Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Khảo sát đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1 TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Đỗ Thị Lệ Hằng, học viên cao học khóa 25 (2016-2018), chuyên ngành

Sinh học Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại

học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan:

1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của:

TS. Vũ Thị Thơm và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung.

2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được

công bố tại Việt Nam.

3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm Ngƣời viết cam đoan

Đỗ Thị Lệ Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Vũ Thị Thơm

và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung là những người hướng dẫn khoa học, những

người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý

báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội, mã

số: QG.17.29 đã cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Trung Kiên, chủ nhiệm đề tài đã hỗ trợ và tạo điều

kiện cho tôi thực hiện đề tài này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy cô, các nhà Khoa học trong

Hội Đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý

báu, giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu nhà trường, phòng Đào Tạo sau Đại

Học, các Thầy Cô Khoa Sinh học và các Thầy Cô bộ môn Sinh học Tế Bào -

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cho tôi những

kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học

Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.

Các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong

quá trình hoàn thành luận văn này.

Xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Bố Mẹ và những người thân trong gia đình

cùng với bạn bè đồng nghiệp là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu,

khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tinh thần giúp tôi hoàn thành

tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận văn này.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm

nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Bệnh lý van tim và thay van tim .......................................................................... 3

1.2. Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim ....................................................... 4

1.3. Dược di truyền học của acenocoumarol .............................................................. 6

1.4. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1 ...................... 9

1.4.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotide .............................................................. 9

1.4.2. Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol .............................................................................................................. 11

1.4.3. Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol .............................................................................................................. 15

1.4.4. Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 18

1.5. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa di truyền học và liều thuốc

acenocoumarol trên thế giới và trong nước .............................................................. 21

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 21

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 24

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26

2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 26

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân .................................................................. 26

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ...................................................................................... 26

2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 27

2.3. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ............................................................ 27

2.3.1. Hóa chất ...................................................................................................... 27

2.3.2. Thiết bị ........................................................................................................ 28

2.3.3. Dụng cụ....................................................................................................... 28

2.3.4. Mẫu nghiên cứu .......................................................................................... 28

2.4. Các bước nghiên cứu ......................................................................................... 29

2.4.1. Quy trình nghiên cứu .................................................................................. 29

2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu ............................................................... 30

2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số ........................................ 30

2.4.4. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 32

2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR ............................................ 32

2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................................ 33

2.4.7. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải

trình tự gen ................................................................................................................ 34

2.4.8. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải

trình tự gen ................................................................................................................ 35

2.4.9. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 37

2.5. Xử lý và phân tích số liệu .................................................................................. 37

2.6. Các loại sai số và cách khắc phục ...................................................................... 37

2.6.1. Sai số có thể mắc phải ................................................................................ 37

2.6.2. Cách khắc phục sai số ................................................................................. 37

2.7. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................................... 38

Chƣơng 3. KẾT QUẢ ............................................................................................. 39

3.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu .................................. 39

3.2. Kết quả phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKOCR1 ........................................................................... 40

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................. 40

3.2.2. Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................ 41

3.2.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 47

3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 50

3.3. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................................................................... 55

3.3.1. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 ...................... 55

3.3.2. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và rs99

rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................................................... 56

3.4. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 ................................................................................................................... 57

Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 58

4.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu ............................. 59

4.2. Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438

trên gen VKORC1 ..................................................................................................... 60

4.3. Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934348 trên gen VKORC1 ........................................................................... 62

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 66

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 68

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 76

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Mỹ AHA

Anti Vitamin K : Kháng vitamin K AVK

Atrial Fibrillation: Rung nhĩ AF

Base pair (cặp bazơ) bp

cộng sự cs

Thuốc chống đông máu đường uống họ Coumarinic COA

Deep Venous Thrombosis: Huyết khối tĩnh mạch sâu DVT

Deoxyrinucleotide Triphosphate dNTP

ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate

Deoxyribonucleic Acid (Acid deoxyribonucleic) DNA

Heart Valve Replacement: Thay Van Tim HVR

Ethylenediaminetetraacetic Acid EDTA

International Normalized Ratio: Chỉ số bình thường hoá Quốc Tế INR

Nhiễm sắc thể NST

Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase PCR

Prothrombin PT

Restriction Enzym: enzym cắt giới hạn RE

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: Đa hình chiều dài

đoạn cắt giới hạn

Single Nucleotide Polymorphism: Đa hình đơn nucleotide SNP

Tris base, acetic acid and EDTA TAE

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol ...... 14

Bảng 1.2. Mối liên hệ giữa kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol .............. 16

Bảng 1.3. Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người ......................... 23

Bảng 1.4. Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người ......................... 23

Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen ............................................ 32

Bảng 2.2. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 ........ 35

Bảng 2.3. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 ........ 36

Bảng 3.1. Một số đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu .............. 39

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số ......................... 41

Bảng 3.3. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 ................................... 47

Bảng 3.4. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 .... 48

Bảng 3.5. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 .... 48

Bảng 3.6. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 .......................... 55

Bảng 3.7. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................................................................... 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Buồng tim và vị trí các van tim ................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của acenocoumarol ......................................................... 7

Hình 1.3. Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol ........... 8

Hình 1.4. Mô tả Single nucleotide polymorphisms .................................................... 9

Hình 1.5. Mô tả Haplotype ....................................................................................... 10

Hình 1.6. Vị trí nhiễm sắc thể số 10 trong bộ NST người ........................................ 12

Hình 1.7. Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 ............................................ 12

Hình 1.8. Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hoá thuốc ............................ 13

Hình 1.9. Vị trí nhiễm sắc thể số 16 trong bộ NST người ........................................ 15

Hình 1.10. Vị trí gen VKORC1 trên nhiễm sắc thể số 16 ......................................... 15

Hình 1.11. Gen VKORC1 .......................................................................................... 15

Hình 1.12. Giải trình tự gen bằng máy tự động ........................................................ 19

Hình 1.13. Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo đầu bằng ........................................... 20

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,7% .............................. 40

Hình 3.2. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP CYP2C9*3 ............................................................................................... 42

Hình 3.3. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 .................................................................. 42

Hình 3.4. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 .................................................................. 43

Hình 3.5. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 ............................................................. 44

Hình 3.6. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ................................ 45

Hình 3.7. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ................................ 46

Hình 3.8. Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP

CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438 .......................................................... 49

Hình 3.9. Kết quả giải trình tự SNP CYP2C9*3 ....................................................... 50

Hình 3.10. Sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ....................... 51

Hình 3.11. Sản phẩm RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ....................... 52

Hình 3.12. Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ........................ 53

Hình 3.13. Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ........................ 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934431

trên gen VKORC1 ..................................................................................................... 57

Biểu đồ 4.1. Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 ở một số quần thể người

khác nhau .................................................................................................................. 63

Biểu đồ 4.2. Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau ......................................................................................... 64

Biểu đồ 4.3. Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau ......................................................................................... 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh van tim là bệnh khá phổ biến trong cơ cấu bệnh lý tim mạch nói chung

trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do

di chứng của tổn thương van tim trong bệnh thấp tim [2]. Bệnh nhân có thể tổn

thương một van hoặc nhiều van, van bị tổn thương nhiều nhất là van hai lá, sau đó

đến van động mạch chủ [7][8]. Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống

của bệnh nhân mắc bệnh van tim đã được cải thiện rất nhiều và mang lại cho họ

cuộc sống gần như bình thường [39]. Tuy nhiên, do khi hoạt động các van tim nhân

tạo thường sinh ra các cục máu đông dễ gây biến chứng như: tắc mạch, huyết khối.

Do vậy, ngay sau khi thay van tim bệnh nhân phải sử dụng thuốc chống đông máu

trong một thời gian dài hoặc suốt đời nhằm ngăn ngừa sự hình thành cục máu đông,

tránh các nguy cơ gây huyết khối hoặc tắc mạch [62]. Có rất nhiều loại thuốc chống

đông máu nhưng được sử dụng rộng rãi và nhiều nhất là thuốc chống đông máu

nhóm kháng vitamin K (AVK) [17]. Các thuốc chống đông máu nhóm AVK làm

giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông máu (yếu tố II, VII, IX và X) ngăn ngừa sự

hình thành cục máu đông và ngăn cục máu đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần

hoàn. Thuốc chống đông máu đường uống nhóm AVK được sử dụng từ những năm

1940, có một số nhóm thuốc chống đông máu nhóm AVK như: warfarin,

acenocoumarol và phenprocoumon [54].

Hiện nay, ở Việt Nam acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều

trị hơn warfarin. Tuy nhiên, trở ngại cho bệnh nhân và các thầy thuốc là khoảng an

toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên việc xác định liều lượng

đủ hiệu lực điều trị nhưng tránh được nguy cơ gây chảy máu là rất khó khăn [56].

Nếu dùng liều thuốc chống đông thấp thì không đạt hiẹ u quả kháng đông, nhu ng

nếu quá liều s gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng bệnh nhân. Trên lâm

sàng, các bác sĩ thường dò liều điều trị dựa vào kinh nghiệm, lứa tuổi và xét nghiệm

chức năng gan, thận của bệnh nhân và đặc biệt là theo dõi chặt ch chỉ số INR

(International Normalized Ratio - chỉ số bình thường hóa quốc tế) của từng bệnh

nhân [63]. Trong các yếu tố kể trên, di truyền học là một trong các yếu tố quan

trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong

muốn [62]. Hơn 30 gen đã được tìm thấy s tham gia vào các hoạt động trao đổi

chất của thuốc chống đông máu họ Coumarinic dạng uống (COA), trong đó gen

CYP2C9 (gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và gen

VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của thuốc) là quan trọng nhất [20][35][37].

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều phụ thuộc

vào đa hình đơn nucleotide (SNP) của gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào

hai SNP CYP2C9*2, CYP2C9*3 [33]. Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa

có thông tin về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử

dụng cho bệnh nhân do đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Khảo sát đa hình

gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống

đông Acenocoumarol”.

Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu:

1. Xây dựng đƣợc quy trình phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.

2. Khảo sát đƣợc tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở quần thể bệnh nhân thay van

tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol tại Bệnh Viện Tim Hà Nội.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Bệnh lý van tim và thay van tim

Bệnh lý van tim là một bệnh phổ biến tại Việt Nam trong cơ cấu bệnh lý tim

mạch nói chung. Nguyên nhân gây tổn thương van tim phần lớn là do di chứng của

bệnh lý thấp tim [2]. Bệnh nhân có tiền sử thấp khớp từ nhỏ hoặc bị tấn công bởi

liên cầu khuẩn gây thấp tim nhưng không có triệu chứng. Bệnh thấp tim gây suy tim

và đe dọa tính mạng người bệnh [7][8][14].

Tim người bình thường có 4 buồng tim, 2 tâm nhĩ (nhĩ phải, nhĩ trái) và 2 tâm

thất (thất phải, thất trái). Ngăn cách giữa các buồng tim là các van tim, van 2 lá giữa

nhĩ trái và thất trái, van 3 lá giữa nhĩ phải và thất phải. Có 2 đại động mạch đi ra từ

tim là động mạch chủ và động mạch phổi. Ngăn cách giữa tim với 2 đại động mạch

này là van động mạch chủ và van động mạch phổi [1] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Buồng tim và vị trí các van tim [2]

Tổn thương van tim có 2 dạng chính là hở van tim hoặc hẹp van tim. Với tổn

thương do bệnh lý thấp tim thường có cả 2 dạng tổn thương trên kết hợp. Khi tổn

thương hẹp hoặc hở van tim ở mức nặng s làm suy giảm chức năng tim và gây ra

những triệu chứng khó chịu cho người bệnh [14].

Kỹ thuật sửa và thay van tim đã cứu sống được hàng triệu bệnh nhân mắc

bệnh van tim và trả lại cho họ cuộc sống bình thường [39]. Năm 1923, Elliot Cuttler

đã thực hiện tách van tim kín bằng dụng cụ [43]. Năm 1925, Henry Souttar đã tách

van tim kín bằng tay [26]. Đến năm 1948, Wright Harken và Charler Bailey đã hoàn

thiện kỹ thuật tách van hai lá bằng tay [66]. Năm 1959, Nina Braunwald đã thực

hiện ca thay van tim nhân tạo đầu tiên trên thế giới, kể từ đó hàng năm có hàng trăm

ngàn bệnh nhân mắc bệnh van tim được thay van tim nhân tạo [64]. Tại các nước

Bắc Mỹ, hàng năm có khoảng 100.000 trường hợp bệnh nhân phải thay van tim với

bệnh lý chủ yếu là tổn thương van tim do thấp tim [28].

1.2. Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim

Sau thay van tim bệnh nhân có thể gặp một số biến chứng như: liên quan đến

sau phẫu thuật, do hoạt động của van nhân tạo, nhưng biến chứng hay gặp nhất là

do việc sử dụng các thuốc chống đông máu sau thay van tim. Có thể nói thay van

tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”. Nguyên nhân là

do van tim mới được cơ thể người nhận biết như một “yếu tố lạ”, sau khi tiếp xúc

với dòng máu trong cơ thể s kích thích quá trình đông máu nội sinh. Bên cạnh đó,

sự rối loạn dòng chảy của máu quanh van cơ học (dòng chảy rối, rối loạn dòng

chảy) cũng là một yếu tố góp phần hình thành cục máu đông [62][63]. Do vậy, tất

cả bệnh nhân sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông máu (thuốc

loãng máu) trong một thời gian dài hoặc cả đời để dự phòng việc hình thành cục

máu đông gây các biến chứng tắc mạch cho bệnh nhân. Hiện tại, ở Việt Nam các

dạng thuốc chống đông máu được bác sĩ chỉ định cho bệnh nhân dùng sau thay van

tim phần lớn đều thuộc nhóm AVK. Thuốc chống đông máu nhóm AVK đã được sử

dụng từ rất lâu (từ những năm 1940) [17]. Hai dạng thuốc chống đông máu nhóm

AVK thường gặp là: Sintrom (hoạt chất: acenocoumarol) và Coumadine (warfarin).

Cơ chế tác dụng của nhóm thuốc này: làm giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông

máu như II, VII, IX và X, ngăn ngừa hình thành cục máu đông và ngăn cục máu

đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần hoàn [54]. Tuy được dùng từ lâu và rộng rãi

nhưng việc sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK hiệu quả lại có nhiều khó

khăn cho người bệnh do khoảng tác dụng của loại thuốc này hẹp, liều dùng thuốc ở

mỗi bệnh nhân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cơ địa bệnh nhân, chế độ dinh

dưỡng, ảnh hưởng của các loại thuốc khác kèm theo, các bệnh khác đi kèm. Vì vậy

khi bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK thì bệnh nhân phải được

sự chỉ định liều dùng của bác sĩ điều trị, phải thường xuyên theo dõi và xét nghiệm

thời gian đông máu prothrombin (PT) và chỉ số INR [56][63].

INR (International normalized radio), đu ợc xây dựng bởi tổ chức y tế thế giới

và uỷ ban quốc gia về chứng huyết khối và cầm máu với nhiệm vụ báo cáo các kết

quả kiểm tra sự đông máu. Tất cả các kết quả đu ợc tiêu chuẩn hoá bằng việc sử

dụng các chỉ số quốc tế cho thuốc thử đông máu thông thu ờng và các thiết bị thống

nhất để thực hiện việc kiểm tra [30][46][73 . Ví dụ một ngu ời đang uống thuốc

chống đông máu có thể có chỉ số INR từ 2 - 3, thì bất kể phòng thí nghiệm nào kiểm

tra INR kết quả cần phải nhu nhau dù dùng thuốc loại gì và dụng cụ gì để kiểm tra.

Ngu ời ta sử dụng chỉ số INR để thăm dò toàn bộ yếu tố đông máu ngoại sinh (yếu

tố II, V, VII và X) [73]. Chỉ số INR đu ợc tính bằng công thức:

INR = [PT bệnh nhân/PT chứng]ISI

Việc kiểm soát và điều chỉnh liều lu ợng dùng thuốc đu ợc thực hiện bằng cách

kiểm tra và theo d i chỉ số INR của một ngu ời đang uống thuốc chống đông thường

xuyên. Khi INR tre n 6,0 xuất hiện nguy co xuất huyết ở người bệnh. Các loại thuốc

chống đông máu giúp ngăn chặn sự đông và vón cục của máu [30], đu ợc kê dùng

dài ngày cho những bệnh nhân có các triệu chứng đông máu không bình thu ờng,

bao gồm: các bệnh nhân tim, đột quỵ hoặc tắc ngh n mạch và đu ợc dùng cho từng

giai đoạn ngắn đối với bệnh nhân đã điều trị qua phẫu thuật thay van tim. Chất

chống đông máu cần đu ợc kiểm soát cẩn thận để giữ đu ợc cân bằng giữa việc chống

đông máu với việc gây nên biến chứng chảy máu quá mức. X t nghiẹ m chỉ số INR

không phức tạp, bệnh nhân thu ờng lấy máu vào buổi sáng, lấy khoảng 4,5 ml máu

0,5 ml Citrate để làm x t nghiệm [36][56]. Bệnh nhân cần đo chỉ số INR mỗi 1 - 2

ngày trong 2 tuần đầu sau khi sử dụng đến khi INR đạt mục tiêu 2 lần liên tiếp, khi

INR ổn định bệnh nhân nên đo INR mỗi 2 - 4 tuần 1 lần. Ngoài ra mỗi lần tái khám

bệnh nhân cũng phải đo INR để đánh giá hiệu quả liều thuốc dùng và điều chỉnh

liều thuốc:

+ INR mục tiêu: mỗi bệnh nhân tuỳ theo tình trạng bệnh lý cụ thể mà phân

loại INR mục tiêu. Bệnh nhân thay van 2 lá cơ học, INR mục tiêu = 2,5 - 3,5. Bệnh

nhân thay van cơ học kèm tiền sử kẹt van thì INR mục tiêu = 3,5 - 4,5. Bệnh nhân

lớn tuổi, có nguy cơ xuất huyết cao thì INR mục tiêu = 2,0 [11].

+ INR thấp: không đạt mục tiêu điều trị, dễ tạo cục máu đông gây kẹt van tim

hay những biến chứng gây tắc mạch khác [11].

+ INR cao: gây biến chứng xuất huyết như bầm dưới da, chảy máu chân răng,

chảy máu cam, tiểu máu, nặng nhất là chảy máu não [11].

1.3. Dƣợc di truyền học của acenocoumarol

Thuốc chống đông máu nhóm AVK thông dụng như: warfarin, acenocoumarol

và phenprocoumon là những loại thuốc thường được kê đơn nhiều nhất cho việc xử

lý các vấn đề liên quan đến chống đông máu ở bệnh nhân: rung nhĩ (AF), thay van

tim (HVR), huyết khối tĩnh mạch (DVT), phổi thuyên tắc, tăng áp động mạch phổi

và với những bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình [18]. Ở Việt Nam,

acenocoumarol được sử dụng rộng rãi trong điều trị các vấn đề về huyết khối của

bệnh nhân sau thay van tim hơn warfarin [24].

Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí

para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R(+) và S(-), trong đó R( )

acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với acenocoumarol S(-).

Acenocoumarol ức chế quá trình khử vitamin K, qua đó ngăn ngừa phản ứng

carboxyl hóa đuôi axit amin glutamic của các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin

K. Sự carboxyl hóa rất quan trọng cho sự tương tác giữa các yếu tố đông máu và

canxi. Nếu không có sự tương tác này, quá trình đông máu không thể xảy ra. Cả yếu

tố bên ngoài thông qua yếu tố VII, X và II [21][32][34].

Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường uống và đạt nồng độ

tối đa (Cmax = 0,3 ± 0,05 mcg/ml) trong 2 - 3 giờ. Acenocoumarol trong huyết

tương đa phần ở dạng liên kết với protein chỉ 1,52% tồn tại ở trạng thái tự do. Sau

khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán

thải của thuốc lần lượt là 3,9 ± 0,7 mcg ml/giờ và 10,9 ± 1,5 mcg ml/giờ. Thời

gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian PT là từ 24 - 30 giờ

[21]. Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải

ra ngoài một cách nhanh chóng. Do đó, việc xác định liều lượng sử dụng cho từng

bệnh nhân một cách ổn định là điều hết sức có ý nghĩa. Vì nếu bệnh nhân sử dụng

liều thấp có thể gây giảm hiệu quả chống đông của thuốc, còn sử dụng liều cao có

thể gây nguy cơ biến chứng chảy máu. Quan trọng hơn, giai đoạn đầu của điều trị

rất dễ bị các biến chứng lâm sàng liên quan tới việc sử dụng trên hoặc dưới liều.

Trong những tuần đầu điều trị, giá trị INR thường rối loạn và có nguy cơ chảy

máu nhiều hơn. Để tránh nguy cơ này bác sĩ nên có những tính toán cho liều dung

nạp thuốc đầu tiên và duy trì liều sau đó đối với thuốc [36]. Liều thuốc

acenocoumarol cũng tùy thuộc vào mỗi cá thể và phụ thuộc vào chỉ số INR. Liều

dùng thường vào ngày thứ nhất từ 8 - 12 mg, trong ngày thứ hai là từ 4 - 8 mg.

Liều duy trì từ 1 - 10 mg hàng ngày. Uống acenocoumarol vào cùng thời điểm

hàng ngày [35][61].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của acenocoumarol [21]

Hình 1.3. Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol

[53][69][76]

Trong tất cả các yếu tố có nguy cơ gây ảnh hưởng đến liều dùng thuốc

acenocoumarol của bệnh nhân như trên thì yếu tố di truyền học là một yếu tố được

đánh giá là rất quan trọng và đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt

được khoảng INR mong muốn [37]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng gen

VKORC1, gen CYP2C9 và gen CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ yếu chịu trách

nhiệm cho sự thay đổi liều dùng thuốc chống đông nhóm AVK ở bệnh nhân da

trắng và trong đó các SNP của gen VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của

thuốc) và gen CYP2C9 (gen mã hóa cho siêu họ enzym chuyển hóa thuốc

cytochrome P450) có vai trò quan trọng nhất [20][54][70]. Xét về sự ảnh hưởng đến

liều dùng thuốc acenocoumarol, gen VKORC1 được cho là có ảnh hưởng hơn gen

CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [17][24][25][33]. Vì vậy, trong những

năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu để phát triển các thuật toán

hướng dẫn liều sử dụng acenocoumarol dựa trên các yếu tố di truyền cũng như lâm

sàng [22]. Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc

hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc chống đông máu thuộc nhóm AVK. Theo

nghiên cứu của tác giả Verde và cs (2010) đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di

truyền gen VKORC1, gen CYP4F2 và gen CYP2C9*2*3 với liều thuốc

acenocoumarol sử dụng cho bệnh nhân sau thay van tim [76]. Một nghiên cứu khác

của tác giả Van Schie và cs (2011) cũng công bố chi tiết về các thuật toán tiên

lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể

so với thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [60].

1.4. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1

1.4.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotide

Đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism-SNP, đọc là “snip”)

là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất

hiện một loại nucleotide khác nhau (A, T, G hoặc C). Mỗi vị trí được coi là một

SNP chỉ khi tần số ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1%. Mỗi gen

là một đoạn ngắn trong chuỗi xoắn kép DNA, tạo nên một bộ gen của con người.

Đoạn ngắn đó lại là một chuỗi rất nhiều các nucleotide, các biến động về một gen

giữa các cá thể chỉ do sự khác nhau của một nucleotide trong gen đang x t, đó chính

là tính đa hình đơn nucleotide [17].

Hình 1.4. Mô tả Single nucleotide polymorphisms [17]

Mặc dù về lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, song thông

thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen. Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một

đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide

khác [15]. Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì s có các

thế hệ sau ra đời mang đột biến này và qua nhiều thế hệ s hình thành SNP trong

quần thể. Nhưng chỉ có 2 alen - một alen gốc và một alen đột biến. Nếu muốn có

alen thứ 3, s cần có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen và

cá thể mang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau. Điều này vẫn có thể

xảy ra nhưng rất hiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [15]. Đa hình thái được

gọi là đột biến khi có tỉ lệ <1% trong quần thể [58]. Các trường hợp có thể xảy ra khi

đột biến tại 1 nucleotide:

- Ở đoạn trình tự mã hóa, SNP có thể dẫn đến thay đổi trình tự axit amin, độ

dài chuỗi polypeptide nếu một bộ ba nucleotide (codon) kết thúc bị biến đổi.

- Ở các vị trí không thuộc các trình tự mã hóa nhưng vẫn có thể chi phối đến

mức độ biểu hiện của gen, SNP ảnh hưởng đến sự biểu hiện của sản phẩm protein.

- Nhiều SNP thuộc các vùng mã hóa hay không mã hóa các gen không gây ảnh

hưởng đến cấu trúc hay sự biểu hiện hoạt động của các gen.

Biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người là các SNP. Mỗi

SNP lại có thể liên kết với các SNP khác trên cùng một nhiễm sắc thể. Các SNP liên

kết đó thường có xu hướng tạo thành một tập hợp di truyền cùng nhau vì ít khả năng

trao đổi chéo tạo ra những tập hợp mới, và được gọi là haplotype. Trong tiến hóa, dĩ

nhiên các haplotype cũng có thể bị thay đổi do trao đổi chéo tạo thành các

haplotype mới [26]. Tính đến thời điểm này, có hơn bốn triệu SNP trong hệ gen của

con người đã được xác định. Các SNP xảy ra khi một cặp nucleotide bị thay thế. Do

đó, các SNP là sự khác biệt duy nhất, cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [15].

Hình 1.5. Mô tả Haplotype [26]

Với tần suất lớn và sự phân bố khắp hệ gen người, mặc dù hầu hết các SNP

không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, nhưng chúng lại là những công

cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền. Ví dụ như SNP là cơ sở cho phương pháp

GWAS, cho phép các nhà nghiên cứu xác định vùng gen quan trọng với tiến triển

bệnh tật. Nhiều SNP có thể giúp dự đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại

thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số

bệnh, cũng như theo d i các bệnh lý di truyền theo gia đình [51]. Việc xác định các

đột biến gây bệnh cũng là bước đầu tiên quan trọng trong liệu pháp điều trị, từ đó có

lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể [51].

1.4.2. Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol

Cytochrome P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa

phần lớn các thuốc được sử dụng trong lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng

tập tiểu cầu (clopidogrel), thuốc chống động kinh (mephenytoin, diazepam) và các

thuốc an thần. Enzym CYP bao gồm: CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19,

CYP1A2 và CYP2E1 [57]. Trong đó, CYP2C9 là enzym đóng vai trò quan trọng

trong việc oxy hoá các hợp chất nội sinh và ngoại sinh đồng thời cũng chính là

enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc acenocoumarol [69].

Hàng trăm loại thuốc điều trị các loại bệnh khác nhau được chuyển hóa bởi

CYP2C9 tại gan, bao gồm cả các loại thuốc chống đông máu có chỉ định điều trị hẹp

như: acenocoumarol, warfarin và phenytoin và các loại thuốc điều trị thường xuyên

theo chỉ định khác như: tolbutamide, losartan, glipizide...cũng như một số loại thuốc

chống viêm không steroid. Không chỉ ở gan, CYP2C9 còn tham gia chuyển hóa các

hợp chất nội sinh quan trọng như 5-hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt

động, hay các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh

học [45][47].

Gen CYP2C9 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), từ

cặp nucleotide 94,762,624 đến 94,853,260 [26].

Hình 1.6. Vị trí nhiễm sắc thế số 10 trong bộ NST Người [26]

Hình 1.7. Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 [26]

Quá trình chuyển hóa thuốc trải qua hai giai đoạn: pha I và pha II. Pha I: xảy

ra các phản ứng sinh hóa như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng chủ yếu là

phản ứng oxy hóa có sự tham gia của enzym cytochrome P450 [52]. Pha II: các

phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid

glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) s ghép với một nhóm hóa học của

thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước. Thông thường, các phản ứng

ở pha I s tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II, đó là các

nhóm: -OH, -COOH, -NH2, -S [27][50][58]. Phản ứng được thực hiện theo nhiều

bước (Hình 1.8) [19][28]:

1. Thuốc (drug) phản ứng với dạng oxy hóa của Cytochrome P450 (Fe3+) tạo

thành phức hợp Drug-P450 (Fe3+).

2. Phức hợp Drug- P450 (Fe3+) nhận 1 electron từ NADPH, bị khử thành Drug -

P450 (Fe2+).

3. Sau đó, phức hợp Drug- P450 (Fe2+) phản ứng với 1 phân tử oxy để tạo thành

phức hợp oxy hoạt hóa.

4. Cuối cùng, 1 nguyên tử oxy được giải phóng, tạo H2O. Còn nguyên tử oxy thứ 2 s oxy hóa thuốc: Drug  Drug-OH, và Cyt. P450 (Fe3+) được tái tạo.

Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc không có hoạt tính trở thành chất

có hoạt tính.

Hình 1.8. Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc [19][28]

Gen CYP2C9 có tính đa hình cao, hơn 50 nucleotide polymorphisms (SNPs)

đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [26]. Một số SNP đã được

chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng

kiểu dại. Theo kết quả nghiên cứu của Saraevaf và cs (2007) đã xác định được gen

CYP2C9 là enzym chuyển hóa acenocoumarol, trong đó alen CYP2C9*3 có vai trò

quan trọng trong quyết định liều lượng sử dụng acenocoumarol [58]. Một nghiên

cứu khác của Tassies và cs (2002) cũng cho rằng người mang alen CYP2C9*2,

CYP2C9*3 chỉ cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn từ 16 - 27% [24].

Bảng 1.1. Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol

Tài liệu Số Phƣơng Nƣớc Mối liên quan tham khảo mẫu pháp

Tassies và cs, Tây Ban Nghiên cứu Giảm liều: *1*2: 16%,*1*3: 325 Nha mô tả 36%, *2*2: 1%, *2*3: 27% 2002 [35]

Schalekamp và Nghiên cứu Hà Lan 231 Giảm liều: *2: 1%, *3: 20% cs, 2004 [98] mô tả

Visser và cs, Nghiên cứu Giảm liều: *1*2:13%,*1*3:20% Hà Lan 1124 mô tả và *2*2: 28%, *2*3: 40% 2004 [66]

Alen đa hình của gen CYP2C9 được chứng minh có liên quan tới việc gia tăng

Visser và cs, Nghiên cứu Hà Lan 996 Nguy cơ chảy máu: 1,83 mô tả 2005 [67]

gấp đôi nguy cơ chảy máu. Mặc dù có ít công bố về mối liên quan giữa đa hình di

truyền gen CYP2C9 với liều thuốc acenocoumarol, một số các nghiên cứu cũng chỉ

ra mối liên quan giữa kiểu gen CYP2C9 và nguy cơ chảy máu gây ra bởi

acenocoumarol [45]. Sự hiện diện của một alen CYP2C9*3 làm giảm sự chuyển hóa

bình thường của dạng S-acenocoumarol, dạng có tác dụng lâm sàng và do đó làm

tăng thời gian bán hủy của enantiomer này [45]. Có nghĩa là liều thuốc

acenocoumarol cần thiết ở người mang alen *3 thấp hơn ở người mang alen kiểu dại

khoảng 27 - 36% [35] và thấp hơn người mang alen *2 khoảng 13 - 15% [24][44].

Tuy nhiên, theo nghiên cứu của tác giả Schalekamp và cs (2004) vẫn chứng minh

nên giảm 20% liều điều trị cho bệnh nhân mang alen CYP2C9*3 đa hình khi dùng

thuốc chống đông máu acenocoumarol [65].

Alen CYP2C9*3 (kí hiệu rs1057910) trên gen CYP2C9:

Alen CYP2C9*3 có kí hiệu rs1057910 nằm ở vị trí c.1075A>C. Đây là đột

biến đồng hoán A thay thế bằng C. Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt

ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính [68]. Alen

CYP2C9*3 là dạng alen mã hoá cho enzym CYP2C9 phổ biến nhất [75].

1.4.3. Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều dùng thuốc

acenocoumarol

Gen VKORC1 là gen mã hóa cho protein cùng tên VKORC1 (vitamin K

epoxide reductase complex subunit 1), đây là một protein xuyên màng có kích

thước nhỏ của lưới nội chất. Protein VKORC1 rất cần thiết cho chu trình chuyển hóa

vitamin K và nó là protein đích tác dụng của thuốc acenocoumarol [17].

Gen VKORC1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 16 ở người (16p11.2), từ

cặp nucleotide 31,090,842 đến cặp nucleotide 31,095,980 [17].

Hình 1.9. Vị trí nhiễm sắc thể số 16 trong bộ NST Người [17]

Hình 1.10. Vị trí gen VKORC1 trên nhiễm sắc thể số 16 [17]

Hình 1.11. Gen VKORC1 [17]

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều lượng sử dụng acenocoumarol cũng chịu

ảnh hưởng bởi kiểu gen VKORC1. Theo nghiên cứu của tác giả Reitsma và cs

(2005) thực hiện khảo sát trên 330 bệnh nhân người Hà Lan và kết quả là những

bệnh nhân mang một hoặc hai alen -1173T cần giảm liều tương ứng là 28% và 47%

so với bệnh nhân không mang alen này [53]. Trong khi đó, theo một nghiên cứu

khác của tác giả Markatos và cs (2008) tiến hành trên 98 bệnh nhân người Hy Lạp,

cho thấy kết quả: bệnh nhân mang một alen -1173T cần liều thuốc acenocoumarol

thấp hơn khoảng 19% so với bệnh nhân không mang alen này và với bệnh nhân

mang hai alen -1173T cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn 63% so với bệnh

nhân không mang alen này [23].

Bảng 1.2. Mối liên hệ giữa kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol

Tài liệu tham Số Phƣơng Nƣớc Mối liên hệ khảo mẫu pháp

Giảm liều: AG: 28%, AA: 47% Reitsma và cs, Nghiên cứu Hà Lan 330 Nguy cơ chảy máu (OR): 2,6 2005 [53] mô tả trên bệnh nhân mang alen A

Markatos và cs, Nghiên cứu Hy Lạp 98 Giảm liều AG: 19%, AA: 63% 2008 [23] mô tả

Cadamuro và cs Nghiên cứu Áo 206 Giảm liều AG: 25%, AA: 52% 2010 [40] mô tả

Kovac và cs, Nghiên cứu Sebia 200 Giảm liều AG: 27%, AA: 62% 2010 [48] mô tả

Esmerian và cs, Nghiên cứu Lebanese 133 Giảm liều AG: 34%, AA: 50% 2011 [49] mô tả

Nghiên cứu của Reitsma và cs (2005) cho thấy sự gia tăng nguy cơ chảy máu

ở người mang một alen 1173T của gen VKORC1 [53]. Trong một nghiên cứu khác

của tác giả Montes và cs (2008) nguy cơ xuất huyết tiêu hóa được tăng lên ở những

người sử dụng acenocoumarol mang từ một alen 1173T của gen VKORC1 [59].

Trong một nghiên cứu gần đây hơn, nguy cơ chảy máu cũng được thấy đã tăng lên ở

người sử dụng acenocoumarol mang một hoặc hai alen 1173T của gen VKORC1 (tỷ

lệ 4,9% cho kiểu gen AA; 2,3% ở AG và 0,47% ở những bệnh nhân mang kiểu gen

GG) [42]. Tuy nhiên, mức tăng này nằm trong khoảng giới hạn ở những tháng đầu

tiên điều trị [68].

1.4.3.1. SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Vị trí SNP rs9923231 trên gen VKORC1: là một đa hình trong vùng promoter

của gen VKORC1 được cho là nguyên nhân đa hình đơn nucleotide cho kiểu hình

liều thấp. Sự đa hình này làm thay đổi vị trí gắn kết nhân tố phiên mã VKORC1 và

các xét nghiệm luciferase cho thấy hoạt động của alen G tăng 44% so với hoạt động

của alen A. Ngoài ra, phân tích VKORC1 mRNA phân lập từ mẫu gan người cho

thấy rằng những người mang alen A ở vị trí c.1639 G>A có lượng mRNA giảm hơn

so với những ngày không mang alen này [17]. Thay đổi trong sự biểu hiện gen dẫn

đến giảm các bản sao của protein VKORC1 trưởng thành, đây chính là enzym kiểm

soát trong chu trình vitamin K [17].

Đa hình rs9923231 trên gen VKORC1 đã được phân tích tại nhiều quần thể

khác nhau. Đa hình này có tần số khác nhau ở các quần thể, chủng tộc người khác

nhau. Alen rs9923231 xuất hiện với tần số cao ở quần thể người Châu Á (khoảng

90%) còn với quần thể người da trắng thì chỉ xuất hiện khoảng 40% [31].

1.4.3.2. SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Vị trí SNP rs9934438 trên gen VKORC1: c.1173C>T. SNP rs9934438 là SNP

trong intron đầu tiên của gen VKORC1 [29]. Nó nằm gần đoạn liên kết với

rs9923231. rs9934438 là đa hình đầu tiên có liên quan đến kiểu hình AVK liều thấp

[7]. Mặc dù nó thường được coi là bị trơ về mặt chức năng, tuy nhiên rs9934438

vẫn thường được sử dụng làm đa hình marker cho rs9923231 và cho các halotypes

chứa biến thể này. Đa hình này có tần số khác nhau ở các quần thể, chủng tộc người

khác nhau. Alen rs9934438 xuất hiện với tần số cao ở quần thể người Châu Á

(khoảng 80 - 90%) [31].

1.4.4. Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

1.4.4.1. Phương pháp PCR - giải trình tự gen

 Phương pháp PCR

PCR (polymerase chain reaction) được dùng để khuếch đại một chuỗi DNA

(DNA đích). Trong quá trình sao chép, các sợi DNA tách nhau ra và mỗi sợi của

phân tử DNA bố mẹ lại làm khuôn để tổng hợp lên các sợi DNA con theo nguyên

tắc bổ sung. Quá trình sao chép hoàn toàn dựa trên nguyên tắc Watson và Crick: A

bổ sung với T; G bổ sung với C và luôn đảm bảo tính bảo tồn cao, ít sai sót [12].

Nguyên tắc của phương pháp PCR là dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai

đoạn khác nhau của quá trình phản ứng:

+ Giai đoạn 1 là giai đoạn biến tính

+ Giai đoạn 2 là giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài chuỗi

+ Giai đoạn 3 là kết thúc

Quá trình PCR chỉ sử dụng những thành phần cơ bản của toàn bộ hệ thống sao

chép phức tạp trong tự nhiên để sao chép một phân đoạn ngắn DNA trong ống

nghiệm [12]. Các cặp oligonucleotid mồi gắn đặc hiệu với một đoạn của chuỗi

DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Hai chuỗi xoắn kép trong phân tử DNA

khuôn được tách rời nhau bởi nhiệt độ. Nhiệt độ cao phá vỡ các liên kết hydro giữa

các đôi base. Quá trình này gọi là quá trình biến tính. Các cặp mồi sau đó liên kết bổ

sung với chuỗi DNA khuôn và enzym DNA polymerase bắt đầu quá trình gắn các

đươn vị deoxynucleotid vào vị trí 3'-OH của mồi để tạo thành các phân tử kẹp đôi

mới. Các mồi lại gắn vào khuôn theo nguyên tắc bổ sung và quá trình kéo dài sợi

tiếp tục diễn ra. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân thành hai bản

sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25 - 35 lần thì từ một DNA đích s được khuếch đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao [5][12][13].

 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp

của các nucleotid trong phần tử DNA [72]. Giải trình tự gen sử dụng máy giải trình

tự tự động [72]:

Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp

Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được

đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy bao

gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín

hiệu. Các vạch điện di trong mao quản s đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống

nhận diện tín hiệu màu s ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [72].

Ưu điểm của phương pháp xác định kiểu gen của SNP phương pháp bằng giải

trình tự gen: kết quả chính xác, rõ nét, không cần thực hiện nhiều các thao tác kĩ

thuật, quy trình kĩ thuật hiện đại do sử dụng hệ thống máy tự động.

Hình 1.12. Giải trình tự gen bằng máy tự động [72]

1.4.4.2. Phương pháp cắt bằng enzym giới hạn (RFLP - Restriction fragment length

polymorphism)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân

đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn (Restriction Enzym, RE). Khi ủ

DNA với enzym giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp với pH, nhiệt độ thích hợp s

tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ

gen [12][70]. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các RE đối với

vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể s

tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [70].

 Trình tự nhận biết của enzym giới hạn (RE)

Mỗi một enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu

đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi.

Enzym giới hạn mang tính đặc hiệu cao, mỗi enzym chỉ có thể nhận biết một đoạn

trình tự đặc thù các cặp bazơ trên DNA. Đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài

4 - 5 hoặc 6 nucleotide tương ứng với khoảng 44 = 256 cặp bazơ, 45 = 1024 cặp

bazơ, hoặc 46 = 4096 cặp bazơ có khả năng lặp lại một lần trong cấu trúc chung của

DNA. Như vậy, RE nhận biết đoạn trình tự nucleotide s cắt phân tử DNA ngắn

hơn các RE nhận biết đoạn trình tự 5 hoặc 6 nucleotide [9][12].

 Các kiểu cắt của RE

Hình 1.13. Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo bằng [110]

Cắt tạo ra đầu bằng (blunt ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu bằng

không tự nối các đoạn DNA lại với nhau. Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA

ngay chính giữa palindromic. Để nối các đoạn DNA sau khi cắt cần sử dụng enzym

nối ligase và các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzym [74].

Cắt tạo ra đầu dính (cohesive ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu so le

tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung.

Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát

triển của công nghệ di truyền [74].

 Ưu điểm của phương pháp RFLP

Phân tích RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các phân

đoạn DNA được nhân bản bởi kỹ thuật PCR. Những phân đoạn như vậy có thể

được phân tách bằng cách chạy điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel bằng

ethidium bromide, tính đặc thù của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp

hoặc chụp ảnh qua máy soi DNA. Số lượng và kích thước của các phân đoạn s

phản ánh sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA. Sự hiện diện của các

đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp DNA/RE. Người ta có thể sử

dụng phương pháp xác định kiểu gen RFLP để đánh giá trực tiếp tính biến dị di

truyền của sinh vật [74].

Phương pháp RFLP có ưu điểm: kỹ thuật đơn giản, kết quả rõ ràng, nhanh, tiết

kiệm chi phí và độ tin cậy cao. Kỹ thuật RFLP là công cụ hữu hiệu trong trường

hợp cần xác định sự có mặt của đột biến tạo ra trong phản ứng PCR, mà đột biến

này cấu thành vị trí cắt của enzym là sợi DNA khuôn ban đầu không có [74].

1.5. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa di truyền học và liều thuốc

acenocoumarol trên thế giới và trong nƣớc

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Do khi hoạt động van tim nhân tạo được cơ thể nhận biết như một yếu tố lạ, do

đó s kích thích quá trình đông máu nội sinh gây việc hình thành nên các cục máu

đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối. Chính vì vậy, tất cả bệnh nhân sau

thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình thành các

cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch hoặc huyết khối [1]. Thuốc chống đông

máu nhóm AVK có khoảng an toàn rất hẹp, nếu dùng liều thấp thì không đạt hiệu

quả kháng đông, nhưng nếu quá liều s gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng

bệnh nhân [38].

Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau

thay van tim. Theo nghiên cứu của Bourguignon và cs (2011) theo dõi 505 bệnh

nhân thay van tim cơ học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất

là tắc mạch và chảy máu có liên quan đến hoạt động của van [67]. Tác giả

Abhijit Trailokya và cs (2016) khuyến cáo liều sử dụng thuốc acenocoumarol từ:

4 - 8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 - 4 là an toàn và hiệu quả

[25]. Nghiên cứu của Alec Vahanian và cs (2010) đã đưa ra được những chỉ định

rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất mức INR cho

bệnh nhân thay van tim cơ học từ 2,5 - 4 [71]. Nghiên cứu của tác giả Nashimura

và cs (2014) trên 650 bệnh nhân thay van tim thấy có: 0,62% có tắc mạch và

0,95% chảy máu, dùng thuốc chống đông nhóm AVK liều từ: 1 - 2,5 mg/ngày có

thể hạn chế được tắc mạch [89]. Còn theo nghiên cứu của tác giả Isthyak

Ashmed Mir (2015) thực hiện trên 127 bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông

máu acenocoumarol sau khi thay van tim cho thấy nếu bệnh nhân duy trì được

mức INR hợp lý (thường từ 2,5 - 3,5) thì s không có nguy cơ tắc mạch và chảy

máu [55]. Một nghiên cứu khác Elbardissi và cs (2007) khảo sát trên 861 bệnh

nhân thay van động mạch chủ cho thấy nếu sử dụng sớm thuốc chống đông máu

thì dường như không thấy xuất hiện biến chứng tai biến huyết khối tắc mạch sau

thay van [16].

Gen CYP2C9 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 trong bộ nhiễm sắc thể người và

nằm ở vị trí 10q23,33. Gen CYP2C9 có tính đa hình cao, một số SNP đa hình của

gen CYP2C9 đã được chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính của

enzym. Sự phân bố tần số các alen của gen CYP2C9 phụ thuộc nhiều vào từng

chủng tộc [38].

Bảng 1.3. Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người [38][67]

Ngƣời Mỹ Ngƣời Phi Ngƣời Châu Á Ngƣời da Alen gốc Phi (%) da đen (%) lùn (%) (%) trắng (%)

CYP2C9*2 2,9 0 - 4,3 0 0 - 0,1 8 - 19

CYP2C9*3 2,0 0 - 2,3 0 1,1 - 3,6 3,3 - 16,2

CYP2C9*7 0 0 6 0 0

CYP2C9*8 1,9 8,6 4 0 0

CYP2C9*9 13 15,7 22 0 0,3

2,7 6 0 0,4 - 1,0 CYP2C9*11 1,4 - 1,8

Năm 1970 người ta phát hiện enzym Vitamin K epoxide reductase được mã

hóa bởi gen VKORC1 [17]. Vitamin K epoxide reductase chịu trách nhiệm chuyển

hóa vitamin K epoxide reductase thành vitamin K tham gia vào quá trình đông máu.

Một số đột biến trên VKORC1 có liên quan tới hiện tượng tăng nhạy cảm với

acenocoumarol. Tần số phân bố alen của rs9923231 và rs9934438 trên gen

VKORC1 khác nhau ở các chủng tộc người khác nhau [23].

Bảng 1.4. Tần số phân bố alen của gen VKORC1 ở các quần thể người [23]

Tần số alen (%) Quần thể

Ngƣời rs9923231 rs9934438 rs2359612 rs7294

Tamilian 10 8,8 83,6 9,3

Trung Quốc 92,4 87,9 5,8 91,5

Nhật Bản 91,8 92,5 90,1 91,5

Da Trắng 30,1 19,9 36,3 NA

Mỹ Phi 43,8 19,4 42,2 NA

Trong một nghiên cứu gần đây, kết quả đã thấy có sự khác biệt trong liều đáp

ứng của thuốc chống đông máu acenocoumarol liên quan tới đột biến -1639G>A ở

quần thể người da trắng [48]. Từ kết quả nghiên cứu này, người ta khuyến cáo, đối

với bệnh nhân người da trắng mang một alen -1639A cần giảm 25% liều dùng thuốc

acenocoumarol so với bệnh nhân không mang alen này, còn đối với bệnh nhân

người da trắng mang hai alen -1639A cần giảm 50% liều dùng acencocoumarol so

với bệnh nhân không mang alen này [52]. Đột biến -1639G>A liên kết chặt với đột

biến -1173C>T có liên quan tới biểu hiện hoạt tính enzym khác nhau ở các chủng

tộc người khác nhau [48].

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, kể từ ca thay van tim nhân tạo đầu tiên được thực hiện tại Bệnh

viện Việt Đức vào năm 1979, cho đến nay, mỗi năm có hàng ngàn bệnh nhân được

thay van tim tại nhiều bệnh viện/trung tâm tim mạch trên cả nước. Tại Bệnh viện

Tim Hà Nội, trong thời gian từ tháng 01/2006 đến tháng 12/2007 đã có 1.335 bệnh

nhân được thay van tim. Tại trung tâm Tim mạch Bệnh viện E, hàng năm thay van

tim cho khoảng 1.000 bệnh nhân. Viện Tim mạch Bệnh viện Bạch Mai cũng thực

hiện gần 1.000 ca thay van tim mỗi năm. Cũng giống như tại các nước trên thế giới,

bệnh nhân sau khi thay van tim tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam thường

gặp nhiều các biến chứng sau thay van tim như kẹt van tim, hư van, nhưng phổ biến

và nguy hiểm nhất là huyết khối, tắc mạch do các cục máu đông hình thành trong

quá trình hoạt động van tim nhân tạo [5][7].

Năm 2008, Hội tim mạch học Việt Nam đã đưa ra khuyến các về chuẩn đoán

và điều trị các bệnh van tim đã đưa ra các chỉ định điều trị ngoại khoa các bệnh van

tim cũng như chiến lược điều trị sau thay van tim [6]. Để hạn chế biến chứng của

bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim bệnh nhân bắt buộc phải sử dụng thuốc

chống đông máu cả đời. Tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam, thuốc chống

đông máu nhóm AVK thường được sử dụng hiện nay có 2 loại: warfarin (Coumadin

2 mg) và acenocoumarol (Sintrom 4 mg). Tuy nhiên, acenocoumarol được dùng phổ

biến hơn (ngoài sự lựa chọn của bệnh nhân và thầy thuốc còn do chế độ Bảo hiểm y

tế). Do khoảng an toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên khi điều

trị phải dò liều an toàn, đảm bảo đạt hiệu lực nhưng tránh được biến chứng chảy

máu do quá liều vì vậy bệnh nhân phải theo dõi chỉ số INR thường xuyên để điều

chỉnh liều dưới sự tư vấn của bác sĩ [30][50].

Tuy nhiên, hiện nay tỉ lệ bệnh nhân được theo dõi và INR đạt đích điều trị chỉ

có 21 - 44,8%. Nguyễn Quốc Kính và Tạ Mạnh Cường (2011) nghiên cứu trên 200

bệnh nhân thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội thấy có 5 bệnh nhân tử

vong, 8 bệnh nhân kẹt van và 5 - 7,5% bệnh nhân bị huyết khối, 18 - 23,6% bệnh

nhân có biến chứng chảy máu, tỉ lệ đạt đích INR chuẩn hóa (INR: 2,5 - 3,5) chỉ đạt

30 - 33%. Việc hướng dẫn dùng thuốc chống đông chưa được tốt với 27,3% bệnh

nhân cho là không cần xét nghiệm đông máu và có tới 21,8% bệnh nhân không biết

cần điều chỉnh liều thuốc chống đông theo giá trị INR. Chỉ có 67,3% bệnh nhân ý

thức được phạm vi đích điều trị INR nhưng 10% trong số đó hiểu sai giá trị đích

INR [8].

Nghiên cứu của Hồ Thị Thiên Nga (2009) tại bệnh viện Việt Đức, trong số

180 bệnh nhân thì 40% không biết đích INR cần đạt [10]. Hoàng Quốc Toàn và cs

(2010) nghiên cứu trên 168 bệnh nhân sau thay van tim tại bệnh viện 108: có 60,1%

bệnh nhân thay van hai lá và 25,6% thay van hai lá và van động mạch chủ. Liều

Sintrom cho bệnh nhân sau thay van từ 1/8 đến ¾ viên/ngày, trong đó có 42,9%

bệnh nhân dùng liều 3/8 viên và 29,8% bệnh nhân dùng liều ¼ và 3/8 viên xen k .

Tác giả gặp: 20,2% bệnh nhân có biến chứng liên quan đến thuốc chống đông sau

thay van tim trong đó xuất huyết là 19% và huyết khối gây kẹt van là 1,2%, vị trí

xuất huyết nhiều nhất là xuất huyết dưới da (31,3%), chảy máu mũi miệng (37,5%)

và có 12,5% xuất huyết não. Yếu tố liên quan đến biến chứng do thuốc chống đông

là: bệnh nhân không uống thuốc thường xuyên và không kiểm tra định kì (đánh giá

INR) [11].

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim:

+ Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân theo khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt

Nam [6] và hướng dẫn điều trị bệnh van tim của Hội Tim mạch Hoa Kỳ [18].

+ Hồ sơ bệnh nhân gồm: lối sống và tiền sử dùng thuốc. Thông tin thu thập

bao gồm: các chỉ định điều trị, điều kiện kèm theo, loại thuốc, các hoạt động thể

chất và đặc biệt là khẩu phần ăn các loại thực phẩm giàu vitamin K trong 1 tuần.

+ Chỉ số đông máu INR được duy trì trong khoảng giới hạn mong muốn để đạt

được liều điều trị acenocoumarol.

- Kiểm tra khi tái khám:

+ Lâm sàng: kiểm tra xem bệnh nhân có triệu chứng quá liều hoặc chưa đạt

liều hay không.

+ Cận lâm sàng: cho bệnh nhân kiểm tra chỉ số INR. Khi INR nằm trong giới

hạn mong muốn tức là đã “đạt liều” thuốc chống đông.

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng.

- Bệnh nhân huyết động không ổn định.

- Bệnh nhân tai biến mạch não dưới 3 tháng.

- Bệnh nhân mới phẫu thuật dưới 1 tuần.

- Bệnh nhân suy thận, suy gan giai đoạn cuối.

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 2/2018.

- Địa điểm lấy mẫu: Bệnh viện Tim Hà Nội.

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

+ Bệnh viện Tim Hà Nội

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang.

- Cỡ mẫu nghiên cứu: trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp

chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp, thỏa mãn tiêu

chuẩn lựa chọn bệnh nhân (mục 2.1.1) tại địa điểm được chọn là Bệnh viện Tim Hà

Nội. Những bệnh nhân này tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu.

2 n = Z

p(1-p) 1-α/2

Số lu ợng bẹ nh nhân tối thiểu cần cho nghiên cứu đu ợc xác định bằng công thức:

n: số bẹ nh nhân tối thiểu cần đạt đu ợc.

Z1-α/2 = 1,96.

p: tỷ lẹ tối thiểu phát hiẹ n ra đọ t biến gen khoảng 7%

d: hẹ số ảnh hu ởng 0,05

Thay số vào ta có tổng cỡ mẫu n 100 bệnh nhân. Như vậy, ta có tổng số mẫu cho

nghiên cứu là 100.

2.3. Nguyên liệu và phƣơng tiện nghiên cứu

2.3.1. Hóa chất

- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ.

- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Fermentas.

- 6 X DNA loading dye, code: R0611, hãng: Thermo Scientific.

- GeneRuler: Marker 100-4 kb Plus DNA (Lonza).

- dNTPs 2 mM each, code: R0241, hãng: Thermo Scientific.

- Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) code:15701500GM, Affymetrix.

- Nước khử ion (DDW), code: 16500100, hãng: Invitrogen.

- Tris base, code: TB0196, hãng: Bio basic.

- Acid acetic, code: 100056, hãng: Merck.

- Phusion DNA polymerase, hãng: Neb (New England Biolabs).

- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code : D3392, hãng: Omega-Biotek.

- GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific.

2.3.2. Thiết bị

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (code: 5PRIME/02, Anh).

- Máy khuếch đại DNA có gradient nhiệt, Mastercycler pro S, Eppendorf , Đức.

- Máy ly tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen, Code: D78532, Đức.

-Tủ an toàn sinh học cấp II, Model: AC2-4E8, ESCO 2016-113443, Indonesia.

- Máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer-implen NP80, Đức.

- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ.

- Tủ ấm (Lab.Incubator, Digisystem Laboratory Instruments Inc.), Đài Loan.

- Hệ thống điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.

- Máy chụp ảnh gel và xử lý hình ảnh điện di có màn hình, GelDoc-it2-UVP, Mỹ.

- Tủ lạnh lưu mẫu sinh phẩm -300C, MDF-U334, Nhật.

- Máy cô DNA, Model: CVE2200, Nhật Bản.

2.3.3. Dụng cụ

- Pipet eppendoft từ 2,5 - 1000 µl.

- Đầu côn sử dụng cho các pipet.

- Ống fancol 15 ml.

- Ống eppendoft loại 1,5 ml và 2 ml.

- Ống PCR 0,2 ml.

2.3.4. Mẫu nghiên cứu

- Mẫu máu bệnh nhân được bảo quản trong chất chống đông EDTA ở -300C.

- Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm

theo quy trình về an toàn xét nghiệm.

2.4. Các bƣớc nghiên cứu

2.4.1. Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được chúng tôi thực hiện như sơ đồ thể hiện dưới đây

Mẫu máu của bệnh nhân/EDTA

Bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn

Tách DNA tổng số

Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu

Tinh sạch sản phẩm PCR

Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 trên

gen VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 VKORC1 bằng phương pháp RFLP có đối bằng phương pháp giải trình tự gen chiếu kết quả với phương pháp giải trình tự

gen ở 20 mẫu bệnh nhân đầu

Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP

SNP rs9934438 trên gen VKORC1

CYP2C9*3, SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và

2.4.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu

- Cách lấy mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chứa vào ống chuyên dụng

chứa sẵn chất chống đông EDTA. Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn và không bị

lẫn các mẫu với nhau, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code. Mỗi ống máu

phải đủ cho nhiều hơn 1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể

lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân.

- Cách bảo quản: tại địa điểm thu nhận, mẫu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ từ -200C đến -300C không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc

an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Mẫu được bảo quản ở -300C cho đến khi dùng.

- Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã bệnh nhân, tên, tuổi,

ngày lấy mẫu, đánh dấu số thứ tự mẫu nghiên cứu. Thông tin về mẫu máu của bệnh

nhân phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, số giường và phòng điều trị,

ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.

2.4.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số

2.4.3.1. Tách chiết DNA tổng số

- Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số.

Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng

silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải

phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất trên màng silica-

gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA. Trước khi tách, lấy mẫu giã đông từ từ trên

đá hoặc trong tủ mát. Khi mẫu đã giã đông hoàn toàn mới được sử dụng để tiến

hành tách DNA tổng số.

- Quy trình tách DNA tổng số bằng kit E.Z.N.A blood DNA Mini Kit:

1. Lắc đều ống máu. Chuyển 250 µl mẫu vào ống epp 1,5 ml vô trùng.

2. Thêm 25 µl OB Protease Solution và 250 µl BL Buffer. Vortex 10 giây 3. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15s

4. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây

5. Ly tâm 1000 v/p trong 15s để đảm bảo mẫu không dính trên thành ống

Chú ý: Tất cả các bước ly tâm phải cân và đối trọng các mẫu ly tâm

6. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml

7. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)

8. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

9. Bỏ dịch lọc và Collection Tube

10. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 ml mới

11. Thêm 500 µl HBC Buffer

12. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

13. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

14. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer

15. Ly tâm trong 14.000 vòng/phút trong 1 phút

16. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

17. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer

18. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 v/p trong 2 phút

19. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới

20. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C, 5 phút.

21. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

22. Thêm 50 µl Elution Buffer, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

23. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

24. Thu và bảo quản DNA ở -300C.

2.4.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang

Các mẫu sau khi tách DNA tổng số đều được kiểm tra chất lượng DNA bằng

phương pháp đo quang ở bước sóng A260 nm và A280 nm để đánh giá nồng độ DNA

và độ tinh sạch của DNA. Phương pháp này sử dụng máy đo quang phổ nồng độ

nano, Nano Photometer-implen NP80. Quy trình thao tác chung gồm các bước sau:

- Đo Blank: đo với 2 µl môi trường dùng để bảo quản mẫu DNA tổng số.

- Đo mẫu DNA: đo với 2 µl mẫu DNA tổng số vừa thu được.

Mỗi mẫu phải đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA

của mẫu.

2.4.4. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Trình tự các cặp mồi được tham chiếu trên ngân hàng gen NCBI và đặt tổng

hợp từ hãng IDT-Mỹ. Trình tự mồi xuôi và ngược như sau:

Bảng 2.1. Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen

Kích Alen Mồi Trình tự thƣớc (bp)

rs1057910-F GCATCTGTAACCATCCTCTC 719 CYP2C9*3 rs1057910-R GTGTCAAGATTCAGTTCTTTCC

rs9923231-F TACAACTCCCATCATGCCTG 771 rs9923231 rs9923231-R GACCATCGTCAATCTCTACC

rs9934438-F GGTGCCTTAATCCCAGCTACTC 714 rs9934438 rs9934438-R AAAGACTCCTGTTAGTTACCTCC

2.4.5. Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR

2.4.5.1. Nguyên lý

Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn. Nguyên

lý của kỹ thuật là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên các DNA mới từ DNA

khuôn ban đầu. Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, mồi, dung

dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase. Gồm 3

giai đoạn chính:

- Giai đoạn biến tính: dùng nhiệt độ cao (980C) để tách hai mạch của chuỗi

DNA xoắn kép [12].

- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp của

mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mồi như trình tự

và số lượng nucleotide của mồi [12].

- Giai đoạn kéo dài: tại 720C DNA polymerase s hoạt động tổng hợp lên

mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại dNTP [12].

Để có quy trình khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đặc hiệu

và ổn định thì nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ của DNA và nồng độ các

thành phần trong phản ứng PCR cần phải được xác định, tối ưu chuẩn xác.

2.4.5.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR

Chất lượng sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel

agarose với quy trình tiến hành như sau:

- Nồng độ gel agarose sử dụng: 1,5% (1,5 g agarose pha trong 100 ml dung

dịch đệm TAE 1 X).

- Điện di gel agarose trong đệm TAE 1 X, hiệu điện thế 100 V, trong vòng 45

phút. Sử dụng hệ thống máy điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ.

- Dùng thang chuẩn: Marker 100 - 4 kb Plus (Lonza).

- Thể tích mẫu điện di: 5 µl sản phẩm sau PCR + 1 µl dye 6 X; 5 µl Marker

100 - 4 kb Plus (Lonza) (thường tra ở giếng đầu tiên để kiểm tra độ chính xác kích

thước các băng điện di).

- Kết quả: hình ảnh điện di được ghi lại bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel-

DocItx.

Mẫu PCR có chất lượng tốt là những mẫu có băng điện di sáng, rõ nét, không

bị smear, đứt đoạn, không xuất hiện băng phụ và đúng với kích thước theo lý thuyết

của SNP sau khi so sánh với thang chuẩn (Marker).

2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR của các SNP sau khi kiểm tra chất lượng bằng phương pháp

điện di trên gel agarose nếu đủ điều kiện về chất lượng (băng sáng r , đúng với kích

thước lý thuyết, không bị đứt gãy, smear) s được tinh sạch bằng phương pháp sử

dụng kit tinh sạch GeneJET PCR trước khi thực hiện cắt bằng enzym giới hạn hoặc

gửi giải trình tự.

Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện như sau:

1. Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1, mix đều.

2. Nếu DNA < 500 bp, thêm isopropanol 100% tỉ lệ 1:2, mix đều.

3. Chuyển 800 µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột GeneJET.

4. Ly tâm trong 30-60 giây, bỏ phần dịch lọc.

5. Thêm 700 µl Wash Buffer vào cột, ly tâm 14.000 v/p ở 60 s, bỏ dịch lọc.

6. Lặp lại bước 4, 5.

7. Ly tâm cột ở 14.000 v/p trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer.

8. Chuyển cột lọc sang ống epp 1,5 ml đã khử trùng.

9. Thêm 50 µl Elution Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

10. Ly tâm ống epp ở 14.000 v/p trong vòng 1 phút, thu dịch lọc.

11. Bảo quản ở -300C nếu chưa sử dụng ngay.

2.4.7. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải trình tự

gen

Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và kiểm tra nồng độ bằng cách đo

OD (định lượng DNA) sử dụng máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer-

implen NP80 (quy trình giống với quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng phương

pháp đo quang ở mục 2.4.3.2). Tuỳ vào nồng độ của từng mẫu sau khi tinh sạch mà

chúng tôi cô đặc hoặc pha loãng mẫu cho tới khi nồng độ DNA của mẫu lúc này đạt

tới nồng độ 40 - 50 ng/µl để tiếp tục đem gửi giải trình tự mẫu.

Do vị trí điểm đột biến của SNP CYP2C9*3 không có trình tự nhận biết cho

enzym cắt giới hạn. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác

định kiểu gen SNP CYP2C9*3. Dùng 25 µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc

hiệu và sáng nét tinh sạch và gửi đi giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia). Kết

quả giải trình tự gen được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu

gen của SNP được xác định dựa trên hình ảnh giải trình tự thu được.

Kết quả giải trình tự gen tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau:

- Bốn loại nucleotide được phân biệt bởi các màu khác nhau (ví dụ: màu đen là

Guanine (G), màu xanh nước biển là Cytosine (C), màu xanh lá cây là Adenine (A)

và màu đỏ là Thymine (T).

- Tín hiệu huỳnh quang của các nucleotide là các đỉnh màu đơn, r ràng.

- Không có tín hiệu nhiễu (hoặc có tín hiệu nhiễu nhưng nền nhiễu thấp).

2.4.8. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình

tự gen

Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và kiểm tra nồng độ bằng cách đo

OD (định lượng DNA) sử dụng máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer-

implen NP80 (quy trình giống với quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng

phương pháp đo quang ở mục 2.4.3.2). Tuỳ vào nồng độ của từng mẫu sau khi tinh

sạch mà chúng tôi cô đặc hoặc pha loãng mẫu cho tới khi nồng độ DNA của mẫu

lúc này đạt tới nồng độ 40 - 50 ng/µl để tiếp tục thực hiện phản ứng RFLP hoặc

gửi giải trình tự mẫu.

2.4.8.1. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 bằng phương pháp RFLP

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, DNA s được cô đặc hoặc pha loãng cho đến

nồng độ 40 - 50 ng/µl và tiến hành quy trình cắt bằng enzym cắt giới hạn.

Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn cũng như kiểm tra độ lặp lại của phản ứng,

mỗi mẫu s được cắt (quá trình ủ) ở 2 điểm thời gian trong vùng thời gian cắt đã được

chúng tôi tối ưu.

Bảng 2.2. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKOR1

Thể tích 1 phản ứng Điều kiện phản ứng Thành phần (7,5 µl)

DNA 3,0 µl Ủ ở nhiệt độ: 370C trong 10 X Buffer 0,75 µl 2 điều kiện: 30 và 45 phút Enzym Msp1 0,15 µl

DDW 3,6 µl

Bảng 2.3. Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9934438 trên gen VKORC1

Thể tích 1 phản ứng Điều kiện phản ứng Thành phần (7,5 µl)

DNA 3,0 µl - Ủ ở nhiệt độ: 370C trong 2

10 X Buffer 0,75 µl điều kiện: 15 và 30 phút.

- Bất hoạt ở nhiệt độ: 800C Enzym HinfI 0,15 µl

trong 5 phút. DDW 3,6 µl

Kiểm tra kết quả RFLP của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 bằng phương pháp điện di trên agarose 1,5% trong thời gian 45 phút, hiệu

điện thế 100 V (quy trình và các bước điện di kiểm tra kết quả giống với quy trình

điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR ở mục 2.4.5.2). Ảnh điện di được ghi lại

bằng hệ thống chụp ảnh điện di Gel-DocItx. So sánh kết quả điện di với Marker 100 -

4 kb Plus.

2.4.8.2. Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 bằng phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên.

Sau khi có kết quả phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438

trên gen VKORC1 bằng phương pháp RFLP. Để kiểm tra độ chính xác của phương

pháp này, chúng tôi cũng tiến hành phương pháp giải trình tự gen ở 20 mẫu bệnh

nhân đầu tiên. Nếu kết quả của cả hai phương pháp như nhau, điều đó cho thấy quy

trình và điều kiện phản ứng của phương pháp RFLP được tối ưu tốt và cho kết quả

chính xác. Do đó, các mẫu bệnh nhân tiếp theo chúng tôi s sử dụng phương pháp

RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1. Vì phương pháp này cho kết quả nhanh và hiệu quả kinh tế cho bệnh

nhân đồng thời cũng tiết kiệm thời gian nghiên cứu.

Dùng 25 µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, sáng rõ sau khi tinh sạch

được gửi đi giải trình tự gen tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự

được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9. Kết quả kiểu gen của các đa hình

được xác định dựa trên các ảnh giải trình tự thu được.

2.4.9. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Để xác định được kiểu gen của từng bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng

tôi. Như đã trình bày ở trên, chúng tôi cần tìm được kiểu gen của từng alen hay nói

cách khác xác định được từng SNP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 3 SNP:

SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1. Sau khi đã

có kết quả kiểu gen chúng tôi s đánh giá tần số phân bố alen, phân bố kiểu gen của

SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.

2.5. Xử lý và phân tích số liệu

- Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0, exel 2010.

- Sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, T- test, 2, ANOVA

test, Chisquare-test, Fisher test…một cách phù hợp nhất.

2.6. Các loại sai số và cách khắc phục

2.6.1. Sai số có thể mắc phải

- Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân.

- Sai số trong quá trình tiến hành xét nghiệm và thí nghiệm: sai số hệ thống do máy

móc hoặc do các loại test, kit. Sai số ngẫu nhiên do người làm xét nghiệm hoặc thí

nghiệm, do ảnh hưởng của môi trường tác động lên kết quả xét nghiệm.

- Sai số trong quá trình thu thập số liệu:

+ Trong quá trình thăm khám bệnh nhân.

+ Trong quá trình ghi chép bệnh án: không ghi ch p được các đặc điểm lâm

sàng quan trọng, ghi ch p không đúng biểu mẫu, ghi chép thiếu thông tin, thiếu các

thông tin cần thiết trong biểu mẫu.

- Sai số trong quá trình nhập liệu và phân tích số liệu.

2.6.2. Cách khắc phục sai số

- Đối với sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân: khắc phục bằng việc cố gắng

lựa chọn các bệnh nhân có đặc điểm tương đồng với nhau về tuổi và giới.

- Đối với sai số trong quá trình làm sạch số liệu và nhập liệu: khắc phục bằng đọc

phiếu thu thập thông tin/bệnh án cẩn thận, làm sạch trước khi nhập liệu.

- Đối với sai số trong quá trình xét nghiệm: khắc phục bằng việc chuẩn hóa quy

trình xét nghiệm, các bộ testkit. Đào tạo tập huấn cán bộ phòng xét nghiệm làm

thành thạo các quy trình. Chuẩn hóa các loại máy móc, trang thiết bị. Ước tính sai

số do máy móc gây ra để điều chỉnh hợp lý.

- Đối với sai số trong quá trình thu thập số liệu:

+ Chuẩn hóa quy trình thăm hỏi bệnh nhân và ghi chép bệnh án.

+ Các biểu mẫu được xây dựng và được các bác sỹ, điều dưỡng và điều tra

viên tham gia nghiên cứu góp ý chỉnh sửa và tiến hành thu thập thử để hoàn thiện.

- Đối với sai số trong quá trình làm sạch số liệu và nhập liệu: khắc phục bằng đọc

phiếu thu thập thông tin/bệnh án cẩn thận, làm sạch trước khi nhập liệu.

2.7. Đạo đức nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được thông qua tại hội đồng đạo đức Khoa Y Dược - Đại

học Quốc gia Hà Nội, ngày 02/10/2015, theo mã số đề tài QG.17.29. Bệnh nhân

trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu

nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên

cứu tới bệnh nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu s được ký bản đồng

thuận tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu bất kỳ lúc nào.

Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng

cho mục đích nghiên cứu.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ

3.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 100 bệnh nhân đã thay van tim và sử dụng

thuốc chống đông acenocoumarol tại Bệnh viện Tim Hà Nội. Chúng tôi dùng phần

mềm SPSS 20.0 để phân tích thống kê các biến phân loại được thực hiện dưới dạng

N (%) và các biến liên tục là trung bình ± SD. Phân tích có ý nghĩa thống kê với giá

trị p<0,05.

Bảng 3.1. Một số đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Đặc điểm Đặc điểm ̅ SD %, ̅ SD

INR1, (n=100) 2,70±0,40 Tăng huyết áp (n=100) 14

INR2, (n=100) 2,73±0,43 Giới tính (n=100, nữ/nam) 1,43

INR3, (n=100) 2,72±0,43 Tuổi 51,14 8,92

BMI 21,67 2,85

Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu: tuổi trung bình

của nhóm bệnh nhân là: 51,14 tuổi; bệnh nhân ít tuổi nhất là: 31 tuổi; bệnh nhân

nhiều tuổi nhất là: 65 tuổi. Các bệnh nhân có chỉ số BMI trung bình là: 21,67 tức là

BMI của bệnh nhân ở mức bình thường và trong nhóm bệnh nhân chỉ có 14% bệnh

nhân bị tăng huyết áp. Nhóm bệnh nhân có số lượng nữ nhiều hơn nam là 1,43%.

Trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu: chỉ số INR1 (INR trung bình trong

tháng thứ 1 sau phẫu thuật), INR2 (INR trung bình trong tháng thứ 2 sau phẫu

thuật), INR3 (INR trung bình trong tháng thứ 3 sau phẫu thuật) đều nằm trong

khoảng mong đợi (INR<3,0).

3.2. Kết quả phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKOCR1

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Mẫu máu của bệnh nhân được bảo quản và mang đến phòng xét nghiệm gen

tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Tại đây chúng tôi thực hiện bước đầu

tiên trong quy trình xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 là tách chiết DNA tổng số (DNA tổng số bao gồm:

DNA trong nhân và DNA trong ty thể được tách từ máu toàn phần). Bước tách chiết

này là bước đầu tiên và cũng là quan trọng nhất để thu được DNA.

Để đánh giá được chất lượng DNA sau khi tách chiết từ mẫu máu chúng tôi

cần kiểm tra kết quả thu được bằng cách đo OD (đánh giá định lượng) mẫu DNA

vừa thu được bằng 2 cách:

- Kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 0,7%

với hiệu điện thế 100 V chạy trong 60 phút. Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu

cho băng điện di sáng rõ, có một băng duy nhất tương ứng với băng 23.1 kb của

Lambda DNA/HindIII Marker như hình 3.1 dưới đây.

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7%

Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker.

Làn 1-11: DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng.

Các băng điện di lên sáng rõ, các mẫu DNA tổng số đều lên một băng điện di

duy nhất (không có băng phụ), các băng điện di không bị đứt gãy, smear.

- Kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng cách đo quang sử dụng máy quang

phổ đo thể tích nano-Nano photometer NP88 (quy trình giống với quy trình kiểm tra

chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang ở mục 2.4.3.2).

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số

Chỉ số ̅ SD

Nồng độ DNA (ng/µl) 110,99 47,67

2,023 0,01 A260/280

Các mẫu DNA tổng số trong nghiên cứu có nồng độ trung bình là: 110,99

ng/µl và có độ tinh sạch cao (tỉ lệ của độ hấp thụ ở bước sóng A260/280 trung bình là:

2,023). Điều này chứng tỏ rằng, tất cả các mẫu DNA tổng số thu được đủ tiêu chuẩn

để tiếp tục sử dụng thực hiện phản ứng nhân dòng đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3

và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.

3.2.2. Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

3.2.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Chúng tôi tiến hành PCR với 10 nhiệt độ dao động quanh nhiệt độ gắn mồi

được hãng khuyến cáo. Đối chứng dương chúng tôi sử dụng 1 mẫu DNA trong đề

tài. Kết quả như sau:

 SNP CYP2C9*3

Hình 3.2. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP CYP2C9*3

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn (-): đối chứng âm, làn (+): đối chứng dương.

Từ khoảng nhiệt độ 50,8 - 56,600C xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu. Ở khoảng nhiệt độ từ 67,7 - 69,00C băng điện di giảm độ sáng hoặc không lên băng. Trong khoảng nhiệt độ 58,8-65,50C băng điện di lên đặc hiệu, không bị smear, đặc biệt là ở 63,30C băng điện di lên sáng r , đặc hiệu.

Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 là: 63,30C.

 SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Hình 3.3. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn (-): đối chứng âm, làn (+): đối chứng dương.

Ở khoảng nhiệt độ từ 50,8 - 63,30C băng điện di lên sáng rõ, tuy nhiên xuất hiện nhiều băng phụ, không đặc hiệu kèm theo. Còn tại nhiệt độ 67,20C băng điện di giảm độ sáng. Trong khoảng nhiệt độ từ 60,9 - 65,50C và tại nhiệt độ 69,00C băng

điện di lên sáng rõ, không bị smear, các băng điện di đặc hiệu, không xuất hiện các băng phụ. Đặc biệt là ở nhiệt độ 65,50C băng điện di lên sáng rõ, không có băng phụ

và không bị smear.

Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn

gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 là: 65,50C.

 SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Hình 3.4. Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn (-): đối chứng âm, làn (+): đối chứng dương Ở trong khoảng nhiệt độ từ 50,8 - 63,40C không xuất hiện các băng điện di, chỉ có các băng phụ hoặc smear. Tại nhiệt độ từ 65,9 - 70,40C băng điện di giảm độ sáng. Với nhiệt độ 73,50C không lên băng điện di. Tuy nhiên tại nhiệt độ 72,20C

băng điện di lên sáng, đặc hiệu, không bị smear hay đứt gãy.

Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu tối ưu cho phản ứng khuếch đại

đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 72,20C.

3.2.2.2. Tối ưu nồng độ mồi, nồng độ DNA cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa

SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Chúng tôi lần lượt thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi lần lượt là: 0,5;

0,7 và 0,9 µM.

Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ DNA được chọn

lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/µl.

Kết quả của phản ứng tối ưu nồng độ mồi và tối ưu nồng độ DNA cho phản

ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438

trên gen VKORC1 được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%

(quy trình điện di giống quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR ở mục

2.4.5.2).

 SNP CYP2C9*3

Hình 3.5. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.

Kết quả phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.4-A) ở cả 3 nồng độ mồi:

0,5; 0,7 và 0,9 µM các băng điện di đều lên sáng rõ, không bị smear, không xuất

hiện các băng phụ, băng điện di lên đặc hiệu.

Với phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.4-B) ở tất cả nồng độ DNA

được chọn: 5; 10; 50; 100 và 200 ng/µl các băng điện di đều lên sáng, không bị

smear, đứt gãy, không xuất hiện các băng phụ và băng điện di lên đặc hiệu. Tuy

nhiên băng điện di ở vị trí nồng độ DNA 100 ng/µl lên sáng rõ nhất.

Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP CYP2C9*3 là: 0,5 µM.

Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 là: 100 ng/µl.

 SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Hình 3.6. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.

Kết quả của phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.5-A): ở nồng độ mồi

0,7 và 0,9 µM băng điện di lên sáng tuy nhiên lại bị nhiều băng phụ. Còn ở nồng độ

mồi 0,5 µM băng điện di lên sáng r , đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ.

Tiếp theo chúng tôi thực hiện phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.5-

B) ở các nồng độ DNA: 5; 10 và 50 ng/µl các băng điện di lên mờ hoặc lên sáng

nhưng kèm nhiều băng phụ. Còn ở nồng độ DNA: 100 và 200 ng/µl các băng điện

di đều lên sáng rõ, không xuất hiện các băng phụ, không bị smear và băng điện di

lên đặc hiệu,

Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen

chứa SNP rs9923231 trên VKORC1 là: 0,5 µM.

Nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên

VKORC1 là: 100 ng/µ.

 SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Hình 3.7. Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100-4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm.

Kết quả của phản ứng PCR tối ưu nồng độ mồi (Hình 3.6-A): với nồng độ mồi

0,9 µM băng điện di không xuất hiện. Tại nồng độ mồi: 0,5 và 0,7 µM băng điện di

lên sáng, đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, không bị smear.

Chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng PCR tối ưu nồng độ DNA (Hình 3.6-B),

kết quả như sau: ở nồng độ DNA: 5; 10 và 50 ng/µl không xuất hiện băng điện di. Ở

nồng độ DNA: 100 và 200 ng/µl các băng điện di đều lên sáng rõ, đặc hiệu, không

xuất hiện các băng phụ.

Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 0,5 µM và nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng

khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là: 100 ng/µl.

Như vậy, chúng tôi chọn được nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại

đoạn gen chứa SNP cho cả 3 SNP trong nghiên cứu là: 0,5 µM. Nồng độ DNA tối

ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP cho cả 3 SNP trong nghiên cứu là:

100 ng/µl.

3.2.3. Kết quả phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Sau khi tiến hành tối ưu các điều kiện: nhiệt độ gắn mồi tối ưu, nồng độ mồi

tối ưu, nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1. Cùng với những

hoá chất cần thiết khác như: dNTP mix (2 mM), 5X HF buffer, phusion pol (2u/µl)

sử dụng theo nồng độ như khuyến cáo sử dụng của hãng. Ngoài ra còn có nước khử

ion (DDW) cũng là thành phần quan trọng tham gia quy trình khuếch đại đoạn gen

chứa các SNP trong nghiên cứu.

Chúng tôi đã xây dựng được quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 với các thành

phần và điều kiện phản ứng như trình bày dưới đây.

Bảng 3.3. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3

Nồng độ Thể tích 1 phản Thành phần hoạt động ứng (30 µl) Điều kiện phản ứng (Chu trình nhiệt)

DNA 100 ng/µl 1,5 µl

dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0 µl - Biến tính: 980C-3 phút.

5X HF buffer 1 X 6,0 µl - 35 chu kỳ:

Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

+ 980C-10 giây; + 63,30C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút. Phusion pol 2u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl

DDW 16,2 µl

Bảng 3.4. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen

VKORC1

Nồng độ Thể tích 1 phản Điều kiện phản ứng Thành phần hoạt động ứng (30 µl) (Chu trình nhiệt)

DNA 100 ng/µl 1,5 µl

dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0 µl - Biến tính: 980C-3 phút.

- 35 chu kỳ: 5X HF buffer 1 X 6,0 µl

Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

Phusion pol, 2 u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl + 980C-10 giây; + 65,50C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút.

DDW 16,2 µl

Bảng 3.5. Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen

VKORC1

Nồng độ Thể tích 1 phản Điều kiện phản ứng Thành phần hoạt động ứng (30 µl) (Chu trình nhiệt)

DNA 100 ng/µl 1,5 µl

dNTP mix, 2 mM 0,2 mM 3,0 µl - Biến tính: 980C-3 phút.

- 35 chu kỳ: 5X HF buffer 1 X 6,0 µl

Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl

+ 980C-10 giây; + 72,20C-30 giây; + 720C-30 giây - Kết thúc: 720C-2 phút. Phusion pol 2, u/µl 0,02 u/µl 0,3 µl

DDW 16,2 µl

Áp dụng quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu cho

100 mẫu bệnh nhân trong nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy đã khuếch đại thành công

đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9934438, rs9923231 trên gen VKORC1.

Điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% (quy trình

điện di tương tự quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR mục 2.4.5.2).

Hình 3.8. Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP

CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438

Làn (M): Marker 100-4 kb Plus.

Làn 1, 2, 3: sản phẩm phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 của bệnh nhân: Đt 01.

Làn 4,5,6: Đối chứng âm.

Trên gel điện di, các mẫu DNA tạo thành một băng duy nhất, rõ nét, không có

băng phụ, không bị smear. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 điện di cho băng có kích thước: 719 bp. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 điện di cho băng có kích thước: 771

bp. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1

điện di cho băng có kích thước: 714 bp.

Kết quả cho thấy các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng khuếch đại đoạn

gen chứa các SNP trong nghiên cứu là đặc hiệu, các yếu tố cần thiết khác của phản

ứng khuếch đại đoạn gen chứa các SNP trong nghiên cứu đã được tối ưu tốt. Các

sản phẩm PCR của các SNP trong nghiên cứu đủ điều kiện để sử dụng cho quy trình

giải trình tự và RFLP tiếp theo.

3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1

3.2.4.1. Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 bằng phương pháp giải trình tự

SNP CYP2C9*3 không có vị trí cắt đặc hiệu, do đó không thể dùng phương

pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP này. Nên đối với SNP này chúng tôi chỉ

dùng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen.

Dùng 25 µl sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa SNP CYP2C9*3 lên băng điện

di đặc hiệu, có nồng độ tối thiểu là 20 ng/µl, tinh sạch và gửi giải trình tự tại hãng

First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được mở bằng phần mềm BioEdit

version 7.1.9, dựa vào ảnh giải trình tự thu được, chúng tôi s xác định được kiểu

gen của SNP CYP2C9*3.

Trình tự vùng gen chứa SNP CYP2C9*3 là:

GTGGTGCACGAGGTCCAGAGATAC[A/C]TTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGC

Hình 3.9. Kết quả giải trình tự SNP CYP2C9*3

Hình A. Kiểu gen AA, Hình B. Kiểu gen AC

Đối với SNP CYP2C9*3 kết quả giải trình tự gen thể hiện qua hình ảnh giải

trình tự: các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không có tín hiệu

nhiễu, kết quả các kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử AA và kiểu gen dị hợp tử AC.

Trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy xuất hiện bệnh

nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CC.

3.2.4.2. Kết quả phân tích kiểu gen SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 bằng phương pháp RFLP, đối chiếu với phương pháp giải trình tự

 Kết quả xác định kiểu gen SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 bằng phương pháp RFLP

Phân tích kiểu gen sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9923231 và SNP

rs9934438 trên gen VKORC1. Vì hai SNP này có vị trí cắt đặc hiệu với enzym cắt

giới hạn. Sản phẩm sau khi PCR s được tinh sạch và pha loãng hoặc cô đặc để đạt

nồng độ 40 - 50 ng/µl và tiến hành RFLP theo quy trình đã được tối ưu (Bảng 2.2 và

Bảng 2.3).

Kết quả sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 được kiểm tra bằng phương pháp điện di (quy trình điện di tương tự với

quy trình điện di kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR mục 2.4.5.2). Kết quả kiểu gen

được đọc dựa trên ảnh điện di.

- SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Hình 3.10. Sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100 - 4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm

Kết quả RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: hình ảnh các băng điện

di r n t, đặc hiệu. Kết quả điện di cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen là đặc hiệu,

các yếu tố của phản ứng cắt đã được tối ưu tốt. Kết quả RFLP cho 3 kiểu gen:

+ Kiểu gen đồng hợp tử (AA) cho một băng điện di duy nhất kích thước: 771 bp.

+ Kiểu gen đồng hợp tử (GG) điện di cho hai băng có kích thước: 493 và 278 bp.

+ Kiểu gen dị hợp tử (AG) cho ba băng điện di có kích thước: 771; 493 và 287 bp.

- SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Hình 3.11. Sản phẩm RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Làn M: Marker 100 - 4 kb Plus, làn ĐC-: đối chứng âm

Kết quả RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: hình ảnh điện di cho

thấy các băng điện di rõ nét, không bị smear. Như vậy, enzym cắt sử dụng là đặc

hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt đã được tối ưu tốt. Kết quả RFLP cho ba kiểu gen:

+ Đồng hợp tử (AA) điện di cho hai băng kích thước: 417 và 297 bp.

+ Kiểu gen đồng hợp tử (GG) điện di cho một băng có kích thước: 714 bp.

+ Kiểu gen dị hợp tử (AG) điện di cho ba băng có kích thước: 714; 417 và 297 bp.

 Kết quả giải trình tự SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 đều có thể phân tích kiểu

gen bằng phương pháp giải trình tự gen. Dùng 25 µl sản phẩm PCR của phản ứng

nhân vùng gen chứa SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 lên băng

điện di đặc hiệu, có nồng độ tối thiểu là 20 ng/µl, tinh sạch và gửi giải trình tự tại

hãng First Base (Malaysia) Kết quả giải trình tự gen được mở bằng phần mềm

BioEdit version 7.1.9, để đọc được kết quả kiểu gen chúng tôi dựa vào ảnh giải trình

tự thu được.

- Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Trình tự vùng gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 là:

CCATTGGCC[A/G]GGTGCGGTGG.

Hình 3.12. Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Hình A. Kiểu gen AA, Hình B. Kiểu gen AG, Hình C. Kiểu gen GG

Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1 được thể hiện qua ảnh

giải trình tự: sản phẩm giải trình tự rõ nét, các đỉnh màu tương ứng với các

nucleotide rõ ràng, không có tín hiệu nhiễu. Kết quả giải trình tự gen xác định được

ba kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG, kiểu gen dị hợp tử: AG, kiểu gen

đồng hợp tử kiểu dại: AA.

- Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Trình tự vùng gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 là:

CCGACCTCCCATCCTAGTCCAAG[A/G]GTCGATGATCTCCCTGGCACCGG

Hình 3.13. Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Hình A. Kiểu gen AA, Hình B. Kiểu gen AG, Hình C. Kiểu gen GG

Kết quả giải trình tự gen SNP rs9934438 trên gen VKORC1 được thể hiện qua

ảnh giải trình tự: sản phẩm giải trình tự r n t. Các đỉnh màu tương ứng với các

nucleotide rõ ràng và không có tín hiệu nhiễu. Kết quả giải trình tự gen xác định

được ba kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG, kiểu gen dị hợp tử: AG và

kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA.

So sánh kết quả xác định kiểu gen của hai SNP rs9923231, SNP rs9934438

trên gen VKORC1 ở 20 mẫu nghiên cứu đầu tiên sử dụng phương pháp giải trình tự

gen và phương pháp RFLP chúng tôi nhận thấy kiểu gen của cả 20 mẫu này đều

tương đồng hoàn toàn khi thực hiện xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP và

phương pháp giải trình tự gen. Mặc dù phương pháp giải trình tự gen được coi là

tiểu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đa hình thái đơn gen (SNP). Tuy nhiên,

thực hiện phương pháp này đòi hỏi chi phí cao và tốn nhiều thời gian. Do đó, chúng

tôi s sử dụng phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 với các mẫu tiếp theo trong nghiên cứu để giảm chi

phí, tiết kiệm thời gian cho bệnh nhân và giảm thời gian cho nghiên cứu.

3.3. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

3.3.1. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3

Sau khi phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 bằng phương pháp PCR-GTT.

Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen như sau:

Bảng 3.6. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3

Số lƣợng kiểu gen trên SNP Tần số phân bố alen từng alen (%)

p-value CC AC AA A C (Chi-square test) rs1057910 (n=100)

0 4% 96% 0,98 0,02 0,84

Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 (với n=100) cho

kết quả: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA chiếm tỉ lệ 96% và chỉ có 4% bệnh nhân

mang kiểu gen dị hợp tử AC. Trong nghiên cứu này của chúng tôi cũng chưa xuất

hiện kiểu gen đồng hợp tử đột biến CC.

Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3: alen C (0,02) chiếm tỉ lệ rất thấp so với

alen A (0,98).

3.3.2. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP

rs9934438 trên gen VKORC1

Sau khi tiến hành phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438

trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR-RFLP cho các mẫu bệnh nhân còn lại

trong nghiên cứu. Chúng tôi thu được kết quả: tần số phân bố alen, kiểu gen của

SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1.

Bảng 3.7. Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP

rs9934438 trên gen VKORC1

Số lƣợng kiểu gen trên Tần số phân bố alen từng alen (%)

SNP p-value GG AG AA G A (chi-square)

rs9923231(n=100) 1% 32% 67% 0,17 0,83 0,18

rs9934438(n=100) 3% 11% 86% 0,075 0,925 0,0034

Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1:

tỷ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA và dị hợp tử AG lần lượt

là 67% và 32%. Trong khi đó bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG

chỉ chiếm tỉ lệ 1% trong nghiên cứu này.

Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1:

tỉ lệ nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại: AA trong nghiên cứu của chúng tôi

chiếm đến 86%, còn lại 11% bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AG và tỉ lệ bệnh

nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: GG chỉ chiếm 3% trong nghiên cứu của

chúng tôi.

Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: alen A chiếm tỉ lệ

cao (0,83) so với alen G (0,17).

Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: alen A chiếm tỉ lệ

cao (0,925) so với alen G (0,075).

3.4. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1

AG+GG 2%

AG+AG 11%

AG+AA 19%

GG+AA 1%

AA+AA 67%

Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438

trên gen VKORC1

Kết quả kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1: người mang kiểu gen AA+AA chiếm tỷ lệ cao nhất là 67%. Các kiểu gen

GG+AA, AG+GG chỉ chiếm số lượng rất ít với tỷ lệ lần lượt là 1% và 2%.

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

Acenocoumarol là thuốc chống đông máu đường uống thuộc nhóm AVK được

sử dụng khá phổ biến trong: phòng ngừa, điều trị huyết khối động mạch và tĩnh

mạch ở bệnh nhân sau thay van tim cơ học [3]. Tuy nhiên, thuốc có giới hạn điều trị

rất hẹp nên gây ra nhiều biến chứng khi không sử dụng đúng liểu lượng: nếu bệnh

nhân sử dụng liều acenocoumarol quá liều s gây biến chứng xuất huyết, nghiêm

trọng nhất là xuất huyết não, nếu bệnh nhân sử dụng liều thuốc ở dưới liều cần dùng

thì lại gây biến chứng huyết khối như tắc mạch và kẹt van, đây là một trong những

nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở bệnh nhân sau thay van tim [3]. Yếu tố di

truyền và môi trường được dự tính đóng vai trò quyết định liều thuốc tối ưu cho mỗi

cá nhân. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh ảnh hưởng của đa hình di

truyền gen CYP2C9 và gen VKORC1 có ảnh hưởng đến việc tiên lượng và quyết

định liều lượng sử dụng thuốc chống đông máu acenocoumarol cho từng bệnh nhân

[25][113].

Gen VKORC1 mã hóa cho enzym Vitamin K epoxide reductase 1 là enzym

đích tác dụng của thuốc acenocoumarol, enzym này chịu trách nhiệm chuyển hóa

vitamin K dạng oxy hóa thành vitamin K dạng khử. Sự hiện diện của các biến thể

của gen VKORC1 gây nguy cơ cao quá liều thuốc, trong trường hợp này nên sử

dụng liều thuốc thấp hơn để có thể đạt được khoảng INR trong giới hạn đích điều trị

(2,0 - 3,5) [20]. Do vậy, việc xác định các alen đột biến của gen này rất hữu ích cho

việc lựa chọn liều thuốc phù hợp với từng cá thể người bệnh mang lại hiệu quả điều

trị đồng thời hạn chế các biến chứng nguy hiểm cho bệnh nhân.

Alen đa hình của gen CYP2C9 được chứng minh có liên quan tới việc gia

tăng gấp đôi nguy cơ chảy máu so với alen kiểu dại. Mặc dù có ít công bố về mối

liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 với liều thuốc acenocoumarol, một

số các nghiên cứu cũng chỉ ra mối liên quan giữa kiểu gen CYP2C9*3 và nguy cơ

chảy máu gây ra bởi acenocoumarol. Sự hiện diện của một alen CYP2C9*3 làm

giảm sự chuyển hóa bình thường của dạng S-acenocoumarol, dạng có tác dụng

lâm sàng và do đó làm tăng thời gian bán hủy của enantiomer này [49][67]. Có

nghĩa là liều acenocoumarol cần thiết ở người mang alen *3 thấp hơn ở người

mang alen kiểu dại khoảng 19 - 35% [35][62] và thấp hơn người mang alen *2

khoảng 13 - 15% [66].

Tại Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di truyền học liên quan

tới việc chỉ định liều dùng thuốc acenocoumarol sử dụng cho bệnh nhân sau thay

van tim được thực hiện. Do đó, chúng tôi muốn xây dựng quy trình phân tích đa

hình gen CYP2C9 và VKORC1 trên mẫu máu bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc

chống đông acenocoumarol nhằm xác định và đánh giá tần số phân bố alen, kiểu

gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, rs9934438 trên gen VKORC1.

4.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu: tuổi trung bình của bệnh nhân là

51,14 tuổi, độ tuổi phân bố rộng từ 31 tuổi đến 66 tuổi. Lứa tuổi nhỏ hơn 15 tuổi

không ghi nhận, có thể do nhóm này được khám và điều trị chuyên khoa nhi. Tỷ lệ

bệnh nhân nữ chiếm ưu thế (nữ/nam: 1,43%). Chỉ số IBM của nhóm bệnh nhân

tham gia nghiên cứu đều ở mức bình thường (IBM = 21,67 2,85). Tỷ lệ bệnh nhân

mắc tăng huyết áp chỉ chiếm 14% trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Và

100% bệnh nhân đều có INR nằm trong khoảng INR mục tiêu (INR<3).

Lý do nhập viện và các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân phong phú, đa dạng,

các triệu chứng được ghi nhận như sau: tăng áp động mạch phổi, khó thở khi gắng

sức, đau tức ngực, rối loạn nhịp tim, uể oải do cung lượng tim giảm thấp, ngất.

Trong đó triệu chứng bệnh nhân bị tăng áp động mạch phổi chiếm 22%. Có nhiều

nguyên nhân dẫn đến phải phẫu thuật thay van tim như: bệnh lý viêm nội tâm mạc,

bệnh lý thoái hoá van, bệnh lý thấp tim và những nguyên nhân khác. Tuy nhiên

trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu của chúng tôi có đến 72% bệnh nhân thay van

tim nguyên nhân là do tiền sử bệnh lý thấp tim và chỉ có 6% bệnh nhân thay van tim

do nguyên nhân bệnh lý viêm nội mạc tâm thất.

4.2. Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên

gen VKORC1

Ngày nay, kinh tế và đời sống của con người ngày càng phát triển và nâng cao

đi đôi với nó là lĩnh vực sức khỏe cũng được quan tâm nhiều hơn. Những kĩ thuật

giúp phát hiện sớm bệnh và sử dụng những phương pháp điều trị tiên tiến nhằm

giảm chi phí và điều trị trúng đích ngày càng được chú trọng hơn. Y sinh học phân

tử ra đời nhằm hỗ trợ việc xác định chính xác căn nguyên bệnh và từ đó đưa ra liệu

pháp điều trị đích phù hợp. Với kỹ thuật này, ngày nay chúng ta có thể phân tích

một đoạn gen bất kì nào đó để phát hiện những bất thường, các dấu hiệu, nguy cơ

bệnh tật từ đó có thể đưa ra chẩn đoán sớm và có cách điều trị phù hợp.

Để xác định các kiểu gen của từng alen, bệnh nhân cần trải qua quá trình tiến

hành xét nghiệm bằng cách lấy mẫu máu bệnh nhân, bảo quản trong ống có chứa

chất chống đông EDTA. Mẫu được bảo quản theo tiêu chuẩn và chuyển đến phòng

xét nghiệm để tiến hành quy trình xác định kiểu gen. Đầu tiên, mẫu sinh phẩm của

bệnh nhân s được tách DNA tổng số, đây là khâu đầu tiên và rất quan trọng vì chất

lượng sản phẩm DNA có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của các kĩ thuật y sinh học

phân tử tiếp theo. Sản phẩm DNA sau khi được tách chiết phải có nồng độ đảm bảo,

độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy, không nhiễm tạp. Để kiểm tra chất lượng sản

phẩm DNA tổng số, chúng tôi sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang để đánh

giá định lượng. Bước tiếp theo của nghiên cứu là khuếch đại đoạn gen chứa SNP

CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1.

Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã

được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả như: kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới

hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), giải trình tự gen, kỹ thuật

sử dụng đầu dò DNA (DNA-probe). Tuy nhiên, trong số đó, PCR-RFLP và giải trình

tự gen là hai phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi sử dụng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Quy trình PCR đã được tối

ưu tốt và sản phẩm thu là: đoạn gen dài 719 bp chứa SNP CYP2C9*3, đoạn gen dài

771 bp chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 và đoạn gen dài 714 bp chứa SNP

rs9934438 trên gen VKORC1. Sử dụng sản phẩm PCR thu được, chúng tôi tiếp tục

tinh sạch và xác định nồng độ DNA trước khi thực hiện gửi giải trình tự và RFLP.

Trong các mẫu nghiên cứu của chúng tôi khi tiến hành xác định kiểu gen của

SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp giải trình

tự gen đều cho kết quả ba loại kiểu gen: đồng hợp tử đột biến: GG, dị hợp tử: AG

và đồng hợp tử kiểu dại: AA. Trong khi đó, khi xác định kiểu gen của SNP

CYP2C9*3 bằng phương pháp giải trình tự gen thì chỉ cho kết quả hai kiểu gen:

đồng hợp tử kiểu dại: AA và dị hợp tử: AC (không thấy xuất hiện bệnh nhân nào

mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến: CC).

Mặc dù phương pháp giải trình tự gen vẫn là tiêu chuẩn vàng để xác định các

đột biến điểm. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự gen đòi hỏi chi phí cao, thời

gian thực hiện lâu. Vì vậy, ngoài phương pháp giải trình tự gen, chúng tôi xác định

kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp

RFLP vì cả hai SNP này đều có vị trí cắt đặc hiệu với enzyme cắt tương ứng là

Msp1 và HinfI. Còn SNP CYP2C9*3 không có vị trí cắt đặc hiệu nên chúng tôi chỉ

sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định kiểu gen của SNP này.

Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9923231 trên gen VKORC1 cho kết

quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (AA), kiểu gen đồng hợp tử đột biến

(GG), kiểu gen dị hợp tử (AG).

Sử dụng phương pháp RFLP với SNP rs9934438 trên gen VKORC1 cho kết

quả kiểu gen: kiểu gen đồng hợp tử đột biến (GG), kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại

(AA) và kiểu gen dị hợp tử (AG).

Thực hiện so sánh và đối chiếu kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp

giải trình tự gen và kỹ thuật RFLP trên 20 bệnh nhân đầu với SNP rs9923231 và

rs9934438 trên gen VKORC1 chúng tôi nhận thấy cả hai kĩ thuật xác định kiểu gen

này đều cho kết quả như nhau. Trong đó, kỹ thuật RFLP thao tác đơn giản, chi phí

rẻ và thời gian xác định được kiểu gen nhanh hơn. Do đó, tất cả các mẫu bệnh nhân

trong nhóm nghiên cứu còn lại chúng tôi đều sử dụng phương pháp RFLP để xác

định kiểu gen của SNP rs9923231 và rs9934438 trên gen VKORC1.

Kết quả phân tích gen của chúng tôi có sự tương đồng với các nghiên cứu

trước đó. Với gen CYP2C9 nghiên cứu của nhiều tác giả sử dụng phương pháp giải

trình tự sử dụng cặp mồi nhân dòng khác nhau [24][33]. Với gen VKORC1, ngoài

phương pháp giải trình tự gen trực tiếp thì đa số các nghiên cứu của các nhóm tác

giả khác đều sử dụng phương pháp RFLP [31]. Nghiên cứu của tác giả Harrington

và cs (2008) từ Vương Quốc Anh cũng sử dụng enzym cắt Hinf để xác định trình tự

của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 [37]. Và nghiên cứu của tác giả Chua Y.A et

al (2015) tại Malaysia cũng sử dụng enzym Msp1 để cắt SNP rs9923231 trên gen

VKORC1 [112]. Kết quả nghiên cứu của những nhóm tác giả này cũng tương đồng

so với kết quả nghiên cứu này của chúng tôi.

4.3. Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934348 trên gen VKORC1

Trong nghiên cứu của chúng tôi SNP CYP2C9*3 được xác định kiểu gen bằng

phương pháp giải trình tự gen. Còn SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen

VKORC1 được xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP. Kết quả xác định kiểu

gen của 3 đa hình như sau:

 SNP CYP2C9*3

Với SNP CYP2C9*3 kết quả nghiên cứu với cỡ mẫu n=100 của chúng tôi cho

thấy: có tới 96% bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA và chỉ có 4%

bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AC, đặc biệt trong nhóm bệnh nhân tham gia

nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy xuất hiện bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp

tử đột biến CC.

Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3: alen C chiếm tỉ lệ rất thấp (0,02) so

với alen A (0,98).

Biểu đồ 4.1. Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 ở một số quần thể người

khác nhau

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6040167/)

Tần số alen C xuất hiện rất ít ở các quần thể người ở các quốc gia như:

Swendish (0,007%), Việt Nam (trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ thấy xuất hiện

tần số alen C là 2%). Tuy nhiên, tần số alen C lại xuất hiện nhiều hơn ở các quần

thể người như ở German (5%), Caucasian (5,8%). Như vậy có thể kết luận được

rằng sự phân bố alen của SNP CYP2C9*3 phụ thuộc vào sự khác nhau giữa các khu

vực, các quốc gia, chủng tộc.

 SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Với SNP rs9923231 trên gen VKORC1 kết quả xác định kiểu gen của SNP này

ch ba kiểu gen: trong đó tỉ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA

chiếm tới 67%, tỉ lệ bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AG chiếm 32% và bệnh

nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến GG chỉ chiếm 1%.

Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1: tần số phân bố

alen A chiếm tỉ lệ cao hơn so với alen G (A/G) = 0,83/0,17.

Biểu đồ 4.2. Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau

(Nguồn: https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-

molecular-biology/vkorc1)

Tần số phân bố alen A xuất hiện rất cao ở 1 số quần thể người thuộc khu vực

Châu Á trong đó có Việt Nam (trong nghiên cứu của chúng tôi tần số alen A xuất

hiện trên 80%), Chinese (91%). Trong khi đó các quốc gia khác như: Swendish,

Caucasian và German tần số alen A chỉ dưới 42%. Như vậy có thể kết luận được

rằng sự phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 phụ thuộc nhiều vào

từng khu vực, chủng tộc khác nhau trên thế giới.

 SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Với SNP rs9934438 trên gen VKORC1 kết quả kiểu gen của SNP này xác định

được ba kiểu gen khác nhau: tỉ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến

GG chỉ chiếm 3%, ngược lại tỉ lệ bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại

AA lại chiếm tới 86% và số bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử AG chiếm 11%.

Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1: tần số alen G

chiếm tỉ lệ rất thấp so với tần số alen A (A/G) = 0,925/0,075.

Biểu đồ 4.3. Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau

(Nguồn: https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-

molecular-biology/vkorc1)

SNP rs9934438 trên gen VKORC1: tần số phân bố alen A trong quần thể

người thuộc khu vực các nước Châu Á trong đó có Việt Nam có tỉ lệ rất cao (trong

nghiên cứu của chúng tôi tần số alen A chiếm đến > 90% dân số). Trong khi đó các

nước khác như: Swendish, German lại có tần số alen A thấp (chỉ < 42%). Như vậy,

ta có thể kết luận rằng sự phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 phụ

thuộc nhiều vào các khu vực, quốc gia và các chủng tộc khác nhau.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu thực hiện trên 100 bệnh nhân sau thay van tim sử dụng thuốc

chống đông acenocoumarol tại Bệnh viện Tim Hà Nội từ tháng 6/2017 - 2/2018.

Sau khi thực hiện đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1. Xây dựng thành công quy trình phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3

và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở mẫu máu bệnh nhân thay van

tim sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol tại Bệnh viện Tim Hà Nội.

2. Đánh giá tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

- SNP CYP2C9*3:

+ Số lượng kiểu gen: AA = 96%, AC = 4%

+ Tần số phân bố alen: A/C: 0,98/0,02

+ p-value = 0,84.

- SNP rs9923231 trên gen VKORC1:

+ Số lượng kiểu gen: AA = 67%, AG = 32%, GG =1%

+ Tần số phân bố alen: A/G: 0,83/0,17

+ p-value = 0,18.

- SNP rs9934438 trên gen VKORC1:

+ Số lượng kiểu gen: AA = 86%, AG = 11%, GG = 3%

+ Tần số phân bố alen: A/G: 0,925/0,075

+ p-value = 0,0034

Tần số phân bố các alen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 phụ thuộc nhiều vào các khu vực, quốc gia và chủng

tộc khác nhau trên thế giới.

KIẾN NGHỊ

Để các bác sĩ lâm sàng có thể dễ dàng hơn trong việc đưa ra liều dùng thuốc

chống đông máu acenocoumarol phù hợp, hiệu quả cao, ít biến chứng cho từng

bệnh nhân. Cũng là nhằm tiết kiệm chi phí điều trị cũng như giảm các biến chứng

của bệnh nhân sau khi thay van tim và phải sử dụng thuốc chống đông máu suốt

đời. Dựa vào kết quả nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị

như sau:

- Quy trình phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP

rs9934438 trên gen VKORC1 trên mẫu máu bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc

chống đông acenocoumarol đã được chúng tôi xây dựng thành công và có thể áp

dụng quy trình phân tích đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1 này rộng rãi tại các

cơ sở y tế, phòng thí nghiệm phân tích gen hoặc các bệnh viện có nhu cầu.

- Khi tiến hành xét nghiệm xác định kiểu gen của SNP rs9923231 trên gen

VKORC1 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1, nên sử dụng phương pháp RFLP

để tiết kiệm chi phí cho người bệnh đồng thời cũng có thể trả kết quả xét nghiệm

nhanh hơn cho bác sĩ điều trị, tiết kiệm thời gian nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bệnh viện Trung ương Quân Đội 108 (2018), Bệnh lý van tim, Hà Nội.

2. Bệnh viện Tim Tâm Đức (2011), Chuyên đề thuốc kháng đông, TP HCM.

3. Nguyễn Thuỳ Châu (2016), Sử dụng thuốc kháng vitamin K trong điều trị

ngoại trú.

4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội.

5. Đặng Hanh Đệ (2007), Mổ tim: những điều cần biết, NXB Y Học, Hà Nội.

6. Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Họ i tim mạch Viẹ t Nam về chẩn

đoán điều trị các bẹ nh van tim, Hà Nội.

7. Nguyễn Quốc Kính và Lê Ngọc Thành (2006), Bu ớc đầu nghiên cứu đặc điểm

lâm sàng, chẩn đoán và xử trí tắc ngh n van tim co học do huyết khối , ạp ch

học iẹ t Nam, 323(6), tr.9-16.

8. Nguyễn Quốc Kính và Tạ Mạnh Cu ờng (2011), Đánh giá hiẹ u quả điều trị

bằng thuốc chống đông kháng vitamin K ở bẹ nh nhân sau thay van tim co

học , ạp ch học iẹ t Nam, 2, tr. 44-46.

9. Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu (1972), Enzym I,II, NXB Đại Học Tổng

Hợp, Hà Nội.

10. Hồ Thị Thiên Nga (2009), Theo d i điều trị kháng vitamin K ở bẹ nh nhân

sau mổ thay van tim co học tại bẹ nh viẹ n Viẹ t Đức , ạp ch học iẹ t

nam, 355(2), tr. 72-76.

11. Hoàng Quốc Toàn, Ngô Vi Hải, Ngô Tuấn Anh và các cọ ng sự (2011), "Đánh

giá kết quả phẫu thuạ t thay van tim nhân tạo tại Bẹ nh viẹ n TWQĐ 108",

Các biến chứng và các yếu liên quan tới viẹ c sử d ng thuốc chống đông.

12. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học

Hà Nội, Hà Nội.

13. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR - Các vấn đề cơ bản và các

ứng d ng thường gặp, NXB Y học Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố

Hồ Chí Minh.

14. Nguyễn Lân Việt và cộng sự (2014), Thực hành bệnh tim mạch, NXB Y học,

Hà Nội.

TIẾNG ANH

15. Vignal A., Milan D., SanCristobal M. et al (2002), "A review on SNP and

other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics,

selection, evolution, 34(3), p. 275-305.

16. Elbardissi A. W., Wiegmann D. A., Dearani J. A. et al (2007), "Application of

the human factors analysis and classification system methodology to the

cardiovascular surgery operating room", Ann Thorac Surg, 83(4), pp. 1412-

8; discussion 1418-9.

17. Garcia A. A., Reitsma P. H. (2008), " VKORC1 and the vitamin K cycle",

Vitamins and Hormones, 78, pp. 23-33.

18. Camm A. J., Lip G. Y., De Caterina R. et al (2012)," Focused update of the

ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation: an update of the

2010 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation. Developed

with the special contribution of the European Heart Rhythm Association",

Euro Heart, 33(21), pp. 2719-47.

19. Stuart A. S., Katrin S., Alan R. S. et al (2012), "PharmGKB summary: very

important pharmacogene information for cytochrome P450, family 2,

subfamily C, polypeptide 19", Pharmacogenet Genomics, 22(2), p. 159-65.

20. Samuel A. Y. (2014), CYP2C9, VKORC1 and CYP4F2 variant frequencies in

patients on either low or high stable wafarin maintenance therapy in the

ghanaian population. University of Ghana. Master thesis.

21. Trailokya Abhijit, Hiremath J. S., Sawhney J. P. S. et al (2016),

"Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety", Journal

of The Association of Physiccian of India, 64(2), pp. 88-93.

22. Annabel Blasi, Guido Muñoz, Ines de Soto et al (2015), "Reliability of

thromboelastometry for detecting the safe coagulation threshold in patients

taking acenocoumarol after elective heart valve replacement", Thrombosis

Research, 136(3), p. 669-672.

23. Markatos C. N., Grouzi E., Politou M. et al (2016), "VKORC1 and CYP2C9

allelic variants in fluence acenocoumarol dose requirements in Greek

patiens", Future Medicine, p.1631-1638.

24. Tassies D., Freire C., Pijoan J. et al (2002), "Pharmacogenetics of

acenocoumarol: cytochrome P450 CYP2C9 polymorphisms influence dose

requirements and stability of anticoagulation", Haematologica, 87(11), p.

1185-91.

25. Harrington D. J., Gorska R., Wheeler R. et al (2008), "Pharmacodynamic

resistance to warfarin is associated with nucleotide substitutions in

VKORC1", J Thromb Haemost, 6(10), pp. 1663-70.

26. Van Booven D., Sharon M., Howard M. et al (2010), "Cytochrome P450 2C9-

CYP2C9", Pharmacogenet Genomics, 20(4), pp. 277-81.

27. Butchart E. G., Payne N., Li H. H. et al (2002), "Better anticoagulation control

improves survival after valve replacement", J Thorac Cardiovasc Surg,

123(4), pp. 715-723.

28. Alan F. Jones. (n.d.), Role of the Liver in Metabolism - Medical Biochemistry.

Available at: http://doctorlib.info/medical/biochemistry/32.html [Accessed

29 May 2018].

29. D'Andrea G., D'Ambrosio R. L., Di Perna P., Chetta M. et al (2005). "A

polymorphism in the VKORC1 gene is associated with an interindividual

variability in the dose-anticoagulant effect of warfarin", Blood, 105(2), pp.

645-649.

30. Johanna H. H., Andre B. D., Leandra J. M. et al (2005), "Preanalytical

Variables and off-site Blood Collection: Influeces on the Results of the

Prothrombin Time/International Normalized Ratio Test and Implications

for Monitoring of Oral Anticoagulant Therapy", Clinical Chemistry, 51(3),

pp. 561-568.

31. Yuan H. Y., Chen J. J., Lee M. T. et al (2005), " A novel functional VKORC1

promoter polymorphism is associated with inter-individual and inter-ethnic

differences in warfarin sensitivity", Hum Mol Genet, 14(13), pp. 1745-51.

32. Thijssen H. H., Drittij M. J., Vervoort L. M., de Vries-Hanje J. C. (2001),

"Altered pharmacokinetics of R- and S-acenocoumarol in a subject

heterozygous for CYP2C9*3", Clin Pharmacol Ther, 70(3), pp. 292-8.

33. Neth Heart. Anticoagulation in patients with mechanical heart valves: follow

the guidelines! 2015 Feb; 23(2): 109-110.

34. Kirchheiner J., Ufer M., Walter E. C. et al (2004), "Effects of CYP2C9

polymorphisms on the pharmacokinetics of R- and S-phenprocoumon in

healthy volunteers", Pharmacogenetics, 14(1), pp. 19-26.

35. Ansell J., Hirsh J., Poller L. et al (2005), "The pharmacology and management

of the vitamin K antagonists", Chest, 126(3), pp. 2045-2335.

36. Turka J. (2005), "Understanding international normalized ratio (INR)",

Nursing, 35(8), pp.18-19.

37. Ansell J., Hollowell J., Pengo V. et al (2007), "Descriptive analysis of the

process and quality of oral anticoagulation management in real-life practice

in patients with chronic non-valvular atrial fibrillation: the international study

of anticoagulation management (ISAM)", J Thromb Thrombolysis, 23(2),

pp.83-91.

38. Ansell J., Hirsh J., Hylek E. et al (2008), "Pharmacology and management of

the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-

Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)", Chest, 133(6): 160S.

39. Dunning Joel, Versteegh M., Fabbri A. et al (2008), "Guideline on antiplatelet

and anti coagulation management in cardiar surgery", European Journal of

Cardithorac Surgery, 34(1), pp. 73-92.

40. Cadamuro J., Dieplinger B., Felder T. et al (2010), "Genetic Pharmacogenetic-

guided dosing of coumarin anticoagulants", Eur J Clin Pharmacol, 66, p.

253-60.

41. Demirkan K., Stephens M. A., Newman K. P., Self T. H. (2000), "Response to

warfarin and other oral anticoagulants: effects of disease states", South Med

J, 93(5), pp. 448-54.

42. Lund K., Gaffney D., Spooner R. et al (2012), "Polymorphisms in VKORC1

have more impact than CYP2C9 polymorphisms on early warfarin

International Normalized Ratio control and bleeding rates", Br J Haematol,

158(2), p. 256-61.

43. Cohn L. H. (1993), "The first successful surgical treatment of mitral stenosis:

the 70th anniversary of Elliot Cutler's mitral commissurotomy", Ann Thorac

Surg, 56(5), pp. 1187-90.

44. Visser L. E., van Schaik R. H. et al (2004), "The risk of bleeding complications

in patients with cytochrome P450 CYP2C9*2 or CYP2C9*3 alleles on

acenocoumarol or phenprocoumon", Thromb Haemost, 92(1), p. 61-6.

45. Visser L. E., van Vliet M., van Schaik R. H. et al (2005). "Allelic variants of

cytochrome P450 2C9 modify the interaction between nonsteroidal anti-

inflammatory drugs and coumarin anticoagulants", Clin Pharmacol Ther,

77(6), pp. 479-85.

46. Poller L., Keown M., Chauhan N. et al (2005), "European concerted action on

Anticoagulation. A multicentre calibration study of WHO international

reference preparations for thromboplastin, rabbit (RBT/90) and human

(rTF/95)". Journal Clinical Pathology, 58(6), pp. 667-9.

47. Salsali M., Holt A., Baker G. B. (2004), "Inhibitory effects of the monoamine

oxidase inhibitor tranylcypromine on the cytochromeP450 enzymes

CYP2C19, CYP2C9 and CYP2D6", Cellular and Molecular Neurobiology,

24(1), p. 63-76.

48. Kovac M. K., Maslac R. A., Rakicevic L. B. et al (2010), "The c.-1639G>A

polymorphism of the VKORC1 gene in Serbian population: retrospective

study of the variability in response to oral anticoagulant therapy", Blood

Coagulation and Fibrinolysis.

49. Esmerian M. O., Mitri Z., Habbal M. Z. et al (2011), "Influence of CYP2C9

and VKORC1 polymorphisms on warfarin and acenocoumarol in a sample

of Lebanese people", J Clin Pharmacol, 51(10), pp. 1418-28.

50. Shtyak Ahmed Mir (2015), "Role of Acenocoumarol In Prothestic Heart

Valves", Journal Of Intenational Medicine and Dentistry, 2(3), pp. 180-185.

51. Schork N. J., Fallin D., Lanchbury S. (2000), "Single nucleotide

polymorphisms and the future of genetic epidemiology", Clin Genet, 58(4),

p. 250-264.

52. Danielson P. B. (2002), "The cytochrome P450 superfamily: biochemistry,

evolution and drug metabolism in humans", Current Drug Metabolism, 3(6),

pp. 561-97.

53. Reitsma P. H., van der Heijden J. F., Groot A. P. et al (2005), "A C1173T

dimorphism in the VKORC1 gene determines coumarin sensitivity and

bleeding risk", PLoS Med, 2(10): e312.

54. Sullivan P. W., Arant T. W., Ellis S. L., Ulrich H. (2006), "The cost

effectiveness of anticoagulation management services for patients with atrial

fibrillation and at high risk of stroke in the U", Pharmacoeconomics, 24(10),

pp. 1021-33.

55. Eberhard Passarge (2007). Color Atlas of Genetics, Thieme Stuttgart - New

York.

56. Riley R. S., Rowe D., Fisher L. M. (2000), "Clinical utillization of the

international normalized ratio (INR)", J Clin Lab Anal, 14(3), pp. 101-14.

57. Hart R. G., Pearce L. A., Aguilar M. I. (2007), "Meta-analysis: antithrombotic

therapy to prevent stroke in patients who have nonvalvular atrial

fibrillation", Ann Intern Med, 146(12), pp. 857-67.

58. Saraevaf R. B., Paskaleva I. D., Doncheva E. et al (2007)," Pharmacogenetics

of acenocoumarol: CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2, CYP3A4, CYP3A5 and

ABCB1 gene polymorphisms and dose requiments", J Clin Pharm Ther,

32(6), pp. 641-9.

59. Montes R., Nantes O., Alonso A. et al (2008), "The influence of

polymorphisms of VKORC1 and CYP2C9 on major gastrointestinal

bleeding risk in anticoagulated patients", Br J Haematol, 143(5), p. 727-33.

60. Van Schie R. M., Wessels J. A., et al (2011), "Loading and maintenance dose

algorithms for phenprocoumon and acenocoumarol using patient

characteristics and pharmacogenetic data", Euro Heart J, 32(15), p. 1909-17.

61. Nashimura R. A., Catherin M. Otto, Paul Soraja et al (2014), "Guideline for

the Management of Patients With Valvular Heart Disease", J of the

Ameriacan College of Cardilogy, 63(22).

62. Cannegieter S. C., Rosendaal F. R., Briet E. (1994), "Thromboembolic and

bleeding complications in patients with mechanical heart valve prostheses",

Circulation, 89(2), pp. 635-41.

63. Nishimura R. A., Catherine M. Otto. (2017), "AHA/ACC Focused Update of

the 2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With

Valvular Heart Disease", J of the Ameriacan College of Cardilogy, 70(2).

64. Little S. H., Massel D. R. (2003), "Antiplatelet and anticoagulation for patients

with prosthetic heart valves", Cochrane Database Syst Rev, 4:CD003464.

65. Schalekamp T., van Geest-Daalderop J. H., de Vries-Goldschmeding H. et al

(2004), "Acenocoumarol stabilization is delayed in CYP2C93 carriers", Clin

Pharmacol Ther, 75(5), pp. 394-402.

66. Treasure T. (2006), "From anecdote to EBM", J R Soc Med, 99(5), p. 267-70.

67. Bourguignon T., Bergöend E., Mirza A et al (2011), "Risk factors for valve-

related complications after mechanical heart valve replacement in 505

. patoents with long-term follow up", J Heart Valve Dis, 20(6), pp. 673-80.

68. Verhoef T. I., Redekop W. K., Buikema M. M. et al (2012), "Long-term

anticoagulant effects of the CYP2C9 and VKORC1 genotypes in

acenocoumarol users", J Thromb Haemost, 10(4), pp. 606-14.

69. The Human Hepatic Cytochromes P450 Involved in Drug Metabolism. (n.d.).

Available at: https://ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/1616599/ [Accessed 29

July 2018].

70. Pérez-Andreu V., Roldan V., Anton A. l. et al (2009), ''Pharmacogenetic

relevance of CYP4F2 V433M polymorphism on acenocoumarol therapy",

Blood, 113, pp. 4977-79.

71. Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti et al (2012), "Guideline

on the management of valvular heart disease", European Heart Journal,

19(33), pp. 2451-2496.

72. Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (2002), From genes to

genomes: Concepts and Applications of DNA technology, John Wiley &

Sons. Ltd.

73. Houdijk W. P., Van A. M. (2004), "International multicenter international

sensitivity index (ISI) calibration of a new human tissure factor

thromboplastin reagent derived from cultured human cells", Journal of

Thrombosis and Haemostasis, 2(2), pp. 266-70.

74. Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nick Plan (2012), "From genes to

genomes: concepts and applications of DNA technology", In Restriction

endonucleases (3th ed) UK: University of Surrey, pp. 36-74.

75. Francis Lam Y. W., Larisa H. C. (2013), Pharmacogenomics, Academic

press.Ltd, USA, p. 1-44.

76. Chua Y. A., Abdullah W. Z., Yusof Z. et al (2015), "VKORC1 and CYP2C9

genotypic data-based dose prediction alone does not accurately predict

warfarin dose requirements in some Malaysian patients", Turk J Med Sci,

45(2), p. 913-8.

77. Verde Z., Ruiz J. B., Santiago C. et al (2010), "A novel, single algorithm

approach to predict acenocoumarol dose based on CYP2C9 allele variants",

Plos One, 5, pp. 11210.

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU

BỆNH VIỆN TIM HÀ NỘI

Mã số trong Tuổi Giới STT Họ và tên Mã bệnh án theo năm tính đề tài

1 Dương Thị L PT163 52 Nữ Đt 01

2 Trương Việt Q PT1039 63 Nam Đt 02

3 Đỗ Thị M PT610 55 Nữ Đt 03

4 Đỗ Thị M PT1688 60 Nữ Đt 04

5 Nguyễn Thị L PT 668 59 Nữ Đt 05

6 Đinh Thị V PT641 58 Nữ Đt 06

7 Đỗ Thị H PT499 52 Nữ Đt 07

8 Nguyễn Văn T PT1222 62 Nam Đt 08

9 Nguyễn Thị T PT126 46 Nữ Đt 09

10 Nguyễn Văn D PT1480 54 Nam Đt 10

11 Nguyễn Thị Tường V PT1275 47 Nữ Đt 11

12 Phan Thị C PT941 56 Nữ Đt 12

13 Đặng Thị T PT95/15 57 Nam Đt 16

14 Nguyễn Thị T PT33/15 52 Nữ Đt 17

15 Nguyễn Văn L PT460 53 Nam Đt 18

16 Nguyễn Thị H PT401/15 46 Nữ Đt 19

17 Nguyễn Văn T PT1298 55 Nam Đt 21

18 Vũ Thị H PT1390 54 Nữ Đt 22

19 Nguyễn Thị H PT518 32 Nữ Đt 23

20 Nguyễn Thạc Q PT747/15 51 Nam Đt 24

21 Nguyễn Thị H PT137 62 Nữ Đt 25

22 Nguyễn Thị D PT1090 65 Nữ Đt 26

23 Trịnh Thị H PT1011 52 Nữ Đt 27

24 Nguyễn Văn D PT343 41 Nam Đt 28

25 Nguyễn Công L PT1405 35 Nam Đt 31

26 Nguyễn Thị N PT295/16 54 Nữ Đt 32

27 Hoàng Thị M PT1912 49 Nữ Đt 33

28 Đặng Văn H PT969 53 Nam Đt 34

29 Hà Văn M PT1198/16 37 Nam Đt 35

30 Trần Thị H PT17 39 Nữ Đt 36

31 Nguyễn Văn N PT419 50 Nam Đt 38

32 Nguyễn Thị L PT 748 62 Nữ Đt 39

33 Vũ Thị D PT635 49 Nữ Đt 40

34 Vũ Thị T PT1923 42 Nữ Đt 42

35 Phạm Thị T PT1127 60 Nữ Đt 44

36 Ngô Thị L PT1683 56 Nữ Đt 46

37 Vương Thị V ST100 60 Nữ Đt 48

38 Nguyễn Thị N PT1485 60 Nữ Đt 49

39 Đặng Văn L PT167 39 Nam Đt 51

40 Nguyễn Ngọc C PT786 53 Nam Đt 52

41 Đỗ Thị V PT915 33 Nữ Đt 53

42 Phạm Văn T ST953 31 Nam Đt 58

43 Nguyễn Văn D PT1162/17 42 Nam Đt 61

44 Nguyễn Thị B PT699 62 Nữ Đt 65

45 Đỗ Minh Đ PT960 58 Nam Đt 67

46 Lê Văn S PT1048 52 Nam Đt 68

47 Trịnh Thị K PT882 60 Nữ Đt 69

48 Phạm Khắc X PT368 62 Nam Đt 71

49 Đặng Thanh B PT676 37 Nam Đt 72

50 Nguyễn Văn H NT1501 59 Nam Đt 73

51 Nguyễn Gia Q PT8152/15 65 Nữ Đt 74

52 Đỗ Thị V PT573 42 Nữ Đt 75

53 Đặng Thị V PT1244/16 53 Nữ Đt 78

54 Phùng Thị T PT144 43 Nữ Đt 79

55 Nguyễn Văn H PT1228 64 Nam Đt 80

56 Hoàng Thị C ST1610 52 Nữ Đt 82

57 Dương Văn B PT203 61 Nam Đt 84

58 Nguyễn Thị V PT860/16 62 Nữ Đt 85

59 Đỗ Trọng T PT1060 59 Nam Đt 86

60 Trịnh Thị H PT311 54 Nữ Đt 87

61 Phùng Thế H PT1098/16 59 Nam Đt 88

62 Nguyễn Thị C PT127 54 Nữ Đt 89

63 Nguyễn Văn D PT1162/17 42 Nam Đt 90

64 Phạm Văn T PT257 36 Nam Đt 92

65 Nguyễn Thị H PT684 38 Nữ Đt 93

66 Đinh Thị V PT880 47 Nữ Đt 94

67 Bùi Đức C PT928 46 Nam Đt 95

68 Nguyễn Thị K PT1412 63 Nữ Đt 96

69 Nguyễn Thị H PT245 44 Nữ Đt 97

70 Phùng Thị Đ PT1066 53 Nữ Đt 98

71 Nguyễn Thị Ư PT525 62 Nữ Đt 99

72 Phan Thị Q PT270 34 Nữ Đt 100

73 Nguyễn Đức T PT461 54 Nam Đt 101

74 Nguyễn Thành C PT26 45 Nam Đt 102

75 Bùi Khánh T PT202 52 Nam Đt 103

76 Nguyễn Văn N PT253 47 Nam Đt 104

77 Nguyễn Thị S PT1630 58 Nữ Đt 105

78 Phạm Đắc T PT1062 50 Nam Đt 107

79 Nguyễn Thị N PT776 56 Nữ Đt 109

80 Đỗ Thị H PT1626 45 Nữ Đt 110

81 Nguyễn Văn C PT1623 45 Nam Đt 113

82 Triệu Thị S PT1382 47 Nữ Đt 114

83 Vũ Đình S PT76 50 Nam Đt 115

84 Nguyễn Thị N PT1041 56 Nữ Đt 117

85 Dương Thị L PT515 41 Nữ Đt 118

86 Trần Quốc B PT249/15 66 Nam Đt 123

87 Phạm Văn L PT193 57 Nam Đt 124

88 Phùng Thị T PT874 49 Nữ Đt 126

89 Phạm Thị K PT865 56 Nữ Đt 127

90 Trần Thị L PT38 48 Nữ Đt 128

91 Nguyễn Văn Đ PT29 52 Nam Đt 129

92 Hoàng Thế Q ST897 32 Nam Đt 130

93 Nguyễn Thị N PTVT1091 47 Nữ Đt 132

94 Kiều Duy T PTVT 584 52 Nam Đt 136

95 Đặng Văn C PTVT1080 63 Nam Đt 140

96 Vi Thị N PTVT1704 57 Nữ Đt 141

97 Đinh Đăng C PTVT241 44 Nam Đt 145

98 Đinh Thị H PTVT887 35 Nữ Đt 146

99 Phạm Thị H PTVT308 42 Nữ Đt 147

100 Triệu Hồng L PTVT1650 61 Nam Đt 148

PHỤ LỤC

DANH SÁCH KẾT QUẢ ĐO OD CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

STT Mẫu Nồng độ DNA (ng/μl) A260/A280

01 ĐT 01 78,85 1,957

02 ĐT 02 63,35 1,931

03 ĐT 03 80,15 1,964

04 ĐT 04 72,10 1,970

05 ĐT 05 64,40 2,051

06 ĐT 06 89,65 1,960

07 ĐT 07 99,55 1,807

08 ĐT 08 48,60 1,808

09 ĐT 09 54,00 1,983

10 ĐT 10 41,15 1,892

11 ĐT 11 61,50 2,026

12 ĐT 12 62,25 1,853

13 ĐT 16 50,90 1,950

14 ĐT 17 73,40 1,984

15 ĐT 18 56,15 2,052

16 ĐT 19 96,15 1,985

17 ĐT 21 69,20 1,838

18 ĐT 22 63,20 1,904

19 ĐT 23 114,95 1,874

20 ĐT 24 73,65 1,872

21 ĐT 25 48,90 1,970

22 ĐT 26 63,55 1,903

23 ĐT 27 41,75 2,016

24 ĐT 28 93,65 1,862

25 ĐT 31 57,55 1,927

26 ĐT 32 95,85 1,861

27 ĐT 33 43,00 2,275

28 ĐT 34 59,65 2,138

29 ĐT 35 62,50 2,155

30 ĐT 36 48,25 2,271

31 ĐT 38 71,85 2,074

32 ĐT 39 101,15 1,940

33 ĐT 40 69,10 2,107

34 ĐT 42 106,50 1,873

35 ĐT 44 88,20 1,964

36 ĐT 46 42,80 1,860

37 ĐT 48 63,55 2,021

38 ĐT 49 46,00 1,970

39 ĐT 51 49,45 2,181

40 ĐT 52 41,80 1,922

41 ĐT 53 46,25 2,024

42 ĐT 58 53,95 2,017

43 ĐT 61 46,10 1,921

44 ĐT 65 52,85 2,052

45 ĐT 67 54,10 2,386

46 ĐT 68 57,50 2,223

47 ĐT 69 59,45 2,424

48 ĐT 71 46,25 2,102

49 ĐT 72 75,85 2066

50 ĐT 73 2,095 55,20

51 ĐT 74 2,096 43,10

52 ĐT 75 1,910 61,90

53 ĐT 78 2,148 48,80

54 ĐT 79 2,125 58,15

55 ĐT 80 2,196 63,25

56 ĐT 82 2,172 57,75

57 ĐT 84 2,020 46,30

58 ĐT 85 2,135 45,45

59 ĐT 86 2,162 46,00

60 ĐT 87 2,002 41,60

61 ĐT 88 2,079 50,70

62 ĐT 89 2,027 45,60

63 ĐT 90 2,022 53,20

64 ĐT 92 2,115 65,50

65 ĐT 93 2,181 56,50

66 ĐT 94 2,185 55,75

67 ĐT 95 1,962 48,90

68 ĐT 96 1,985 50,65

69 ĐT 97 2,035 57,25

70 ĐT 98 2,015 51,30

71 ĐT 99 2,136 43,40

72 ĐT100 1,925 45,56

73 ĐT101 2,038 65,20

74 ĐT102 2,135 52,30

75 ĐT103 1,956 86,62

76 ĐT104 66,30 1,985

77 ĐT105 46,78 2,015

78 ĐT107 66,50 2,200

79 ĐT109 40,95 1,963

80 ĐT110 110,52 1,895

81 ĐT113 110,25 2,185

82 ĐT114 55,96 2,015

83 ĐT115 209,10 2,065

84 ĐT117 56,51 1,982

85 ĐT118 69,12 2,158

86 ĐT123 85,78 2,085

87 ĐT124 54,62 1,986

88 ĐT126 49,65 2,017

89 ĐT127 55,12 2,056

90 ĐT128 56,85 2,019

91 ĐT129 78,19 2,185

92 ĐT130 49,65 2,019

93 ĐT132 51,65 1,841

94 ĐT136 66,70 1,944

95 ĐT140 47,90 1,855

96 ĐT141 94,90 1,833

97 ĐT145 47,70 1,980

98 ĐT146 46,50 1,865

99 ĐT147 43,65 1,968

100 ĐT148 72,55 1,896

PHỤ LỤC

DANH SÁCH KẾT QUẢ KIỂU GEN CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

Kết quả kiểu gen

STT Kí hiệu mẫu rs9923231 trên rs9934438 trên CYP2C9*3 gen VKORC1 gen VKORC1

1 Đt 01 AG AA AA

2 Đt 02 AA AA AA

3 Đt 03 AG AA AA

4 Đt 04 AA AC AA

5 Đt 05 AA AA AA

6 Đt 06 AA AA AA

7 Đt 07 AA AA AA

8 Đt 08 AG AA AG

9 Đt 09 AA AA AA

10 Đt 10 AA AA AA

11 Đt 11 AA AA AA

12 Đt 12 AA AA AA

13 Đt 16 AG AA AA

14 Đt 17 AG AA AA

15 Đt 18 AA AA AA

16 Đt 19 AA AA AA

17 Đt 21 AA AA AA

18 Đt 22 AG AA AA

19 Đt 23 AG AA AG

20 Đt 24 AA AA AA

21 Đt 25 AG AA AG

22 Đt 26 AA AA AA

23 Đt 27 AA AC AA

24 Đt 28 AG AA GG

25 Đt 31 AA AA AA

26 Đt 32 AA AA AA

27 Đt 33 AA AA AA

28 Đt 34 AA AA AA

29 Đt 35 AA AA AA

30 Đt 36 AA AA AA

31 Đt 38 AG AA GG

32 Đt 39 AG AA AG

33 Đt 40 AA AA AA

34 Đt 42 AG AC AA

35 Đt 44 AA AA AA

36 Đt 46 AG AA AG

37 Đt 48 AA AA AA

38 Đt 49 AA AA AA

39 Đt 51 AG AA AG

40 Đt 52 AA AA AA

41 Đt 53 AG AA AA

42 Đt 58 AG AA AA

43 Đt 61 AG AA AA

44 Đt 65 AA AA AA

45 Đt 67 AA AA AA

46 Đt 68 AA AA AA

47 Đt 69 AA AA AA

48 Đt 71 AG AA AA

49 Đt 72 AA AA AA

50 Đt 73 AG AA AA

51 Đt 74 AA AA AA

52 Đt 75 AA AA AA

53 Đt 78 AA AA AA

54 Đt 79 AA AA AA

55 Đt 80 AA AA AA

56 Đt 82 AA AA AA

57 Đt 84 AA AA AA

58 Đt 85 AG AA AA

59 Đt 86 AA AA AA

60 Đt 87 AA AA AA

61 Đt 88 AA AA AA

62 Đt 89 AG AA AA

63 Đt 90 AA AA AA

64 Đt 92 AG AA AA

65 Đt 93 AA AA AA

66 Đt 94 AA AA AA

67 Đt 95 AA AA AA

68 Đt 96 AA AA AA

69 Đt 97 AA AA AA

70 Đt 98 AG AA AA

71 Đt 99 AG AG AA

72 Đt 100 AA AA AA

73 Đt 101 AA AA AA

74 Đt 102 AA AA AA

75 Đt 103 AA AA AA

76 Đt 104 AA AA AA

77 Đt 105 AA AA AA

78 Đt 107 AA AA AA

79 Đt 109 AG AG AA

80 Đt 110 AA AA AA

81 Đt 113 AA AA AA

82 Đt 114 AA AA AA

83 Đt 115 GG GG AC

84 Đt 117 AA AA AA

85 Đt 118 AA AA AA

86 Đt 123 AA AA AA

87 Đt 124 AG AG AA

88 Đt 126 AG AG AA

89 Đt 127 AA AA AA

90 Đt 128 AA AG AA

91 Đt 129 AA AG AA

92 Đt 130 AA AA AA

93 Đt 132 AA AG AA

94 Đt 136 AA AA AA

95 Đt 140 AG AA AA

96 Đt 141 AA AA AA

97 Đt 145 AA AG AA

98 Đt 146 AA AA AA

99 Đt 147 AA AA AG

100 Đt 148 AA AA AA

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Khảo sát đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1 TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol ...... 14

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Buồng tim và vị trí các van tim ................................................................... 3

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.4.2. Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol

1.4.3. Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều dùng thuốc

acenocoumarol

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR

Chƣơng 3. KẾT QUẢ

AG+GG 2%

AG+AG 11%

AG+AA 19%

GG+AA 1%

AA+AA 67%

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU

BỆNH VIỆN TIM HÀ NỘI

PHỤ LỤC

DANH SÁCH KẾT QUẢ ĐO OD CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

PHỤ LỤC

DANH SÁCH KẾT QUẢ KIỂU GEN CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

Kết quả kiểu gen

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok