72
Chương 7
PHẢN ỨNG KẾT HỢP
KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ
I. Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể
Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các
lực liên kết lý hóa sau:
* Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết
Wander-Wals.
* Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm
amin và nhóm carboxyl.
* Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau
* Lực kỵ nước
Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một
phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần
kháng nguyên và kháng thể.
II. Phản ứng ngưng kết - Agglutination test
1. Nguyên lý
Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi
khuẩn). Khi găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau
thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng
kết trực tiếp,
Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng
thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình
trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau
qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới
hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện
73
bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm
bông lơ lửng.
Các phản ứng ngưng kết thường đơn giản, dễ làm, có độ nhạy cao,
không tốn kém, được sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược điểm là khó đạt
trình độ chính xác cao, thường hay cho phản ứng dương tính giả.
2. Các loại phản ứng ngưng kết
2.1. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Là phản ứng có tính chất định tính, thường sử dụng kháng nguyên
đã biết và nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh.
Hình 20: Phản ứng ngưng k
ế
t
A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một
xác vi khuẩn
B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn
C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM
74
Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau
đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết
quả, nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng
nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng kết, nếu kháng nguyên được nhuộm
màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh nhạt màu hơn.
2.2. Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm
Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm
lượng kháng thể.
Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi
huyết thanh có độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16..)
hoặc theo cơ số 10 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000..) sau đó cho vào mỗi ống
nghiệm một lượng tương đương kháng nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo
yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc kết quả và tính được
hiệu giá ngưng kết. Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà ở đó vẫn
xảy ra hiện tượng ngưng kết.
2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể
tương ứng trong phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta
thường dùng hồng cầu, hạt chất dẻo như hạt latex, bentonit
Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên
hữu hình, bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu
đóng vai trò là giá đỡ cho kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên
hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành kháng nguyên hữu hình và phản
ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng.
Có nhiều phương pháp để gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặt
hồng cầu. Có thể xử lý bằng các hóa chất như a xít tanic, benzidin, các muối
crom, glutaraldehyd.. các hóa chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu
và nhóm chức còn lại gắn với kháng nguyên..
75
Khi có phản ứng xảy ra, nghĩa là khi có kháng thể tương ứng với
kháng nguyên, thì các kháng thể sẽ nối các kháng nguyên lại và các kháng
nguyên đã gắn với hồng cầu hoặc đã hấp phụ vào các hạt chất dẻo, tạo nên
sự ngưng kết nhìn thấy rõ ràng.
2. 4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Phản ứng HI)
Nguyên lý: Một số loại vi rút (vi rút cúm, vi rút Newcastle) có đặc
tính gây ngưng kết hồng cầu của một số loài gia súc gia cầm. Nếu gặp kháng
thể đặc hiệu tương ứng, thì vi rút bị kháng thể trung hòa, không còn vi rút để
tiếp xúc với hồng cầu, hay nói cách khác, kháng thể đã ngăn trở ngưng kết
hồng cầu của vi rút. Còn nếu vi rút không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng,
vi rút sẽ không bị trung hòa và vi rút sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
- Phương pháp tiến hành phản ứng: thường dùng vi rút đã biết để
làm phản ứng HI với huyết thanh cần chẩn đoán. Phản ứng vừa có tính chất
định tính vừa có tính chất định lượng.
Vi rút được pha với nồng độ 4 đơn vị HA (Haemagglutination).
Hình 21. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động
76
Huyết thanh được pha loãng theo cơ số 2: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.. hoặc
theo cơ số 10 : 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000..
Cho hỗn hợp vi rút và huyết thanh ở mỗi nồng độ với lượng nhất
định, để ở nhiệt độ thích hợp.
Sau một thời gian 10-20 phút, cho một lượng hồng cầu pha loãng
từ 0,5-1% với một lượng nhất định vào tất cả các ống.
Đọc kết quả sau 15-30 phút
Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, chứng tỏ
huyết thanh tương ứng với vi rút.
Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết thành mạng, chứng tỏ
huyết thanh không tương ứng với vi rút, nên vi rút đã làm ngưng kết hồng
cầu.
III. Phản ứng kết tủa (Precipitation test)
1- Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong
phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể
tương ứng, cũng là chất hòa tan trong huyết thanh.
Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó
xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được.
Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH,
các ion môi trường điện giải..
1. Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng
1.1. Phản ứng kết tủa vòng
Là phản ứng có tính chất định tính.
Dùng ống nghiệm loại nhỏ, cho kháng nguyên hòa tan vào trước,
sau đó dùng pipet đã hút huyết thanh có kháng thể tương ứng, để đầu mút
pipet vào sát đáy ống nghiệm rồi nhỏ từ từ cho kháng thể vào, với một lượng
tương đương, kháng thể sẽ đội kháng nguyên lên (vì là kháng nguyên hòa
tan nên nhẹ hơn kháng thể).