì màng ngoài của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin.

Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàm

lượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm.

Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng.

Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngoài tế bào. Không gây nguy hiểm

sinh lý tế bào.

- Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong

tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của Bacteriocin

Trong đó:

- Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotic gồm những phân tử lưỡng tính dài có thể

tiêu diệt các tế bào bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất.

- Lớp II (Sakasin): mang điện dương trong môi trường trung tính và chứa

một vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực. Dẫn đến làm thay đổi tính thấm của màng

tế bào.

- Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào.

1.4.3. Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng

khuẩn

Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm. Đặc

biệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiện

sản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp. Lợi thế của việc sản xuất invitro là

do không có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế,

bất hoạt bởi protease. Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm soát các quy trình lên men thì

sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến

Đồ án tốt nghiệp

các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon và

Phumkhachorn, 2010).

Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tử

bacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học. Ngoài ra, nhiệt

độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trò quan trọng

trong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làm

giảm khả năng sản xuất. Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đến

sản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối.

Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộc

vào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và quá trình chuyển hóa

của LAB.

Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thể

được phân biệt:

- Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammonium

sulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao

áp.

- Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủa

ammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược pha

lỏng cao áp.

- Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cô lập thông qua một quy

trình duy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độ

hấp thụ bacteriocin có sẵn thông qua điều chỉnh pH của môi trường lên men thô.

Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phương

pháp đầu tiên.

Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh

sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus

amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium

RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi

Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007).

Đồ án tốt nghiệp

1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn

a. pH

Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0. Hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin vẫn hoạt động trong môi trường có tính acid hoặc trung tính. Sự ổn

định của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thực

phẩm. Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốt

trong pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong môi trường có pH 8,0 - 12,0.

b. Nhiệt độ

Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phòng, hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ được hoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạt

động yếu ở nhiệt độ thấp.

c. Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme

Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tính

kháng khuẩn của bacteriocin. Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin và

trypsin không gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ các

chủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001).

d. Các chất hoạt động bề mặt

Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khả

năng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau. Đối với hợp chất

kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS,

Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5

mM vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv,

2011). Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lại

làm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA

và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất

từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013).

Đồ án tốt nghiệp

1.5. Một số phƣơng pháp bảo quản thực phẩm và tình hình ứng dụng các sản

phẩm từ vi sinh vật

1.5.1. Một số phương pháp bảo quản thực phẩm

Thực phẩm không được bảo quản thường bị biến đổi dẫn đến mất giá trị dinh

dưỡng và giá trị cảm quan. Những biến đổi đó do những nguyên nhân sau:

- Do vi sinh vật: vi sinh vật có sẵn trong thực phẩm hoặc nhiễm từ bên ngoài

vào.

- Do enzyme: enzyme có sẵn trong tế bào vi khuẩn có trong nguyên liệu thực

phẩm.

- Do phản ứng giữa các chất bên trong thực phẩm với nhau và chất bên trong

thực phẩm với bao bì.

- Do độc tố: độc tố vi khuẩn có sẵn trong thực phẩm.

- Do kí sinh trùng và côn trùng.

Có nhiều phương pháp để bảo quản thực phẩm gồm: phương pháp vật lý,

phương pháp hóa học và phương pháp sinh học.

1.5.1.1. Phương pháp vật lý

a. Phương pháp làm khô

 Phương pháp sấy tự nhiên (phơi nắng)

- Là phương pháp sử dụng nhiệt của ánh sáng mặt trời để làm khô sản phẩm

- Thích hợp cho các loại hạt ngũ cốc, các loại thủy sản ướp muối (cá, tôm,

mực…)

- Hong khô rau quả mà không cần nắng.

 Phương pháp sấy nhân tạo

- Sấy khô: dùng lò sấy than, củi… để làm bay hơi nước trong thực phẩm.

Chất lượng sản phẩm không cao (chất dinh dưỡng, vitamin bị ảnh hưởng).

- Sấy phun: đặc thù của phương pháp này là cô đặc sản phẩm bằng cách dùng vòi phun cao áp dạng sương mù trong buồng sấy có nhiệt 950C để diệt các vi sinh

vật đồng thời tạo ra sản phẩm khô.

Đồ án tốt nghiệp

- Sấy thăng hoa: nước trong thực phẩm (thể lỏng) chuyển sang dạng hơi nước

và tạo thành thể rắn.

- Sấy bằng bức xạ: làm sản phẩm nóng bằng cách dùng các đèn hồng ngoại

có công suất 250-500W, chiếu tia hồng ngoại (0,75 - 4µm) vào sản phẩm.

- Sấy bằng điện cao tần: là phương pháp đặt sản phẩm sấy vào điện trường

xoay chiều có tần số dao động cao (500kHz) giúp cho sản phẩm khô đều và nhanh.

Để giữ sản phẩm được trong thời gian dài thì các sản phẩm sau khi làm khô

phải được làm nguội ngay, bao gói tốt, tránh hút ẩm trở lại, giữ nơi khô mát.

b. Phương pháp sử dụng nhiệt

 Phương pháp nhiệt độ thấp

- Làm lạnh: chủ yếu được áp dụng để bảo quản rau quả tươi. Nhiệt độ hạ xuống gần 00C, tinh thể nước đá chưa xuất hiện, hệ thống men

(trong nguyên liệu và trong VSV) hoạt động yếu đi dẫn đến kìm hãm những biến

đổi về lý, hóa, sinh; hoạt động vi sinh vật.

- Làm lạnh đông (đông lạnh): là phương pháp giúp giữ thực phẩm vài tháng

đến vài năm.

Nhiệt độ của thực phẩm được hạ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của các dung

dịch nước trong thực phẩm giúp phần lớn nước trong thực phẩm bị đóng băng,

màng tế bào của vi sinh vật bị nén mạnh. Các quá trình sống của vi sinh vật và hoạt

động của các hệ thống men bị kiềm chế.

 Phương pháp nhiệt độ cao: là phương pháp diệt vi sinh vật và cả bào tử của

chúng

- Thanh trùng Pasteur (gián đoạn và liên tục)

Thanh trùng gián đoạn: phương pháp này dùng một lò hấp Pasteur, bên trong

có một thùng chứa được bao quanh bởi hơi nước lưu thông. Trong thùng chứa này,

sữa được làm nóng và được khuấy đều trong suốt thời gian khử trùng. Sau đó sữa có

thể được làm nguội trong thùng chứa. Ngoài ra, người ta có thể làm nóng sữa một

phần trong một lò hình ống trước khi đưa vào thùng chứa. Phương pháp này ít dùng

để thanh trùng sữa, thường dùng để thanh trùng những sản phẩm từ sữa hơn.

Đồ án tốt nghiệp

Thanh trùng liên tục: trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp

Pasteur tiệt khuẩn nhanh ở nhiệt độ cao. Môi trường làm nóng sản phẩm có thể chứa hơi nước hoặc nước nóng ở chân không. Sữa thô ở 40C được cho chảy qua các thíết

bị của lò hấp Pasteur này, nó dược làm nóng đến nhiệt độ khử trùng khoảng 720C/16 giây. Sau khi khử trùng, sữa được chảy vào một thiết bị làm nguội đến 40C

hoặc thấp hơn. Sau cùng, sữa được chuyển vào một hệ thống đóng gói sản phẩm.

- Phương pháp UHT (Ultra-high temperature) Phương pháp UHT thanh trùng thực phẩm ở nhiệt độ lớn hơn 100oC, thực

phẩm được thanh trùng trước khi đóng gói, rồi được cho vào các đồ chứa đã được

khử thanh trong điều kiện vô trùng.

Phương pháp UHT tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và bào tử, kể cả vi sinh vật

chịu nhiệt có bào tử. Thực phẩm dược xử lí bằng phương pháp UHT có thể để được

đến 6 tháng mà không cần làm lạnh.

c. Phương pháp sử dụng tia bức xạ

Trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp Pasteur tiệt khuẩn

nhanh ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên việc chiếu xạ lại gây nguy hiểm cho con người khi

ăn các loại thực phẩm này.

d. Phương pháp hút chân không

Ở phương pháp này, người ta đặt các sản phẩm thực phẩm trong những bao bì

không thấm khí và hút không khí ở trong ra, tạo ra một môi trường chân không.

Trong trường hợp này những quá trình oxi hoá thường xảy ra dưới tác dụng

của không khí bị kìm hãm mạnh, lớp bề mặt của sản phẩm không bị khô, giữ được

màu sắc và tính chất ban đầu của sản phẩm.

e. Phương pháp dùng dòng điện cao tần

Sản phẩm được đặt trong điện trường của dòng điện xoay chiều có tần số cao

để thanh trùng.

Các phân tử tích điện trong sản phẩm (ion, điện tử) sẽ dao động do tác dụng

của điện năng, chuyển điện năng được hấp thụ thành nhiệt năng để làm chết vi sinh

vật.

Đồ án tốt nghiệp

f. Phương pháp siêu âm

Siêu âm là sóng âm có tần số dao động cao mà con người không cảm thụ

được. Dưới tác dụng của siêu âm, môi trường lỏng (sản phẩm) truyền âm bị xô đi

đẩy lại, bị ép và tạo chân không liên tiếp sinh ra nhiều khoảng trống. Lúc đó, các

chất hòa tan và hơi của chất lỏng lập tức dồn vào các khoảng trống ấy, gây ra tác

dụng cơ học làm chết vi sinh vật ở trong môi trường.

g. Phương pháp lọc thanh trùng

Kỹ thuật màng lọc góp phần bảo quản thực phẩm bằng cách giữ lại vi sinh vật

trên màng và do đó dịch lỏng thấm qua sẽ vô khuẩn.

h. Phương pháp đóng gói bằng thay đổi khí quyển

Tính năng của công nghệ bảo quản bằng cách bao gói sản phẩm trong khí

quyển thay đổi (MAP) nhằm kéo dài tuổi thọ của thực phẩm đã được nhận biết cách

đây nhiều năm. Ngày nay thực phẩm đóng gói trong MA bao gồm thịt tươi và nấu

chín, thịt gia cầm và cá, rau quả, mì sợi, phomat, các loại bánh nướng từ bột mì,

khoai tây chiên, cà phê và trà.

i. Bảo quản bằng áp lực thủy tĩnh cao

Dựa trên nguyên tắc thủy tĩnh, áp lực thủy tĩnh tại một điểm cho trước bằng

nhau ở mọi hướng và áp lực được truyền đi lập tức và giống nhau qua môi trường

truyền áp lực.

Sử dụng phương pháp vật lí có thể bảo quản thực phẩm tốt nhưng gây tốn

kém, quá trình phức tạp và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng khi sử

sụng các tia chiếu xạ.

1.5.1.2. Phương pháp hóa học

Sử dụng các chất hóa học để ức chế tác nhân làm biến đổi các thành phần hóa

học trong thực phẩm.

- SO2 (sulfurous dioxide): Khí SO2 ảnh hưởng đến các quá trình oxy hóa

trong tế bào vi sinh vật, đồng thời cũng có tác dụng tương hỗ với các nhóm

cacboxyl của các hợp chất đặc biệt có trong thành phần của chất nguyên sinh, làm

Đồ án tốt nghiệp

thay đổi trạng thái lý, hóa học của chất nguyên sinh. Khí SO2 dùng trong bảo quản

rau quả. Không dùng các hợp chất SO2 để bảo quản thịt, ngũ cốc, đậu đỗ, sữa.

- NO3 (nitrate): NaNO3, KNO3. Nitrit được ứng dụng trong công nghiệp chế

biến thịt với mục đích giữ màu đỏ cho thịt muối mặn, làm thuốc sát khuẩn trong bảo

quản cá, thịt và các chế phẩm từ cá, thịt (cá, thịt muối hoặc ướp lạnh). Sử dụng làm

chất sát khuẩn và giữ màu cho thịt, các sản phẩm thịt, cá và phomat. Khi ăn phải

thức ăn chứa nhiều nitrit có thể gây ngộ độc.

- Acid benzoic, muối benzoat: ức chế mạnh nấm men và nấm mốc, có tác

dụng yếu đối với vi khuẩn. Tác động lên màng tế bào nấm, ức chế quá trình hô hấp

của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, ức chế quá trình biến

dưỡng các hợp chất đa lượng (N, P,…) của sinh vật. Acid benzoic được sử dụng

nhiều trong bảo quản trái cây và rau quả.

Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm thay đổi mùi vị sản phẩm, ảnh hưởng tới

thận của người sử dụng.

Dùng benzoic hoặc benzoat trong bảo quản sản phẩm có thể làm cho sản phẩm

bị thâm đen, và dễ nhận biết dư vị, làm giảm chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm.

Acid benzoic có thể tác động hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây kích

ứng mắt.

- Ester diethyl của acid pyrocarbonic : ethylpyrocarbonat hoàn toàn không

độc đối với người, khi tiếp xúc với nước sẽ phân hủy dần dần thành ethanol và

CO2.Dùng trong bảo quản nước quả, quả tươi. Sử dụng ethylpyrocarbonat để thay

thế phương pháp sulfite hoá trong bảo quản rượu nho và nước quả.

- Carbonic (CO2): Khí carbonic tác động tới quá trình trao đổi chất của vi

sinh vật, ức chế một vài quá trình biến dưỡng của vi sinh vật. Nấm mốc nhạy cảm

hơn đối với khí carbonic, còn vi khuẩn thí ít nhạy cảm hơn. Nồng độ khí carbonic

cao ức chế sự phát triển của những vi khuẩn hiếu khí và cả vi khuẩn yếm khí.

- Ozon (O3): Ozon có tính oxi hóa rất mạnh, tác động trực tiếp tới các chất

sống gây biến đổi và bất hoạt các đại phân tử sinh học, gây rối loạn các hoạt động

sống của vi sinh vật.

Đồ án tốt nghiệp

- Chất gia tăng áp suất thẩm thấu : Sử dụng đường hay muối trong bảo quản

thực phẩm làm gia tăng áp xuất thẩm thấu của môi trường, tạo áp suất thẩm thấu

cao nên nước trong tế bào thấm ra khỏi màng tế bào chất và gây ra hiện tượng co

nguyên sinh, đồng thời tế bào vi sinh vật không thể hấp thu được các chất dinh

dưỡng, làm ức chế hoạt động và sự phát triển của vi sinh vật.

- Acid acetic (ngâm dấm): acid acetic làm giảm pH của sản phẩm, làm cho

quá trình trao đổi ion của vi sinh vật không thực hiện được. Sự thay đổi quá lớn của

nồng độ ion trong và ngoài màng tế bào làm rối loạn các quá trình trao đổi chất của

vi sinh vật, ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm.

- Kháng sinh được sản xuất theo phương pháp hóa học: các chất kháng sinh

có tác dụng chủ yếu với vi khuẩn, tác động yếu đối với nấm mốc, nấm men. Tác

dụng là là làm ngưng tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; phá vỡ tính thẩm thấu của

màng tế bào, ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, ảnh hưởng đối

với acid nucleic. Các chất kháng sinh được phép dùng: biomixin (clotetraxyclin),

teramixin, oreomixin,…

- Chất chống oxy hóa: các chất chống oxy hóa có đặc tính dễ bị oxi hóa hơn

so với các chất béo có trong thực phẩm. Sự oxi hóa các hợp chất chống oxi hóa sẽ

làm giảm sự oxi hóa của các chất béo trong thực phẩm. Các chất chống oxy hóa có

hai dạng như sau:

Acid (hoặc muối hay ester của chúng) như acid citric, acid ascorbic,... Hợp

chất phenol làm chậm khả năng oxy hóa chất béo và dầu có trong thực phẩm.

Phương pháp hóa học làm thực phẩm dễ bị nhiễm và tích lũy các chất hóc học

gây độc trong thực phẩm, gây tác dụng xấu cho con người

1.5.1.3. Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học là phương pháp bảo quản thực phẩm nhờ vi sinh vật, nó

đem lại hiệu quả cao và không gây độc cho con người, ví dụ:

- Phương pháp lên men

Đồ án tốt nghiệp

Sử dụng các vi sinh vật lên men tạo ra acid làm thay đổi pH môi trường ức chế

sự phát triển của vi sinh vật gây hại thực phẩm và kéo dài thời gian bảo quản thực

phẩm. Điển hình là vi khuẩn lactic.

Trong quá trình lên men, các vi khuẩn này tiết ra acid lactic và acid acetic làm

acid hóa môi trường, kiềm hãm và tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm. Ngoài

ra, vi khuẩn lactic còn tiết ra bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao.

- Phương pháp sử dụng bacteriocin

Bacteriocin là các protein có tính kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng và gây

ngộ độc thực phẩm, nó được các vi sinh vật chủ yếu là nhóm vi khuẩn sinh lactic

tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Nisin là một bacteriocin được sinh

ra bởi Lactococcus lactis và Streptococcus lactis. Nisin liên kết với anion

phospholipid sau đó chúng di chuyển vào tế bào gây rối loạn quá trình trao đổi ion

và làm chết vi sinh vật. Bacteriocin dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biến

phomat, bảo quản đồ hộp, nước ép quả đóng hộp…

- Phương pháp sử dụng enzyme

Lyzozyme có trong sữa động vật, xúc tác quá trình cắt đứt nối peptidoglycan

trên vách tế bào vi khuẩn.

Lactose peroxidase và Glucose peroxidase từ sữa bò A.niger, xúc tác quá trình

oxy hóa, giải phóng chất độc hay các sản phẩm làm bất hoạt vi khuẩn.

Glucose oxidase từ Penicillium, A.niger, xúc tác quá trình oxy hóa loại bỏ cơ

chất hay chất dinh dưỡng.

Hydrolase từ các nguồn khác nhau, xúc tác quá trình thủy phân polysaccharide

ngoại bào.

1.5.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới và tại Việt

Nam

1.5.2.1. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới

Sản phẩm công nghệ sinh học nói chung và sản phẩm từ vi sinh vật nói riêng

đã được ứng dụng vào nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược, môi trường,

trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

Đồ án tốt nghiệp

a. Trong công nghiệp sản xuất acid lactic

Từ năm 1881, con người đã bắt đầu ứng dụng lên men lactic để sản xuất acid

lactic ở quy mô công nghiệp.

Từ các nguyên liệu như rỉ đường, tinh bột, dịch thải công nghiệp sản xuất

đường và bánh kẹo, dịch thủy phân từ cám gạo, cám ngô, người ta sản xuất một

lượng lớn acid lactic đáp ứng cho nhu cầu của nhiều ngành công nghiệp: dược, dệt,

da, nhuộm, chất dẻo, mỹ phẩm, sơn và vật liệu cao cấp…

Vi khuẩn lactic được sử dụng cho mục đích này thuộc loại lên men đồng hình, có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 45 – 480C, có lợi thế để ngăn ngừa sự gây nhiễm,

như: Lactobacillus delbruckii, L. bulgaricus, L. leichmanii. Nguồn đạm cần cho sự

lên men tạo acid lactic thường là dịch chiết ngô hay sunphat amon. Gần đây, người ta sử dụng vi khuẩn lactic cố định trong alginate natri để lên men liên tục ở 430C,

pH = 5,7 với hiệu suất lên men đạt 97% (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Acid lactic

được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, trong in ấn,

chế tạo chất dẻo, sơn, dược phẩm và mỹ phẩm.

Lactate natri, lactate canxi và một số muối lactic khác được dùng làm chất giữ

ẩm, chất nhủ hóa, chất làm đông trong ngành mỹ phẩm… Lactate sắt được dùng để

bổ sung sắt cho sữa mẹ và bệnh nhân thiếu máu.

Acid lactic còn được dùng làm nguyên liệu để chế các sản phẩm dưỡng tóc và

làm giảm sự lão hóa của tóc. Lactate canxi cũng được dùng làm nguyên liệu trong

sản xuất kem đánh răng.

b. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Việc sử dụng quá trình lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, thịt, cá,

trứng, sữa không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà con nhằm đưa ra thị trường có

tính chất và hương vị mong muốn. Đây là một trong những phương pháp bảo quản

thực phẩm phổ biến hiện nay.

Có thể thực hiện quá trình lên men thực phẩm theo 2 cách:

Đồ án tốt nghiệp

- Sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu hoặc có sẵn trong

không khí. Theo cách này, người ta thường áp dụng để chế biến các thực phẩm lên

men ở quy mô nhỏ, thủ công, trang thiết bị đơn giản.

- Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuẩn chủng bổ sung vào nguyên liệu để

điều khiển quá trình lên men. Phương pháp này được áp dụng ở quy mô công

nghiệp như sản xuất sữa chua, phomat, váng sữa, bơ.

- Ngoài việc sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản thực phẩm,

người ta còn dùng chúng để sản xuất một lượng acid lactic và muối lactate dùng làm

phụ gia thực phẩm. Các vi khuẩn lactic cũng đóng vai trò rất quan trọng trong sản

xuất bánh mì đen (Tortora và Funke, 1992).

Gần đây người ta phát hiện ra vài trò to lớn của vi khuẩn lactic với sức khỏe

của người và động vật. Khu hệ vi khuẩn lactic trong đường ruột người và động vật

có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh, tăng cường tiêu hóa, bảo vệ đường

ruột. Các nghiên cứu về vấn đề này làm cơ sở tạo ra các chế phẩm sống (probiotic)

giúp cân bằng hệ VSV đường ruột, giảm cholesteron trong máu, bệnh không dung

nạp lactoza, viêm dạ dày cấp. Các chế phẩm này còn tạo ra các thức ăn có bổ sung

khoáng, vitamin cho người bệnh, người ăn kiêng và gia súc, gia cầm (Vũ Hồng

Thắng, 1998).

Nhờ giá trị đặc biệt của các thực phẩm lên men lactic đối với sức khỏe con

người mà đến nay các sản phẩm lên men ngày càng được sử dụng rộng rãi và được

tiêu thụ với khối lượng rất lớn.

c. Trong nông nghiệp

Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic có sẵn trong đất đã phân giải dường và

cacbon hydrat tạo thành acid lactic. Acid này có tác dụng như:

- Kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi, đặc biệt là hệ vi sinh vật

phân giải đường, tạo điều kiện phân giải nhanh các đại phân tử hữu cơ trong đó có

các chất khó phân gải như lignin, cenlulose, tinh bột mà không gây hại cho đất.

- Ức chế sự phát triển của các vi nấm có hại như Fusarium, giun tròn và các

đối tượng chuyên phá hại mùa màng.

Đồ án tốt nghiệp

Trong chăn nuôi, vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình ủ chua thức ăn gia

súc. Nhờ ủ chua, thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi, phần lớn các

chất dinh dưỡng như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh… được bảo đảm góp phần

tăng năng suất trong chăn nuôi, đồng thời góp phần hạ giá thành sản phẩm.

Nhiều loại thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus, nấm đã được sản

xuất, ứng dụng đại trà. Chỉ riêng chế phẩm thuốc trừ sâu Bt, hàng năm đã mang lại

lợi nhận hàng trăm triệu đô la Mỹ. Sản xuất thuốc BVTV sinh học không chỉ phát

triển mạnh ở các nước phương Tây, mà còn phát triển ở cả Trung Quốc, Thái Lan.

Phân bón sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn (Rhizobium, Azotobacter,

Bacillus…), xạ khuẩn (Frankia), nấm (Mycorhiza), tảo lam đã được các nước trên

thế giới nghiên cứu, sản xuất và áp dụng rộng rãi. Phân vi sinh làm tăng năng suất

cây trồng 7-15% và tiết kiệm 20% phân khoáng. Riêng phân vi khuẩn nốt sần,

doanh số thế giới hàng năm đạt 25 triệu USD, trong đó riêng Mỹ chiếm 19 triệu

USD.

d. Trong y học

Acid lactic được sử dụng rộng rãi để điều chế một số loại thuốc sát trùng, một

số loại thuốc dưới dạng muối canxi.

Các vi khuẩn lactic sinh kháng sinh được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu

hóa sống” dùng để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân

bằng hệ VSV đường ruột. Trong đó nỗi bật là L. acilophilus khi bổ sung vào đường

tiêu hóa, tại ruột già chúng phát triển ức chế một số bệnh đường ruột khác. Chúng

tiết ra các chất diệt khuẩn, kháng sinh, chất kháng độc tố kháng hệ miễn dịch kích

thích sự tạo thành interferon làm giảm quá trình hình thành các khối u. Đặc biệt

trong quá trình sinh trưởng các vi khuẩn này thường sử dụng cholesterol nên có vai

trò làm giảm lượng cholesterol được hấp thu vào cơ thể (Salmien và Deighton,

1998).

e. Ứng dụng trong bảo vệ và xử lý môi trường

Xử lý các chất thải, phế liệu trong nông nghiệp - nông thôn bằng công nghệ

vi sinh để bảo vệ môi trường và sản xuất ra khí sinh học (biogas), phân bón hữu

Đồ án tốt nghiệp

cơ… phục vụ dân sinh và nông nghiệp. Những nước có công nghệ phát triển trong

lĩnh vực này là Nhật Bản, Mỹ, EU và Canada.

1.5.2.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men

truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản

phẩm men tiêu hoá đông khô. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước

đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng

khuẩn từ các nguồn sản phẩm lên men và các sản phẩm men tiêu hoá đông khô có

sẵn trên thị trường. Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều

kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực

phẩm tự nhiên.

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các

sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có

nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm

này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng

hợp bacteriocin. Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm

nem chua. Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp

phần tạo hương vị cho nem chua.

Việt Nam đã nghiên cứu hoàn thiện một số công nghệ sản xuất phân vi sinh

vật, thức ăn bổ sung cho gia cầm, chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật và bả diệt chuột

sinh học; ứng dụng thành công công nghệ biogas để xử lý chất thải hữu cơ…

Sử dụng vi sinh vật để làm phân bón (phân VSV cố định Nitơ tự do hoặc hội

sinh; phân VSV phân giải phot phat khó tan từ vi khuẩn hoặc nấm mốc; phân VSV

có nguồn gốc từ nấm Mycorhiza, vi khuẩn Rhizobium, xạ khuẩn Frankia cho cây

lâm nghiệp: Thông, Keo, Phi lao, Sao đen), chế phẩm VSV bổ sung thức ăn gia

cầm...

Chế phẩm thuốc BVTV sinh học được ứng dụng rộng rãi như NPV, V-Bt để

trừ sâu khoang, sâu xanh hại rau, màu, bông, đay, thuốc lá; chế phẩm vi khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

huỳnh quang (Pseudomonas fluorescens) phòng trừ bệnh hại rễ cà phê, vải thiều,

lạc.

Nhiều kết quả nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt côn trùng đã đạt được kết

quả tốt như: Metarhizium flovoviridae trừ mối, châu chấu hại mía (hiệu quả phòng

trừ đạt 76%), Beauveria bassiana trừ sâu róm hại thông (hiệu quả phòng trừ đạt

93,6%), hay Beauveria bassiana và Metarhizium aníopliae phòng trừ sâu hại dừa đạt

hiệu quả từ 56-97%; nấm đối kháng Trichoderma trừ bệnh khô vằn trên ngô đạt

hiệu quả 45-50%, hạn chế bệnh lở cổ rễ đậu tương 51-58%. Hiện nay, các nhà khoa

học đang hoàn thiện qui trình sử dụng nấm Exserohilum monoceras để trừ cỏ lồng

vực.

Trong lĩnh vực xử lý môi trường: đã ứng dụng thành công công nghệ Biogas

để chuyển các chất thải hữu cơ thành khí đốt. Đã xử lý rác thải, than bùn... làm phân

bón. Những nghiên cứu trong ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải,

chuyển đổi sinh học các nguồn phụ, phế thải nông, lâm nghiệp cũng đang được tiến

hành.

1.6. Yêu cầu đối với việc sử dụng chất bảo quản sinh học trong thực phẩm

- Chất bảo quản sinh học được sử dụng không có tính độc và kích thích sự

kháng thuốc của vi sinh vật khác.

- Được cơ quan thẩm quyền công nhận và cho phép sử dụng.

- Phải được sử dụng một cách hợp kinh tế trong công nghiệp.

- Sản phẩm có bổ sung chất bảo quản sinh học phải không bị ảnh hưởng.

Ví dụ: chất bảo quản sinh học không gây tác động xấu đối với đánh giá cảm

quan của sản phẩm.

- Vẫn tỏ ra hiệu quả khi được dùng ở nồng độ tương đối thấp.

- Chất bảo quản sinh học phải đủ bền khi được cất trữ.

- Không được sử dụng trong chữa bệnh hoặc dùng làm phụ gia thực phẩm

cho động vật hay bổ sung vào thức ăn giúp tăng sự phát triển của động vật.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –

Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2014 đến tháng 06/2014.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được sử dụng trong nghiên cứu được cung

cấp bởi Lê Ngọc Thùy Trang (2013).

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella, Listeria monocytogenes được

cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi

trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM.

2.2.3. Nguồn mẫu khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm của hợp chất kháng

khuẩn vi khuẩn L. plantarum

Nguồn mẫu là thịt nạc đùi tươi được mua từ cửa hàng Vissan Quận Bình

Thạnh.

2.2.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.4.1. Môi trường nuôi cấy

Môi trường MRS OPTSC01 (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013)

Môi trường Tryptone Soya Borth (HiMedia - Ấn Độ)

Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

Môi trường Saline Pepton Water (SPW)

Môi trường Plate Count Agar (PCA)

Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB)

Đồ án tốt nghiệp

Môi trường Briliant Green Bile Lactose borth (BGBL)

Môi trường Eosine Methylene Blue Agar (EMB)

Môi trường Tryptone

Môi trường MR-VP

Môi trường Simon Citrate Agar (SCA)

Thuốc thử Kovac’s

Thuốc thử Methyl Red

Thuốc thử α-naphtol 5%

Dung dịch KOH 40%

Dung dịch NaOH 2M

Môi trường Baird Parker (BP)

Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya (RV)

Môi trường Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)

Môi trường TSI

Môi trường Mannitol Phenol Red both

Môi trường Urea broth

Môi trường LDC

2.2.4.2. Dụng cụ và thiết bị

a. Dụng cụ

Đĩa petri Đũa thủy tinh

Ống nghiệm Giấy đo pH

Ống đong 50ml, 100ml Ống Falcon

Becher 100ml, 250ml, 500ml Các loại đầu típ

Pipette 1ml, 10ml, 25ml Đèn cồn

Ống ly tâm Eppendorf Micropipette 100µl, 1000µl

Bình môi trường 250ml, 500ml, 1l Dao cắt mẫu

Dây cấy ria, dây cấy thẳng, que cấy trang Kẹp gắp mẫu

Bông y tế và bông không thấm nước

Đồ án tốt nghiệp

b. Thiết bị

Máy đo UV - VIS

Tủ cấy vi sinh Tủ ấm 300C, 370C Máy ly tâm

Bể điều nhiệt Tủ hút

Cân phân tích Máy lắc

Tủ lạnh Bếp từ

Autoclave Máy nước cất

Máy đo pH

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất

quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ

thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích.

Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường

hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.

Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng

độ cần thiết.

Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng

(Phạm Minh Nhựt, 2014).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu

2.3.2. Phương pháp tăng sinh

Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi

trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi

lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm

bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và

môi trường.

Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trong

glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường MRS broth. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 48 giờ.

Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong

glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa

10ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt

độ phòng.

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật

được cấy trên môi trường thạch nghiêng và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển đến tủ mát (3 – 50C) để bảo quản.

Đồ án tốt nghiệp

Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật

luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh

vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa

là 3 tháng cấy chuyển giống một lần.

Đối với chủng LAB: cấy chuyển định kỳ 2 tuần/1 lần trên ống thạch nghiêng

chứa môi trường MRS agar. Bảo quản trong trong tủ mát.

Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C

(Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, ta

có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ

trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là

việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước

trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn

chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.

Vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút dịch

tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch, thu cặn có chứa sinh khối. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn

Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.3.3. Phương pháp vi gói L. plantarum trong hỗn hợp gelatine và aginate

Nguyên tắc: vi gói là phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các

polymer có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo như gelatine và aginate để bẫy, nhốt

và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ. Giúp tế bào cách

ly được với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự thất thoát

của số lượng tế bào. Vi gói giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào,

các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường không thuận lợi như độ acid

cao, muối mật, sốc nhiệt hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên

men... và sản sinh hợp chất kháng khuẩn tại những nơi ta mong muốn. Từ đó có thể

Đồ án tốt nghiệp

làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại, giúp việc bảo quản chủng, giống tế bào

được lâu dài hơn.

Chủng L. plantarum sau khi tăng sinh cấp 1 trong môi trường MRS đi ly tâm

thu cặn và pha loãng với nước muồi sinh lý với thể tích bằng với lượng dịch trong

bỏ đi. Trôn đều hỗn hợp gelatine (6%) và aginate (2,5%) với nhau theo tỷ lệ 4 : 1

thành một hỗn hợp gel. Tiếp tục trộn đều hỗn hợp gel với sinh khối L. plantarum

theo tỷ lệ 2 : 1, theo nghiên cứu của Lê Trần Hồng Xuân.

Sử dụng ống bơm tiêm hút hỗn hợp gel và sinh khối L. plantarum và nhỏ

thành từng giọt trong dung dịch hổ trợ tạo gel là dung dịch CaCl2 (2%), ngay lập tức

các polymer gelatine và alginate bao quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+ tạo thành các hạt gel tròn chứa chủng L. plantarum. Các thao

tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng (Đỗ Quốc Cường, 2009).

Sau đó có thể bảo quản chúng trong dung dịch đường lactose 10% trong tủ

mát 40C hoặc có thể tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS.

2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp: đối với dịch sau ly tâm của LAB sau khi nuôi cấy trong môi

trường thích hợp được xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị bằng

phương pháp đồng nuôi cấy (Vaseeharan và Ramasamy, 2003).

Vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong các erlen chứa 10ml TSB rồi đem đi lắc

với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ

thị được đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml.

Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch L.

plantarum SC01 sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 2

µl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 106 cfu/ml cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm và môi trường TSB ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ rồi tiến hành xác định hoạt

tính ức chế vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp đo độ đục đã trình bày ở trên. Từ đó,

đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn của

Đồ án tốt nghiệp

dịch tế bào L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate

2,5 % sau ly tâm thông qua tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị.

Phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau

(Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012):

𝑶𝑫𝑻𝑵 𝑶𝑫Đ𝑪

% Tỷ lệ ức chế = ( 𝟏 − ) 𝒙 𝟏𝟎𝟎%

2.3.5. Phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)

Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý đến độ pha loãng cần sử dụng

Hút 1ml ở mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri vô trùng

Lắc đều, chờ đĩa thạch nguội ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ

Đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C vào các đĩa trên

Đọc kết quả, chọn các kết quả từ 25 - 250 khuẩn lạc

Tính toán kết quả

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)

Đồ án tốt nghiệp

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml

dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều

kiện vô trùng. Thời gian đồng nhất mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1.

Dịch pha loãng sẽ được pha loãng bằng cách dùng micropipette với đầu tip vô

trùng hút 1 ml vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, lắc đều được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết.

Tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự

kiến chứa từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật.

Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa

petri vô trùng tương ứng với mỗi độ pha loãng. Tiến hành đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ 45 – 500C. Xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim

đồng hồ từ 3 – 5 lần để mẫu và môi trường được trộn đều chờ đĩa nguội đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ.

Tiến hành đọc kết quả bằng cách đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa

sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật

độ tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau:

𝑁 𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖

A (CFU/g) =

Trong đó:

A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f: độ pha loãng tương ứng

(Phạm Minh Nhựt, 2014).

Đồ án tốt nghiệp

2.3.6. Phương pháp định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa

Cho 25g mẫu vào 225 ml SPW và đồng nhất mẫu

Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng hợp lý

Hút 1 ml ở mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri vộ trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và đợi trong 30 phút

Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0,5mm

Ở mỗi đĩa chọn 3 - 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

Tính tỷ lệ xác nhận R

Ủ 370C trong 24 giờ

Tính tổng số Coliform (cfu/g)

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung

dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1.

Hút 1 ml dịch pha loãng mẫu vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa và chọn

2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Tùy vào mẫu cần kiểm định mà chọn độ pha loãng thích hợp. Đổ vào mỗi đĩa 5ml môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C, trộn

đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim

đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chọn các

đĩa từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ

đậm và đường kính >0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật.

Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã

đếm được với các hình dạng khác nhau cấy sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi có bọt khí xuất hiện trong ống

Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số

khuẩn lạc khẳng định.

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms

theo công thức sau:

𝑁 𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖

A (CFU/g hay CFU/ml) = x R

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng

v: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

Số ống BGBL dương tính

R: tỷ lệ xác nhận

Tổng số ống BGBL th ử nghi ệm

Với R =

Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ

có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014).

Đồ án tốt nghiệp

2.3.7. Phương pháp định lượng Staphylocuccus aureus bằng phương pháp cấy

trang

Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2

Hút 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-2 cho vào đĩa môi trường BP có bổ sung egg yolk rồi tiến hành cấy trang

Cho 25 g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen và có quầng sáng bao quanh

Cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ

Ủ 370C trong 24 giờ

Xác định tỷ lệ ngưng kết và tính tổng số S. aureus (cfu/g)

Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng S. aureus bằng phương pháp cấy trang

Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung

dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1, tương tự tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành

pha loãng mẫu đến độ pha loãng cần sử dụng.

Đồ án tốt nghiệp

Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP và

cấy trang đều cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ đối với môi trường BP. Sau 48 giờ, trên môi trường

BP khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng, có vòng

sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.

Quy trình khẳng định được thực hiện bằng cách: cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ. Tiến hành ủ ở 370C và theo dõi sau 24 giờ từ đó xác

định tỷ lệ ngưng kết R. Tỷ lệ xác nhận (tỷ lệ ngưng kết) là tỷ số giữa khuẩn lạc cho

kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.

Đếm số lượng các khuẩn lạc và dựa vào tỷ lệ ngưng kết R để tính mật độ S.

aureus theo công thức:

𝑁 𝑛1𝑉𝑓1+ … + 𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖

A (CFU/g hay CFU/ml) = x R

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng

v: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

Số ống huy ết thanh dương tính

R: tỷ lệ xác nhận

Tổng số ống huy ết tương th ử nghi ệm

Với R =

Kết quả S. aureus được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ

có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014).

Đồ án tốt nghiệp

Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu

2.3.8. Phương pháp định tính E. coli trong thực phẩm

Hút 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BGBL

Chọn các ống BGBL đục và có sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Ủ ở nhiệt độ 440C trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E. coli trên EMB: tròn, dẹt, đường kính <0,5mm, có ánh kim tím

Cấy vào các môi trường: 1 Trypton, 2 MR - VP, 1 Simmons Citrate

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Hình 2.5. Sơ đồ quy trình định tính E. coli

Chuẩn bị mẫu và tiến hành pha loãng mẫu. Hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL, ủ ở nhiệt độ 440C trong

Đồ án tốt nghiệp

24 giờ. Sau đó, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB rồi mang đi ủ ở 370C

trong 24 giờ.

Nhận dạng khuẩn lạc E. coli: khuẩn lạc tròn, dẹt, có tâm đen, có bờ đều,

đường kính >0,5mm và có ánh kim tím.

Những khuẩn lạc nghi ngờ được cấy vào các ống thử nghiệm sinh hóa sau đây:

1 ống canh trypton, 2 ống MR – VP, 1 ống Simmon citrate để thực hiện nghiệm

thức IMViC (Indol, Methyl Red, VP, Citrate):

- Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi

trường canh trypton. Phản ứng Indol là dương tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề

mặt, phản ứng là âm tính khi không có sự xuất hiện của vòng đỏ ở trên.

- Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn

trong môi trường MR – VP, lắc đều. Phản ứng MR là dương tính khi canh khuẩn

chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính là khi canh khuẩn không chuyển màu.

- Thử nghiệm Voges – Proskauer: cho 3 giọt thuốc thử α – napthol 5 % vào

canh khuẩn MR – VP, lắc đều. Sau đó, bổ sung 1 giọt KOH 40%, lắc đều rồi quan

sát sau 10 phút. Phản ứng VP là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ,

phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu.

- Thử nghiệm Citrate: trong môi trường Simmon Citrate, phản ứng là dương

tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang

xanh lam, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển

màu.

Khẳng định phát hiện E. coli khi các nghiệm thức cho kết quả như sau:

Thử nghiệm Indol (+)

Thử nghiệm Voges – Proskauer (-)

Thử nghiệm Methyl Red (+)

Thử nghiệm Citrate (-)

(Phạm Minh Nhựt, 2014)

Đồ án tốt nghiệp

2.3.9. Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm

Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Hút 0,1 ml canh trường cho vào ống nghiệm chứa10 ml môi trường RV

Ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

Cấy vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Indole, VP, Urea, Manitol, LDC

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc thử để kiểm tra

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình định tính Salmonella trong mẫu thịt

Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung

dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều kiện vô

trùng. Tiến hành quá trình tiền tăng sinh bằng cách ủ các bao nylon chứa mẫu đã

Đồ án tốt nghiệp

được pha loãng và đồng nhất ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Trộn môi trường canh

sau khi đã ủ 24 giờ trước cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24 giờ.

Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh

chọn lọc RV cấy ria trên môi trường chọn lọc cho Salmonella là XLD. Trên môi

trường XLD khuẩn lạc đặc trưng Salmonella có màu hồng trong suốt, có hay không

có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi

trường XLD chuyển sang màu hồng. Tất cả các đĩa sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 370C trong 22 – 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để

khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa.

Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella lên men glucose,

lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, LDC và mannitol. Các chủng Salmonella

cho kết quả thử nghiệm như sau:

- Thử nghiệm trên môi trường TSI: Salmonella chỉ lên men được glucose

trong các môi trường TSI nên phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa

số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên

môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi làm vỡ thạch môi trường hoặc môi

trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm.

- Thử nghiệm Urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay

đổi pH môi trường, sau khi cấy môi trường vẫn giữ nguyên được màu tím nhạt.

- Thử nghiệm lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa

chuyển sang màu vàng.

- Thử nghiệm LDC: sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu

môi trường được chuyển sang màu ban đầu.

- Thử nghiệm Indole và VP đều (+).

(Phạm Minh Nhựt, 2014).

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Statgraphics

centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey.

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Bố trí thí nghiệm

Vi khuẩn L. plantarum SC01

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

Khảo sát hiệu quả ức chế của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum đối với vi khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát

Đánh giá khả năng bảo quản thịt của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 đối với vi khuẩn chỉ thị

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của hợp

chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01

L. plantarum SC01

Tăng sinh cấp 1

Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate

Nuôi cấy

Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút

Loại bỏ cặn thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về pH 6

Khảo sát ở các nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 600C, 800C, 1000C trong 30 phút

Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị

Xác định % tỷ lệ ức chế

Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

Qua thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh

hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 của Lê Trần Hồng Xuân

(2014), tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 %

Đồ án tốt nghiệp

- alginate 2,5 % cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính mạnh nhất

được tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng, 600C, 800C, 1000C trong 30

phút để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng

khuẩn.

L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01, ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000

vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối

sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate. Cân 1,5 g tế bào L. plantarum

SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate cho vào erlen chứa 50ml MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.

L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01, ủ ở nhiệt độ 370C

trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa, thu

dịch trong. Chỉnh pH dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2N

vô trùng để loại bỏ hoạt động ức chế của acid hữu cơ và ủ lần lượt ở các nghiệm thức nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 600C, 800C và 1000C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức

lặp lại 3 lần. Sau đó tiền hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo

phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng

khuẩn từ L. plantarum SC01

L. plantarum SC01

Tăng sinh cấp 1

Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate

Nuôi cấy

Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút

Loại bỏ tủa, thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về các nghiệm thức pH: pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10

Ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ

Chỉnh pH các nghiệm thức về pH 6

Thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút

Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị

Xác định % tỷ lệ ức chế

Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2

Vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin -

alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ

sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về các giá trị pH: pH 2,

Đồ án tốt nghiệp

pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 bằng NaOH 2N và HCl 2N vô trùng ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ. Sau đó chỉnh pH các nghiệm thức về giá trị pH

6,0 để loại bỏ hoạt động ức chế của acid hữu cơ cũng như pH kiềm đối với vi sinh vật. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3

lần. Sau đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương

pháp đã trình bày ở phần 2.3.4.

2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt

tính của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01

L. plantarum SC01

Tăng sinh cấp 1

Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate

Nuôi cấy

Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút

Ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ

Chỉnh pH các nghiệm thức về pH 6

Loại bỏ tủa, thu dịch trong. Ở các nghiệm thức bổ sung các chất hoạt động bề mặt: Sodium dodecyl sulfate (SDS), Tween 20, Tween 80, Urea, EDTA với tỷ lệ 1% (w/v)

Thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút

Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị

Xác định % tỷ lệ ức chế

Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3

Đồ án tốt nghiệp

L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000

vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối

sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L.

plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.

Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp

gelatin - alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút

để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về pH 6,0

bằng NaOH 2N vô trùng. Sau đó lần lượt xử lý dịch trong bằng các chất hoạt động

bề mặt được bổ sung với tỷ lệ 1% (w/v): Sodium dodecyl sulfate (SDS), Tween 20, Tween 80, Urea, EDTA rồi ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau

đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã

trình bày ở phần 2.3.4.

2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu quả ức chế của hợp chất kháng khuẩn từ vi

khuẩn L. plantarum SC01 theo thời gian khảo sát

Đồ án tốt nghiệp

Tăng sinh cấp 1

L. plantarum SC01

Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate

Nuôi cấy

Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút

Loại bỏ cặn, thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về pH 6

Thanh trùng các nghiệm thức ở nhiệt độ 800C trong 30 phút

Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ

Đo OD các nghiệm thức ở bước sóng 600nm và tính % tỷ lệ ức chế

Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm 4

L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000

vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối

sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6% - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L. plantarum

SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.

Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp

gelatin - alginate được tăng sinh cấp 2 trong erlen chứa 50ml môi trường MRS

Đồ án tốt nghiệp

OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút

trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30

phút. Sau đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương

pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ,

42 giờ và 48 giờ. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

2.4.5. Thí nghiệm 5: Đánh giả khả năng bảo quản thịt của hợp chất kháng

khuẩn từ L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị

Cắt thịt thành các khối 25 g

Thịt heo tươi

Ngâm thịt vào dịch tế bào L. plantarum SC01 sau ly tâm trong 2 giờ

Định tính Salmonella Đánh giá cảm quan của mẫu

Mẫu thịt đã được xử lý

Định tính E. coli Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)

Định lượng tổng số coliform Định lượng Staphylococcus aureus

Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm bảo quản thịt

Đồ án tốt nghiệp

L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000

vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối

sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6% - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L. plantarum

SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ.

Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp

gelatin - alginate được tăng sinh cấp 2 trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút

trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt

về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng.

Thịt nạc heo tươi sau khi mua về được cắt thành từng khối lập phương, mỗi

khối 25 g. Các mẫu được chia làm 2 phần: một phần làm mẫu đối chứng, một phần

làm mẫu thí nghiệm. Dùng kẹp gắp các mẫu đối chứng vào các lọ thủy tinh vô

trùng. Tiến hành ngâm mẫu thí nghiệm vào dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm đã

chỉnh về pH 6,0 trong 2 giờ rồi lấy ra để ráo và cho vào các lọ thủy tinh vô trùng.

Tiến hành khảo sát ở các mốc thời gian: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Ứng với

các mốc thời gian, tiến hành kiểm tra cảm quan và các chỉ tiêu vi sinh của các mẫu

thịt. Mỗi nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần và trong điều kiện vô trùng.

2.4.5.1. Đánh giá cảm quan mẫu

Đánh giá cảm quan của sản phẩm thịt heo theo các tiêu chí:

- Màu sắc

- Mùi

- Trạng thái cấu trúc của thịt heo (độ đàn hồi, độ nhớt,…)

Các chỉ tiêu được đánh giá mẫu được thực hiện trước và sau khi làm thí nghiệm.

2.4.5.2. Đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh

Tại mỗi thời điểm khảo sát tiến hành thu mẫu và đánh giá sự hiện diện của các

chỉ tiêu vi sinh vật trong mẫu bao gồm TPC, Coliform tổng số, S. aureus, E. Coli và

Salmonella.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng

khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01

Từ nghiên cứu của Zambou và ctv (2013) cho thấy rằng nhiệt độ có ảnh

hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum

sản sinh. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng

khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định trong hỗn hợp gelatin 6

% - alginate 2,5 % sau ly tâm. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Hình 3.1.

70%

a

60%

b

a

)

b

%

b

50%

c

E. coli

c

Salmonella

40%

S. aureus

B. subtilis

30%

L. monocytogenes

( ế h c c ứ ệ l ỷ T

d

20%

d

10%

0%

37^C 370C

60^C 600C

80^C 800C

100^C 1000C

Hình 3.1. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các

nhiệt độ khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch

tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 thông qua mức độ ức chế sự phát triển của vi

khuẩn chỉ thị được thể hiện trên Hình 3.1. Kết quả này cho thấy rằng nhiệt độ có

ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Dịch ly tâm

Đồ án tốt nghiệp

sau trung hòa khi xử lý ở 4 chế độ nhiệt độ đều thể hiện tính đối kháng với 5 chủng

vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với từng chủng vi

khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong 4 nghiệm, nghiệm thức xử lý dịch kháng khuẩn ở nhiệt độ 800C cho tỷ lệ ức chế cao

nhất với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị so với 3 nghiệm thức còn lại (tỷ lệ ức chế gần 60

% trong đó tỷ lệ ức chế đối với Salmonella là trên 60 %). Nghiệm thức ủ dịch kháng khuẩn ở nhiệt độ 1000C cho tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn chỉ thị thấp nhất (tỷ lệ ức

chế từ 10 % đến 20 %).

Xét về tỷ lệ ức chế của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa được ủ ở nhiệt độ 800C

cho tỷ lệ ức chế mạnh đối với cả 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là E. coli, Salmonella, S.

aureus, B. subtilis, L. monocytogenes và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

3 nghiệm thức còn lại (P < 0,05). Từ kết quả trên cho thấy hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được ủ ở nhiệt độ 800C cho hoạt

tính mạnh nhất và ủ ở nhiệt độ càng cao thì hoạt tính càng giảm. Điều này có thể do khi xử lý ở nhiệt độ 800C sẽ bất hoạt một số thành phần ức chế hoạt tính của các hợp chất vi khuẩn đặc biệt là bacteriocin trong hỗn hợp. Đồng thời, khi xử lý ở 800C

cũng giúp hạn chế sự lây nhiễm của các vi sinh vật khác trong quá trình thao tác, từ

đó đánh giá chính xác hơn hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Tuy nhiên khi xử lý dịch ở nhiệt độ 1000C tỷ lệ ức chế vi khuẩn

giảm, điều này do khi nhiệt độ cao sẽ làm bất hoạt một số thành phần trong hợp chất

kháng khuẩn dẫn đến hạn chế hoạt tính của chúng.

Theo nghiên cứa của Ogunbanwo và ctv (2003), khi khảo sát độ bền nhiệt

của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum F1 thì kết quả cho thấy

bacteriocin sản xuất từ chủng này cũng giảm dần khi nhiệt độ xử lý ở nhiệt độ 1000C. Theo kết quả nghiên cứu của Zambou và ctv (2013), khi khảo sát khả năng

bền nhiệt của bacteriocin do chủng Lactobacillus plantcuarum 29V sản sinh ra bằng cách thu dịch bacteriocin ủ ở nhiệt độ 600C, 800C, 1000C, 1210C lần lượt trong 10

phút, 30 phút và 60 phút đã cho thấy rằng bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic

Đồ án tốt nghiệp

khảo sát có sự thay đổi về hoạt tính khi được ủ trong các khoảng nhiệt độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 600C và 800C hoạt tính đo được là 800 (AU/ml), trong khi ở nhiệt độ 1000C hoạt tính bacteriocin giảm 50 % chỉ còn 400 (AU/ml) và tiếp tục giảm khi ủ ở nhiệt độ 1210C chỉ còn 200 (AU/ml). Kết quả

này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu đã tiến hành.

Đối với nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất

kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn

hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 %, chủng này cho tỷ lệ ức chế mạnh nhất khi dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa khi được xử lý ở nhiệt độ 800C

trong 30 phút. Điều này cho thấy rằng các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic có khả năng chịu nhiệt độ tốt (khoảng 800C), điều này rất có ích cho những nghiên

cứu liên quan đến việc bảo quản các loại thực phẩm xử lý nhiệt độ cũng như các

nghiên cứu liên quan đến ủ chua. Do đó, kết quả của thí nghiệm này sẽ được sử

dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị

Ở thí nghiệm 1 đã xác định hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được thanh trùng ở nhiệt độ 800C cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

Tiếp đến, tiến hành khảo sát khả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng

khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01. Kết quả đối kháng được trình bày ở

Hình 3.2.

Đồ án tốt nghiệp

70%

a

60%

bcd

bc

a

b b ab

a

ab

a bc bc a

cd

bcd

a ab

a bcd

cd

d

a cd bc

a cd

c

bcd bc b b

50%

bcd c

bc d

cd c

d

de

e

40%

E. coli

30%

Salmonella

20%

S. aureus

B. subtilis

10%

L. monocytogenes

0%

pH 2

pH 3

pH 4

pH 5

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

pH 10

Hình 3.2. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các

giá trị pH khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của

dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 thông qua mức độ ức chế sự phát triển của

vi khuẩn chỉ thị được thể hiện trên Hình 3.2 cho thấy pH có ảnh hưởng đến hoạt

tính kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Dịch ly tâm sau trung hòa sau

khi được xử lý ở 9 nghiệm thức pH đều thể hiện tính đối kháng với 5 chủng vi

khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị

đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Xét về tỷ lệ ức chế của

dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum

SC01 khi được xử lý ở pH acid (từ pH 2 – pH 5) cho kết quả kháng khuẩn trung

bình cao nhất (tỷ lệ kháng khuẩn luôn duy trì ở mức 50%), đặc biệt dịch vi khuẩn

khi xử lý ở pH 4 cho tỷ lệ ức chế mạnh nhất đối với cả 5 chủng vi khuẩn chỉ thị (tỷ

lệ ức chế trên 50% trong đó tỷ lệ ức chế đối với E. coli và S. aureus gần 60%) (P <

0,05). Ở các nghiệm thức xử lý dịch vi khuẩn ở pH trung tính (pH 6 và pH 7) có sự

khác biệt về giá trị tỷ lệ ức chế. Ở nghiệm thức pH 6, tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

luôn đạt giá trị cao và ổn định trên 50%, trong khi đó ở nghiệm thức xử lý pH 7 cho

kết quả tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn không ổn định và đạt tỷ lệ ức chế thấp đối với

một số chủng vi khuẩn chỉ thị (tỷ lệ ức chế đối với chủng B. subtilis và L.

monocytogenes trên 40%, trong khi đó tỷ lệ ức chế đối với Salmonella chỉ dưới

40%). Các nghiệm thức xử lý dịch vi khuẩn ở giá trị pH bazơ (pH 8 đến pH 10) cho

kết quả tỷ lệ ức chế thấp và không ổn định (tỷ lệ ức chế các nghiệm thức trung bình

đều dưới 50% và tỷ lệ ức chế đối với chủng Salmonella ở các nghiệm thức này đều

duy trì ở mức 40%) (P < 0,05). Xét về tổng thể kết quả tỷ lệ ức chế các nghiệm thức

ở các giá trị pH trên cho thấy tỷ lệ ức chế đạt giá trị cao nhất ở pH 4 và pH 6, trong

khi ở giá trị pH 4 đạt tỷ lệ ức chế cao nhưng không ổn định giữa các chủng vi khuẩn

chỉ thị còn ở giá trị pH 6 cho tỷ lệ ức chế ổn định hơn. Từ kết quả nghiên cứu này

cho thấy pH tuy có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch vi khuẩn L.

plantarum SC01 nhưng mức độ ảnh hưởng không lớn giữa các khoảng pH acid,

trung tính và base.

Zambou và ctv (2013) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các

giá trị pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH6, pH 7, pH 8, pH 9 và pH 10 đến hoạt tính của

bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum 29V ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

sau đó chỉnh pH của tất cả các nghiệm thức về pH 6,5 bằng HCl 6M và NaOH 6M.

Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tất cả các giá trị pH khác nhau hoạt tính của

bacteriocin vẫn duy trì ở mức 800 (AU/ml). Theo nghiên cứu của Ogunbanwo và

ctv (2003) khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng

khuẩn của L. brevis OG1, kết quả cho thấy hoạt tính hợp chất kháng khuẩn vẫn ỗn

định ở các giá trị pH 2, pH 4, pH 6, pH 8 và giảm dần khi ở pH 10. Theo kết quả

của Moshood và TengkuHaziyamin (2012), khi khảo ảnh hưởng của pH đến hoạt

tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Enterococcus faecium B3L3. Kết quả cho

thấy, khi điều chỉnh pH ở các giá trị pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 sau đó

khảo nghiệm sự khuếch tán trên đĩa petri sau khi ủ 24 giờ với các khuẩn

Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa thì hoạt tính của hợp chất

kháng khuẩn Enterococcus faecium B3L3 không thay đổi (dao động từ 12 mm đến

Đồ án tốt nghiệp

14 mm). Từ kết quả của những nghiên cứu trên cho thấy hoạt tính của hợp chất

kháng khuẩn của vi khuẩn khi được xử lý ở các giá trị pH không ảnh hưởng nhiều

đến hoạt tính của các hợp chất khảo sát.

So với các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của

dịch từ vi khuẩn L. plantarum SC01, kết quả nghiên cứu này cũng ghi nhận sự ảnh

hưởng không lớn của pH đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn thu được từ vi

khuẩn L. plantarum SC01. Điều này chứng tỏ rằng ở pH kiềm hay acid cũng đều có

thể ứng dụng các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn latic.

3.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp

chất kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01 đối với các chủng vi

khuẩn chỉ thị

Kaur và ctv (2013) đã nghiên cứu và cho thấy rằng bacteriocin của các chủng

vi khuẩn lactic có sự thay đổi về hoạt tính khi có sự hiện diện của của chất hoạt

động bề mặt khác nhau. Do đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề

mặt đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01 thông

qua mức độ ức chế vi khuẩn chỉ thị. Kết quả ức chế được trình bày ở Hình 3.3.

a

100% 90%

b

)

b

c

b

c

E. coli

c

Salmonella

c

d

c

S. aureus

80% 70% 60% 50% 40%

( ế h c c ứ ệ l ỷ T

d

B. subtilis

d

e

L. monocytogenes

.000%

30% 20% 10% 0%

Đối Chứng Tween 80 Tween 20

EDTA

Urea

SDS

Hình 3.3. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 khi bổ

sung các chất hoạt động bề mặt với tỷ lệ 1% (w/v). Các nghiệm thức mang các chữ

cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả trên cho thấy rằng chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng đến hoạt tính

hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Kết quả cho thấy 5 nghiệm

thức bổ sung các chất hoạt động bề mặt đều thể hiện tính đối kháng với 5 chủng vi

khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với từng chủng vi

khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong 6

nghiệm thức khảo sát, ở nghiệm thức bổ sung EDTA vào dịch L. plantarum SC01

với tỷ lệ 1% (w/v) cho tỷ lệ ức chế cao nhất với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị (E. coli,

Salmonella, S. aureus, B. subtilis và L. monocytogenes) so với 4 nghiệm thức còn

lại và cao hơn nghiệm thức đối chứng khoảng 20 % (tỷ lệ ức chế trên 90% trong khi

đó ở ngiệm thức đối chứng chỉ xấp xỉ 70%). Ở nghiệm thức bổ sung Urea vào dịch

kháng khuẩn với tỷ lệ 1% (w/v), bất hoạt hoàn toàn đối với 5 chủng vi khuẩn. Với

các nghiệm thức bổ sung SDS, Tween 20, Tween 80 cho kết quả tỷ lệ kháng khuẩn

rất thấp. Cụ thể khi bổ sung SDS cho tỷ lệ ức chế dao động từ 15 % với chủng B.

subtilis đến 65 % với chủng E. coli, khi bổ sung Tween 20 cho tỷ lệ ức chế trung

bình là 30 % và khi bổ sung Tween 80 cho tỷ lệ ức chế xấp xỉ 10 % (riêng chủng B.

subtilis cho tỷ lệ trên 20%). Trong khi đó, khi bổ sung Urea kết quả không gây ức

chế vi khuẩn chỉ thị vì khi bổ sung Urea vào dịch chứa hợp chất kháng khuẩn Urea

sẽ bất hoạt các thành phần trong hợp chất kháng khuẩn từ đó làm mất hoạt tính dẫn

đến hiệu quả kháng khuẩn sẽ giảm.

Xét về mức độ đồng đều và tỷ lệ ức chế của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01

với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa sau khi bổ

sung chất hoạt động bề mặt EDTA với tỷ lệ 1 % (w/v) và ủ trong 5 giờ cho khả

năng ức chế mạnh và đồng đều với cả 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là E. coli,

Salmonella, S. aureus, B. subtilis, L. monocytogenes và có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với 3 nghiệm thức còn lại (P < 0,05).

Theo kết quả nghiên cứu của Kaur và ctv (2013) cho thấy bacteriocin do

chủng Pediococcus acidilactici BA28 sản sinh khi bổ sung 1% w/v các chất hoạt

động bề mặt như SDS, Tween 20, Tween 80, Tritone X-100, EDTA và Urea vào dịch bacteriocin rồi ủ ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ và tiến hành đánh giá hoạt tính

Đồ án tốt nghiệp

bacteriocin bằng phương pháp đục lỗ thạch và đo đường kính vòng kháng khuẩn

trên đĩa petri sau khi ủ 24 giờ với các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Kết quả

nghiên cứu đã cho thấy các chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng đến hoạt tính của

bacteriocin với các mức độ khác nhau: SDS cho đường kính vòng kháng khuẩn là

13 ± 0,5 mm; Tween-20 là 12 ± 0,6 mm; Tween-80 là 11±1,5 mm; Triton X-100 là

6 ± 0,9 mm trong khi đường kính vòng kháng khuẩn của mẫu đối chứng là 15 ± 1,5

mm. Cũng như theo Kusmarwati và ctv (2013) khi khảo sát ảnh hưởng của chất

hoạt động bề mặt đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng LAB phân lập từ cải chua,

kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao nhất khi bổ sung EDTA và tiếp đó là

SDS nhưng khi bổ sung Tween 20, Tween 80 và Urea thì không cho khả năng ức

chế với các chủng vi khuẩn chỉ thị. Kết quả các nghiên cứu này khá phù hợp với kết

quả nghiên cứu đã tiến hành.

3.4. Kết quả khảo sát hiệu quả ức chế của dịch tế bào L. plantarum SC01 đối

với các chủng vi khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát

Sau khi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính các hợp chất

kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 đã xác định được nhiệt độ, pH và các

chất hoạt động bề mặt có ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn. Từ đó

đánh giá hiệu quả ức chế các chủng vi khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát. Kết quả

đối kháng được trình bày ở Hình 3.4.

Kết quả thí nghiệm này cho thấy hiệu quả ức chế của dịch vi khuẩn L.

plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị có sự thay đổi theo thời gian.

Dịch ly tâm sau trung hòa sau khi xử lý ở 8 nghiệm thức thời gian đều thể hiện tính

đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế

đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P

< 0,05). Trong 8 nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của thời gian khảo sát, ở nghiệm

thức thời gian khảo sát là 30 giờ và 36 giờ cho tỷ lệ ức chế cao nhất với 5 chủng vi

khuẩn chỉ thị. Nghiệm thức thời gian khảo sát là 6 giờ cho kết quả kháng khuẩn

thấp nhất với tỷ lệ kháng khuẩn trung bình đạt gần 30 % sau đó tỷ lệ kháng khuẩn

có xu hướng tăng dần và đạt tỷ lệ cao nhất tại nghiệm thức thời gian khảo sát 30 giờ

Đồ án tốt nghiệp

và 36 giờ gần 70 %. Kết quả trên có thể thấy được, trong thời gian từ 6 giờ đến 24

giờ vi khuẩn chị thị đang trong giai đoạn phát triển mạnh, mật độ vi khuẩn cao vì

thể khả năng kháng khuẩn chưa đủ mạnh để gây ức chế toàn bộ vi khuẩn chỉ thị,

đến 36 giờ phần lớn vi khuẩn chị thị rơi vào pha suy vong kết hợp hoạt tính từ hợp

chất kháng khuẩn làm kết quả ức chế ở mức cao nhất. Ở thời gian khảo sát là 42 giờ

thì tỷ lệ kháng khuẩn giảm dần xuống khoảng 60 % và tiếp tục giảm xuống khoảng

55 % ở nghiệm thức 48 giờ. Trong khoảng thời gian này hoạt tính bacteriocin giảm

dần, vi khuẩn chỉ thị có cơ hội phát triển vì thế tỷ lệ ức chế nhanh chóng tăng dần

theo thời gian.

90%

80%

a

)

a ab a

b

a

%

c

70%

c

b

c

d

c

cd

c

d

60%

d

e

E. coli

d

e

50%

f

e

Salmonella

f

40%

e

f

S. aureus

( ế h c c ứ ệ l ỷ T

g

30%

f

B. subtilis

20%

L. monocytogenes

10%

0%

6 giờ

12 giờ

18 giờ

24 giờ

30 giờ

36 giờ

42 giờ

48 giờ

Hình 3.4. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 cố

định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 % theo thời gian khảo sát. Các nghiệm

thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

(P < 0,05).

Theo kết quả nghiên cứu của Prema (2013) đã cho thấy rằng bacteriocin của L.

plantarum sản xuất có sự thay đổi về tỷ lệ ức chế khi khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn với một số chủng vi khuẩn chỉ thị trong các khoảng thời gian khác nhau.

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của bacteriocin của chủng

Đồ án tốt nghiệp

Lactobacillus plantarum được phân lập từ cải chua ở các mốc thời gian 0 giờ, 6 giờ,

12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ. Kết quả nghiên cứu cho

thấy tỷ lệ ức chế tăng dần từ thời gian khảo sát 0 giờ và đạt cao nhất ở 18 giờ là

2450 (AU/ml) và giữ ổn định cho tới 30 giờ là 2400 (AU/ml) sau đó giảm dần đến

giá trị 1500 (AU/ml) khi ở mốc thời gian là 48 giờ. Ngoài ra còn có nghiên cứu của

Issazadeh và ctv (2012), khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch L. acidophilus

với các chủng gây bệnh thực phẩm ở các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả

nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng dần đều từ 0 giờ và đạt cao nhất ở

18 giờ là 2500 (AU/ml) và ổn địnhcho tới 30 giờ sau đó giảm dần đến giá trị 1900

(AU/ml) khi ở mốc thời gian là 48 giờ. Những kết quả nghiên cứu trên đều phù hợp

với kết quả nghiên cứu đã tiến hành. Điều này chứng tỏ hiệu quả ức chế của dịch vi

khuẩn L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị có sự thay đổi theo

thời gian khảo sát.

Kết quả đánh giá hiệu quả ức chế các chủng vi khuẩn chỉ thị của chủng L.

plantarum SC01 ở các mốc thời gian khảo sát cho thấy bắt đầu sau 6 giờ bổ sung

vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị, dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 cho tỷ

lệ ức chế sự phát triển của vi khuẩn chị thị là gần 30 % rồi tăng dần đến 70 % sau

30 giờ, tỷ lệ ức chế giữ ổn định ở mức 70 % cho đến 42 giờ và giảm xuống còn 50

% sau 48 giờ. Kết quả thí nghiệm này có ý nghĩa trong việc xác định tỷ lệ ức chế vi

khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các khoảng thời gian. Thí

nghiệm này sẽ là tiền đề cho các thí nghiệm sản xuất cũng như tách chiết các hợp

chất kháng khuẩn ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.

3.5. Kết quả đánh giá khả năng bảo quản thịt của dịch tế bào vi khuẩn L.

plantarum SC01

Thông qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thúy Hương và ctv (2008), đã

cho thấy rằng dịch bacteriocin do Lactococus lactic sản sinh có khả năng bảo quản

thịt. Bên canh đó dựa trên kết quả khả quan của các thí nghiệm khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01, tiến hành đánh giá khả năng bảo

quản thịt của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 bằng cách ngâm thịt trong

Đồ án tốt nghiệp

dịch trong 2 giờ và sau đó tiến hành khảo sát ở 4 nghiệm thức thời gian là 0 giờ, 12

giờ, 24 giờ và 48 giờ thông qua đánh giá cảm quan mẫu thịt và phân tích các chỉ

tiêu vi sinh: tổng số vi sinh vật hiếu khí, Coliform, S. aureus, E. coli và Salmonella

nhằm đánh giá khả năng bảo quản thịt tươi của dịch kháng khuẩn của vi khuẩn L.

plantarum SC01.

3.5.1. Kết quả đánh giá cảm quan mẫu thịt

Sau khi thu mẫu, về màu sắc và trạng thái: mẫu có màu sắc đặc trưng của thịt

tươi, bề mặt khô, sạch, không dính tạp chất lạ, có tính đàn hồi. Về mùi và vị, các

mẫu thu được có mùi đặc trưng của thịt, vị không có mẫu nào có mùi lạ (không

hỏng hay ôi thiu). Nhìn chung các mẫu được lấy vẫn trong tình trạng rất tốt, màu

sắc và mùi, vị bắt mắt không có biểu hiện của sự hư hỏng hay ôi thiu. Do các mẫu

được lấy vào khoảng thời gian sáng, mẫu được lấy thường bảo quản trong nhiệt độ

mát, nên các mẫu vừa được thu đạt tính ổn định và đang trong tình trạng tốt nhất để

quá trình nghiên cứu được chính xác hơn.

Kết quả sau 12 giờ cho thấy: mẫu đối chứng có bề mặt hơi nhầy, sạch, không

dính tạp chất lạ, có tính đàn hồi thấp, có màu đỏ đậm hơn so với màu sắc đặc trưng

của mẫu thịt ban đầu, có mùi lạ và có mùi hơi thối. Trong khi mẫu thí nghiệm có kết

quả cho thấy: mẫu thịt có bề mặt hơi nhầy, sạch, không dính tạp chất lạ, có tính đàn

hồi, mẫu thịt hơi nhạt, có mùi lạ và hơi chua.

Kết qua sau 24 giờ và 48 giờ đều cho thấy kết quả khá tương đồng nhau: mẫu

đối chứng có bề mặt nhầy, bủn và ko giữ được trạng thái vuông vức ban đầu, có lớp

ván và bọt khí hình thành trên bề mặt và không còn giữ được tính đàn hồi, có màu

đỏ bầm và có mùi hôi thối. Trong khi mẫu thí nghiệm cho kết quả: mẫu thịt có bề

mặt nhầy, không còn giữ được tính đàn hồi, màu thịt nhạt, có mùi chua và khá hôi.

Các kết quả trên có thể nhận thấy rằng, sau 12 giờ các vi khuẩn ở mẫu đối

chứng đã bắt đầu hoạt động gây ảnh hưởng đến mùi cũng như bắt đầu có sự thay

đổi về màu sắc, trong khi đó mẫu thí nghiệm với sự có mặt của hợp chất kháng

khuẩn từ L. plantarum SC01 nên hạng chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị nên

không có mùi thối như mẫu đối chứng nhưng lại có vị chua từ acid lactic trong dịch

Đồ án tốt nghiệp

kháng khuẩn. Với nghiệm thức 24 giờ và 48 giờ, vi khuẩn chỉ thị lúc này nhờ nguồn

dinh dưỡng từ thịt đã phát triển và có mật độ cao khiến mẫu thịt không còn giữ

được trạng thái ban đầu, cũng như xuất hiện các tạp chất do quá trình phát triển của

vi khuẩn. Trong khi đó, với mẫu thí nghiệm theo thời gian, dịch kháng khuẩn thấm

vào bên trong nên bị phân giải dần do tác động của enzyme protease trong khối thịt

nên hoạt tính kháng khuẩn cũng mất dần từ đó không ảnh hưởng nhiều đến vi khuẩn

chỉ thị làm mẫu thịt bắt đầu hư hỏng nặng.

Tuy nhiên, việc đánh giá cảm quan mẫu không chứng tỏ được có sự hiện

diên của vi sinh vật trong mẫu hay không và chủ yếu dựa vào kinh nghiệm. Do đó,

việc đánh giá cảm quan chỉ đóng vai trò giúp có cái nhìn tổng quát về trạng thái của

mẫu. Vì vậy, việc đánh giá các chỉ tiêu vi sinh đóng vai trò quyết định đến chất

lượng cũng như mức độ an toàn của thực phẩm.

Hình 3.6. Mẫu thịt thí nghiệm sau 24 giờ Hình 3.5. Mẫu thịt đối chứng sau 24 giờ

Đồ án tốt nghiệp

3.5.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh

3.5.2.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu TPC

10 í

9 h k u ế i

8

7

6 h t ậ v h n

5 Đối Chứng

4 Thí nghiệm

i s i v ố s

3 g n ổ T

2

1 0 1 g o L

0 0 giờ

12 giờ

24 giờ

48 giờ

Hình 3.7. Tổng số vi sinh vật hiếu khí các mẫu thịt ở các thời gian khảo sát

Kết quả đánh giá chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí trên các mẫu thử tại các

thời điểm được thể hiện trên Hình 3.7. Kết quả này cho thấy rằng dịch vi khuẩn L.

plantarum SC01 có ảnh hưởng đến tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thịt ở các mốc

thời gian khác nhau. Ở nghiệm thức 12 giờ, mẫu đối chứng cho tổng số vi khuẩn hiếu khí trung bình là 2,9.108 (cfu/g) và ở mẫu thí nghiệm là 4,0.105 (cfu/g) (tổng số

vi khuẩn hiếu khí ở mẫu đối chứng gấp 700 lần tổng số vi khuẩn hiếu khí ở mẫu thí

nghiệm). Khả năng bảo quản giảm dần sau 24 giờ và sau 48 giờ cho khả năng bảo quản thấp nhất với mẫu đối chứng có tổng số vi khuẩn hiếu khí là 2,9.108 (cfu/g), trong khi đó tổng số vi sinh vật hiếu khí ở mẫu thí nghiệm là 2,7.108 (cfu/g). Và kết

quả thí nghiệm trên còn cho thấy, dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 kìm hãm sự

phát triển của các vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu đến thời điểm 24 giờ so

với đối chứng.

Đồ án tốt nghiệp

Thí nghiệm Đối chứng

Hình 3.8. Tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nghiệm thức 12 giờ

Hình 3.9. Tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nghiệm thức 24 giờ

Đồ án tốt nghiệp

3.5.2.2. Kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliform

16000

14000

) g /

12000

u f c (

10000

m

8000

Đối chứng

Thí nghiệm

6000

4000

r o f i l o C ố s g n ổ T

2000

0 0 giờ

12 giờ

24 giờ

48 giờ

Hình 3.10. Tổng số Coliform các mẫu thị ở các thời gian khảo sát

Kết quả đánh giá khả năng bảo quản của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum

SC01 sau ly tâm thông qua phân tích chỉ tiêu Coliform được thể hiện trên Hình

3.10. Kết quả này cho thấy rằng dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau ly tâm có ảnh

hưởng đến tổng số Coliform của thịt ở các mốc thời gian khảo sát. Trong 4 nghiệm

thức đánh giả khả năng bảo quản, ở nghiệm thức bảo quản trong 12 giờ cho khả

năng bảo quản tốt nhất. Cụ thể cho thấy ở nghiệm thức 12 giờ, ở mẫu đối chứng cho tổng số Coliform trung bình là 4,1.103 (cfu/g) và ở mẫu thí nghiệm là 2,2.103 (cfu/g)

(tổng số Coliform ở mẫu đối chứng gấp 1,85 lần tổng số Coliform ở mẫu thí

nghiệm). Khả năng bảo quản giảm dần ở nghiệm thức 24 giờ (tổng số Coliform ở

mẫu đối chứng gấp 1,58 lần tổng số Coliform ở mẫu thí nghiệm). Nghiệm thức 48

giờ cho kết quả bảo quản thấp nhất, hầu như không có sự khác biệt giữa kết quả

giữa tổng số Coliform giữa mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm, ở mẫu đối chứng có tổng số Coliform là 13,5.104 (cfu/g) và tổng số Coliform ở mẫu thí nghiệm là 12,4.108 (cfu/g).

Như vậy, kết quả này cũng cho thấy rằng mặc dù số lượng Coliform ở mẫu thí

nghiệm tăng dần theo thời gian khảo sát nhưng tỷ lệ tăng thấp hơn so với nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

thức đối chứng. Điều này chứng tỏ dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 có khả năng

hạn chế sự phát triển của Coliform trong mẫu.

3.5.2.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu S. aureus

120000

100000

) g /

80000

60000

Đối chứng

u f c ( s u e r u a

.

Thí nghiệm

40000

S ố s g n ổ T

20000

0 0 giờ

12 giờ

24 giờ

48 giờ

Hình 3.11. Tổng số S. aureus các mẫu thịt ở các thời gian khảo sát

Kết quả đánh giá khả năng bảo quản của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum

SC01 sau ly tâm thông qua phân tích chỉ tiêu S. aureus được thể hiện trên Hình 3.9.

Kết quả này cho thấy rằng dịch vi khuẩn L. plantarum có ảnh hưởng đến tổng số S.

aureus của thịt với các mốc thời gian khác nhau. Trong 4 nghiệm thức đánh giả khả

năng bảo quản, ở nghiệm thức bảo quản trong 12 giờ cho khả năng bảo quản tốt

nhất. Cụ thể cho thấy ở nghiệm thức 12 giờ, ở mẫu đối chứng cho tổng số S. aureus trung bình là 5,6.104 (cfu/g) và ở mẫu thí nghiệm là 2,4.104 (cfu/g) (tổng số S.

aureus ở mẫu đối chứng gấp 2,29 lần tổng số S. aureus ở mẫu thí nghiệm). Khả

năng bảo quản giảm dần ở nghiệm thức 24 giờ (tổng số S. aureus ở mẫu đối chứng

gấp 1,76 lần tổng số S. aureus ở mẫu thí nghiệm). Nghiệm thức 48 giờ cho kết quả bảo quản thấp nhất, ở mẫu đối chứng có tổng số S. aureus là 9,5.104 (cfu/g) và tổng số S. aureus ở mẫu thí nghiệm là 8,5.104 (cfu/g).

Như vậy, kết quả này cũng cho thấy rằng mặc dù số lượng S.aureus ở mẫu thí

nghiệm tăng dần theo thời gian khảo sát nhưng tỷ lệ tăng thấp hơn so với nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

thức đối chứng. Điều này chứng tỏ dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 có khả năng

hạn chế sự phát triển của S. aureus trong mẫu.

Đối chứng Thí nghiệm

Hình 3.12. Tổng số S. aureus ở nghiệm thức 12 giờ

Ở tất cả các thí nghiệm trên, khả năng bảo quản tốt nhất luôn ở 12 giờ vì lúc

này các vi khuẩn chưa đủ thời gian để phát triển, trong khi đó hợp chất kháng khuẩn

đã phát huy tác dụng gây ức chế cao tới vi sinh vật hiếu khí làm mật độ vi khuẩn

giảm đi đáng kể. Đến 24 giờ và 48 giờ, các loại vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng mạnh,

đồng thơi dịch kháng khuẩn phần nào thấm vào bên trong mẫu thịt nên bị phân giải

dần do tác động của enzyme protease trong khối thịt vì thế hoạt tính kháng khuẩn

cũng dần kém đi tạo điều thuận lợi phát triển hơn cho vi khuẩn nên mật độ vi khuẩn

hiếu khí tăng dần theo thời gian.

Ngoài ra, không phát hiện được sự có mặt của E. coli và Salmonella trong các

mẫu đối chứng và thí nghiệm ở tất cả các mẫu khảo sát.

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thúy Hương và ctv (2008), khi khảo sát

khả năng bảo quản thịt tươi sơ chế bằng bacteriocin từ vi khuẩn Lactococus lactics

bằng cách thu dịch bacteriocin và tiến hành tẩm dịch bacteriocin lên màng mỏng

Đồ án tốt nghiệp

BC (Bacterial Cellulose) bằng cách ngâm 30 phút trong dịch bacteriocin có hoạt

tính lần lượt là 100, 200 và 400 (AU/ml). Sau đó tiến hành bảo quản thịt bằng cách

dùng màng BC đã qua xử lý bao gói thịt tươi rồi tiến hành đánh giá cảm quan và

phân tích các chỉ tiêu vi sinh như: tổng số vi sinh vật hiếu khí, S. aureus, E. coli,

Salmonella sau 1 ngày và 3 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 3 ngày thịt vẫn

giữ được mùi, trạng thái và kết cấu đặc trưng so với đối chứng. Các kết quả phân

tích vi sinh cũng cho thấy sau 3 ngày mật độ tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số E.

coli đều cho kết quả thấp hơn mẫu đối chứng và không phát hiện sự có mặt của S.

aureus và Salmonella. Cùng với đó còn có nghiên cứu của Phạm Minh Nhựt và ctv

(2012) khi ứng dụng dịch kháng khuẩn từ chủng lactic NC206 trong bảo quản thủy

sản. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu TPC và Coliform trong mẫu cho thấy, chất lượng bảo

quản mẫu tôm sú tốt nhất ở trong thời gian bảo quan 12 giờ và giảm dần trong 24

giờ tiếp theo; ngoài ra không phát hiện E. Coli, Salmonella và S.aureus trong các

mẫu thí nghiệm. Những kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu đã

tiến hành.

Như vậy, từ kết quả đánh giả khả năng bảo quản thịt của dịch vi khuẩn L.

plantarum SC01 cho thấy rằng hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum

SC01 sản sinh ra có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hiện diện

trong mẫu thịt thí nghiệm. Nhưng kết quả cho thấy mức độ bảo quản vẫn chưa được

cao vì thời gian ức chế không được kéo dài, tốt nhất chỉ bảo quản được sau 12 giờ

và sau đó vi sinh vật tiếp tục phát triển và gây hư hỏng thịt. Tuy nhiên, kết quả của

thí nghiệm này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu sản xuất chất bảo quản sinh học an

toàn đối với người sử dụng và đồng thời tăng thời gian sử dụng của sản phẩm để có

thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản sinh học thay thế cho các chất bảo quản

hóa học.

Tóm lại, từ các kết quả thí nghiệm đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng

kháng khuẩn của dịch chủng này khá tốt. Đồng thời đã xác định các yếu tố ảnh

hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn và khảo sát khả năng bảo quản thịt của dịch tế

Đồ án tốt nghiệp

bào vi khuẩn L. plantarum SC01. Các kết quả của nghiên cứu này rất có ý nghĩa

nhằm hướng đến khả năng ứng dụng của các hợp chất kháng khuẩn cũng như bản

thân sinh khối vi khuẩn L. plantarum SC01 trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm, sản

xuất chế phẩm vi sinh trong chăn nuôi, thủy sản hay ứng dụng ủ chua thức ăn xanh

cho gia súc.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

- Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định cho thấy rằng khi xử lý dịch kháng khuẩn ở nhiệt độ 800C cho khả năng ức chế mạnh hơn so với việc thanh trùng ở 600C, 1000C và ủ ở 370C.

- Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của

dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 cho thấy ở pH 6 thì dịch kháng khuẩn của L.

plantarum SC01 hoạt động ổn định, cho kết quả ức chế vi khuẩn chi thị tốt và đồng

đều nhất.

- Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp chất

kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01 được cố định trong ly tâm sau

trung hòa đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị cho thấy khi bổ sung EDTA với tỷ lệ

1% (w/v) cho khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị tốt nhất.

- Kết quả khảo sát hiệu quả ức chế của dịch tế bào L. plantarum SC01 được cố

định sau ly tâm đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát cho thấy

tỷ lệ ức chế tăng dần từ mốc thời gian 6 giờ đến 30 giờ, sau đó giảm dần từ mốc

thời gian 36 giờ. Tỷ lệ ức chế cao nhất trong khoảng thời gian 30 giờ đến 36 giờ.

- Kết quả đánh giả khả năng bảo quản thịt của dịch tế bào L. plantarum SC01 cho

thấy dịch kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01có khả năng ức chế sự phát

triển của các vi khuẩn tốt nhất sau 12 giờ.

4.2. Đề nghị

- Khảo sát các phương pháp thí nghiệm khác giúp nâng cao hiệu quả khả năng

bảo quản thực phẩm.

- Đánh giả khả năng bảo quản của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với các

lọai thực phẩm tươi sống khác.

- Tách, chiết và tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum

SC01 sản sinh ra để tạo chế phẩm sinh học giúp nâng cao hiệu quả bảo quản thực

phẩm.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Đỗ Quốc Cường (2009). Nâng cao chất lượng sữa chua bằng phương pháp vi gói vi

khuẩn lactic. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại Học Công

Nghệ Tp. HCM.

Lê Ngọc Thùy Trang (2013). Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng

sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khóa luận

tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Công Nghệ Tp. HCM.

Lê Thị Châu, Tạ Kim Chính (1994). Lựa chọn môi trường thích hợp để nhân giống

vi khuẩn lactic trong bảo quản thức ăn gia súc. Tạp chí công nghiệp thực

phẩm, 3: 37 – 40.

Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh

vật.03/03/2007.http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythuatbao

quanvisinhvat.htm

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. 2002. Vi sinh vật học. Nhà

xuất bản giáo dục.

Nguyễn Hoài Hương, Dương Thúy Vy, Trần Linh Châu, Đoàn Kim Như. 2012.

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ nem chua truyền thống làm

giống khởi động lên men nem chua probiotic. Hội nghị Công nghệ Sinh học

toàn quốc khu vực phía Nam lần thứ II: 8 – 11.

Nguyễn Thành Đạt (2001). Cơ sở sinh học vi sinh vật, 2. Nhà xuất bản giáo dục.

Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An. 2008. Thu nhận bacteriocin bằng

phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mnang

cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu.

Science & Technology Development 11: 100 – 109.

Phạm Minh Nhựt (2012). Đánh giá mức độ đối kháng của các hợp chất kháng

khuẩn từ vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn gây bệnh và ứng dụng trong bảo

quản thủy hải sản. Hội nghị Khoa học Nông nghiệp CAAB.

Đồ án tốt nghiệp

Phạm Minh Nhựt (2014). Thực hành các phương pháp phân tích vi sinh. Đại học

Công Nghệ Tp. HCM.

Phạm Ngọc Lan, Trần Thị Thúy, Lê Thanh Bình (1999). Đặc tính hóa phân loại

chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có phổ tác dụng rộng. Hội nghị Công

nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội: 314 – 318.

Trần Thanh Thủy (2003). Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để lên men lactic đồ uống

từ sắn. Luận án Tiến sĩ Sinh hoc, Đại học Sư phạm Hà Nội.

Vũ Hồng Thắng (1998). Vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình chế biến nem

chua. Luận án Thạc sĩ khoa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Daniel A., Joana B., Helena A., Joana S., Paul A. G., Paula T. (2011).

Characterization of bacPPK34 a bacteriocin produced by Pediococcus

pentosaceus strain K34 isolated from “Alheira”. University of Applied

Sciences, Germany.

De Vuyst L., Leroy F. (2007). Bacteriocin form Lactic Acid Bacteria: Production,

Purification and Food Applications. Journal of Molecular Microbiology and

Biotechnology: 194 – 199.

Isazadeh K., Majid M. R., Massiha A. (2012). Isolation of Lactobacillus Species

from Sediments of Caspian Sea for Bacteriocin Production. International

Conference on Biomedical Engineering and Technology, 34 (2): 79 – 84.

Jun J. W., Kang S. C., Koo S., Song (1997). Manitol Accumulation during

fermentation of Kimchi. Ferment Bioeng, 84 (2): 172 – 175.

Kaur B., Garg N. (2013). Characteristics of bacteriocin BA28 produced by

Pediococus acidilactici BA28. Mintage journal of Pharmaceutical and Medical

sciences: 2320 – 3315.

Khalid K. (2011). A review of novel feedstock for the production of polylactic acid.

Journal of Chemistry, 2 (1): 11 – 16.

Đồ án tốt nghiệp

Kusmarwati A., Indriati N., Hermana I. (2013). Production and characterization of

bacteriocin produced by lactic acid bacteria isolated from rusip. Bulletin of

marine and fisher postharvest and biotechnology, 8 (1): 13 – 22.

Moshood A. Y., TengkuHaziyamin A. T. A. H. (2012). Optimization of temperature

and pH for the growth and bacteriocin production of Enterococus faecium.

B3L3. IOSR Journal of Pharmacy, 2 (6): 49 – 59.

Ogunbanwo S. T., Sanni A. I., Onilude A. A. (2003). Characterization of

bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis

OG1. African Jounal of Biotechnology, 2 (8): 219 – 227.

Prema P. (2013). In vitro antagonis activity of a probiotic Lactobacillus Plantarum

against water borne pathogens. International Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, 5 (4): 175 – 178.

Rattanachaikunsopon P., Phumkhachorn P. (2010). Lactic acid bacteria: their

antimicrobial compounds and their uses in food production. Annals of

Biological Research, 1 (4): 218 – 228.

Ravi V., Prabhu M., Subramanyam D. (2011). Isolation of bacteriocin producing

bacteria from mango pulp and its antimicrobial activity. International Journal

of Microbiological Research, 1 (2): 54 – 63.

Salminen S., Deighton M. A., Benmo Y., Gorbach S. L. (1998). Lactic acid

bacteria in health and disease. Lactic acid bvacteria Microbiology and

Funtional asspects: 157 – 159.

Tortora G. J., Funke B. R. (1992). Introduction In Microbiology. The

Benjamin/Cummings Publishing Company: 701 – 709.

Yasuhisa K., Irwin F. (1983). Functionnal Significance of Manganese Catalase in

Lactobacillus plantarum. Journal of Bacteriology: 742 – 746.

International Conference on Biotechnology and Food Science 2: 50 – 56.

Zacharof M. P., Lovitt R. W. (2012). Bacteriocin produced by lactic acid bacteria.

Đồ án tốt nghiệp

Zambou N. F., Kaktcham P. M., Tiogo A. H. N., Guetiya W. R. E. (2013).

Antimicrobial activity of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum

29V and strain’s viability in Palm kernel oil. Internatinal Journal of Nutrition

and Food Sciences, 2 (3): 102 – 108.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG SỬ DỤNG

TRONG THÍ NGHIỆM

Thành phần môi trường MRS OPTSC01

MRS OPTSC01 (g/l)

Beef extract 10

Yeast extract 5

Trypton 10

Sucrose 20

Sodium acetate 5

Dipotassium phosphate 4

Ammonium citrate 2

Magnesium sulfate 0,2

Tween 80 1ml/l

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA VI

KHUẨN L. PLANTARUM SC01 CỐ ĐỊNH TRONG HỖN HỢP GELATIN 6 % - ALGINATE 2,5 %

B.1. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi ủ dịch ở các nhiệt độ (%)

370C 45.16% 42.18% 42.38% 39.45% 41.72%

41.01% 40.90% 40.69% 40.34% 38.87%

44.30% 43.79% 42.52% 41.39% 40.91%

53.81% 48.09% 52.14% 41.54% 53.46%

600C 51.80% 47.35% 52.14% 44.24% 50.88%

51.61% 46.54% 51.16% 44.91% 50.27%

53.32% 62.39% 61.00% 56.36% 57.67%

57.16% 58.70% 52.71% 56.14% 59.70%

21.57% 17.26% 12.30% 12.57% 19.40%

1000C 18.95% 16.66% 11.88% 10.70% 17.98%

19.20% 18.13% 12.93% 11.15% 16.82%

800C 55.45% 60.11% 60.22% 55.39% 59.36%

E. coli Salmonella S. aureus B. subtilis L. monocytogenes

53.28% 50.32% 48.88% 48.51% 48.52%

B.2. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi xử lý ở các giá trị pH (%)

pH 2 51.03% 47.52% 50.00% 52.01% 46.25%

49.97% 51.14% 50.12% 51.49% 49.15%

52.35% 50.57% 51.18% 49.50% 50.66%

pH 3 51.23% 52.03% 51.43% 52.28% 51.73%

53.35% 51.40% 54.47% 53.40% 48.39%

59.71% 53.11% 60.30% 53.14% 50.54%

61.63% 53.37% 59.31% 51.88% 48.39%

52.35% 45.36% 48.14% 46.27% 46.25%

pH 5 50.76% 48.54% 50.74% 46.27% 48.71%

50.70% 48.22% 51.61% 47.46% 46.38%

pH 4 59.31% 52.03% 59.80% 49.50% 52.55%

E. coli Salmonella S. aureus B. subtilis L. monocytogenes

Đồ án tốt nghiệp

B.3. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi xử lý ở các giá trị pH (%)

pH 7

pH 6

pH 10

pH 9

pH 8 50.63 51.23 52.82 50.28 48.42 52.20 49.17 47.32 48.01 47.52 51.31 49.45 49.93 48.97 51.44 54.70 54.89 51.33 38.74 40.07 40.14 41.82 40.00 42.1 37.26 37.96 38.11 42.74 46.11 43.30 52.05 49.75 52.61 48.65 51.42 51.21 50.59 49.62 50.59 50.17 51.28 48.17 47.06 49.62 49.55 51.02 49.97 51.62 44.39 43.67 42.50 49.38 49.77 52.63 44.65 47.57 44.13 50.29 50.88 47.83 50.85 51.73 51.10 47.10 46.17 44.20 46.83 46.77 47.36 43.60 45.71 44.39 44.99 45.05 47.89

E. coli Salmonella S. aureus B. subtilis L. monocytogenes

B.4. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi bổ sung các chất hoạt động bề mặt

với tỷ lệ 1% (w/v) (%)

EDTA

Tween 80 8.86 12.42 11.20 14.44 13.73 13.91 9.37 10.57 11.00 22.79 26.49 23.33 10.61 11.81 12.18

Tween 20 25.15 26.78 26.17 37.94 35.48 34.07 22.11 19.83 21.46 33.51 37.66 36.94 23.89 26.01 27.95

95.82 96.03 95.11 98.24 99.56 98.59 92.48 92.05 92.16 99.01 98.83 97.93 93.17 96.68 94.56

Urea 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

SDS 65.38 67.82 66.19 59.86 56.43 60.56 35.29 38.02 39.11 15.14 16.22 14.14 52.77 48.62 50.65

NT ĐC 84.93 85.34 82.38 E. coli 72.80 71.92 71.83 Salmonella 74.07 70.48 71.79 S. aureus 69.46 68.29 72.25 B. subtilis L. monocytogenes 61.16 63.47 64.76

Đồ án tốt nghiệp

32.18 28.78 30.28 24.97 27.92

B.5. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 theo thời gian khảo sát (%)

6 giờ 30.71 29.88 27.08 23.76 26.92

30.82 28.69 27.72 22.94 25.60

57.92 55.07 56.87 48.85 54.70

54.92 58.16 59.12 51.78 55.41

44.29 35.86 45.41 31.44 37.75

40.80 37.09 42.88 33.20 40.91

47.17 46.66 52.91 49.47 50.48

12 giờ 58.20 56.66 58.34 48.93 58.96

18 giờ 44.07 36.51 45.19 34.96 40.69

24 giờ 48.22 48.57 52.23 48.34 49.38

50.17 48.98 49.89 51.80 52.77

E. coli Salmonella S. aureus B. subtilis L. monocytogenes

66.74 76.53 70.42 73.12 76.43

B.6. Kết quả tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 theo thời gian khảo sát (%)

30 giờ 67.42 74.89 71.73 72.61 73.53

68.87 72.61 73.27 70.91 76.72

67.68 72.02 67.43 75.60 72.39

66.60 72.88 68.77 73.26 72.98

61.22 66.13 64.40 72.09 60.54

62.94 66.84 61.93 68.48 57.06

56.23 55.36 57.41 57.50 56.37

36 giờ 65.52 70.04 69.38 71.72 69.23

42 giờ 63.66 64.64 63.42 70.54 59.82

48 giờ 60.09 54.13 55.67 58.12 54.71

57.71 57.34 54.56 55.39 54.32

E. coli Salmonella S. aureus B. subtilis L. monocytogenes

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO THỊT CỦA DỊCH VI KHUẨN L. PLANTARUM SC01

C.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu TPC (khuẩn lạc)

12h

10-3

0h 10-4

10-5

10-6

10-7

201 196

224 195 188 224 195 188

203 213 204 203 213 204

197 168 110 197 168 110

180 204 124 180 204 124

140 107 68 140 107 68

105 115 75 105 115 75

>250 >250 >250 3 2 3

213 203 186 2 2 0

203 1 2 1

108 103 119 0 0 1

118 130 114 1 0 0

>250 >250 >250 2 4 5

Tỷ lệ pha loãng Đối chứng 1 Đối chứng 2 Đối chứng 3 Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3

C.2. Kết quả đánh giá chỉ tiêu TPC (khuẩn lạc)

48h

24h 10-6

10-7

10-5 >250 >250 >250 62 69 56

>250 >250 >250 63 67 42

>250 222 203 26 32 24

>250 >250 187 35 44 22

197 203 156 16 6 5

199 189 166 8 5 5

10-6 >250 >250 >250 184 173 153

123 112 218 84 96 98

>250 >250 >250 190 151 180

10-8 64 91 94 61 51 42

53 43 44 51 36 38

93 105 223 80 84 96

Tỷ lệ pha loãng Đối chứng 1 Đối chứng 2 Đối chứng 3 Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3

Đồ án tốt nghiệp

C.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliform (khuẩn lạc)

0h

12h

24h

48h

10-1

10-2

10-3

10-2

10-3

10-4

90 78 88 63 59 70

>100 89 >100 69 66 62

43 40 44 30 28 27

46 41 43 26 33 35

50 54 43 40 38 38

46 58 48 41 45 46

30 25 18 30 36 20

26 20 26 22 28 26

36 33 35 36 33 35

42 40 37 42 40 37

16 14 15 16 14 15

15 10 21 15 10 21

54 43 61 21 18 26

50 52 48 22 23 20

21 20 27 8 10 9

25 24 25 6 7 12

Tỷ lệ pha loãng Đối chứng 1 Đối chứng 2 Đối chứng 3 Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3

C.4. Kết quả đánh giá chỉ tiêu S. aureus (Nồng độ pha loãng 10-2) (khuẩn lạc)

0h 12h 24h 48h

96 80 75 45 55 47 91 83 77 46 44 49 4 6 5 4 6 5 6 4 7 6 4 7 60 56 49 27 26 24 54 60 56 24 23 22 102 93 95 74 90 78 80 105 97 86 84 96

Đối chứng 1 Đối chứng 2 Đối chứng 3 Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

D.1. Kết quả ức chế vi khuẩn E. coli của dịch vi khuẩn L. plantarum sau

khi ủ ở các nhiệt độ

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 2320.1 3 773.367 256.18 0.0000

Within groups 24.1509 8 3.01887

Total (Corr.) 2344.25 11

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Method: 95.0 percent LSD

Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups

100 3 19.9067 X

37 3 43.49 X

60 3 52.4067 X

80 3 55.31 X

Đồ án tốt nghiệp

D.2. Kết quả ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch vi khuẩn

Lactobacillus plantarum sau khi ủ ở các nhiệt độ

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 2923.62 3 974.54 580.81 0.0000

Within groups 13.4231 8 1.67788

Total (Corr.) 2937.04 11

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Method: 95.0 percent LSD

Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups

100 3 17.35 X

37 3 42.29 X

60 3 47.3267 X

80 3 60.4 X

Đồ án tốt nghiệp

D.3. Kết quả ức chế vi khuẩn S. aureus của dịch vi khuẩn L. plantarum

sau khi ủ ở các nhiệt độ

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 3676.67 3 1225.56 216.99 0.0000

Within groups 45.1846 8 5.64808

Total (Corr.) 3721.86 11

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Method: 95.0 percent LSD

Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups

100 3 12.37 X

37 3 41.8633 X

60 3 51.8133 X

80 3 57.9767 X

Đồ án tốt nghiệp

D.4. Kết quả ức chế vi khuẩn B. subtilis của dịch vi khuẩn L. plantarum

sau khi ủ ở các nhiệt độ

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 3013.9 3 1004.63 243.00 0.0000

Within groups 33.0739 8 4.13423

Total (Corr.) 3046.97 11

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Method: 95.0 percent LSD

Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups

3 11.4733 X 100

3 40.3933 X 37

3 43.5633 X 60

3 54.2967 X 80

D.5. Kết quả ức chế vi khuẩn L. monocytogenes của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi ủ ở các nhiệt độ

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 2855.08 951.694 483.34 0.0000 3

8 Within groups 15.7519 1.96899

Total (Corr.) 2870.83 11

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Nhiệt độ

Method: 95.0 percent LSD

Nhiệt độ Count Mean Homogeneous Groups

3 18.0667 X 100

3 40.5 X 37

3 51.5367 X 60

3 58.91 X 80

Đồ án tốt nghiệp

D.6. Kết quả ức chế vi khuẩn E. coli của dịch vi khuẩn L. plantarum sau

khi điều chỉnh pH

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 285.858 8 35.7323 18.63 0.0000

Within groups 34.5293 18 1.9183

Total (Corr.) 320.387 26

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by pH

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

8 3 48.1667 X

9 3 49.4267 XX

10 3 50.1133 XXX

7 3 50.3 XXX

5 3 51.27 XX

2 3 51.4267 XX

6 3 51.56 XX

3 3 52.31 X

4 3 60.2167 X

Đồ án tốt nghiệp

D.7. Kết quả ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi điều chỉnh pH

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by pH

Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value

Square

Between groups 842.636 8 105.33 55.19 0.0000

Within groups 34.3515 18 1.90842

Total (Corr.) 876.988 26

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by pH

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

9 3 37.7767 X

7 3 39.65 XX

8 3 41.3333 X

10 3 44.05 X

5 3 47.3733 X

2 3 49.66 XX

3 3 51.3333 XX

4 3 52.8367 X

6 3 53.64 X

Đồ án tốt nghiệp

D.8. Kết quả ức chế vi khuẩn S. aureus của dịch vi khuẩn L. plantarum

sau khi điều chỉnh pH

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 263.08 8 32.885 17.48 0.0000

Within groups 33.8537 18 1.88076

Total (Corr.) 296.934 26

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by pH

Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneous Groups pH

10 3 48.7433 X

2 3 49.6667 XX

9 3 49.8733 XX

5 3 50.1633 XXX

8 3 50.2667 XXX

7 3 50.4267 XXX

6 3 51.47 XX

3 3 52.36 X

4 3 59.8033 X

Đồ án tốt nghiệp

D.9. Kết quả ức chế vi khuẩn B. subtilis của dịch vi khuẩn L. plantarum

sau khi điều chỉnh pH

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 213.157 8 26.6446 10.75 0.0000

Within groups 44.5995 18 2.47775

Total (Corr.) 257.756 26

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by pH

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

7 3 43.52 X

9 3 45.45 XX

5 3 46.6667 X

10 3 49.6667 X

8 3 50.5933 X

2 3 50.67 X

6 3 50.87 X

4 3 51.5067 X

3 3 51.7267 X

Đồ án tốt nghiệp

D.10. Kết quả ức chế vi khuẩn L. monocytogenes của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi điều chỉnh pH

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 131.675 8 16.4593 8.29 0.0001

Within groups 35.7329 18 1.98516

Total (Corr.) 167.408 26

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by pH

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

3 44.5667 X 9

3 45.8233 XX 7

10 3 45.9767 XX

3 46.9867 X 8

3 47.1133 X 5

3 47.9733 XX 2

3 50.26 XX 3

3 50.4933 X 4

3 51.2267 X 6

Đồ án tốt nghiệp

D.11. Kết quả ức chế vi khuẩn E. coli của dịch vi khuẩn L. plantarum

sau khi bổ sung chất hoạt động bề mặt

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 24263.8 5 4852.75 3507.99 0.0000

Within groups 16.6001 12 1.38334

Total (Corr.) 24280.4 17

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Method: 95.0 percent LSD

Chất hoạt động bề mặt Count Mean Homogeneous Groups

Urea 0.0 X 3

Tween 80 10.8267 X 3

Tween 20 26.0333 X 3

SDS 66.4633 X 3

DC 84.2167 X 3

EDTA 95.6533 X 3

Đồ án tốt nghiệp

D.12. Kết quả ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi bổ sung chất hoạt động bề mặt

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 20640.3 5 4128.05 2576.68 0.0000

Within groups 19.225 12 1.60208

Total (Corr.) 20659.5 17

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Method: 95.0 percent LSD

Chất hoạt động bề mặt Count Mean Homogeneous Groups

Urea 0.0 X 3

Tween 80 14.0267 X 3

Tween 20 35.83 X 3

SDS 58.95 X 3

DC 72.1833 X 3

EDTA 98.7967 X 3

Đồ án tốt nghiệp

D.13. Kết quả ức chế vi khuẩn S. aureus của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi bổ sung chất hoạt động bề mặt

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 19785.9 5 3957.19 2548.68 0.0000

Within groups 18.6317 12 1.55264

Total (Corr.) 19804.6 17

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Method: 95.0 percent LSD

Chất hoạt động bề mặt Count Mean Homogeneous Groups

Urea 0.0 X 3

Tween 80 10.3133 X 3

Tween 20 21.1333 X 3

SDS 37.4733 X 3

DC 72.1133 X 3

EDTA 92.23 X 3

Đồ án tốt nghiệp

D.14. Kết quả ức chế vi khuẩn B. subtilis của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi bổ sung chất hoạt động bề mặt

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 20278.5 5 4055.7 1546.51 0.0000

Within groups 31.4697 12 2.62248

Total (Corr.) 20310.0 17

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Method: 95.0 percent LSD

Chất hoạt động bề mặt Count Mean Homogeneous Groups

Urea 0.0 X 3

SDS 15.1667 X 3

Tween 80 25.87 X 3

Tween 20 36.0367 X 3

DC 70.0 X 3

EDTA 98.59 X 3

Đồ án tốt nghiệp

D.15. Kết quả ức chế vi khuẩn L. monocytogenes của dịch vi khuẩn L.

plantarum sau khi bổ sung chất hoạt động bề mặt

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 18762.1 5 3752.41 1447.44 0.0000

Within groups 31.1093 12 2.59244

Total (Corr.) 18793.2 17

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Chất hoạt động bề mặt

Method: 95.0 percent LSD

Chất hoạt động bề mặt Count Mean Homogeneous Groups

Urea 0.0 X 3

Tween 80 11.5333 X 3

Tween 20 25.95 X 3

SDS 50.68 X 3

DC 63.13 X 3

EDTA 94.8033 X 3

Đồ án tốt nghiệp

D.16. Kết quả ức chế vi khuẩn E. coli của dịch vi khuẩn L. plantarum

theo thời gian khảo sát

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 3336.46 7 476.637 213.88 0.0000

Within groups 35.6569 16 2.22856

Total (Corr.) 3372.12 23

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Method: 95.0 percent LSD

Thời gian Count Mean Homogeneous Groups

6h 3 31.2367 X

18h 3 43.0533 X

24h 3 48.52 X

12h 3 57.0133 X

48h 3 58.01 X

42h 3 62.6067 X

36h 3 66.6 X

30h 3 67.6767 X

Đồ án tốt nghiệp

D.17. Kết quả ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch vi khuẩn L.

plantarum theo thời gian khảo sát

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 5493.95 7 784.85 448.10 0.0000

Within groups 28.0241 16 1.75151

Total (Corr.) 5521.97 23

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Method: 95.0 percent LSD

Thời gian Count Mean Homogeneous Groups

6h 3 29.1167 X

18h 3 36.4867 X

24h 3 48.07 X

48h 3 55.61 X

12h 3 56.63 X

42h 3 65.2033 X

36h 3 71.6467 X

30h 3 74.6767 X

Đồ án tốt nghiệp

D.18. Kết quả ức chế vi khuẩn S. aureus của dịch vi khuẩn L.

plantarum theo thời gian khảo sát

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 4123.54 7 589.078 308.27 0.0000

Within groups 30.5743 16 1.91089

Total (Corr.) 4154.12 23

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Method: 95.0 percent LSD

Thời gian Count Mean Homogeneous Groups

6h 3 28.36 X

18h 3 44.4933 X

24h 3 51.6767 X

48h 3 55.88 X

12h 3 58.11 X

42h 3 63.25 X

36h 3 68.5267 X

30h 3 71.8067 X

Đồ án tốt nghiệp

D.19. Kết quả ức chế vi khuẩn B. subtilis của dịch vi khuẩn L.

plantarum theo thời gian khảo sát

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 7088.94 7 1012.71 394.76 0.0000

Within groups 41.0459 16 2.56537

Total (Corr.) 7129.98 23

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Method: 95.0 percent LSD

Thời gian Count Mean Homogeneous Groups

6h 3 23.89 X

18h 3 33.2 X

12h 3 49.8533 X

24h 3 49.87 X

48h 3 57.0033 X

42h 3 70.37 X

30h 3 72.2133 XX

36h 3 73.5267 X

Đồ án tốt nghiệp

D.20. Kết quả ức chế vi khuẩn L. monocytogenes của dịch vi khuẩn L.

plantarum theo thời gian khảo sát

ANOVA Table for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value

Squares Square

Between 5265.65 7 752.235 246.59 0.0000

groups

Within 48.8086 16 3.05054

groups

Total (Corr.) 5314.46 23

Multiple Range Tests for Tỷ lệ ức chế by Thời gian

Method: 95.0 percent LSD

Thời gian Count Mean Homogeneous Groups

6h 3 26.8133 X

18h 3 39.7833 X

24h 3 50.8767 X

48h 3 55.1333 X

12h 3 56.3567 XX

42h 3 59.14 X

36h 3 71.5333 X

30h 3 75.56 X