ị ằ ỹ
Lê Thúy Quyên*(1), Ph m Hùng Vân
(2), Võ Đ c Xuyên An
(3), Lê Th Phi Y n ị
Đ nh genotype HPV b ng k thu t PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11 ọ (4) ế (3), Hòang Hi u Ng c ậ ạ
ứ
ế
nh 16, 18 là
ơ
ư
ư ạ
ệ t ớ ng tiên ch n đóan nên có r t ít các công trình nghiên c u v t n su t các ki u gen HPV phát
ể
ứ
ề ề ầ
các tác nhân có ti m năng sinh ung th . T i Vi ấ
ươ c trong các qu t c t
ặ
ậ
ể
ệ
ể
ứ Xây d ng và phát tri n k thu t PCR-ELISA lai v i 9 dò đ c hi u ki u gen là 16, 18, 31,
ớ các qu t c t
ỹ ể
ệ ổ ử
ẩ
ệ
ươ
cung. ệ ổ ử
ậ
ứ ỹ
ng và ph ủ
ừ ứ B nh ph m nghiênc u là các qu t c t ự
ư
ắ
ạ
ế
ủ
ữ
ế
ượ
cung. Đ ớ ể ạ ự
ạ ự
ả ế
ặ ế ả
ệ ạ ẩ
ả ả ứ ắ
ượ
ừ
ẩ
ế
ữ ệ ả
ấ ặ ằ
ệ ộ
ế
ệ
ắ
ợ
ẽ ượ
ệ
ệ
ả Ti n hành th nghi m PCR-ELISA trên 84 m u b nh ph m l y t
ấ ừ ổ ử
ế
ẫ
ẩ
ằ
ệ ộ ố
c t ụ
ử ế
ệ
ố
ị
khá cao so v i các nghiên c u tr
ng tính chi m t l
ừ ế
ứ
ậ
ớ
55%. Đây là m t t l ỉ ệ ệ ẫ
ươ
ả ẩ ệ ủ
ế ụ ị
ệ ằ
ượ
ậ
ỹ
ế
ế
ả
ậ
ế ệ
ế
ế
ả ng mà các tác gi
ợ ễ
ườ
ử
ả
cho là k thu t PCR-ELISA là k thu t thích h p nh t đ
ậ T các k t qu nghiên c u trên, các tác gi
ỉ ệ ừ
ế
ứ
ả
ậ
ậ
ợ
ỹ
ữ này cũng không ph i là ít. ả i các phòng thí nghi m lâm sàng có ph ệ
ấ ể ng ti n PCR đ phát hi n và xác đ nh genotype ệ
ỹ ươ
ệ
ể
ị
cung
tắ Tóm t ề HPV v i các ki u gen nguy c cao Đ t v n đ : ể ặ ấ Nam, do thi u ph ẩ ấ ế cung. hi n đ ệ ổ ử ệ ượ M c tiêu nghiên c u: ự ụ 33, 35, 39/45 và 6/11 đ phát hi n và xác đ nh ki u gen HPV t ị ệ ể Đ i t ể phát hi n và xác ng pháp nghiên c u: ệ ố ượ đ nh genotype c a human papilloma virus, chúng tôi đã xây d ng k thu t PCR – ELISA v i nguyên t c nh sau: ị ẩ đ u tiên khu ch đ i 1 đo n gen đ c hi u dài 450 bp n m trên vùng L1 c a HPV đ t o ra nh ng s n ph m ạ ằ ầ c đánh d u DIG trong quá trình th c hi n ph n ng PCR. khu ch đ i. Nh ng s n ph m khu ch đ i này đ u đ ệ ề ẩ c g n trên các Sau đó th c hi n bi n tính và lai s n ph m v i các đo n dò đ c hi u cho t ng genotype đã đ ạ ớ gi ng ELISA. S n ph m lai g n trên gi ng s đ ứ ợ c phát hi n b ng c ng h p là anti – DIG g n HRPO. Ph c h p ắ ẽ ượ c phát hi n b ng ch t hi n màu TMB. này s đ ấ ằ cung b ng que Ayre hòa trong K t qu : ế ệ ử c b nh vi n T Dũ và m t s phòng khám ph khoa khác g i đ n, chúng tôi ghi c mu i sinh lý đ dung d ch n ượ ệ ướ c nh n có 45 m u có DNA – HPV d ướ ộ ỉ ệ ươ ẫ đây c a b nh vi n Hùng V ng th c hi n trên các m u xét nghi m b t kỳ. S n ph m PCR-ELISA c a 45 m u ẫ ủ ệ ấ ự ủ ệ ủ ẵ c ph s n c ti p t c đ nh genotype b ng k thu t ELISA lai v i dò đ c hi u c a 9 genotype đ này sau đó đ ặ ượ ớ ợ trên gi ng là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11; k t qu ghi nh n đ ng h p c nh sau: type 16 chi m 25 tr ườ ư ượ ế t là 18 (4%), 31 (2%), 33 (7%), 35 (2%), 39/45 (2%), 6/11 (16%). Có 7 l l n l (56%), các type khác chi m t ỷ ệ ầ ượ nh n th y r ng có m t tr c genotype, chi m 16%. V i các k t qu này, các tác gi ng h p không phát hi n đ ộ ấ ằ ậ ả ớ ượ ườ nhi m nh ng genotype HPV khác ngoài 9 type thông th t l ệ t l p trong th nghi m đã thi ế ậ ỉ ệ ELISA và t l ả K t lu n: có th tri n khai đ ể ể HPV trong các b nh ph m qu t c t ệ
ế c t ượ ạ ẩ
ệ ổ ử
Abstract Genotyping of HPV by PCR – ELISA hybridized 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic tool detecting and genotyping of HPV, there were still very few studies on the prevalence of HPV genotype detected from cervical swabs. Aims of the study: Develop the PCR-ELISA hybridized with 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11 to detect and genotype HPV from the cervial swabs. Methods: To detect and identify genotype of HPV, we set PCR – ELISA technique with main principle: First, a 450 bp – DNA HPV in L1 region is amplified by PCR. These PCR product were labelled with DIG in the PCR reaction, then it will be denatured and hybrided with specific probes which are attached passively to streptavidine in ELISA wells. Hybrided products will be detected by anti DIG – HRPO conjugate and then detected by TMB. Results: With 84 samples received from Tu Du hospital and other gynecology clinics, after running PCR reaction, there are 45 samples positive to DNA – HPV. These 45 PCR products, then, will be genotyped by ELISA method in which these PCR product will be hybridized with 9 genotypic probes including 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, and 6/11. The collected result revealed that 25 are belong to type 16 (56%), other types 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 have 4%, 2%, 7%, 2%, 2%, 11%, respectively. There are 7 samples positive to DNA-HPV but cannot identify genotype, have 16%. Authors realize that there is an unexpected incidence of other HPV types besides 9 HPV types that set up in ELISA. Conclusions: In Vietnam, PCR-ELISA is the most suitable technique that can be set up in the clinical laboratories with PCR facilities to detect and genotyping of HPV in the cervical swabs
t, Nam, ung th c t Đ t v n đ ặ ấ ề ạ ế ạ ư ế ọ Ung th c t ư ổ ử ặ ấ ụ ố ặ ở ị ủ ề ế ữ ế châu Âu và B c M là t ấ ộ ở ụ ữ ệ ắ ỹ ng là 100% 100.000 dân. T i Vi cung ệ ư ổ ử ụ ữ ộ ổ 38,55%, đa s g p chi m t l ph n đ tu i ỉ ệ 40 – 49(1). K t qu đi u tr tùy thu c hoàn toàn ộ ả ề vào giai đ an phát tri n c a ung th đ c phát ư ượ ể hi n. N u phát hi n và đi u tr khi còn là giai ệ ệ (2). ng lành b nh th đ an 0, tiên l ọ ị ườ ượ ệ ỉ ệ cung là lo i ung th chi m t l ế ư ở ơ cao nh t ho c nhì trong các lo i ung th c ạ quan sinh d c n , chi m 12% các b nh ác tính ừ c a ph n . Xu t đ ủ 30 đ n 35 ca b nh m i hàng năm, tính trên ớ ệ
ượ
ạ
ả
ọ
ọ
ộ
ạ (3)C Nhân Sinh H c, Công ty Nam Khoa Biotek;
(2)TS., B Môn Vi Sinh, (4)BS., B Môn Sinh Hóa,
ơ ả ọ
ử
ộ
*Tác gi Khoa Y, Đ i H c Y D c TP. H Chí Minh; ượ Khoa Y, Đ i H c Y D c TP. H Chí Minh ượ
ế (1)Th c Sĩ, BM Sinh H c, Khoa Khoa H c C B n, Đ i H c Y D c TP. HCM; chính, ọ ọ ạ ọ ạ
ồ ồ
1
c đây, ng ề ấ ằ ả i ta th y r ng có nhi u y u t ườ ế ể ụ i d n đ n ung th c t ư ổ ử ư ườ ử ụ ẩ ơ ằ ế ệ i ta đã phát hi n đ ệ cung ư ổ ử ượ ớ ố ả ượ ấ ể ả ấ ớ K/detergent do công ty Nam Khoa s n xu t v i m c đích dùng dung d ch này đ tiêu hóa các ị protein bám trên DNA c a virus cũng nh trong ư ủ ươ b nh ph m. Sau đó, chúng tôi s d ng ph ng ệ ng pháp pháp ly trích DNA b ng ph ươ phenol/choloform v i b thu c th DNAPREP ử ộ PHCHL do công ty Nam Khoa s n xu t đ trích bi t DNA t m u. ư ỏ ử ừ ẫ ệ ơ : Dùng 10m Phát hi n HPV- DNA ị ệ
ơ ộ ề ứ ẵ ể ộ ớ ấ ị ả ư ầ ủ ế
bào niêm m c c t ạ ế ộ ồ ớ ườ ạ ế ả ồ ủ ờ ẽ ạ ươ ớ ự bình th ế ấ ể ầ ẩ ấ ọ ử t dành cho HPV nh ng trình luân nhi ả ươ ệ ậ ơ ừ
ế ủ ế ươ ọ ớ ố ướ ế ế ẩ ượ ệ ả ạ ậ ỗ ớ ạ ậ ệ ể ộ ớ ng pháp này l ệ ẫ ứ ế ạ ộ
l d ch ly trích cho vào tube ch a s n HPV – ELISA mix. PCR ủ mix này dùng đ phát hi n và đ nh genotype c a ệ HPV do công ty Nam Khoa s n xu t v i các thành ph n ch y u là PCR buffer (Biorad), dNTP (Roche), Taq polymerase (Biorad), m iồ MY09 và MY11 (Invitrogen) và dUTP có g nắ c pha v i các n ng đ thích DIG (Roche) đ ượ h p đ khu ch đ i môt đo n DNA dài 450 bp ạ ể ợ trên vùng gen L1 c a HPV đ ng th i s t o ra nh ng s n ph m PCR có đánh d u DIG. Sau đó ữ ư ch y ch ạ sau: 40oC trong 10 phút; 95oC trong 5 phút; 95oC trong 30giây và 70oC trong 30 giây đ ượ ặ ạ i c l p l 20 chu kỳ; sau đó là 95oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút đ i trong 35 c l p l ượ ặ ạ oC trong 10 phút. chu kỳ k ti p; cu i cùng là 72 S n ph m khu ch đ i đ c đi n di trên gel ế agarose 2% pha trong TBE 0.5X (dùng b AGE ộ do công ty Nam Khoa s n xu t) cùng v i m t ấ ả 100 – 1000 bp gi ng ch a thang DNA chu n t ẩ ừ (Biorad) v i m i băng DNA chu n cách nhau ẩ ỗ ớ c cho là d 100 base. K t qu đ ng tính khi ươ ả ượ ế v trí 450 bp. v ch khu ch đ i rõ nét ở ị ế ạ ạ
ậ ỏ ng pháp lai trên v ch (InoLiPA) Xác đ nh genotype c a HPV ị ữ ữ ế ươ ớ ư ề ử ụ
ằ ệ ặ ạ ắ ệ ụ ộ ươ ồ ờ ị ủ ể ủ ầ ượ ớ ủ ẩ ớ ế ươ cung ế ố Tr ướ cung trong đó thu n l ậ ợ ẫ có human papilloma virus nh ng cho đ n nay, ế c r ng HPV là tác nhân ng ượ ằ (3-5). Cho đ n nay, h n 100 gây ung th c t c phát hi n trong đó có genotype HPV đã đ kho ng 29 genotype đ c phân làm 3 nhóm nguy c lien quan đ n ung th c t cung, đó là: nhóm ế ơ nguy c cao v i 15 genotype (16, 18, 31, 33, 39, ớ 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82) 3 genotype thu c nhóm nguy c cao ti m tàng (26, 53, 66) và 11 type thu c nguy c th p (6, 11, 40, 42, 43, 44, ơ ấ 54, 61, 70, 72, và 81)(3). Ph ong pháp t ọ bào h c ế ể ầ c xem là khá h u hi u đ t m (PAP’s smear) đ ượ ệ ữ c quá soát ung th c t cung vì xem xét đ ượ ư ổ ử cung trình bi n đ i c a t ổ ủ ế ổ ử ươ ng ng sang ác tính. Tuy nhiên, ph t ừ ng pháp duy bào h c không ph i là ph pháp t ọ nh t đ t m soát b nh. Cùng v i s phát tri n ể ệ i ta đã phát tri n c a sinh h c phân t ể , ng ườ ủ ệ nh ng k thu t m i có kh năng phát hi n ữ ả ớ ỹ nh ng type HPV có nguy c cao v i đ nh y và ơ ộ ạ ữ cho xét đ chính xác cao. T vai trò h tr ỗ ợ ộ ở bào, nh ng ph nghi m t ng pháp này d n tr ầ ữ ệ ư ổ ử thành ch y u đ sàng l c s m ung th c t ể cung(6-11). Tr ạ c khi có k thu t khu ch đ i, ỹ ế i ch v i đo n dò ng i ta dùng k thu t lai t ạ ỹ ườ đ c hi u đ phát hi n và đ nh genotype HPV ị ặ ạ i trong m u th , tuy nhiên, ph ươ ử ứ ạ (12-14). Ngày nay, đã có đ nh y th p và ph c t p ấ ng pháp phát hi n và đ nh có nhi u ph ị ệ ươ ề genotype HPV nh k thu t micro array s d ng ử ụ ư ỹ DNA chip, lai trong pha l ng (hybrid capture 2) (17,18). (15,16), ph ạ ươ ắ ng pháp này l Tuy nhiên, nh ng ph i khá đ t ạ ti n, ch a phù h p v i đi u ki n Vi t Nam. Vì ệ ệ ợ ề th , chúng tôi ti n hành nghiên c u nh m xây ứ ế ế d ng ph ng pháp PCR – ELISA phát hi n DNA ự – HPV đ ng th i đ nh genotype c a HPV đ góp ph n vào vi c t m soát và ch n đoán s m ung ầ c ta. th c t ư ổ ử ệ ầ n ở ướ ệ ự ứ ả ẩ ế ế ả V t li u và ph ng pháp nghiên c u ậ ệ ươ ứ c gi ữ
ẩ ẫ ẫ ệ ượ ế ẩ ằ ứ ằ ặ ạ ố ự ế ặ ượ ơ ệ ệ
ẩ ộ ệ ứ ầ ế ằ ẩ : 84 m u b nh ph m là các M u b nh ph m ệ cung b ng que Ayre hòa trong m u ph t c t ế ổ ử ẫ c mu i sinh lý ho c b ng gòn dung d ch n ị ướ c b nh nhân tr c ti p mang đ n ho c do đ ế ượ ệ ở m t s phòng khám hay b nh vi n T Dũ ừ ộ ố TP.H Chí Minh g i đ n phòng thí nghi m R&D ệ ử ế ồ c l u ặ ượ ư c a công ty Nam Khoa trong ngày ho c đ ủ oC vào ngày cu i tu n và đ ử ế c g i đ n -20 ượ ở ố công ty Nam Khoa vào ngày th hai ti p theo. ế ứ
ệ ừ b ị ủ ứ Trích bi ầ t HPV – DNA t ử ị ố ấ ệ các m u b nh ẫ ph mẩ : Đ u tiên, chúng tôi x lý m u b ng dung ằ d ch PROKPREP t c là dung d ch proteinase ị ẩ ị ứ ẫ : Nh ng m u ủ c ti n hành xác đ nh HPV – DNA (+) đ ị ượ genotype nh sau: Chúng tôi s d ng các gi ng ế ư ế c ph streptavidin và đã g n k t ELISA đã đ ượ th đ ng l n l t v i các đo n dò đ c hi u cho các genotype c a HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, ng ng c a 1 thanh 6/11 trên t ng gi ng t ủ ừ ở ELISA.Th c hi n bi n tính s n ph m PCR ẩ 95oC trong 10 phút, s n ph m sau khi bi n tính ngay trong đá đ duy trì tình tr ng ph i đ ạ ể ả ượ bi n tính. Sau đó chúng tôi ti n hành lai nh ng ữ ế ế ế c bi n tính vào các gi ng s n ph m PCR đã đ ả ng ng v i 1 ELISA, v i m i thanh ELISA t ớ ỗ ớ ươ m u. Khi đó, đo n dò s tóm b t đ c hi u v i ớ ắ ặ ẫ ẽ ệ m i m ch đ n (đã đ ươ ng c đánh d u DIG) t ỗ ấ ạ ắ ng v i t ng genotype. Sau đó, s n ph m lai g n ả ớ ừ ứ c phát hi n b ng c ng h p là trên gi ng s đ ợ ằ ẽ ượ ế c anti – DIG g n HRPO. Ph c h p này s đ ẽ ượ ợ ắ phát hi n b ng ch t hi n màu TMB. K t qu s ả ẽ ệ ệ ấ ủ c sóng 450nm. Khi OD c a c đ c đ ọ ở ướ ượ gi ng có giá tr > 1.7 OD c a gi ng ch ng âm và ế có tr s cao nh t so v i OD c a các gi ng khác ớ ẫ trong cùng m t m u thì đó là ki u gen c a m u. ế ủ ể ế ủ ẫ ộ
2
ế ủ ữ ươ ậ ẫ ư ể ớ ổ ế t c các gi ng có OD < OD c a gi ng N u t ế ấ ả ớ ng tính v i ch ng âm thì k t lu n là m u d ươ ế ứ HPV nh ng v i ki u gen khác v i ki u gen 16, ể ớ 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11. ạ
K t quế ả ả
ệ ự ươ ạ ế ế ườ ừ ợ 56%), các genotype khác l n l ầ ượ ượ ử ệ ủ ả ế ườ Bi u đ 1 ị
K t qu phát hi n HPV d a trên PCR ả khu ch đ i đo n DNA dài 450bp trên gene L1 : ạ 15/03/2005 – 15/07/2005, Trong th i gian t ờ ệ chúng tôi đã th nghi m đ c 84 m u b nh ẫ ẩ Hình 1 trình bày k t qu PCR c a 84 ph m. ế ấ c trích bi m u DNA đã đ t. K t qu cho th y ả ệ ượ ẫ là có nh ng m u không hi n lên v ch sáng nào, ệ ẫ ữ m u âm tính v i DNA-HPV, đi u này ch ng t ỏ ẫ ạ ớ ứ ề ứ ng ng có nh ng m u hi n lên v ch sáng t ệ ẫ ạ ớ ng tính v i m u d v ch 450bp, rõ ch ng t ươ ỏ ứ ạ ẫ DNA – HPV. Trong t ng s 84 m u bau đ u, sau ầ ẫ ố ng tính chi m t l khi ch y PCR, có 45 m u d ỉ ệ ế ươ ẫ 45%. 55% và 39 m u âm tính chi m t l ỉ ệ ế ẫ ẫ V i 45 m u K t qu phát hi n genotype HPV: ớ ệ ế ng tính, chúng tôi ti n hành đ nh genotype d ị ế ươ ế c k t ng pháp ELISA và đã thu đ b ng ph ượ ằ ng h p, chi m đa qu nhu sau: type 16 có 25 tr ế ả ế t chi m s (t l ố ỉ ệ là 18 (4%), 31 (2%), 33(7%), 35(2%), t l ỉ ệ ng h p (16%) 39/45(2%), 6/11(11%). Có 7 tr ợ iướ ồ d c genotype. không xác đ nh đ ể ượ đây trình bày t ệ các genotype HPV phát hi n l ỷ ệ c.ượ đ
16%
Không xác đ nhị
11%
Genotype 6/11
Genotype 16 Genotype 18 Genotype 31 Genotype 33 Genotype 35 Genotype 39/45 Genotype 6/11 Không xác đ?nh
2%
56%
Genotype 39/45
Genotype 16
2%
Genotype 35
7%
Genotype 33
2%
Genotype 31
4%
Genotype 18
S tr
ng h p phát hi n genotype c a HPV.
ể ồ Bi u đ 1:
ố ườ
ủ
ệ
ợ
Hình 1:
K t qu PCR phát hi n HPV c a 84 m u DNA trích bi
qu t c t
t t
ả
ệ ừ ệ ổ ử
cung b nh nh n. Các s ố
ậ 100 đ n
ệ ệ c là mã s c a m u th nghi m. MK là thang DNA chu n t ẩ ừ ệ ướ
ủ ố ủ
ẫ ẫ
ử
ế
ế c đánh d u bên b th t ấ 1000bp v i các v ch cách nhau 100bp.
đ ứ ự ượ ớ
ạ
Bàn lu nậ ng h p dù PCR d ế th y có đ n 16% các tr ế Trong k t qu thu nh n đ ả ấ ậ ườ c, chúng tôi nh n ậ ượ ươ ng ợ
3
K t lu n. ớ ấ ế ậ ỏ c genotype. Đi u này ch ng t ề ệ ư ẫ ứ ủ ấ ầ ệ ổ ử ế ự ớ ẩ ả ủ ặ ầ ề ả ế ử ụ ươ ệ ể ệ ồ ả ế ủ ế gn pháp phòng ch ng lây nhi m c ng nh ễ ữ ệ ủ ộ ế ượ ố ụ ư ậ ể ng pháp PCR – ELISA đ ư ượ ậ ệ ị ậ ầ ả ư ủ ế ể ng pháp này b gi ươ ộ ầ ị ưở ấ ề ệ ư ậ ơ ấ ừ ầ ẽ ỹ ế ế ầ ả ẫ ự ệ ệ ẩ ứ ừ ự ự ẽ ắ ơ ủ ộ ỹ ẽ ớ ậ ằ ấ ợ ụ ệ ườ ủ ờ ơ ồ ườ ử ể ể ự ử Phát hi n và đ nh genotype c a HPV trong các ủ ị t cung là xét nghi m r t c n thi m u qu t c t ế ệ ẫ đ ch n đoán và t m soát s m ung th c t ư ổ ử ớ ẩ ể h c thì xét cung và n u xét v m t đ ch t ễ ọ ị ế ạ nghi m này cũng nên đ c đ a vào s d ng đ i ượ ư trà đ xác đ nh đ c các genotype l u hành trong ư ị ượ khác nhau đ ng th i t các vùng d ch t đó giúp ờ ừ ễ ị c s h u d ng c a các tiên đoán và đánh giá đ ụ ượ ự ữ ph ư ố ươ c s h u hi u c a vaccine phòng ng a s đ ừ ẽ ượ ự ữ ặ đ a vào áp d ng cho dân s trong t ong lai. M c ư c xem là khá dù ph ươ h u hi u đ phát hi n và đ nh genotype HPV ệ ữ i h n s genotype nh ng ph ị ớ ạ ố HPV c n xác đ nh vì ph thu c vào đ an dò đ c ặ ọ ụ ế ề hi u cho t ng genotype cũng nh b h n ch v ệ ư ị ạ s gi ng c n đ th nghi m. Trong t ng lai, ươ ể ử ố ế chúng tôi s hoàn thi n thêm k thu t ELISA ậ ệ c phát b ng cách gia tăng s genotype c n đ ượ ố ằ hi n ch không d ng l i 9 genotype nh trên. ư ạ ở ệ Bên c nh đó, chúng tôi cũng s tích c c nghiên ạ ể c u đ đ a vào m t k thu t m i cũng nh m đ ứ ể ư ph c v cho vi c xác đ nh genotype c a HPV ị ụ đ c chính xác và đa d ng h n đ ng th i giúp ạ ượ hoàn thi n them b kit PCR – ELISA hi n có. ệ ệ ộ ệ ắ tính r t rõ v i HPV nh ng v n không th đ nh ể ị ư ộ ố có m t s đ ượ genotype mà chúng tôi ch a ph dò đ c hi u lên ệ ặ ệ trên gi ng ELISA. Do v y chúng tôi đã th c hi n ậ lai thêm s n ph m PCR v i dò c a genotype 58. ượ K t qu trong 7 m u không xác đ nh đ c ị ẫ ng tính v i genotype genotype này có 3 m u d ẫ ớ ỹ i chúng tôi đã th c hi n k 58. Còn 4 m u còn l ự ạ ẫ thu t gi tr c ti p s n ph m PCR và i trình t ẩ ự ự ả ậ k t qu cho th t có 1 là genotype 52, 1 là ấ ả genotype 54, m t là genotype 62 và 1 là genotype ộ c trình bày trong m t bài báo 83 (k t qu này đ ả ti p theo s p đăng). Nh v y đ có th hòan ể ắ ế c k thu t PCR-ELISA, chúng tôi cho thi n đ ỹ ượ ệ i quy t đó là r ng v n đ k thu t c n ph i gi ế ả ề ỹ ấ ằ nên có thêm các gi ng ph thêm các dò đ c hi u ệ ặ (3) c aủ ng nh t là đ 29 genotype genotype, lí t ủ ơ đ 3 nhóm nguy c cao, ti m tàng hay nguy c ủ th p. Tuy nhiên n u làm nh v y thì v n đ ề ấ ấ ư ậ i quy t ti p theo là giá thành vì nh v y ph i gi ả m t m u b nh ph m là ph i th c hi n trên ½ ả ộ b ng nh a ELISA và 6 HPV-PCR ELISA mix, do ả v y giá thành s đ t h n 6 l n giá c . Chính vi ầ ậ v y con đ ng đi thích h p nh t là có thêm các ậ ư ng l u m u th đ thăm dò các genotype th ẫ hành đ xây d ng b thu c th PCR-ELISA phát ố ộ hi n HPV, và đây chính là đích nh m mà chúng tôi đang ti p t c th c hi n. ệ ế ụ ự
Tài li u tham kh o. ệ ả ắ ể ề ề ị ậ ệ
1.
ọ
ườ
ồ
ọ ủ
ố ư ọ
ấ ể ệ ả ấ ằ
2.
ườ
ồ
ố
ể
Ung th c t
c Thành ph H Chí ượ u. ướ Ung th h c lâm p191 - 210 c Thành ph H Chí ư ổ ử
cung: ượ ụ
ả
ộ
Tr ng Đ i h c Y d ạ Minh. B môn Ung b ộ sàng.Ung th c t ư ổ ử Tr ng Đ i h c Y d ọ ạ Minh. B môn S n Ph Khoa. cung: p918 – 929 (2000)
ạ ự ả ố ự ủ ẵ ả ấ ả ủ ệ ỹ ặ ự ả ặ ệ ẵ ả
4.
V m t nguyên t c, có nhi u cách đ xây ặ d ng k thu t PCR-ELISA phát hi n và đ nh ỹ ự (19). Chúng tôi ch n cách dùng genotype c a HPV DIG dUTP đ đánh d u s n phâm PCR vì theo ng kinh nghi m chúng tôi th y r ng đây là ph ươ ế ẵ pháp khá nh y, ngòai ra chúng ta có th ch s n các b n nh a ELISA ph s n probe thông qua c u n i Streptavitin trên b n nh a và Biotin trên ầ ậ ể đ u 5’ c a dò đ c hi u. T t c các k thu t đ ầ ch t o b n nh a ph streptavidine và sau đó ế ạ ủ ph dò đ c hi u chúng tôi đã có s n và thành ủ giúp làm gi m giá th c. Đây cũng chính là y u t ụ thành c a s n ph m khi ch t o kit. ẩ ế ố ế ạ ủ ả
of
Dù v i s m u còn gi ế ớ ạ i h n, nh ng k t qu ư ễ ẫ
5.
ệ ủ ố ấ ố ủ ế ơ ố ệ ỉ ể
6.
ữ ố ị ệ ễ ọ ủ ự i Vi ợ ạ ệ ộ
3. Munoz., N., F.X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, X. Castellsague, K.V. Shah, P.J. Snijders, and C.J. Meijer Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. (2003) Feb 6;348(6):518-27 Castellsaque X, Diaz M et al, Worldwide human papillomavirus cervical etiology adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention. J Natl Cancer Inst. 2006 Mar 1;98(5):303-15 Chen CA, Liu CY, Chou HH, Cho CM, Twu NF et al. The distribution and differential risks of human papillomavirus genotypes in cervical preinvasive lesions: A Taiwan Cooperative Oncologic Group Study. Int J Gynecol Cancer (2006) Sep- Oct;16(5):1801-8. Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, and K. V. Shah. 2002. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J. Clin. Pathol. 55:244–265.
ả ớ ố ẫ cao (55%) nhi m HPV c a ủ cũng cho th y t l ấ ỷ ệ ụ ữ ử cung c a ph n g i c t các m u th l y t ủ ử ấ ừ ổ ử i phòng nghiên c u và phát đ n xét nghi m t ế ứ ạ tri n c a công ty Nam Khoa. S phân b các ự ể genotype cũng cho th y đa s là có mang các genotype nguy c cao mà ch y u là genotype ỏ ư 16. Tuy nhiên đây ch là nh ng s li u nh ch a c s phân b d ch t th nói lên đ h c c a các ượ ự genotype HPV l u hành. Vi c xây d ng thành ư t Nam công b kit PCR-ELISA thích h p t s có giá tr đóng góp l n sau này trong các đi u ề ớ ẽ tra d ch t h c nh v y. ị ị ễ ọ ư ậ
