Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
94
KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ TYROSINASE
VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TÔ
Nguyễn Thị Hạnh Trúc*, Nguyễn Thùy Dương*, Võ Thị Diễm*,
Nguyễn Quốc Thái*, Huỳnh Ngọc Trinh*
Mở đầu: Hiện nay, trên thị trường xuất hiện nhiều các sản phẩm làm trắng da chứa acid kojic, arbutin,
hydroquinon... nhưng các chất này lại có nhiều tác dụng phụ. Do đó, nhu cầu phát triển những hợp chất thiên
nhiên có tác dụng làm sáng da ngày càng tăng cao.
Mục tiêu: Đề tài nhằm đánh giá tác động ức chế enzym tyrosinase kết hợp với tác động chống oxy hóa của
các cao chiết từ lá Tía tô.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Cao toàn phần (cao TP) của lá Tía tô được chiết bằng phương
pháp ngấm kiệt với ethanol 50%. Các cao phân đoạn được chiết bằng phương pháp lắc phân bố lỏng-lỏng với
cloroform và ethyl acetat thu được cao cloroform (CF), ethyl acetat (EA), cao ethyl acetat/cloroform (EA/CF). Tác
động ức chế tyrosinase của các cao Tía tô được đánh giá thông qua phản ứng với L-DOPA, từ đó tính IC50 của
các cao tiềm năng. Hoạt tính chống oxy hóa được xác định qua thử nghiệm DPPH.
Kết quả: Trong các cao khảo sát, cao EA và cao EA/CF thể hiện rõ tác động ức chế tyrosinase. Cao EA/CF có
hoạt tính mạnh nhất với IC50 thấp hơn cả chất đối chiếu acid kojic (0,07 mg/mL so với 0,12 mg/mL). Cao này
cũng có tác động chống oxy hóa mạnh với IC50= 9,47 µg/mL so với 4,6 µg/mL của acid ascorbic.
Kết luận: Các cao chiết từ lá Tía tô đều có tác động ức chế tyrosinase, trong đó cao phân đoạn EA/CF thể
hiện đồng thời tác động ức chế enzym tyrosinase và chống oxy hóa mạnh nhất.
Từ khóa: DPPH, melanin, Tía tô, tyrosinase
ABSTRACT
EVALUATION OF TYROSINASE INHIBITORY EFFECT
AND ANTIOXYDANT ACTIVITY OF PERILLA EXTRACTS
Nguyen Thi Hanh Truc, Nguyen Thuy Duong, Vo Thi Diem,
Nguyen Quoc Thai, Huynh Ngoc Trinh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 94 - 99
Introduction: Various whitening products containing kojic acid, arbutin, hydroquinon... are currently
available. However, these substances have many side effects. Therefore, the requirement in development of
whitteners originating from natural sources is increasing.
Objectives: This study aimed to evaluate the inhibitory effect of tyrosinase enzyme and the antioxidant effect
of perilla leaf extracts.
Materials and methods: Total extract (TP) was obtained by maceration method with 50% ethanol from
Perilla leaves. TP extract were then fractionated by liquid-liquid distribution with chloroform and ethyl acetat to
obtain extracts of chloroform (CF), ethyl acetat (EA) and ethyl acetat/chloroform (EA/CF). The tyrosinase
inhibitory effect of perilla extracts was assessed by reaction with L-DOPA, thereby calculating IC50 of potential
extracts. Antioxidant activity was determined by DPPH test.
Results: Among studied extracts, EA and EA/CF exhibited clearly tyrosinase inhibition effect.
EA/CF presented the highest activity with IC50 lower than the reference substance kojic acid (0.07 mg/mL
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Huỳnh Ngọc Trinh ĐT: 0907733259 Email: hntrinh@ump.edu.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
95
vs. 0.12 mg/mL). This extract also had strong antioxidant effect with IC50 = 9.47 µg/mL compared to 4.6 µg/mL
of ascorbic acid.
Conclusion: All studied extracts exhibited tyrosinase inhibition effect. EA/CF represented the strongest
tyrosinase inhibition and antioxidant effect.
Key words: DPPH, melanin, Perilla, tyrosinase
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, da người thường xuyên tiếp xúc
với những tác nhân gây tổn thương ADN từ bên
ngoài như ánh sáng mặt trời hay sự ô nhiễm môi
trường. Cơ thể cần có nhiều cơ chế nội sinh
nhằm chống lại hoặc sửa chữa những sai hỏng
này; và một trong những cơ chế quan trọng nhất
là cơ chế sản sinh sắc tố da melanin(1). Tuy nhiên,
việc sản xuất quá mức melanin có thể dẫn đến
các bất thường trên da như nám, tàn nhang, sạm
da do tăng hắc tố bo (lentigo) và các bất thường
khác gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính
thẩm mỹ ở người bệnh(2,3). Melanin được hình
thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa
liên quan đến acid amin tyrosin với sự xúc tác
của enzym tyrosinase(4). Các chất ức chế
tyrosinase an toàn và hiệu quả không những
đáp ứng được nhu cầu làm trắng da mà còn là
nền tảng cho việc nghiên cứu những thuốc để
điều trị các rối loạn sắc tố da(5). Hiện nay, có
nhiều hoạt chất làm trắng da đã được sử dụng
rộng rãi như acid kojic, arbutin, hydroquinon...
nhưng các chất này lại có nhiều tác dụng phụ(5).
Do đó, nhu cầu phát triển những chất mới có
nguồn gốc từ thiên nhiên đang ngy cng tăng
cao. Bên cạnh đó, gốc tự do không những là
nguyên nhân gây ra các quá trình lão hóa, ung
thư, các bệnh lý tim mạch… m cũng còn l một
trong những yếu tố thúc đẩy quá trình tổng hợp
melanin ở da. Các chất đánh bắt gốc tự do hay
ức chế sự hình thành gốc tự do có thể làm giảm
sự hình thành melanin trên da. Vì thế, ngoài các
chất ức chế tyrosinase tác động trực tiếp vào quá
trình sinh tổng hợp melanin, các chất chống oxy
hóa cũng thường được phối hợp vào trong các
công thức sản phẩm làm trắng da(6).
Tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) là một cây
rất phổ biến, dễ dng được tìm thấy và trồng trọt
tại các nước châu Á(7). Trong thành phần Tía tô
đã được chứng minh có chứa nhiều hợp chất
phenolic và flavonoid cho hoạt tính chống oxy
hóa tốt cũng như có tiềm năng ức chế enzym
tyrosinase(4,8-10). Bên cạnh đó, kết quả thử nghiệm
tác động chống oxy hóa của các cao chiết từ lá
Tía tô thu hái tại các địa điểm khác nhau còn cho
thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ cao toàn
phần cồn 50% có tác dụng tốt nhất(9).
Từ những lý do nêu trên, đề tài được thực
hiện nhằm khảo sát tác động ức chế sự hình
thành melanin thông qua khả năng ức chế
enzym tyrosinase kết hợp với tác động chống
oxy hóa từ lá Tía tô.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu
Tía tô được trồng và thu hái tại Hà Nội vào
tháng 1 năm 2019. Sau khi thu hái, cây được nhặt
lá, rửa sạch, phơi trong râm cho khô; lá khô tiếp
tục được xay thành bột thô để chiết xuất.
Hóa chất, trang thiết bị
Enzym tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus,
L – DOPA (3,4-dihydoxy-L-phenylalanin),
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), acid kojic
mua từ Sigma-Aldrich, Đức; acid ascorbic của
viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh;
NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, ethyl acetat,
cloroform, cồn ethanol (EtOH), dimethyl
sulfoxyd (DMSO) của Trung Quốc.
Các thiết bị bao gồm: máy đo quang
ELISA iMark™ Microplate Absorbance Reader,
máy quang phổ UV - Vis SP 8001, máy đo pH
Neo Met, bếp cách thủy Memmert, đĩa 96 giếng.
Phương pháp chiết xuất các cao Tía tô
Bột lá Tía tô được chiết bằng phương pháp
ngấm kiệt với cồn 50% cho đến khi dịch chiết
không còn phản ứng với thuốc thử FeCl3 5%
trong ethanol thì ngừng quá trình chiết. Toàn bộ
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
96
dịch chiết cao toàn phần được thu hồi dung môi
bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 55 oC.
Dịch sau khi cô quay được chia làm 2 phần,
phần thứ hai gấp đôi phần thứ nhất. Phần thứ
nhất tiếp tục cô trên bếp cách thủy đến thể chất
cao đặc, thu được cao ton phần (cao TP). Phần
thứ 2 được chia làm 2 phần bằng nhau: phần thứ
1 lắc phân bố lỏng lỏng với ethyl acetat, phần
thứ 2 lắc lần lượt với cloroform sau đó đến ethyl
acetat; khi các dịch lắc không còn phản ứng với
FeCl3 nữa thì dừng quá trình lắc phân bố. Cô thu
hồi dung môi thu được cao phân đoạn ethyl
acetat (cao EA), cao phân đoạn cloroform (cao
CF) v cao phân đoạn ethyl acetat sau khi lắc với
cloroform (cao EA/CF). Các cao sau khi loại hết
dung môi được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC trước
khi tiến hành các thí nghiệm.
Thử nghiệm ức chế tyrosinase in vitro
Sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase
của các cao
Các cao được hòa tan trong các dung môi
khác nhau đến nồng độ tối đa tan được trong
giếng phản ứng. Theo đó, cao toàn phần được
hòa tan trong đệm natri phosphat 50 mM pH 6,5
ở nồng độ 3,4 mg/mL; cao EA trong EtOH ở
nồng độ 0,75 mg/ml; cao CF và EA/CF trong
DMSO với nồng độ lần lượt là 0,5 mg/mL và
1 mg/mL. Tyrosinase và L-DOPA được hòa tan
trong đệm phosphat với nồng độ tương ứng là
100U/mL và 10 mM.
Thành phần hỗn hợp phản ứng được cho
vào giếng như trình by ở Bảng 1.
Bảng 1. Các thành phần phản ứng
Trắng
chứng
(B)
Thử
(CE)
Trắng
thử
(C)
Đệm phosphat (µL)
110
80
110
Cao Tía tô (µL)
-
10
10
Dung môi (µL)
10
-
-
Tyrosinase 100U/ml (µL)
-
30
-
Ủ 5 phút ở 25 oC
L-DOPA 10 mM (µL)
80
80
80
Mỗi mẫu được thực hiện trên 3 giếng, sản
phẩm sau phản ứng được đo động học độ hấp
thu (Abs) của sản phẩm sau phản ứng ở bước
sóng 490 nm mỗi 10 giây trong thời gian 10 phút
và tính vận tốc phản ứng (Abs/phút) của các
mẫu(11).
Đánh giá % ức chế tyrosinase theo công thức:
% ức chế = (1 – VCE – VC
VBE – VB
) × 100
Trong đó: VBE : vận tốc phản ứng của mẫu
chứng VB: vận tốc phản ứng của mẫu trắng
chứng
VCE: vận tốc phản ứng của mẫu thử
VC: vận tốc phản ứng của mẫu trắng thử
Xác định IC50 của các cao tiềm năng so với
acid kojic
Dựa vào kết quả sàng lọc tác động ức chế
tyrosinase và chọn ra các cao có tiềm năng. Với
mỗi cao, tiến hành pha thành dãy nồng độ và
xác định % ức chế tyrosinase ở từng nồng độ.
Acid kojic được dùng làm chất đối chứng
dương. Các thành phần phản ứng và quy trình
thực hiện giống thử nghiệm sàng lọc hoạt tính
ức chế enzym tyrosinase của các cao.
Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính mô
tả sự liên quan giữa logC với phần trăm ức chế
tyrosinase của chất khảo sát: y = ax + b với y là
% ức chế, x là log nồng độ cao trong giếng; từ đó
tính toán giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% hoạt
tính của tyrosinase của các cao chiết).
Xác định khả năng tương tác của các cao tiềm
năng với Cu2+
Các cao Tía tô tiềm năng ức chế
tyrosinase được hòa tan trong DMSO đến nồng
độ 0,4 mg/ml. Nhằm đánh giá sơ bộ khả năng
tương tác với ion Cu(II) của các cao chiết, giúp
xác định cơ chế tác động của các cao chiết với
enzym tyrosinase, nồng độ các cao chiết trong
giếng phản ứng được cố định 60 μg/ml, sau đó
cho vào mẫu cao tiếp xúc với dung dịch CuSO4 ở
các nồng độ khác nhau (từ 0 mM đến 3 mM) so
với mẫu dung dịch CuSO4 3 mM. Sau đó ủ ở 25 oC
trong 10 phút và đo phổ hấp thu ở bước sóng từ
190 đến 600 nm để đánh giá sự chuyển dịch bước
sóng hấp thu của các hỗn hợp phản ứng(12).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
97
Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro
Các cao Tía tô tiềm năng được pha thành
dãy các nồng độ khác nhau và cho phản ứng với
đồng lượng dung dịch DPPH (0,5 mL) trong
eppendorf. Lắc đều hỗn hợp phản ứng, để yên
trong tối ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30
phút. Sau đó cho mẫu vào cuvet, đo quang bằng
máy UV-Vis ở bước sóng 515 nm(9). Sử dụng acid
ascorbic làm chứng dương, so sánh khả năng
đánh gốc tự do của các cao tiềm năng. Mỗi mẫu
được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Phần trăm đánh bắt gốc tự do được tính theo
công thức:
% đánh bắt = (1 – ) x 100
Trong đó:
ABE : độ hấp thu của mẫu chứng
AB: độ hấp thu của mẫu trắng chứng
ACE: độ hấp thu của mẫu thử
AC: độ hấp thu của mẫu trắng thử
Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính
mô tả sự liên quan giữa logC và phần trăm
đánh bắt DPPH; từ đó suy ra giá trị IC50 của
các chất khảo sát.
KẾT QUẢ
Tác động ức chế tyrosinase in vitro
Sàng lọc hoạt tính ức chế enzym tyrosinase
của các cao
Hoạt tính ức chế tyrosinase của các cao tại
nồng độ cao nhất tan trong giếng được trình bày
trong bảng 2. Trong 4 cao Tía tô khảo sát, cao EA
và cao EA/CF có phần trăm ức chế tyrosinase lớn
hơn 50% tại nồng độ cao nhất trong giếng. Do đó
hai cao ny được lựa chọn để tiếp tục xác định
nồng độ IC50 (Bảng 2).
Xác định IC50 của các cao tiềm năng và
acid kojic
Phương trình hồi quy tương quan giữa lgC
của cao EA và cao EA/CF với phần trăm ức chế
tyrosinase và giá trị IC50 của các cao ny được
trình bày ở Bảng 3.
Bảng 2. Sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase của các
cao Tía tô
Cao Tía tô
Nồng độ tối đa
% ức chế enzym (%)
Cao TP
3,4 mg/mL
46,58 ± 14,52
Cao CF
0,5 mg/mL
37,42 ± 12,93
Cao EA
0,75 mg/mL
68,44 ± 0,57
Cao EA/CF
1 mg/mL
68,74 ± 6,48
Bảng 3. IC50 của các cao tiềm năng so với acid kojic
trong thử nghiệm ức chế tyrosinase
Phương trình hồi quy
IC50
(mg/mL)
Cao EA
y = 28,213x + 73,749 (R2 = 0,996)
0,14
Cao EA/CF
y = 16,579x + 68,679 (R2 = 0,998)
0,07
Acid kojic
y = 33,537x + 80,685 (R2 = 0,980)
0,12
Kết quả cho thấy giá trị IC50 của cao EA
xấp xỉ với giá trị này của chất đối chiếu acid
kojic trong khi cao EA/CF có IC50 thấp hơn cả
acid kojic. Điều này chứng tỏ hoạt tính ức
chế tyrosinase tương đối mạnh của cả 2 cao
khảo sát.
Tương tác giữa cao và ion Cu2+
Khi cao tiếp xúc với dung dịch đồng có
sự gia tăng độ hấp thu ở khoảng bước sóng
350-450 nm đối với cao EA và 380-470 nm đối
với cao EA/CF làm xuất hiện các peak đặc trưng
trong phổ hấp thu so với phổ của CuSO4 và cao
chiết (Hình 1A và Hình 1B). Sự xuất hiện các peak
mới này cho thấy có sự thành lập một phức hợp
mới giữa ion Cu2+ và thành phần cao chiết; các
phức hợp này làm thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp cao Tía tô với CuSO4 ở các bước sóng khác
nhau so với mẫu chỉ có cao Tía tô (mẫu CuSO4
0,00 mM) và mẫu không có cao Tía tô mà chỉ có
Cu2+ nồng độ 3,00 mM. Khảo sát sự thay đổi độ
hấp thu của hỗn hợp cao chiết và CuSO4 tại bước
sóng 400 nm còn cho thấy độ hấp thu của hỗn
hợp phụ thuộc theo logarit nồng độ của CuSO4
(Hình 1C và Hình 1D).
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
98
Hình 1. Phổ hấp thu của cao EA (Hình A) và cao EA/CF (Hình B) với CuSO4 ở các nồng độ khác nhau
và đồ thị tương quan giữa log [CuSO4] với sự thay đổi độ hấp thu của hỗn hợp cao EA (Hình C)
và cao EA/CF (Hình D) và CuSO4 tại bước sóng 400 nm
Hoạt tính chống oxy hóa in vitro
Kết quả thử nghiệm tác động ức chế
tyrosinase của các cao chiết Tía tô cho thấy cao
EA và cao EA/CF là hai cao tiềm năng nhất nên 2
cao được tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxy
hóa và so sánh với chất đối chiếu là acid
ascorbic. Phương trình hồi quy tương quan giữa
lgC của cao EA và cao EA/CF với phần trăm
đánh bắt gốc tự do DPPH và giá trị IC50 của các
cao ny được trình bày ở Bảng 4. So giữa 2 cao
Tía tô thử nghiệm, cao EA/CF có IC50 nhỏ hơn
cao EA khoảng 0,42 lần cao EA, chứng tỏ hoạt
tính chống oxy hóa mạnh cao EA/CF. Ngoài ra,
khi so với acid ascorbic, IC50 của cao EA/CF chỉ
gấp 2 lần, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tốt
của cao này.
Bảng 4. Phần trăm đánh bắt DPPH trên dãy nồng
độ cao EA
Phương trình hồi quy
IC50 (µg /mL)
Cao EA
y = 59,558x – 30,469
(R2 = 0,979)
22,44
Cao EA/CF
y = 78,273x – 26,336
(R2 = 0,998)
9,45
Acid ascorbic
y = 113,86x – 25,477
(R2 = 0,984)
4,6
BÀN LUẬN
Các chất ức chế tyrosinase không những
được sử dụng trong y khoa để điều trị các bệnh
về tăng sắc tố da mà còn là thành phần rất phổ
biến trong các mỹ phẩm làm trắng da. Kết quả
từ đề tài cho thấy trong các cao Tía tô khảo sát,
A
B
C
D