KHÁNG LAMIVUDINE
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Lamivudine được dùng đơn trị liệu viêm gan B mạn từ cuối
thập niên 1990 tại VN, gây đáp ứng mạnh và hữu hiệu nhưng mất dần khi
dòng virút kháng thuốc xuất hiện và trở nên ưu thế. Tỷ lệ kháng Lamivudine
tăng dần theo thời gian trị liệu gồm 4 vị trí đột biến chủ yếu trên cấu tạo gen
polymerase (173, 180, 204, 207). Tỷ lệ hiện diện các đột biến này mới được
vài báo cáo tại Việt Nam.
Mục tiêu: Mô tả tỷ lệ và đặc điểm các kiểu đột biến gen kháng Lamivudine
trên bệnh nhân chưa đáp ứng với trị liệu Lamivudine >12 tháng.
Phương pháp: Khảo sát mô tả cắt ngang thực hiện tại BV Bệnh Nhiệt Đới
từ tháng 06/2006 đến tháng 12/2006. Xét nghiệm xác định đột biến kháng
Lamivudine được thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự phát hiện kháng hoàn
toàn và không hoàn toàn (với khả năng phát hiện chủng kháng không hoàn
toàn khi tỷ lệ chiếm ≥15% quần thể chung)
Kết quả: Có 146 ca viêm gan B mạn được xác định không đáp ứng với trị
liệu Lamivudine >12 tháng. Tỷ lệ có ít nhất một điểm đột biến trên
polymerase của HBV là 34,9% (51/146 ca). Kiểu đột biến chính M204V/I
gặp nhiếu nhất 77 /146 ca (24,7% có đột biến hoàn toàn và 28,1% có đột
biến không hoàn toàn). Kết hợp đột biến M204V/I với L180M có tỷ lệ ưu
thế (18/24 ca) trong các trường hợp có nhiều đột biến. Kiểu gen B có tỷ lệ
đột biến cao hơn (67%) so với kiểu gen C (34%). Kháng không hoàn toàn
với hiện diện song song chủng hoang dại và kháng thuốc cũng hay gặp trong
kiểu đột biến chính (37/56 ca M204I và 4/21 ca M204V).
Kết luận: Đột biến trên polymerase được chọn lọc dưới áp lực của
Lamivudine gặp với tỷ lệ 34,9% trên người trị liệu lamivudine trên 12 tháng.
Kiểu đột biến M204V/I chiếm ưu thế. Kiểu gen B có tỷ lệ đột biến cao hơn.
Có tình trạng kháng không hoàn toàn nhất là trong kiểu đột biến chính
M204I và M204V. Tình trạng kháng thuốc kiểu gen cần được lưu ý bởi các
thầy thuốc lâm sàng trong những trường hợp không đáp ứng với điều trị
lamivudine kéo dài để định hướng cho việc thay đổi thuốc trị liệu.
ABSTRACT
Background: Lamivudine was the first oarl nucleoside analogue
monotherapy for chronic hepatitis B in VietNam since 1992. However, the
response will fade away with clinical deterioration as the HBV mutants
become prominent. The rate of lamivudine resistance increased with the
duration of treatment. The resistance mutations on the polymerase gene, like
rt173, rt180, rt204 and rt207 have aldready been documented. The
preliminary results of the study on HBV resistannce in HCM city has just
been reported.
Objectives: To describe the rates and characteristics of lamivudine resistant
mutations in patients with lamivudine treatment-on >12 months.
Methods: The cross-sectional study was done in the out-patient clinic at
Hospital for Tropical Diseases from June 2006 to December 2006. The
PCR-based sequencing technique were applied to detect the complete and
heterozygote or mixed mutation in the polymerase.
Results: 146 cases were enrolled in our study. 51/146 (34.9%) cases with at
least one mutation were detected. The rate of primary resistance mutation
rtM204V/I were highest: 24.7% complete and 28.2% mixed. The double
mutation rtM204V/I + rtL180M (18/24 cases) were prominent among the
double or triple ones. HBV genotype B had higher rate of mutation in
comparison with HBV genotype C (67% vs 34%). Co-existence of wild type
and mutants were also common in the primary resistance mutation (37/56
cases with rtM204I and 4/21 cases with rtM204V).
Conclusion: The rate of resistance mutation on the polymerase gene were
34.9% in the lamivudine-treated patients with the duration more than 12
months. The rtM204V/I was classified in the first rank. The mutation rate of
HBV genotype B was higher than HBV genotype C. The high rate of co-
existence of wild type and mutants, especially with rtM204V/I was observed
in our study. The genotypic resistance should be paid attention by the
clinician, especially in poor responders or refractory cases in order to select
an rational strategy for the individual cases.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lamivudine là thuốc chống virút được dùng đơn trị liệu viêm gan B mạn gây
đáp ứng ức chế virút mạnh, đáp ứng sinh hóa và mô học hữu hiệu. Các đáp
ứng trên bị mất dần khi xuất hiện dòng virút kháng thuốc, có thể dẫn đến
viêm gan bùng phát, suy gan cấp nặng và tử vong.
Tỷ lệ kháng Lamivudine tăng dần từ 17% sau 1 năm, 22% và 37% sau 2 và
3 năm, trên 50% sau 4 năm (Kao 2002)(3). Có 4 vị trí đột biến kiểu gen chủ
yếu trên cấu tạo gen polymerase (173, 180, 204, 207) ảnh hưởng đến đáp
ứng với lamivudine và hoạt động sao chép của virút. Tại Viêt Nam, dùng kỹ
thuật giải trình tự gen đã phát hiện được cả 4 loại đột biến điểm trên ở người
điều trị lamivudine và bước đầu đã có được vài báo cáo (Hồ Tấn Đạt 2006)(2)
nhưng hình thái vẫn chưa đầy đủ.
Mục tiêu
Mô tả tỷ lệ và đặc điểm các kiểu đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân
chưa đáp ứng trị liệu Lamivudine >12 tháng.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu mô tả cắt ngang thực hiện trên bệnh nhân đã điều trị viêm gan B
mạn bằng lamivudine thời gian >12 tháng chưa đáp ứng, chưa chuyển đổi
huyết thanh HBeAg và/hoặc có HBVDNA >1000 copy/ml, theo dõi khám
tại khoa khám bệnh BV Bệnh Nhiệt đới từ tháng 06/2006 đến tháng
12/2006.
Biến số nghiên cứu: Tuổi, giới, kiểu gen, đột biến trên trình tự nucleotide
của vùng b hay c trên polymerase (vị trí 173, 180, 204, 207).
Xét nghiệm xác định đột biến kháng Lamivudine được thực hiện bằng kỹ
thuật giải trình tự trên hệ thống mở, phát hiện kháng hoàn toàn và không
hoàn toàn (với khả năng phát hiện chủng kháng không hoàn toàn khi tỷ lệ
chiếm ≥15% quần thể chung). Nhập và phân tích số liệu dùng phần mềm
SPSS 12.0, phép kiểm Chi Bình Phương để so sánh các tỷ lệ, mức ý nghĩa
p<0,05.
KẾT QUẢ
Đặc điểm dân số nghiên cứu
Bảng 1: Đặc tính dân số nghiên cứu
Đặc
Tần số Tỷ lệ
tính
Giới Nam 101 69,2
Nữ 45 30,8
Kiểu
B 105 71,9
gen
C 41 28,1
Tuổi <15 5 3,4
15-29 44 30,1
30+ 97 66,4
Tuổi trung 34,8 ± 17,8 (4-
bình 68)
Có đột
Hoàn toàn 51 34,9
biến
Không hoàn
34 23,2
toàn
Đặc tính kháng thuốc
Có 51/146 trường hợp có đột biến kháng lamivudine hoàn toàn ở ít nhất một
vị trí, chiếm tỷ lệ 34,9% (bảng 1 & 2). Đột biến chính tại vi trí M204I/V
chiếm ưu thế, 36/146 ca, 24/7% (19 ca M204I và 17 ca M204V). Đột biến
tại vị trí 180 (L180M, 15,1%) chiếm hàng thứ hai, đột biến M207V/I cũng
có tỷ lệ 13,7%.
Đột biến không hoàn toàn (heterozygote) với một fần dân số virút hoang dại
bị thay thế bởi dòng đột biến cũng hay gặp, nhiều nhất tại vị trí 204 (41 ca,
28,1%) trong đó M204I (37ca) chiếm đa số trương hợp đột biến không hoàn
toàn (so với chỉ có 4 ca M204V không hoàn toàn) (bảng 2, hình 1).
Ngoài ra, có 24 trường hợp có đột biến kết hợp từ 2-4 vị trí đột biến (22
trường hợp có kết hợp 2 điểm đột biến, 2 trường hợp có cùng lúc 3 điểm đột
biến), tất cả các trường hợp này đều có đột biến nền M204V hay M204I.
Hiện diện đồng thời đột biến nguyên phát M204I/V với đột biến thứ phát
L180M thường gặp nhất (23/24 ca) trong các trường hợp có kết hợp nhiều
đột biến. Chỉ 1 trường hợp kết hợp đột biến M204I + V173L.
Bảng 2: Phân loại theo vị trí đột biến trên cấu trúc men reverse transcriptase
(n=146)
Kháng Kháng Tổng số
hoàn không
Vị trí toàn hoàn
điểm đột toàn
biến
Tần Tỷ Tần Tỷ Tần Tỷ
số lệ số lệ số lệ
Có ít nhất 1
51 34,934 23,2
điểm
173 2 1,4 15 10,3 17 11,7
5,4 30 20,5 180 22 15,18
204 36 24,741 28,1 77 52,7
207 20 13,70 0 20 13,7
V173LL180MM204I/VV207M/I
Kháng 1,4 15,1 24,7 13,7
Không 10,3 5,4 28,1 0
HT
Tổng 11,7 20,5 52,7 13,7
số:
Hình 1: Tính chất và tỷ lệ đột biến kháng lamivudine
Khảo sát trong tất cả trường hợp kháng hoàn toàn (85 trường hợp), genotype
B có tỷ lệ kháng thuốc nhiều hơn genotýp C (67.6% so với 34.1%) (bảng 3),
khác biệt rõ nhất trong đột biến kháng ôû vò trí 180 (24.8% so với 9.8%) vaø
204 (60% so với 34.1%) treân caáu taïo cuûa polymerase.
Bảng 3: Tỷ lệ đột biến kháng thuốc theo kiểu gen
Vị trí đột Có đột Kiểu gen P
biến biến B C
Tất cả vị trí 85 71 14 0,000
(67,6) (34,1)
Đột biến 51 42 9 0,040
hoàn toàn (40,0) (22,0)
Vị trí 173 17 13 4 (9,8) 0,657
(12,4)
Vị trí 180 30 26 4 (9,8) 0,044
(24,8)
Vị trí 204 77 63 14 0,005
(60) (34,1)
Vị trí đột Có đột Kiểu gen P
biến biến B C
Vị trí 207 19 17 2 (4,9) 0,068
(16,2)
Biểu đồ 1: Tỷ lệ đột biến theo kiểu gen
Không có khác biệt về tỷ lệ kháng thuốc của hai giới, ngoại trừ tỷ lệ kháng
207 ở nữ nhiều hơn nam (22,2% so với 8,9%).
BÀN LUẬN
Đột biến thay thế acid amin trên vùng B (L180M) và C (M204V/I) trên cấu
tạo polymerase của HBV là đột biến được chọn lọc dần trong quá trình điều trị
Lamivudine kéo dài. Sự thay đổi M204V/I làm biến đổi cấu hình cấp 2 trong
không gian của túi YMDD, vị trí gắn của lamivudine trên polymerase, gây giảm
khả năng gắn kết lamivudine, nhưng đồng thời làm giảm khả năng sao chép của
HBV do polymerase họat động kém hiệu quả hơn. Sự xuất hiện thêm các đột biến
thứ phát là kết quả của quá trình chọn lọc tạo nên chủng virút thích hợp vừa kháng
thuốc vừa giữ được khả năng sao chép. Thí dụ phổ biến là việc xảy ra thêm đột
biến L180M khi có sẵn đột biến M204. Đột biến kép L180M kết hợp M204V/I
vừa sao chép mạnh, vừa kháng lamivudine (Warner 2007)(5). Đột biến V173L
không gây kháng lamivudine, nhưng sự thay thế Valine bằng Leucine phục hồi
khả năng sao chép cho chủng virus đã có đột biến M204V/I và L180M. Như vậy,
trình tự xảy ra đột biến trên bệnh nhân được điều trị lamivudine trước tiên thuờng
là ở vị trí 204 (M204I hay M204V), tiếp theo là L108M và sau đó là V173L. Do
vậy trên thực tế có thể quan sát thấy kiểu kết hợp đột biến V173L-L180M-M204I
hay V173L -L180M-M204V.
Về tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu
Do bệnh nhân thường khó xác định được đúng thời gian đã dùng
Lamivudine, tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu là tỷ lệ sau điều trị tối thiểu 1
năm. Chúng tôi phát hiện được 34,9% có đột biến trên polymerase liên quan
với kháng lamivudine. Tỷ lệ đột biến tại vị trí 204 chiếm đa số, phù hợp với
quá trình chọn lọc nên đột biến nguyên phát và tương tự với các nghiên cứu
trong và ngoài nước (27,8% sau 1 năm của Hồ Tấn Đạt tại TP HCM; 17-
32% theo báo cáo của khu vực và thế giới sau 1 – 2năm). Sự khác biệt về trị
số có lẽ do khác nhau trong chọn mẫu. Trong nghiên cứu của chúng là chọn
trên những bệnh nhân đến khám bệnh sau khi điều trị chưa đáp ứng, vì vậy
do không có dữ liệu về những trường hợp mất theo dõi nên tỷ lệ có đột biến
thật sự có thể thấp hơn.
Về tình trạng đột biến không hoàn toàn hay kháng hỗn hợp
Chúng tôi nhận thấy có tình trạng tồn tại song song của quần thể virút đột
biến và quần thể virút hoang dại với tỷ lệ đáng kể (heterozygote detection),
nhất là tại vị trí 204. Trong các truờng hợp kháng không hoàn toàn hay hỗn
hợp này, cũng gặp đột biến ở các vị trí 173 và 180 nhưng tỷ lệ ít hơn vị trí
204, chứng minh rằng quá trình xuất hiện dần của đột biến vẫn đang tiếp tục
dưới áp lực của lamivudine, phản ánh quá trình thay đổi thứ phát đang được
chọn lọc sau khi đã có đột biến nguyên phát. Điều này giải thích sự gia tăng
dần tỷ lệ đột biến theo thời gian tiếp xúc với thuốc.
Mặt khác, tính chất kháng hỗn hợp với tồn tại vừa chủng hoang dại vừa
chủng kháng cho thấy tính chất phức tạp của việc đối phó với kháng thuốc.
Quyết định theo hướng phối hợp thuốc hay chuyển hẳn sang thuốc nhóm tác
dụng khác cần được cân nhắc và nghiên cứu để có hướng dẫn thích hợp.
Về bản chất của đột biến tại vị trí 204
Trên các nghiên cứu ở vùng lưu hành của týp gen A và D, thay đổi Methionin
thành Valine (rtM204V hay YMDD) gặp nhiều hơn thay đổi Methionin thành
Isoleucin (rtM204I hay YIDD). Theo tác giả Hồ Tấn Đạt, M204V cũng gặp nhiều
hơn M204I (36% so với 11%).
Theo khảo sát này tỷ lệ đột biến rtM204I là 13% (YIDD) và rtM204V là 11.6%
(YMDD) tương đương nhau. Tuy nhiên, khảo sát trong nhóm đột biến không
hoàn toàn, kiểu đột biến rtM204I (25.3%, 37 ca) nhiều hơn kiểu rtM204V (2.7%,
4 ca). Như vậy có thể đột biến rtM204 được chọn lọc sớm hơn. Nếu lamivudine
tiếp tục được dùng nhiều năm sau, kiểu thay thế rtM204I có thể xuất hiện nhiều
hơn. Nếu vậy thì đột biến ở vị trí rtM204V/I có liên quan gì hay không với týp gen
B cũng cần được nghiên cứu tiếp.
Theo Allen 1998, đột biến rtM204I (nhóm II) và đột biến kép rtM204V +
rtL180M (nhóm I) có gia tăng >1000 lần IC50 so với chủng hoang dại(1). Đột
biến đơn rtM204V hay rtL180M gây tăng IC50 ít hơn nhiều (153 lần và 18
lần) (Allen 1998). Allen cũng không gặp đột biến kép rtL180M + rtM204I
nhưng đột biến rtL180M bao giờ cũng đi kèm rtM204V.
Trong khảo sát này, 52,7% có đột biến hoàn toàn hay không hoàn toàn với
Lamivudine, tỷ lệ đột biến rtM204I cũng chiếm 38,3% (13% đột biến hoàn
toàn, 23,3% đột biến không hoàn toàn hay hỗn hợp) là tỷ lệ đáng chú ý. Vì
vậy cần đưa ra quyết định thay đổi điều trị nếu sau 1 năm không có đáp ứng
với biểu hiện HBVDNA còn cao, chưa chuyển đổi HBeAg. Tuy nhiên, ở
mức nào của HBVDNA để ra quyết định thay đổi điều trị, hay nên phối hợp
sớm thêm một thuốc diệt virút theo cơ chế tác dụng khác để tránh chọn lọc
dòng đột biến là điều cần được nghiên cứu để khuyến cáo.
Trong một nghiên cứu can thiệp cùng tại BV Bệnh Nhiệt Đới nhằm quan sát
đáp ứng trị liệu của hai phác đồ ADV đơn độc và ADV+LAM cho bệnh
nhân kháng lâm sàng lamivudine chúng tôi ghi nhận được kết quả như bảng
4.
Bảng 4: Biên độ giảm HBVDNA sau 3 tháng (n=36)
Nhóm can Biên độ giảm Biên độ giảm
thiệp HBVDNA HBVDNA
(log copy/ml) n (log copy/ml) n
(%) (%)
>1 ≤1 P > 2 ≤ 2 p
(OR)
ADEFOVIR + 15 1 0,10 10 6 0,30
(93,8) (6,3) (62,5) (37,5) LAMIVUDINE
(n1= 16)
ADEFOVIR 14 6 (0,98 9 11
(n2=20) (70,0) (30,0) (45,0) (55,0) –
1,83)
Tỷ lệ gây được đáp ứng virút đo bằng giảm HBVDNA sau 3 tháng >1 log
copy/ml hay >2 log copy/ml và biên độ giảm HBVDNA trung bình không
khác nhau ở phác đồ ngưng hẳn LAM hay tiếp tục LAM. Tuy nhiên nhóm
ngưng ADV có 2/20 ca 10%) có cơn bùng phát virút trong vòng 3 tháng
nhưng không có biểu hiện lâm sàng cơn bùng phát viêm gan. Tình trạng
kháng hỗn hợp còn tồn tại một tỷ lệ virút hoang dại nhậy lamivudine có thể
là nguyên nhân gây nên cơn bùng phát sau khi ngưng LAM như trên.
KẾT LUẬN
Qua khảo sát tính chất thay đổi trình tự nucleotide trên polymerase của 146
bệnh nhân không đáp ứng với lamivudine có thời gian điều trị > 1 năm,
chúng tôi có kết luận như sau:
- Tỷ lệ có ít nhất 1 điểm đột biến hoàn toàn là 34.9%. Đột biến M204V/I chiếm ưu
thế trong các kiểu đột biến đơn và đột biến kết hợp ở nhiều vị trí.
- Có tình trạng đột biến không hoàn toàn gây hiện diện song song chủng
hoang dại và chủng đột biến với tỷ lệ 43.8% ở nhiều vị trí như 204, 173 và
180.
- Kiểu gen B có tỷ lệ đột biến cao hơn C.
- Cần nghiên cứu để có kết luận về thời điểm và biện pháp thay đổi trị liệu
(ngưng hay phối hợp) trước khi quá trình chọn lọc chủng kháng thuốc hoàn
tất.
